CN102680716A - ABO/RhD血型抗原检测试剂卡及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ABO/RhD血型抗原检测试剂卡的制备,检测试剂卡上具有8个微柱凝胶管,其中,两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗A单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗B单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的RhD血型的抗D单克隆抗体,两个凝胶管中含凝胶悬浮介质缓冲液和凝胶。
Description
技术领域:
本发明涉及一种血型抗原检测卡及其制备方法,具体是指采用微柱凝胶技术检测人血红细胞表面的血型抗原,涉及检测卡的组成、制备及其应用。
背景技术:
人红细胞血型是最早发现的人类血型,为人类的一种遗传标记,对人类遗传学、输血、组织配型、器官移植和新生儿免疫具有重要意义。
自1900年Landsteinor发现ABO血型以来,1907年Hoktoen首先提出血型鉴定对输血治疗的重要性,而1908年Ottenberg进一步提出了供受体血液交叉配血的概念,更进一步强调血型鉴定对临床输血的深远意义。输血是临床抢救病人生命的重要医疗手段之一,正确鉴定人ABO血型是安全输血的首要步骤,ABO血型不符在临床输血中会导致严重的继发性溶血性输血反应,危及人类生命。因此ABO血型的准确定性至关重要,是安全输血的基础和保障。
RhD血型系统是仅次于ABO血型系统的的重要血型系统,是人红细胞血型系统中最为复杂的一个系统。国际输血协会(ISBT)已确认RhD血型系统主要抗原有5种,分别为:D、C、c、E、e,其中D抗原最强。人红细胞表面含有D抗原的为RhD阳性,反之为阴性,中国汉族人群中RhD阳性的比例约占99.7%。RhD阴性人群接受RhD阳性血液后,会对D抗原发生免疫应答,并在第二次接触该抗原后发生溶血反应;另外,RhD阴性妊娠妇女的胎儿为阳性时,在分娩或流产时,胎儿红细胞可能会通过胎盘进入母体,导致母体对D抗原发生免疫应答,当再次妊娠时,可能造成新生儿溶血。
卫生部卫医法(2000)184号文件规定,每位供血及受血的个体均要进行ABO、RhD血型检测。
在国外、已有戴安娜、达亚美、强生等厂家生产用于ABO血型系统和RhD血型系统血型检测的检测卡,但其均采用葡聚糖凝胶或微玻璃珠,葡聚糖凝胶颗粒为70nm以上,颗粒较大、凝胶之间缝隙较大,易使血型检测卡的灵敏度降低,而玻璃微珠之间容易产生静电,对检测过程存在不同程度影响,此外,国外已有的大部分血型抗原检测卡为6个微柱的凝胶试剂检测卡,仅进行A抗原,B抗原和D抗原检测,无阴性对照,从而降低血型抗原检测卡结果的准确性,易导致ABO血型系统结果的错误报告。
在国内,也已经有长春博迅、江阴力博等企业也有类似的血型检测卡生产,其反应布局与国外试剂类似,无阴性对照,依然存在血型抗原检测卡结果的不准确而导致ABO血型系统结果的错误报告的风险,且质量相对于国外试剂质量,存在一定的差异。
中国专利申请(申请公布号:CN 101718794A)公开了一种ABO/RhD血型定性检测试剂卡的制备方法:选用30-60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶作为凝胶介质,每个空白卡上含有6个微柱管,形成6个微柱凝胶管的检测卡,6个微柱管分别为:抗A、抗B、抗D、阴性对照各一管,反定型检测2管。
中国专利申请(申请公布号:CN 101701961A)公开了一种ABO血型抗原检测试剂卡的制备方法:选用30-60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶作为凝胶介质,每个空白卡上含有6个微柱管,形成6个微柱凝胶管的检测卡,6个微柱管分别为:抗A、抗B、阴性对照各一管,反定型检测3管。
以上两种国内专利均不是单纯的血型抗原检测,在单独血型抗原检测领域使用易造成试剂浪费并增大工作量,且聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的选择、制备易受生产操作及环境的影响,使颗粒之间的间隙不够均匀,容易对对试剂灵敏度造成影响,使试剂质量不稳定。
发明内容:
本发明的内容旨在克服以上不足,提供一种高灵敏度、高特异性、质量稳定,能同时检测ABO血型抗原和RhD血型抗原,并能在一定程度上排除干扰的一种检测试剂卡的制备方法。
为实现上述目的,本发明以以下设计方案进行:
ABO/RhD血型抗原检测卡上具有8个微柱凝胶管,可检测2人份标本,微柱凝胶管分别为:两管含有IgM性质的抗A单克隆抗体、两管含有IgM性质的抗B单克隆抗体、两管含有IgM性质的RhD血型的抗D单克隆抗体,两管含凝胶缓冲液的空白凝胶卡,用于阴性对照。
制备方法及工艺过程:
一、凝胶悬浮介质缓冲液的配制:凝胶悬浮介质缓冲液的配方如下:
以上试剂用纯化水溶解,调整pH值为6.6-6.8。
二、凝胶制备:
选用交联葡聚糖如:进口商品化的交联葡聚糖G50(Sephadex G50)、交联葡聚糖G75(Sephadex G75)或交联葡聚糖G100(Sephadex G100)的一种或几种,用上述配制的凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,收集已得到充分溶胀的凝胶。
三、抗体的选择:
选择IgM性质的抗A单克隆抗体,效价同比检测不低于抗A国家参考品检测结果。
选择IgM性质的抗B单克隆抗体,效价同比检测不低于抗B国家参考品检测结果。
选择IgM性质的RhD血型抗D单克隆抗体,效价≥1:64,与DVI抗原反应为阴性。
四、凝胶配制:
将第二项中制备的凝胶与第三项中的各项抗体混合,混合比例为2∶1~4∶1(w∶w),分别配制成含有IgM性质的抗A单克隆抗体的特异性凝胶,含有IgM性质的抗B单克隆抗体的特异性凝胶,含有IgM性质的RhD血型抗D单克隆抗体的特异性凝胶;将将第二项中制备的凝胶与第一项中的凝胶介质缓冲液充分混合,混合比例为2∶1~4∶1(w∶w),配制成中性凝胶。
五、分装:
按照每管25-30ul的量,将第四步中配制的各种凝胶分别加入到含有8个微柱管的空白微柱凝胶卡中,制备成具有8个微柱凝胶管的ABO/RhD血型抗原检测卡。
六、封口:
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶卡上口密封,贴相标识,2人份/卡,保存于2-25℃。
七、产品技术参数:
ABO/RhD血型抗原检测试剂卡2-25℃室温条件下保存,有效期为一年,在有效期内,ABO/RhD血型抗原检测卡具有如下技术标准:
1、外观:ABO/RhD血型抗原检测卡中抗A特异性凝胶呈均匀蓝色或淡蓝色,ABO/RhD血型抗原检测卡中抗B特异性凝胶呈均匀黄色或淡黄色,ABO/RhD血型抗原检测卡中抗D特异性凝胶呈均匀乳白色,ABO/RhD血型抗原检测卡中中性凝胶呈均匀乳白色,胶面上端有1-5mm澄清透明液体,凝胶之间无气泡或其他异物。
2、灵敏度:含相应抗体的特异性凝胶管中,与具有相应抗原的红细胞产生≥3+的凝集,凝集的红细胞集中出现在凝胶上层表面,并呈现直线型。
3、特异性:含相应抗体的特异性凝胶管中,与具有相应抗原的红细胞产生凝集反应,凝集的红细胞集中出现在凝胶上层表面,并呈现直线型,与不含有相应抗原的红细胞产生非凝集的阴性反应,红细胞可全部通过凝胶达到微管底部,沉积在微管底部;中型凝胶中直接加入红细胞试剂,则红细胞可全部通过凝胶达到微管底部,沉积在微管底部,呈阴性反应。
八、产品的使用方法:
1、ABO/RhD血型抗原检测卡具有8个凝胶管,每张检测卡可检定2人份标本,其中第一和第五管为抗A特异性凝胶,第二和第六管为抗B特异性凝胶,第三和第七管为RhD血型抗D特异性凝胶,第四和第八管为中性凝胶,用于阴性对照检测。
2、分离全血中的人血红细胞和血清(或血浆),用生理盐水或LISS溶液将待检红细胞配制成0.8-1%(体积百分比)红细胞溶液,待用。
3、取第2步中的待检红细胞溶液50ul,分别加入第一、二、三、四或第五、六、七、八管中。
4、混匀后,用微柱凝胶卡专用离心机离心,900rpm、2min,1500rpm、3min,取出,肉眼判读结果并记录。
5、结果判读:红细胞悬浮于凝胶表面或凝胶中为阳性结果,红细胞全部沉降至微管底部为阴性结果。结果判读标准:相见表1或图1
表1:ABO/RhD:血型抗原检测卡结果判读标准
注:+为阳性或凝集,-为阴性或不凝集。
6、血型判定结果详见表2:
表2:ABO/RhD血型抗原检测卡结果判读表(每卡上的两人份检测结果判断标准相同):
注:+为阳性或凝集,-为阴性或不凝集。
九、ABO/RhD血型抗原检测卡发明的优点:
1、ABO/RhD血型定性检测试剂卡技术增加了阴性对照检测,最大程度上避免因标本异常造成的结果误判,进而确保检测结果更为准确可靠。
2、选择交联葡聚糖(Sephadex G)作为凝胶介质。交联葡聚糖凝胶是将纯化后的线性葡聚糖(a-1,b-吡喃型葡聚糖)与环氧氯丙烷反应,再导入丙三醇侧链而在葡聚糖链间形成交联链,再将所得的凝胶制成直径不同的球形,所得三维实体在水中能溶胀而不能溶解,交联度越高,凝胶孔径越小,凝胶的溶胀度不因盐和洗涤剂的存在而受影响,葡聚糖凝胶并不熔融,可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响其性质。交联葡聚糖相对其他类型的凝胶性质更为稳定,进口商品化的交联葡聚糖选择避免了在生产过程中制备交联凝胶而造成孔径、颗粒不均一,进而影响产品质量。
3、采用微量的磷酸钾盐、钠盐组成具有很强缓冲能力的缓冲液,调整pH值为6.6-6.8,与输血领域常用的单一枸橼酸缓冲体系相比,具有更强的缓冲能力,利于保持整个反应系统的缓冲范围,保证缓冲介质的离子强度,并维持低离子溶液状态,保持交联葡聚糖凝胶的充分溶胀,使其孔径及粒径在要求的范围内。
4、采用低浓度的牛血清白蛋白和PEG做为特异的润滑体系,是红细胞通过交联葡聚糖凝胶间隙时可以获得适宜的润滑能力,并维持交联葡聚糖凝胶空隙的稳定,使凝集的红细胞无法通过凝胶间隙聚集,而未凝集的红细胞顺利通过交联葡聚糖凝胶间隙。
5、为保证ABO/RhD血型抗原检测卡的稳定性,在检测卡制备的过程中,需严格筛选交联葡聚糖凝胶、特异性抗原或抗体原材料,使其标准化,并通过严格的制备程序保证产品质量,使检测结果更为准确。
综上所述,ABO/RhD血型抗原检测卡技术的发明不仅具有了优异的灵敏度、特异性及长达一年的室温储藏保质期,更增加了阴性对照反应,最大程度上避免因疾病等原因使标本异常而造成结果误判,进而确保检测结果更为准确可靠。
附图说明:
图1:ABO/RhD血型抗原检测试剂卡结果判读标准图
具体实施方式:
以下通过实施例进一步说明本发明,主要在于帮助阅读者更好的理解本发明,不作为对本发明的限制。
实施例1:
一、凝胶悬浮介质缓冲液的配制:凝胶悬浮介质缓冲液的配方如下:
以上试剂用纯化水溶解,调整pH值为6.6-6.8。
二、凝胶制备:
选用进口商品化的交联葡聚糖G50(Sephadex G50),用上述配制的凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,收集已得到充分溶胀的凝胶。
三、抗体的选择:
选择IgM性质的抗A单克隆抗体,效价同比检测不低于抗A国家参考品检测结果。
选择IgM性质的抗B单克隆抗体,效价同比检测不低于抗B国家参考品检测结果。
选择IgM性质的RhD血型抗D单克隆抗体,效价≥1:64,与DVI抗原反应为阴性。
四、凝胶配制:
将第二项中制备的凝胶与第三项中的各项抗体混合,混合比例为2∶1(w∶w),分别配制成含有IgM性质的抗A单克隆抗体的特异性凝胶,含有IgM性质的抗B单克隆抗体的特异性凝胶,含有IgM性质的RhD血型抗D单克隆抗体的特异性凝胶;将将第二项中制备的凝胶与第一项中的凝胶介质缓冲液充分混合,混合比例为2∶1(w∶w),配制成中性凝胶。
五、分装:
按照每管28ul的量,将第四步中配制的各种凝胶分别加入到含有8个微柱管的空白微柱凝胶卡中,制备成具有8个微柱凝胶管的ABO/RhD血型抗原检测卡。
六、封口:
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶卡上口密封,贴相标识,2人份/卡,保存于2-25℃。
七、产品技术参数:
ABO/RhD血型抗原检测卡2-25℃室温条件下保存,有效期为一年,在有效期内,ABO/RhD血型抗原检测卡具有如下技术标准:
1、外观:ABO/RhD血型抗原检测卡中抗A特异性凝胶呈均匀蓝色或淡蓝色,ABO/RhD血型抗原检测卡中抗B特异性凝胶呈均匀黄色或淡黄色,ABO/RhD血型抗原检测卡中抗D特异性凝胶呈均匀乳白色,ABO/RhD血型抗原检测卡中中性凝胶呈均匀乳白色,胶面上端有1-5mm澄清透明液体,凝胶之间无气泡或其他异物。
2、灵敏度:含相应抗体的特异性凝胶管中,与具有相应抗原的红细胞产生≥3+的凝集,凝集的红细胞集中出现在凝胶上层表面,并呈现直线型。
3、特异性:含相应抗体的特异性凝胶管中,与具有相应抗原的红细胞产生凝集反应,凝集的红细胞集中出现在凝胶上层表面,并呈现直线型,与不含有相应抗原的红细胞产生非凝集的阴性反应,红细胞可全部通过凝胶达到微管底部,沉积在微管底部;中型凝胶中直接加入红细胞试剂,则红细胞可全部通过凝胶达到微管底部,沉积在微管底部,呈阴性反应。
实施示例2:
ABO/RhD血型抗原检测卡使用方法:
1、ABO/RhD血型抗原检测卡具有8个凝胶管,每张检测卡可检定2人份标本,其中第一和第五管为抗A特异性凝胶,第二和第六管为抗B特异性凝胶,第三和第七管为RhD血型抗D特异性凝胶,第四和第八管为中性凝胶,用于阴性对照检测。
2、分离全血中的人血红细胞和血清(或血浆),用生理盐水或LISS溶液将待检红细胞配制成0.8-1%(体积百分比)红细胞溶液,待用。
3、取第2步中的待检红细胞溶液50ul,分别加入第一、二、三、四或第五、六、七、八管中。
4、混匀后,用微柱凝胶卡专用离心机离心,900rpm、2min,1500rpm、3min,取出,肉眼判读结果并记录。
5、结果判读:红细胞悬浮于凝胶表面或凝胶中为阳性结果,红细胞全部沉降至微管底部为阴性结果。结果判读标准:相见表1或图1
表1:ABO/RhD:血型抗原检测卡结果判读标准
注:+为阳性或凝集,-为阴性或不凝集。
6、血型判定结果详见表2:
表2:ABO/RhD血型抗原检测卡结果判读表(每卡上的两人份检测结果判断标准相同):
注:+为阳性或凝集,-为阴性或不凝集。
Claims (10)
1.一种ABO/RhD血型抗原检测试剂卡,其特征在于,检测试剂卡上具有8个微柱凝胶管,其中,两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗A单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗B单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的RhD血型的抗D单克隆抗体,两个凝胶管中含凝胶悬浮介质缓冲液和凝胶。
2.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,所述凝胶是用交联葡聚糖制备的。
3.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,所述凝胶的制备是将交联葡聚糖G50、交联葡聚糖G75或交联葡聚糖G100的一种或几种用凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀制成的。
5.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,所述凝胶的制备,方法如下:选用交联葡聚糖G50、交联葡聚糖G75或交联葡聚糖G100的一种或几种,用凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,得到凝胶。
6.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,其中,所述两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗A单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗B单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的RhD血型的抗D单克隆抗体是每个凝胶管中含有凝胶和相应的单克隆抗体,两者相互混合,混合比例为2∶1~4∶1(w∶w)。
7.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,其中,所述两个凝胶管中含凝胶悬浮介质缓冲液和凝胶是每个凝胶管中含有凝胶介质缓冲液和凝胶,两者相互混合,混合比例为2∶1~4∶1(w∶w)。
8.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,其中,每管内容物的装量为25-30ul。
9.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,检测试剂卡上具有8个微柱凝胶管,其中,两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗A单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的抗B单克隆抗体、两个凝胶管中含有凝胶和IgM性质的RhD血型的抗D单克隆抗体,两个凝胶管中含凝胶悬浮介质缓冲液和凝胶。其中所述凝胶的制备,方法如下:
选用交联葡聚糖G50、交联葡聚糖G75或交联葡聚糖G100的一种或几种,用凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,得到凝胶;所述凝胶悬浮介质缓冲液,其组成如下:
以上试剂用纯化水溶解,调整pH值为6.6-6.8。在含有凝胶和相应的单克隆抗体的凝胶管中,凝胶和相应的单克隆抗体相互混合,混合比例为2∶1~4∶1(w∶w),在含有凝胶悬浮介质缓冲液和凝胶的凝胶管中,凝胶悬浮介质缓冲液和凝胶的混合比例为2∶1~4∶1(w∶w),每管内容物的装量为25-30ul。
10.权利要求1的检测试剂卡的使用方法,其特征在于,
步骤1、分离全血中的人血红细胞和血清(或血浆),用生理盐水或LISS溶液将待检红细胞配制成0.8-1%(体积百分比)红细胞溶液,待用;
步骤2、取第1步中的待检红细胞溶液50ul,分别加入第一、二、三、四或第五、六、七、八管中;
步骤3、混匀后,用微柱凝胶卡专用离心机离心,900rpm、2min,1500rpm、3min,取出,肉眼判读;
其中第一和第五管为抗A特异性凝胶,第二和第六管为抗B特异性凝胶,第三和第七管为RhD血型抗D特异性凝胶,第四和第八管为中性凝胶,用于阴性对照检测。
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