CN102692510A - 广谱抗人球蛋白试剂检测卡及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种广谱抗人球蛋白试剂检测卡及其制备,检测卡上具有8个微柱凝胶管,8个微柱凝胶管中均含有广谱抗IgG、C3D抗体试剂。
Description
技术领域:
本发明涉及一种血型检测卡及其制备方法,主要用于血型交叉配血、不规则抗体筛查、和不规则抗体鉴定等方面的应用,具体指采用微柱凝胶技术进行直接或间接的抗人球蛋白试验验,即Coombs’试验。涉及检测卡的组成、制备及其应用。
背景技术:
微柱凝胶技术,是1984年Yves lapierre发明的,1988年瑞士达亚美将专利产品推向市场。其原理是基于游离红细胞和聚集红细胞是否通过具有分子筛作用的凝胶颗粒构成的胶体介质,从而使不同状态的红细胞得以分离,是一种在微柱管中用凝胶介质进行的凝集反应。微柱凝胶广谱抗人球蛋白试剂检测卡是微柱凝胶技术和抗人球蛋白试验方法相结合的新型产品,近年得到广泛应用。微柱凝胶技术相对于传统试管法的抗人球蛋白试验,省略了繁琐的洗涤程序和在阴性反应试管中加入IgG类型抗体致敏的红细胞,用于确认阴性反应是否准确可靠的步骤,且微柱凝胶技术使用标本量小,操作简便、人为因素干扰小,易于标准化操作和自动化操作,结果易于判断,便于存放及复查等优点,适于大规模标本的检测。
在国外、已有戴安娜、达亚美、强生等厂家生产广谱抗人球蛋白试剂检测卡已广泛应用于血型鉴定、不规则抗体检测及鉴定等血型检测领域,但其均采用葡聚糖凝胶或微玻璃珠,葡聚糖凝胶颗粒为70nm以上,颗粒较大、凝胶之间缝隙较大,易使血型检测卡的灵敏度降低,而玻璃微珠之间容易产生静电,对检测过程及结果存在不同程度影响。
在国内,也已经有长春博迅、江阴力博等企业也有类似的广谱抗人球蛋白卡生产,其反应布局与国外试剂类似,但相对于国外试剂质量,存在一定的差异。
中国专利申请(申请公布号:CN 101718783A)公开了一种广谱抗人球蛋白试剂检测卡的制备方法:选用30-60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶作为凝胶介质,每个空白卡上含有6个微柱管,形成6个微柱凝胶管的检测卡。
以上国内专利选择聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶作为介质、凝胶的制备易受生产操作及环境的影响,使颗粒之间的间隙不够均匀,容易对对试剂灵敏度造成影响,使试剂质量不稳定。
发明内容:
本发明的内容旨在克服以上不足,提供一种高灵敏度、高特异性、质量稳定,满足广谱抗人球蛋白试验检测的一种试剂检测卡的制备方法。
为实现上述目的,本发明以以下设计方案进行:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡上具有8个微柱凝胶管,8个微柱凝胶管中均含有广谱抗IgG、C3D抗体试剂。
制备方法及工艺过程:
一、凝胶悬浮介质缓冲液的配制:凝胶悬浮介质缓冲液的配方如下:
以上试剂用纯化水溶解,调整pH值为6.6-6.8。
二、凝胶制备:
选用交联葡聚糖,如:进口商品化的交联葡聚糖G50(Sephadex G50)、交联葡聚糖G75(Sephadex G75)或交联葡聚糖G100(Sephadex G100)的一种或几种,用上述配制的凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,收集已得到充分溶胀的凝胶。
三、抗体的选择:
选择广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D),该试剂可以从市场上购买得到。
该试剂与IgG性质的抗D致敏红细胞产生阳性反应,与C3D抗体致敏的红细胞产生阳性反应,与既无IgG抗体又无C3D抗体致敏的红细胞产生阴性反应。
广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)灵敏度:与按照体积比1:32稀释的抗D IgG试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应;将广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)按照体积比1:2稀释后,与按照体积比1:16稀释的抗D IgG试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应,且与C3D抗体试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应。
四、凝胶配制:
将第二项中制备的凝胶与第三项中的抗体混合,混合比例为2:1~4:1,配制成含广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)的特异性凝胶。
五、分装:
按照每管25-30ul的量,将第四步中配制的各种凝胶分别加入到含有8个微柱管的空白微柱凝胶卡中,制备成具有8个微柱凝胶管的广谱抗人球蛋白试剂检测卡。
六、封口:
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶卡上口密封,贴相标识,保存于2-25℃。
七、产品技术参数:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡2-25℃室温条件下保存,有效期为一年,在有效期内,广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡具有如下技术标准:
1、外观:广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡检测卡的微管内凝胶呈均匀的淡蓝绿色或乳白色,胶面上端有1-5mm澄清透明液体,凝胶之间无气泡或其他异物。
2、灵敏度:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡灵敏度:与按照体积比1:32稀释的抗D IgG试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应;检测Rh血型系统的IgG型抗D抗体效价和Duffy系统的IgG型抗Fya抗体效价均不低于同步间接抗人球蛋白试管法测定结果;检测补体或C3D抗体致敏的红细胞产生阳性反应。
3、特异性:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡中抗IgG组分特异性:检测Rh血型系统的IgG型抗D抗体,与O型RhD阳性红细胞产生阳性凝集反应,而与O型RhD阴性红细胞产生阴性反应;检测Duffy系统的IgG型抗Fya抗体,与O型Fya阳性红细胞产生阳性凝集反应,而与O型Fya阴性红细胞产生阴性反应。广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡中抗C3D组分特异性:与C3D抗体致敏的红细胞产生阳性反应,与既无IgG型抗体又无C3D致敏的红细胞产生阴性反应。
八、产品的使用方法:
1、广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡具有8个凝胶管,其中第一和第七管用于检测待测标本,第八管用于正常人红细胞的阴性对照检测。
2、分离全血中的人血红细胞和血清(或血浆),用生理盐水或LISS溶液将待检红细胞配制成0.8-1%(体积百分比)红细胞溶液,待用。
3、直接抗人球蛋白试验(DAT):
3.1取待检红细胞溶液50ul加入第一至第七号管中,第八号管中加入0.8-1%(体积百分比)正常人红细胞溶液50ul,做为阴性对照.
3.2用专用离心机离心,900rpm 2min,1500rpm 3min,取出肉眼判定结果。
3.3结果判定:第八号管呈阴性反应,实验结果成立,第一至第七号管中呈阴性结果的,表明红细胞标本在体内未被致敏;第一至第七号管中呈阳性结果的,表明红细胞标本在体内已被致敏;反之实验结果不成立。
4、间接抗人球蛋白试验(IAT)
4.1取0.8-1%标准O型红细胞溶液分别加入第一至第八号管中,每管50ul。
4.2取待检血清25-50ul加入第一至第七号管中,第八号管中加入AB型人阴性对照血清25-50ul。
4.3加样后的试剂卡,置37℃孵育器中15分钟.
4.4用专用离心机离心,900rpm 2min,1500rpm 3min,取出肉眼判定结果。
4.5结果判定:第八号管呈阴性反应,实验结果成立,第一至第七号管中呈阴性结果的,表明被检血清中不含有该标准O型红细胞抗原特异性的不完全抗体;第一至第七号管中呈阳性结果的,表明被检者血清中含有该标准O型红细胞抗原特异性的不完全抗体;反之实验结果不成立。
5、结果判读标准:红细胞悬浮于凝胶表面或凝胶中为阳性结果,红细胞全部沉降至微管底部为阴性结果。结果判读标准:详见表1或图1
表1:广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡结果判读标准
注:+为阳性或凝集,-为阴性或不凝集。
九、广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡发明的优点:
1、广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡技术增加了阴性对照检测,最大程度上避免因标本异常造成的结果误判,进而确保检测结果更为准确可靠。
2、选择交联葡聚糖(Sephadex G)作为凝胶介质。交联葡聚糖凝胶是将纯化后的线性葡聚糖(a-1,b-吡喃型葡聚糖)与环氧氯丙烷反应,再导入丙三醇侧链而在葡聚糖链间形成交联链,再将所得的凝胶制成直径不同的球形,所得三维实体在水中能溶胀而不能溶解,交联度越高,凝胶孔径越小,凝胶的溶胀度不因盐和洗涤剂的存在而受影响,葡聚糖凝胶并不熔融,可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响其性质。交联葡聚糖相对其他类型的凝胶性质更为稳定,进口商品化的交联葡聚糖选择避免了在生产过程中制备交联凝胶而造成孔径、颗粒不均一,进而影响产品质量。
3、采用微量的磷酸钾盐、钠盐组成具有很强缓冲能力的缓冲液,调整pH值为6.6-6.8,与输血领域常用的单一枸橼酸缓冲体系相比,具有更强的缓冲能力,利于保持整个反应系统的缓冲范围,保证缓冲介质的离子强度,并维持低离子溶液状态,保持交联葡聚糖凝胶的充分溶胀,使其孔径及粒径在要求的范围内。
4、采用低浓度的牛血清白蛋白和PEG做为特异的润滑体系,是红细胞通过交联葡聚糖凝胶间隙时可以获得适宜的润滑能力,并维持交联葡聚糖凝胶空隙的稳定,使凝集的红细胞无法通过凝胶间隙聚集,而未凝集的红细胞顺利通过交联葡聚糖凝胶间隙。
5、为保证广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡的稳定性,在检测卡制备的过程中,需严格筛选交联葡聚糖凝胶、特异性抗原或抗体原材料,使其标准化,并通过严格的制备程序保证产品质量,使检测结果更为准确。
综上所述,广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡技术的发明不仅具有了优异的灵敏度、特异性及长达一年的室温储藏保质期,更增加了阴性对照反应,最大程度上避免因疾病等原因使标本异常而造成结果误判,进而确保检测结果更为准确可靠。
附图说明:
图1:广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡结果判读标准图
具体实施方式:
以下通过实施例进一步说明本发明,主要在于帮助阅读者更好的理解本发明,不作为对本发明的限制。
实施例1:
一、凝胶悬浮介质缓冲液的配制:凝胶悬浮介质缓冲液的配方如下:
以上试剂用纯化水溶解,调整pH值为6.6-6.8。
二、凝胶制备:
选用进口商品化的交联葡聚糖G50(Sephadex G50),用上述配制的凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,收集已得到充分溶胀的凝胶。
三、抗体的选择:
选择广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)。
该试剂与IgG性质的抗D致敏红细胞产生阳性反应,与C3D抗体致敏的红细胞产生阳性反应,与既无IgG抗体又无C3D抗体致敏的红细胞产生阴性反应。
广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)灵敏度:与按照体积比1:32稀释的抗D IgG试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应;将广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)按照体积比1:2稀释后,与按照体积比1:16稀释的抗D IgG试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应,且与C3D抗体试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应。
四、凝胶配制:
将第二项中制备的凝胶与第三项中的抗体混合,混合比例为2:1,配制成含广谱的抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)的特异性凝胶。
五、分装:
按照每管28ul的量,将第四步中配制的各种凝胶分别加入到含有8个微柱管的空白微柱凝胶卡中,制备成具有8个微柱凝胶管的广谱抗人球蛋白试剂检测卡。
六、封口:
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶卡上口密封,贴相标识,保存于2-25℃。
七、产品技术参数:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡2-25℃室温条件下保存,有效期为一年,在有效期内,广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡具有如下技术标准:
1、外观:广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡检测卡的微管内凝胶呈均匀的淡蓝绿色或乳白色,胶面上端有1-5mm澄清透明液体,凝胶之间无气泡或其他异物。
2、灵敏度:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡灵敏度:与按照体积比1:32稀释的抗D IgG试剂致敏的红细胞反应,产生肉眼可见的凝集反应;检测Rh血型系统的IgG型抗D抗体效价和Duffy系统的IgG型抗Fya抗体效价均不低于同步间接抗人球蛋白试管法测定结果;检测补体或C3D抗体致敏的红细胞产生阳性反应。
3、特异性:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡中抗IgG组分特异性:检测Rh血型系统的IgG型抗D抗体,与O型RhD阳性红细胞产生阳性凝集反应,而与O型RhD阴性红细胞产生阴性反应;检测Duffy系统的IgG型抗Fya抗体,与O型Fya阳性红细胞产生阳性凝集反应,而与O型Fya阴性红细胞产生阴性反应。广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡中抗C3D组分特异性:与C3D抗体致敏的红细胞产生阳性反应,与既无IgG型抗体又无C3D致敏的红细胞产生阴性反应。
实施示例2:
广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡的使用方法:
1、广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡具有8个凝胶管,其中第一和第七管用于检测待测标本,第八管用于正常人红细胞的阴性对照检测。
2、分离全血中的人血红细胞和血清(或血浆),用生理盐水或LISS溶液将待检红细胞配制成0.8-1%(体积百分比)红细胞溶液,待用。
3、直接抗人球蛋白试验(DAT):
3.1取待检红细胞溶液50ul加入第一至第七号管中,第八号管中加入0.8-1%(体积百分比)正常人红细胞溶液50ul,做为阴性对照.
3.2用专用离心机离心,900rpm 2min,1500rpm 3min,取出肉眼判定结果。
3.3结果判定:第八号管呈阴性反应,实验结果成立,第一至第七号管中呈阴性结果的,表明红细胞标本在体内未被致敏;第一至第七号管中呈阳性结果的,表明红细胞标本在体内已被致敏;反之实验结果不成立。
4、间接抗人球蛋白试验(IAT)
4.1取0.8-1%标准O型红细胞溶液分别加入第一至第八号管中,每管50ul。
4.2取待检血清25-50ul加入第一至第七号管中,第八号管中加入AB型人阴性对照血清25-50ul。
4.3加样后的试剂卡,置37℃孵育器中15分钟.
4.4用专用离心机离心,900rpm 2min,1500rpm 3min,取出肉眼判定结果。
4.5结果判定:第八号管呈阴性反应,实验结果成立,第一至第七号管中呈阴性结果的,表明被检血清中不含有该标准O型红细胞抗原特异性的不完全抗体;第一至第七号管中呈阳性结果的,表明被检者血清中含有该标准O型红细胞抗原特异性的不完全抗体;反之实验结果不成立。
5、结果判读标准:红细胞悬浮于凝胶表面或凝胶中为阳性结果,红细胞全部沉降至微管底部为阴性结果。结果判读标准:详见表2或图1
表2:广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG、C3D)检测卡结果判读标准
Claims (9)
1.一种广谱抗人球蛋白试剂检测卡,其特征在于,检测试剂卡上具有8个微柱凝胶管,8个微柱凝胶管中均含有凝胶和广谱抗IgG、C3D抗体。
2.根据权利要求1的检测卡,其特征在于,所述凝胶是用交联葡聚糖制备的。
3.根据权利要求1的检测试剂卡,其特征在于,所述凝胶的制备是将交联葡聚糖G50、交联葡聚糖G75或交联葡聚糖G100的一种或几种用凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀制成的。
5.根据权利要求1的检测卡,其特征在于,所述凝胶的制备,方法如下:
选用交联葡聚糖G50、交联葡聚糖G75或交联葡聚糖G100的一种或几种,用凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,得到凝胶。
6.根据权利要求1的检测卡,其特征在于,其中,所述凝胶管中含有凝胶和广谱抗IgG、C3D抗体是每个凝胶管中含有凝胶和广谱抗IgG、C3D抗体,两者相互混合,混合比例为2:1~4:1(w :w)。
7.根据权利要求1的检测卡,其特征在于,其中,每管内容物的装量为25-30ul。
8.根据权利要求1的检测卡,其特征在于,检测试剂卡上具有8个微柱凝胶管,8个微柱凝胶管中均含有凝胶和广谱抗IgG、C3D抗体,其中所述凝胶的制备,方法如下:
选用交联葡聚糖G50、交联葡聚糖G75或交联葡聚糖G100的一种或几种,用凝胶悬浮介质缓冲液充分溶胀交联葡聚糖,然后用悬浮介质洗涤5次,去除凝胶碎片及不完全溶胀的凝胶,得到凝胶;所述凝胶悬浮介质缓冲液,其组成如下:
以上试剂用纯化水溶解,调整pH值为6.6-6.8。
在含有凝胶和相应的广谱抗IgG、C3D抗体的凝胶管中,凝胶和相应的广谱抗IgG、C3D抗体相互混合,混合比例为2:1~4:1(w:w),每管内容物的装量为25-30ul。
9.权利要求1的检测卡的使用方法,其特征在于,
步骤1、分离全血中的人血红细胞和血清(或血浆),用生理盐水或LISS溶液将待检红细胞配制成0.8-1%(体积百分比)红细胞溶液,待用。
步骤2、直接抗人球蛋白试验(DAT):
取待检红细胞溶液50ul加入第一至第七号管中,第八号管中加入0.8-1%(体积百分比)正常人红细胞溶液50ul,做为阴性对照.
用专用离心机离心,900rpm 2min,1500rpm 3min,取出,判定结果。
或,
步骤2、间接抗人球蛋白试验(IAT):
取0.8-1%标准O型红细胞溶液分别加入第一至第八号管中,每管50ul,取待检血清25-50ul加入第一至第七号管中,第八号管中加入AB型人阴性对照血清25-50ul。加样后的试剂卡,置37℃孵育器中15分钟.用离心机离心,900rpm2min,1500rpm 3min,取出,判定结果。
其中第一和第七管用于检测待测标本,第八管用于正常人红细胞的阴性对照检测。
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