CN105891509A - 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统 - Google Patents

用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统 Download PDF

Info

Publication number
CN105891509A
CN105891509A CN201610286029.XA CN201610286029A CN105891509A CN 105891509 A CN105891509 A CN 105891509A CN 201610286029 A CN201610286029 A CN 201610286029A CN 105891509 A CN105891509 A CN 105891509A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lca
emulsion particle
alpha
afp
fetoprotein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610286029.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105891509B (zh
Inventor
肖智
李全
焦守恕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tarcine BioMed Inc
Original Assignee
Tarcine BioMed Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tarcine BioMed Inc filed Critical Tarcine BioMed Inc
Priority to CN201610286029.XA priority Critical patent/CN105891509B/zh
Publication of CN105891509A publication Critical patent/CN105891509A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105891509B publication Critical patent/CN105891509B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/471—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统，涉及医用试剂领域。所述侧向层析系统沿层析方向依次包括：样本区和结合区；所述样本区涂布有凝集素活化的乳胶微粒，用于结合液体样品中的甲胎蛋白异质体；所述结合区上涂布有胶体金结合物，用于结合液体样品中的甲胎蛋白；所述凝集素活化的乳胶微粒在所述样本区上的涂布浓度为2.5～50ug/cm2；所述凝集素为小扁豆凝集素。本发明的侧向层析系统操作简单、方便快速、成本低廉，AFP‑L3分离与测定一步实现，效率更高。

Description

用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统
技术领域
本发明属于医药制剂领域，具体涉及一种用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统。
背景技术
一般认为，甲胎蛋白(AFP)是HCC(hepatocellular carcinoma，肝细胞癌)相对特异的肿瘤标志物，AFP持续升高是发生HCC的危险因素。目前，有些欧美学者认为AFP的敏感性和特异度不高，2010版美国肝病研究学会(AASLD)指南已不再将AFP作为筛查指标，但是我国的HCC大多与HBV(乙肝病毒)感染相关，与西方国家HCC致病因素不同(多为HCV、酒精和代谢性因素)，结合国内随机研究(RCT)结果和实际情况，对HCC的常规监测筛查指标中继续保留AFP。
血清AFP及其异质体是诊断肝癌的重要指标和特异性最强的肿瘤标记物，国内常用于肝癌的普查、早期诊断、术后监测和随访。对于AFP≥400μg/L超过1个月，或≥200μg/L持续2个月，并能排除其他原因引起的AFP升高，这种情况一般包括妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及继发性肝癌等。但是尚有30％-40％的肝癌病人AFP检测呈阴性，包括ICC(ntrahepaticcholangiocarcinoma，肝内胆管癌)、高分化和低分化HCC，或HCC已坏死液化者，AFP均可不增高。因此，仅靠AFP不能诊断所有的肝癌，AFP对肝癌诊断的阳性率一般为60％-70％，有时差异较大。
近年来，国内外临床观察和研究结果均提示，血清AFP在部分ICC和胃肠癌肝转移患者中也可升高，并且ICC也多伴有肝硬化。尽管ICC的发病率远低于HCC，但两者均常见于肝硬化患者，因此，肝占位性病变伴AFP升高并不一定就是HCC，仍需进一步鉴别。
AFP是一个单链糖蛋白，不同的肝病患者产生的血清AFP的糖链结构不同，根据与小扁豆凝集素亲和力不同，AFP可以分成3种类型：AFP-L1由良性病变肝细胞分泌，AFP-L2，来自孕妇，而AFP-L3则为恶性癌细胞产生，即通常所说的甲胎蛋白异质体。AFP-L3是肝癌诊断的高特异指标，被称为新一代肝癌标志物。FDA于2005年批准该指标应用于肝癌预警，并把AFP-L3诊断肝癌的阳性界定值为10％。1999年第四届全国癌症学术会议将AFP-L3列为原发性肝癌临床诊断标准的肝癌标记物之一。被公认为是比单纯的AFP更为特异的原发性肝癌指标。
鉴别肝癌与良性肝病。原发性肝癌患者AFP常升高，但许多良性肝脏疾病也可有AFP升高，单凭AFP结果有时很难区分良、恶性病变。此时AFP异质体检测就具有良好的临床意义，尤其对于AFP在30-400ng/ml之间者具有较好的价值。Yozhiaki对361例肝硬化进行了前瞻性研究，在53例AFP在30ug几以上的患者中，2年以后21例发展为肝癌，确诊肝癌时39％的患者AFP在400ug/L以下。对比研究开始时肝细胞肝癌(HCC)组与非HCC组AFP测定值，未发现差异有显著性，研究发现病变时AFP异质体的类型有所不同，对HCC诊断LCA阳性率87.12％，假阳性率21.5％，ConA阳性率89.17％，假阳性率17.15％。目前的研究结果把AFP-L3含量大于10％作为肝癌的阳性指标。
肝癌术后的监测。肝癌切除术后，血清AFP含量随之下降，其下降速度取决于体内残留AFP量及半衰期，一般2月内转阴，转阴时AFP异质体随之消失。如果AFP明显下降但不转阴，异质体变化不明显，则提示手术不彻底，可能还存在边缘残留、血管癌检、卫星结节或转移等。如果异质体下降至25％以下，AFP和异质体浓度相对恒定，则可能是患者有肝炎或肝硬化所致。
胚胎异常发育及胎儿先天性疾患。正常妊娠期母体血清中AFP与胚胎中AFP处于平衡状态，一旦胎儿畸形或胎盘屏障发生异常，可导致胎儿血清渗入羊水中或羊水渗入母体血清，造成母体羊水或血清AFP急剧升高。但仅仅测定AFP总量有一定的局限性。实验表明神经管缺损、无脑儿或脊柱裂等，儿童肝母细胞瘤、胆道闭锁、性腺肿瘤、恶性崎胎瘤等可有AFP和/或AFP异质体的阳性。
AFP-L3是唯一由患者肝脏中癌细胞生成的蛋白。在加拿大和美国的一项多中心、前瞻性、双盲、长期临床试验中，对该检测方法进行了研究。结果显示AFP-L3％升高(15％以上)的患者，在接下来的21个月中，发生肝细胞癌的危险增加7倍之多。根据已有的肝细胞癌肿瘤学实践指南，这些患者肝细胞癌发生率极端增高。
目前，AFP-L3检测方法有检测方法有植物凝集素亲和免疫电泳技术、i30检测系统技术及热景生物糖基捕获离心柱前处理技术。其中植物凝集素亲和免疫电泳技术和i30检测系统技术要求高、操作繁琐、试剂昂贵，限制了其临床应用。而糖基捕获离心柱，由于样本处理和检测分开进行，增加了操作的繁琐性。
侧向层析技术：免疫层析按其原理可分为两类，一类是以酶促反应显色为基础，以显色高度来定量；另一类则使用着色标记物如乳胶微粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等。层析时，标记物与待测物反应形成的复合物被相应的固定在层析材料上的配体捕获而富集显色，根据层析材料上显色条带的有无或多少来定性或定量。以酶促反应显色为基础的免疫层析技术由于待测物的定量是以试纸条上的酶活性为依据，故其测量结果受酶稳定性以及样品基质、pH值、温育时间和温度等环境因素的影响。
免疫胶体金技术是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。80年代出现在临床诊断领域的胶体金免疫层析(colloidal goldimmunochromatography assay，GICA)快速诊断试纸条是建立在金标免疫渗滤基础上的一种免疫检测技术。它具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、携带方便等优点，己成为临床实验诊断领域发展的一个新方向。
综上，本领域亟需开发一种可快速便捷、成本低廉地完成定量检测AFP-L3的试剂盒。
发明内容
根据上述领域存在的缺陷和需求，本发明提供一种以甲胎蛋白异质体为目标蛋白的测定系统。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种用于捕获甲胎蛋白异质体的小扁豆凝集素活化乳胶微粒，其特征在于，是通过小扁豆凝集素活化而得，其中乳胶微粒与小扁豆凝集素的投料比例为1mg：25-60ug。该乳胶微粒可用于层析系统中，在用小扁豆凝集素活化乳胶微粒时，二者通过EDC法共价偶联，偶联后的小扁豆凝集素存在一定程度的空间构象变化，从而影响后续与甲胎蛋白异质体的亲和程度，因此要保证偶联上乳胶微粒的小扁豆凝集素在结合甲胎蛋白异质体AFP-L3的亲和力，就必须控制好活化时小扁豆凝集素与乳胶微粒的用量比例；太低会使有限量的小扁豆凝集素在偶联乳胶微粒后，变得不易与AFP-L3结合，亲和力低；太高则会导致过量的小扁豆凝集素，从而产生非特异性结合AFP-L3以外的甲胎蛋白。采用上述投料比例的小扁豆凝集素活化的乳胶微粒(MP-LCA)，不仅能够特异性地捕获AFP-L3，从而使AFP-L3与AFP分开，同时还能保证MP-LCA结合AFP-L3的亲和力，从而确保检测结果的特异性和准确性。
在进一步的实施例中，所述乳胶微粒的粒径2.0μm，适合于用在侧向层析技术检测甲胎蛋白异质体的技术中，固定在网状结构样本垫中。
在另一些实施例中，还提供所述小扁豆凝集素活化乳胶微粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)乳胶微粒活化
1).取乳胶Latex MP，用1mL MES缓冲液洗涤去上清；
2).将Latex MP用440μL MES缓冲液重悬。
3).加入10μL10mg/mL EDC溶液，充分混匀，缓慢振摇，室温30min；
4).3000rmp，离心5min，去除上清，并用1mLMES缓冲液洗涤3次去上清得到活化的乳胶微粒；
(2)乳胶微粒包被
1).用300μL pH 5.0,25mM MES重悬lmgLatex MP；
2).加入小扁豆凝集素溶液；
3).用25mM MES使反应体系定容为500μL，充分混匀；
4).缓慢振摇，室温30-120min或4℃2小时；
5).离心去除上清得到小扁豆凝集素活化的乳胶微粒，
上述包被过程中，所述小扁豆凝集素与乳胶微粒的投料比例为25-60ug：1mg。上述乳胶微粒的制备方法是在原有步骤的基础上进行了投料浓度比例的改进，本发明通过实验得知，采用上述投料比例的小扁豆凝集素与乳胶微粒进行混合、包被、活化获得的MP-LCA，能够更为特异地捕获AFP-L3，从而使AFP-L3与AFP分开，从而保证检测结果的特异性和准确性。
在进一步的实施例中，所述扁豆凝集素与乳胶微粒的投料比例为50ug：1mg。该比值是经实验验证的，从上述投料比例的范围中进一步优选的投料比例数值，采用该比值进行活化、包被，效果最优。
本发明的另一些实施例还提供了用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统，沿层析方向依次包括：样本区、结合区；
所述样本区包含所述的小扁豆凝集素活化的乳胶微粒，所述小扁豆凝集素活化的乳胶微粒的使用量为2.5～50ug/cm2，优选地，所述小扁豆凝集素活化的乳胶微粒的使用量为10ug/cm2。
所述结合区涂布有胶体金结合物，所述胶体金结合物指胶体金标记的甲胎蛋白抗体，用于结合样品中的甲胎蛋白。
采用本发明提供的上述侧向层析系统，能特异捕获AFP-L3、从而有效地将AFP-L3从AFP中分离，上述使用量是经涂布浓度选自实验获得，采用上述2.5～50ug/cm2的小扁豆凝集素活化的乳胶微粒涂布样本垫，能获得90％-110％的结合效率。而采用10ug/cm2的使用量能使结合效率达到100％。
在进一步的实施例中，所述侧向层析系统，还包括检测区；所述样本区、结合区、检测区沿层析方向依次排布；所述检测区设有检测线和对照线；所述检测线包被有羊抗鼠抗体；所述对照线包被有甲胎蛋白抗体；所述检测线和对照线垂直于层析方向且不重叠。
上述检测区主要起质量控制的作用，用于指示检测结果是否存在假阳性，用于提高侧向层析系统检测的可靠性。
在一些具体的实施例中，所述甲胎蛋白抗体在所述胶体金结合物中的浓度为0.4mg/ml；所述羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL；所述甲胎蛋白抗体浓度为1mg/mL。在所述侧向层析系统中采用上述浓度的抗体进一步保证了检测结果的准确性和可靠性。
本发明还请求保护所述侧向层析系统的制备方法，其特征在于，包括制备样本垫和结合垫：
所述样本垫上涂布有所述的小扁豆凝集素活化的乳胶微粒；
所述结合垫涂布甲胎蛋白抗体的胶体金结合物。
采用上述制备方法可制备出特异性和准确性都较高的定量检测样品中甲胎蛋白异质体的侧向层析系统。该系统具体可以是试纸条、检测芯片、试剂盒等。
进一步地，所述制备方法，还包括制备检测区；
所述样本垫、结合垫、检测区沿层析方依次排布；
所述检测区设有检测线和对照线；
所述检测线包被有羊抗鼠抗体；
所述对照线包被有甲胎蛋白抗体；
所述检测线和对照线垂直于层析方向且不重叠。
上述检测区主要起质量控制的作用，用于指示检测结果是否存在假阳性，用于提高侧向层析系统检测的可靠性。
在一些具体的实施例中，所述小扁豆凝集素活化的乳胶微粒在所述样本垫上的涂布浓度为2.5-50ug/cm2，该涂布浓度范围能获得90％-110％的结合效率，涂布浓度进一步优选为10ug/cm2，这种情况下的结合效率最优，可达100％。
所述甲胎蛋白抗体在所述胶体金结合物中的浓度为0.4mg/ml；所述羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL；所述甲胎蛋白抗体浓度为1mg/mL。在制备过程中采用上述浓度的抗体，可进一步保证所制备出的侧向层析系统的检测结果的准确性和可靠性。
本发明所述侧向层析系统的工作原理如下：甲胎蛋白异质体(AFP-L3)是一种糖链上含岩藻糖的糖基化蛋白，因此可以与植物或微生物凝集素亲和结合。该测定系统选用小扁豆凝集素(LCA)与乳胶微粒用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)法共价偶联，形成稳定的共价化学键，获得活性乳胶微粒。将一定量的活性乳胶微粒处理网状结构的样本垫，活化的乳胶微粒将会固定于样本垫。由于样本中的AFP-L3与凝集素的亲和结合作用，泳动速度降低，进而与AFP-L1、AFP-L2分离，AFP-L1、AFP-L2然后通过与金标结合物的结合、T线和C线的捕获，最后根据T线和C线的吸光度计算出样本中AFP-L1、AFP-L2的总浓度。若AFP浓度已知，便可间接计算得出AFP-L3浓度。
本发明基于网状结构样本垫可以固定一定粒径乳胶微粒(粒径2.0μm)、侧向层析分离技术以及AFP-L3与植物凝集素的亲和结合作用，提供一种改进的甲胎蛋白异质体测定系统。为了提高AFP-L3分离效果，实验从包被凝集素种类和浓度进行优化，获得用于特异的检测甲胎蛋白异质体的含量侧向层析试纸条。
基于上述的分离原理，将样本垫固定有其它凝集素活化的乳胶微粒可用于其它糖蛋白的分离。
由于AFP-L3是甲胎蛋白的岩藻糖糖基化形式，因此欲实现对AFP-L3的定量测定，需将其从甲胎蛋白中分离，然后进行测定。而本发明提供了一种简便、快速的定量测定AFP-L3的侧向层析系统。其原理是利用样本垫上固定的植物凝集素捕获样本中的
AFP-L3，使其与AFP-L1和AFP-L2分离，同时利用金标侧向层析系统测定AFP-L1和AFP-L2的浓度，进而可以计算出样本中AFP-L3的浓度。采用本发明所述的侧向层析系统检测液体样本中的AFP-L3，操作简单、方便快速、成本低廉，结果准确，AFP-L3分离与测定一步实现，效率更高。
附图说明
图1为本发明所述侧向层析系统及其组成的示意图。由左至右，从上至下依次由样本垫、结合垫、T线、C线、NC膜、吸水垫、PVC衬板、卡盒组成；流动方向为由左至右。样本垫上含有凝集素活化的乳胶微粒(MP-Lectin)；结合垫上含有胶体金结合物(CG-Ab)。
图2为NC膜T/C线包被示意图。C线(对照线)为羊抗鼠抗体包被的NC膜；T线(检测线)为AFP抗体包被的NC膜。
图3为不同凝集素对糖蛋白糖链的特异性柱状图。横坐标为不同的凝集素：LPH：菜豆凝集素；LCA：小扁豆凝集素；LUE：荆豆凝集素；ConA：刀豆凝集素。纵坐标为凝集素对糖蛋白糖链的特异性百分比(％)。
图4为不同浓度的凝集素活化的乳胶微粒(MP-LCA)包被条件下AFP-L3的结合效率。横坐标为MP-LCA的浓度(ug/ml)，纵坐标为AFP-L3的结合效率(％)。
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细说明本发明，这并不限制本发明的范围。
试剂与耗材
乳胶颗粒：活性Latex MP(Latex MP)：粒径2.0μm,39510001，Merck；
25mM MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸(sigma，M3671)缓冲液：称取4.88gMES于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH5.0，定容至1L。
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)购自sigma，货号39391；
小扁豆凝聚素(LCA)购自Sigma，货号L9627；
LCA溶液：1mg/ml，溶于25mM MES缓冲液中，pH5.0；
菜豆(Phaseolus vulgaris)凝集素(LPH，Sigma-61764)；
荆豆(Ulexeuropaeus)凝集素(LUE，Sigma-L5505)；
刀豆(Canavaliaensiformis)凝集素(ConA，Sigma-61760)；
pH7.5 10mM PBS：称取0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)(国药，10017608)1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)，8g氯化钠(NaCl)(国药，10019308)、0.2g氯化钾(KCl)(国药，10016308)于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH至7.5，然后用容量瓶定容至1L。
10mM Tris-HCl：称取1.576g(国药，xw020034)于900mL超纯水中，完全溶解后调节到所需的pH值，然后定容至1L。
1％柠檬酸缓冲液：称取1.0g柠檬酸三钠(国药，10019428)于100mL超纯水中，至完全溶解。
EDC溶液：EDC(M＝191.7g/mol)溶解于冷的25mM MES，pH5.0中制得52mM，即10mg/ml的EDC溶液；
胶体金(Colloidal Gold，CG)；甲胎蛋白抗体(AFP抗体)购自菲鹏生物公司；羊抗鼠抗体购自杭州启泰公司；样品垫(Fusion 5，GE)；结合垫(NJ25)、吸水垫(CH37M)、PVC衬板购自上海金标生物科技有限公司；NC膜(135s，Millipore)购自Millipore公司；卡盒购自金灿华公司；BSA(amresco，0332)；Tween-20(sigma，44112)
其它试剂均为国产分析纯。
实施例1、本发明所述侧向层析系统及制备方法
(一)乳胶微粒(latex MP，Merck)制备步骤
1、Latex MP活化
取1mgLatex MP，用1mL 25mM MES(pH5.0)缓冲液洗涤3次(每次混匀10min)；
5).配制10mg/mL EDC(M＝191.7g/mol，C＝52mM)溶液(EDC溶解于冷的25mMMES，pH5.0)；(EDC，sigma，39391)
6).将Latex MP用440μL 25mM MES(pH5.0)重悬。
7).加入10μL EDC溶液，充分混匀，缓慢振摇，30min，RT；
8).将反应完成的离心管离心(3000rmp，5min)，去除上清，并用1mL 25mM MES，pH 5.0洗涤3次；
2、Latex MP包被
6).用300μL 25mM MES，pH 5.0重悬lmgLatex MP；
7).加入5-12ul(优选10ul)5mg/ml LCA(25mM MES，pH5.0)溶液；
8).用25mM MES，pH 5.0使反应体系定容为500μL，充分混匀；
9).缓慢振摇，室温30-120min或4℃2小时；
10).将反应完成的离心管离心(3000rmp，5min)，去除上清得到小扁豆凝集素活化的乳胶微粒，其中小扁豆凝聚素投料量与乳胶微粒的投料量比例为：25-70ug:1mg，优选50:1mg；
3、Latex MP洗涤和保存
1).用500μL 25mM MES(pH 5.0)洗涤4次；
2).加入100μL 0.1-0.5％BSA，30-60min，RT(室温)；
3).用100μL 50mM Tris-HCl(pH 6.8，含1％Tween-20)洗涤4次；
4).加入1mL 5％BSA保存。
(二)金标结合物制备
1)取100mL 0.01％HAuCl4溶液，加热至沸腾。
2)加入2.0mL 1％柠檬酸三钠溶液，加热搅拌15min。
3)关掉加热旋扭，适当速度搅拌至室温。
1)量取20.0mL的胶体金置于100.0mL的小烧杯中，在搅拌的状态下缓慢加入0.4mg AFP抗体，搅拌30min；
3)加入5％BSA至终浓度为1％，继续搅拌30min。
4)以12000r/min离心30min，弃去上清夜，用PBST(PBS含0.05％Tween-20)重悬；
5)以12000r/min离心30min，弃去上清夜，用PBST重悬；
6)以12000r/min离心30min，弃去上清夜，沉淀用1％BSA重悬，得到1.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
(三)样本垫、结合垫制备
1)将样品垫和结合垫用1％BSA浸泡30min，37℃烘干。
2)将凝集素活化的乳胶微粒涂布于样本垫，37℃烘干
3)取胶体金结合物滴加到结合垫上(10uL/cm2)，37℃烘干。
(四)T/C线(检测线/对照线)包被
C线(对照线)：将1mg/mL羊抗鼠抗体包被NC膜C线(见图2a、图2b)，每条1.0μL，37℃干燥。
T线(检测线)：将1.0mg/mLAFP抗体包被NC膜(见图2c、图2d)，每条1.0μg，37℃干燥。
(五)试剂盒组装
将样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫沿液体层析方向由左至右依次排布；PVC衬板置于上述样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫的下方用于支撑它们；卡盒包围在所述样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫和PVC衬板的外侧用于保护它们，由此组装形成本发明所述的侧向层析系统(见图1)，在本实施例中，所述侧向层析系统具体为层析试剂盒。
(六)不同凝集素选择
由于不同的凝集素对糖蛋白糖链的亲和力和特异性不同，因此凝集素种类选择对提高试剂盒的特异性尤为重要。实验对菜豆(Phaseolus vulgaris)凝集素(LPH)、小扁豆(Lens culinaris)凝集素(LCA)、荆豆(Ulexeuropaeus)凝集素(LUE)、刀豆(Canavaliaensiformis)凝集素(ConA)进行了对比试验，分别测定100例正常体检样本，计算其特异性(特异性＝检测阴性样本数/正常样本数)，特异性越接近于100％越好，结果得出AFP-L3的最佳结合型凝集素为LCA小扁豆凝集素(见图3)。
筛选方法如下：
1)选用不同凝集素包被Latex MP，包被步骤同上；
2)层析试纸条制备方法同上；
3)加入100μL正常体检血清(AFP浓度已知)，RT，15min；
4)然后用读条仪即AFP浓度计算AFP-L3比例，若AFP-L3/AFP≥10％则判定为阳性。
实施例2、样本垫固定MP-LCA涂布浓度选择
1、层析试纸条制备
在本实施例中，本发明所述的侧向层析系统为层析试纸条，其样本垫的制备方法与实施例1步骤(三)中样本垫制备方法相同，其中将不同浓度MP-LCA(0、0.1、0.5、2.5、10、50ug/cm2)(以LCA浓度计算)涂布于样本垫。
2、不同浓度MP-LCA条件下AFP-L3的结合效率检测
1)加入100μL含有不同浓度AFP-L3(2、8、40、160、400ng/ml)的血清(AFP浓度已知)，RT，15min；
2)然后用读条仪计算AFP-L3浓度，根据凝集素对不同浓度AFP-L3的结合能力[(实际测定浓度/理论浓度)×100％。
本实施例通过使用固定有不同涂布量的MP-LCA样本垫制备的层析试纸，优选出能使结合效率在90％-110％之间的样本垫固定MP-LCA涂布浓度范围为2.5～50ug/cm2，最佳涂布浓度为10ug/cm2。
实施例3、采用本发明所述侧向层析系统进行临床样本检测
所述侧向层析系统使用方法
具体操作为：
取实施例1所述的层析试剂盒或实施例2所述的层析试纸条，在加样点滴入100μL待测血清，室温15min；
然后在读条仪(C10066-10，滨松)上读出浓度值，根据所测样本AFP浓度计算出样本中AFP-L3浓度(即AFP-L3浓度＝样本AFP浓度-层析试纸条读值)。
收集临床样本共324例，其中HCC(原发性肝癌)样本103例，非HCC(慢性肝炎、肝硬化)63例，正常人血清样本例46。
采用实施例1步骤(六)的方法进行检测，结果如表3所示：
表3 血清样本分布
实验结果表明，本发明对于原发性肝癌的符合率达90.3％，在肝硬化中的特异性高达84.8％，在肝炎中的特异性高达87.5％。

Claims (10)

1.一种用于捕获甲胎蛋白异质体的小扁豆凝集素活化乳胶微粒，其特征在于，是通过小扁豆凝集素活化而得，其中乳胶微粒与小扁豆凝集素的投料比例为1mg∶25-60ug。
2.根据权利要求1所述的小扁豆凝集素活化乳胶微粒，其特征在于，所述乳胶微粒的粒径2.0μm。
3.权利要求1或2所述小扁豆凝集素活化乳胶微粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)乳胶微粒活化
1).取乳胶Latex MP，用1mL MES缓冲液洗涤去上清；
2).将Latex MP用440μL MES缓冲液重悬。
3).加入10μL 10mg/mL EDC溶液，充分混匀，缓慢振摇，室温30min；
4).3000rmp，离心5min，去除上清，并用1mLMES缓冲液洗涤3次去上清得到活化的乳胶微粒；
(2)乳胶微粒包被
1).用300μL pH 5.0,25mM MES重悬lmgLatex MP；
2).加入小扁豆凝集素溶液；
3).用25mM MES使反应体系定容为500μL，充分混匀；
4).缓慢振摇，室温30-120min或4℃2小时；
5).离心去除上清得到小扁豆凝集素活化的乳胶微粒，
上述包被过程中，所述小扁豆凝集素与乳胶微粒的投料比例为25-60ug∶1mg。
4.根据权利要求3所述的制备方法，所述小扁豆凝集素与乳胶微粒的投料比例为50ug∶1mg。
5.用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统，沿层析方向依次包括：样本区、结合区；
其特征在于：
所述样本区包含权利要求1或2所述的小扁豆凝集素活化的乳胶微粒，所述小扁豆凝集素活化的乳胶微粒的使用量为2.5～50ug/cm2，
所述结合区涂布有胶体金结合物，所述胶体金结合物指胶体金标记的甲胎蛋白抗体，用于结合样品中的甲胎蛋白。
6.根据权利要求5所述的侧向层析系统，其特征在于，还包括检测区，
所述样本区、结合区、检测区沿层析方向依次排布；
所述检测区设有检测线和对照线；
所述检测线包被有羊抗鼠抗体；
所述对照线包被有甲胎蛋白抗体；
所述检测线和对照线垂直于层析方向且不重叠。
7.根据权利要求5所述的侧向层析系统，其特征在于，所述小扁豆凝集素活化的乳胶微粒的使用量为10ug/cm2。
8.根据权利要求5或6所述的侧向层析系统，其特征在于，所述甲胎蛋白抗体在所述胶体金结合物中的浓度为0.4mg/ml；
所述羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL；
所述甲胎蛋白抗体浓度为1mg/mL。
9.权利要求5－8任一所述的侧向层析系统的制备方法，其特征在于，包括制备样本垫和结合垫：
所述样本垫上涂布有权利要求1或2所述的小扁豆凝集素活化的乳胶微粒；
所述结合垫涂布甲胎蛋白抗体的胶体金结合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
所述小扁豆凝集素活化的乳胶微粒在所述样本垫上的涂布涂布浓度为2.5-50ug/cm2；
所述甲胎蛋白抗体在所述胶体金结合物中的浓度为0.4mg/ml。
CN201610286029.XA 2016-05-03 2016-05-03 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统 Active CN105891509B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610286029.XA CN105891509B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610286029.XA CN105891509B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105891509A true CN105891509A (zh) 2016-08-24
CN105891509B CN105891509B (zh) 2018-05-11

Family

ID=56703210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610286029.XA Active CN105891509B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105891509B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106248959A (zh) * 2016-07-21 2016-12-21 首都医科大学附属北京佑安医院 一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法及免疫渗滤装置
CN108196063A (zh) * 2017-12-26 2018-06-22 陈复华 一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量检测甲胎蛋白变异体（afp-l3）的试剂盒
CN109593827A (zh) * 2019-02-14 2019-04-09 上海美凯纯生物科技有限公司 一种分子层析pcr检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1920520A (zh) * 2006-09-13 2007-02-28 北京热景生物技术有限公司 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒
CN102147415A (zh) * 2010-12-30 2011-08-10 上海市肿瘤研究所 一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体检测试剂盒
CN102879567A (zh) * 2012-09-29 2013-01-16 同昕生物技术（北京）有限公司 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用
CN103983792A (zh) * 2014-05-29 2014-08-13 同昕生物技术（北京）有限公司 一种免疫球蛋白侧向层析检测系统
CN104459161A (zh) * 2014-12-30 2015-03-25 霍普金斯医药研究院（北京）有限责任公司 一种甲胎蛋白胶体金检测试剂盒及其使用方法
CN104502599A (zh) * 2014-12-19 2015-04-08 同昕生物技术（北京）有限公司 25-羟基维生素d定量检测试纸条及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1920520A (zh) * 2006-09-13 2007-02-28 北京热景生物技术有限公司 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒
CN102147415A (zh) * 2010-12-30 2011-08-10 上海市肿瘤研究所 一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体检测试剂盒
CN102879567A (zh) * 2012-09-29 2013-01-16 同昕生物技术（北京）有限公司 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用
CN103983792A (zh) * 2014-05-29 2014-08-13 同昕生物技术（北京）有限公司 一种免疫球蛋白侧向层析检测系统
CN104502599A (zh) * 2014-12-19 2015-04-08 同昕生物技术（北京）有限公司 25-羟基维生素d定量检测试纸条及其应用
CN104459161A (zh) * 2014-12-30 2015-03-25 霍普金斯医药研究院（北京）有限责任公司 一种甲胎蛋白胶体金检测试剂盒及其使用方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106248959A (zh) * 2016-07-21 2016-12-21 首都医科大学附属北京佑安医院 一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法及免疫渗滤装置
CN106248959B (zh) * 2016-07-21 2019-01-25 首都医科大学附属北京佑安医院 一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法及免疫渗滤装置
CN108196063A (zh) * 2017-12-26 2018-06-22 陈复华 一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量检测甲胎蛋白变异体（afp-l3）的试剂盒
CN109593827A (zh) * 2019-02-14 2019-04-09 上海美凯纯生物科技有限公司 一种分子层析pcr检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105891509B (zh) 2018-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102879567B (zh) 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用
CN104714026B (zh) 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用
Ruoslahti et al. Studies of carcino‐fetal proteins. III. Development of a radioimmunoassay for α‐fetoprotein. Demonstration of α‐fetoprotein in serum of healthy human adults
CN100401068C (zh) 肝细胞癌的诊断
CN101256190B (zh) Ca15-3、cea、ca19-9、ca12-5、sf乳腺癌胶体金五联检诊断试剂盒
Purves et al. Serum alpha‐feto‐protein VII. The range of apparent serum values in normal people, pregnant women, and primary liver cancer high risk populations
CN103364558A (zh) 一种人肿瘤标志物癌胚抗原（cea）的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法
CN107543932A (zh) 一种降钙素的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法
CN104749380B (zh) hCE1及其抗体在制备用于诊断主体中肝癌的组合物中的应用
CN204422547U (zh) 一种甲胎蛋白异质体的分离检测试剂盒及装置
CN105891509A (zh) 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统
CN108351358A (zh) 肝癌测试方法
CN107870234A (zh) 一种检测甲状腺球蛋白浓度的试纸条及其制备方法
CN104849465B (zh) 肿瘤血清标志物ca153、cea、hcg乳腺癌三联诊断试剂盒
CN103344634A (zh) 一种人甲胎蛋白（afp）的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法
CN106468711A (zh) Dcp快速分离检测试剂盒
CN103439511B (zh) 一种检测肺癌的液相芯片试剂盒
CN204789589U (zh) 一种胶体金检测试纸条
CN103487493A (zh) 尿液分子的应用
CN201196651Y (zh) 双肿瘤标志物金标检测试纸
CN103777026A (zh) 一种用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒
CN106290902A (zh) 一种血清淀粉样蛋白a1的胶体金检测卡及其制备方法
CN106119340B (zh) 一种脱‑γ‑羧基凝血酶原的检测方法、检测试剂和检测试剂盒
CN105067820A (zh) IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法
CN109982713A (zh) 外周血循环肿瘤细胞检测体系及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant