CN100401068C - 肝细胞癌的诊断 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于筛查个体是否患有肝细胞癌的方法，该方法通过测定所述个体体液样本中的glypican-3(GPC3)水平来实现。本发明还公开了通过检测肝组织样本中的GPC3来诊断肝细胞癌的方法。此外还提供了能够与GPC3特异结合的抗体。

Description

肝细胞癌的诊断
发明领域
本发明涉及肝细胞癌的诊断。特别地，本发明涉及用于测定作为肝细胞癌标志物(marker)的glypican-3的水平的抗体和方法。
背景技术
在本申请的全部内容中，所引用的各种文献是为了更加全面地说明本发明所属技术领域的状态。本文引用这些文献中公开的内容作为本发明公开的参考。
肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的实体器官肿瘤，每年因此死亡的人数超过1百万(Parkin，et al.(1999)CA.Cancer J. Clin.49：33-64，及Okuda，et al.(1993)，Neoplasms of the Liver in Diseases of the Liver，7thedition 1236)。
在大多数西方国家，HCC的发病率不断增加(Deuffic，et al.(1998)，Lancet 351：214-215)。尽管还没有确切的流行病学研究结果，但来自加拿大卫生部的资料显示男性HCC的死亡率在近15年中几乎翻了一番。肝炎病毒携带者的人口统计表明在未来10年HCC的发病率还将翻番(Zou，et al.(2000)，Can.J.Gastroenterol.14：575-580)。
早期HCC(甚至是较小的原发肿瘤)通常没有症状，其主要倾向于血管内和胆管内侵入(Fong，et al.(2001)，Cancer of the Liver and BiliaryTree.in Cancer：Principles  & Practice of Oncology，6th Edition，1162-1199)。其结果是，当发现时HCC通常已处于晚期阶段。既往调查，在确诊时只有10-20％的原发HCCs能被切除(Fong，et al.(2001)，Cancer of the Liver and Biliary Tree in Cancer：Principles & Practice ofOncology，1162-1199)。虽然大多数病人在确诊时仍然不能治愈，但最近随着HCC筛查计划的实施，潜在的可治愈的肿瘤比例不断增加。
HCC伴随有慢性肝损伤，主要是慢性病毒性肝炎和酒精肝疾病(Rustgi，(1987)，Gastroenterol.Clin.North AM.16：545-551)。在乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)流行的地区HCC的发病率最高。在HBV感染病例中，已证明慢性感染的个体发展为HCC的相对风险比未感染个体高50～100倍(Beasley，et al.(1994)，Epidemiology ofhepatocellular carcinoma in Viral hepatitis and liver disease，209)。与HCC的其它病因不同，慢性乙型肝炎肝硬化并不是发展为HCC的必要先决条件。虽然没有对慢性HCV发展为HCC的相对风险进行评估，但患肝硬化的HCV携带者的HCC发病率每年高达5％，与之相对HBV携带者的发病率却为0.5％(Di Bisceglie，(1995)，Semin.Liver Dis.15：64-69)。在日本，70％的HCC病例是由持续性HCV感染引起的，而且在北美HCC发病率持续上升最有可能是由HCV感染在当地人群中不断扩散引起的(Hasan，et al.(1990)，Hepatology，12：589-591 andEI-Serag，et al.(1999)，N.Engl.J.Med.340：745-750)。
某些化学物质与HCC的发病有关。其中最主要的是乙醇，且HCC与滥用酒精有关(Schiff，(1997)，Hepatology，26：39S-42S及Nalpas，et al.(1995)，Alcohl，12：17-120)。乙醇被认为是通过引发肝硬化或者与其它物质(如HBV和HCV)形成共致癌物从而导致HCC。某些真菌产生的黄曲霉毒素也与HCC有关(Yu，(1995)，J.Gastroenterol.Hepatol.10：674-682)。这些真菌一般生长在谷类、花生和其它食品上，是导致食物变质的最常见的原因。
超声波检查或计算机断层扫描术(CT)对空间占位病变的检查结果，结合血清甲胎球蛋白(AFP)水平高于500ng/ml的检测结果，可相对直接地诊断出病人患有HCC(Fong，et al.(2001)，in Cancer of the Liver andBiliary Tree in Cancer：Principles & Practice of Oncology，6th Edition，1162-1199)。但是，由于AFP水平经常不会表现出确诊性的升高，因此当这些条件都符合时，通常HCC已不能治疗。
无论是超声波检查、CT扫描还是MRI，对小病灶影像的诊断都是相对不准确的(Fong，et AL.(2001)，in Cancer of the Liver and BiliaryTree in Cancer：Principles & Practice of Oncology，6th Edition，1162-1199；及Murakami，et al.(1995)，Detectability of hypervascular hepatocellularcarcinoma by arterial phase images of MR and spiral CT. Acta Radiol.36：372-376)。特别地，肝硬化结节与非塑型性结节(dysplastic nodules)是两个与HCC放射影像非常相似的病灶。
小病灶的肝组织活检同样没有足够的敏感性和特异性(Levy，et AL.(2001)，Ann.SURG.234：206-209)。甚至利用针刺活检时，因该方法获得的物质量通常很有限，所以很难将分化较好的癌症与良性病灶区分开(Fong，et AL.(2001)，in Cancer of the Liver and Biliary Tree in Cancer：Principles & Practice Of Oncology 6th Edition，1162-1199)。因此，尽管影像技术取得了巨大的进步，仍需要适合的分子标志物，从而在较难区分的病例中将良性病灶与HCC区分开。
肿瘤的大小是HCC肝内扩散和转移的显著风险因子(Yuki，et al.(1990)，Cancer，66：2174-2179)。而且，对肿瘤较小的病人，有更多的治疗手段。有症状的肿瘤通常较大且难以进行治疗干预。另一方面，对HCC敏感和特异的标志物可用于筛查可能患病的病人，如HBV慢性携带者和肝硬化HCV患者。尽管此种筛查已广泛应用，但仍没有资料显示其对降低发病率是有效的(Collier，et AL.(1998)，Hepatology，27：273-278)。这种筛查方法无效的原因之一是目前使用的名为sequential AFP分析的血清学检查的敏感性和特异性较低(Collier，et al.(1998)，Viral hepatitis Reviews，4：31-41)。因此，需要对检测系统进行改进从而改善HCC的筛查。
唯一的现已广泛用于筛查和诊断HCC的分子标志物是甲胎球蛋白(AFP)。在胚胎发育阶段，此蛋白由卵黄囊和肝脏大量合成(Chan，et al.(1999)，in Tumor Markers.in Tietz textbook of clinical chemistry，3rd，722-749，Taketa，K(1990)，Hepatology，12：1420-1432)。出生后，在12-18个月内，AFP含量逐渐降低到＜10ng/ml。
在妊娠期间，AFP重新出现在母体血清中。HCC、胃癌、肺癌、胰腺癌、胆管癌、睾丸癌可引起循环中AFP的增加(Chan，et al.(1999)，in Tumor Markers.in Tietz textbook of clinical chemistry，3rd，722-749)。
如果AFP水平为20ng/ml或更高视为确诊时，则可检测出60％～80％的HCC病例，但在肿瘤较小的病例中，其敏感性显著降低(40％)(Trevisani，et al.(2001)，J.Hepatol.34：570-575)。
使用AFP作为HCC标志物的另一个问题是其缺乏特异性；在相当数量的慢性肝病患者中，其AFP含量也显著增加(20-200ng/ml)(Collier，et AL.(1998)，Viral hepatitis Reviews，4：31-41)。据报道，15％-58％的慢性肝炎患者和11％-47％的肝硬化患者的血清AFP增加(Taketa，(1990)，Hepatology，12：1420-1432)。所以，HCC患者与肝硬化患者血清AFP水平相互重叠的情况很常见，混淆了对AFP检测结果的解释。因此，应用AFP检测作为可能患HCC的病人的监测手段受到了置疑(Sherman，(2001)，J.Hepatol.34：603-605)。因此，建议只有在验证根据影像技术做出的最初诊断时，才能使用AFP检测结果进行判定(Sherman，(2001)，J.Hepatol.34：603-605)。
由于AFP水平的不可靠性，大多数筛查方案中包括了对肝肿物高度灵敏的超声波检测法。然而超声波检查缺乏特异性，且当病灶小于约2cm时，不能可靠地区分HCC、肝硬化结节和非塑型性结节。
近年来，对一些新的潜在HCC标志物进行了研究，但还没有发现任何能明显超过AFP的标志物(Seow，et al.(2001)，Proteomics，1：1249-1263)。例如，脱-γ-羧基凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin)曾被视为潜在的标志物。然而与AFP类似，该分子对检测较小的肿瘤没有作用(Nomura，et al.(1999)，Am.J.Gastroenterol.94：650-654)。
Hsu等人报道(1997年)，通过对正常肝脏和HCC进行mRNA差异显示分析，识别出了在HCC中表达上调的转录产物(Hsu，et AL.(1997)，Cancer Res.57：5179-5184)。这种他们命名为MXR7的转录产物，后来发现是Glypican-3(GPC3)。GPC3是一种类肝素硫酸蛋白多糖(heparansulfate proteoglycan)，其通过脂质末端与细胞表面结合(Duenas Gonzales，et al.(1998)，J.Cell.Biol.141：1407-1414)。Hsu等人发现在191例原发和复发HCCs中，有143例(74.8％)表达了GPC3mRNA，但在154例正常肝脏中只有5例(3.2％)表达。
后续研究发现，在75％HCC病例中存在GPC3mRNA过表达，在局灶性增生集中和肝硬化肝脏中并没有检测到GPC3mRNA过表达(Zhu et al.(2001)，Gut，48，558-564)。
这些研究只分析了mRNA水平，但众所周知mRNA水平与蛋白的表达和分泌并不完全对应。此外，通常只有有限数量的肝脏蛋白可分泌进入血液循环。
虽然这些结果表明肝脏组织中的GPC3 mRNA分析可用于HCC的检测，但由于其需要分离肿瘤组织，因此这类分析是侵入性的。此外，mRNA分析较费时，作为常规分析较困难。
因此，需要一种能够用于筛查的血清标志物(即：HCC较小的无症状病人中其呈阳性的比例较高)。对超声波检查已检测出存在较小肿物病灶的病人，该检查也应该能可靠地将HCC病人与那些非恶性病灶的病人区分开。
总之，仍然需要更好的HCC分子标志物，特别是用于监测高危人群(如已出现肝硬化的HCV患者)的标志物。由于HCCs具有高度异源性特征(Thorgeirsson，et al.(2002)，Nature Genet.31：339-346)，因此寻找这样的标志物是非常困难的。
发明概述
本发明的发明者发现了一种新的HCC的血清标志物，即glypican-3(GPC3)，在其基础上开发了新的、快速、方便、非侵入性的分析方法，该方法提高了HCC诊断的特异性。
根据本发明的一个实施方案，本发明提供了筛查个体是否患有肝细胞癌(HCC)的方法，包括：
从该个体获得体液样本；和
检测该样本中的glypican-3(GPC3)水平；
其中该样本中存在可检测水平的GPC3，则提示该个体患有HCC。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了能够特异结合GPC3或其片段的基本纯化的抗体或其片段。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了诊断个体是否患有HCC的方法，包括：
从该个体获得肝脏组织样本；和
检测该组织样本中GPC3的存在；及
其中在该样本检测到GPC3则提示患有HCC。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了一种检测样本中GPC3存在的方法，该方法包括：
将样本与抗体或其片段接触，该抗体或其片段特异地结合到GPC3或其片段上，并形成抗体-GPC3复合物或抗体-GPC3片段复合物；及
检测该抗体-GPC3复合物或抗体-GPC3片段复合物。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了一种检测样本中GPC3水平的方法，包括：
将样本与抗体或其片段接触，该抗体或其片段特异地结合到GPC3或其片段上，并形成抗体-GPC3复合物或抗体-GPC3片段复合物；及
测定该抗体-GPC3复合物或抗体-GPC3片段复合物。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了用于检测或测定样本GPC3水平的试剂盒，包括：
能与GPC3或其片段特异结合的基本纯化的抗体或其片段。
附图的简要说明
结合附图对本发明的优选实施方案进行说明，其中：
图1所示为GPC3转染293细胞(照片C和D)显微照片和只用载体转染的对照细胞(照片A和B)的显微照片，其中细胞均用抗GPC3单克隆抗体1G12标记。照片A和C为相差显微照片，而照片B和D为荧光显微照片。
图2所示为只用载体(EF)或用HA-标签GPC3(GPC3)转染的293细胞中蛋白的Western印记分析(WB)。通过抗GPC3单克隆抗体1G12或抗HA抗体(12CA5)孵育印记膜。实心箭头：GPC3核心蛋白；开放箭头：GPC3的糖基化(glycanated)形式；箭头的头部：含GPC3N-末端的降解产物，其不含能用1G12检测的抗原决定簇。右边的数字对应分子量标准。
图3所示为通过抗单克隆抗体1G12免疫组化标记的肝细胞癌切片的显微镜照片。照片A：16×放大的高度GPC3-阳性HCC(T)的全景照片，其周围为未标记的非肿瘤肝组织(N)；照片B：相同组织的400×放大照片，显示标记的细胞浆颗粒和胞膜。
图4所示为GPC3的ELISA分析中，GPC3含量与光密度的关系。
图5所示为ELISA分析测定的对照个体、肝炎患者(H)、肝炎合并肝硬化患者(H+LC)和肝细胞癌患者(HCC)血清中GPC3的水平，所示结果为四份的平均值。图的顶端显示了HCC患者与肝硬化患者GPC3平均值的显著性差异。
发明的详细描述
本发明提供了一种新的筛查哺乳动物个体是否患有肝细胞癌(HCC)的方法。本发明的发明者已经证明能够检测患有HCC病人循环中、血清或血浆中的细胞表面蛋白多糖GPC3，但在正常个体的血清或血浆中，使用本文所述的具有显著性的标准检测方法没有出现可检测的水平，即显著高于本底的水平。同时还显示，肝炎病人或肝炎合并肝硬化病人的血清或血浆中几乎没有或没有GPC3可检测到。
因此，本发明提供了一种通过检测个体体液中的GPC3水平来筛查该个体是否患有HCC的方便、非侵入性的方法。用于测定的适合的体液包括：血清、血浆和全血。优选筛查血清或血浆。
可以通过任何适合的分析该蛋白的方法来测定体液中的GPC3水平。测定GPC3水平的免疫学方法是非常方便和适合的方法类型，此类方法是本领域所属技术人员公知的，并在本文中做了进一步描述。
例如，特异结合人体GPC3的抗体或抗体片段为多种用于测定GPC3的以抗体为基础的分析方法提供了基础。HCC可通过下列步骤诊断：将个体体液与抗体或抗体片段接触；在允许的条件下，该抗体或抗体片段与GPC3特异结合并形成抗体-GPC3复合物；然后检测和/或测定该复合物的水平。抗体-GPC3复合物的含量与样本中GPC3的水平对应。
本文所用术语“抗体”，如果没有特别说明，应包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及单链抗体。
文中术语“抗体片段”指能够表现其母抗体特异结合性的抗体的一部分，还包括Fab、F(ab′)2及Fv片段。
本文中，如果抗体或抗体片段识别并结合靶分子，但基本不识别和结合含有靶分子的样本中的其它分子，则称该抗体或抗体片段与该靶分子“特异结合”。
嵌合抗体是一类抗体，其含有来自不同物种的抗体部分。例如，嵌合抗体可含有人不变区和其它物种的可变区。嵌合抗体可通过公知的重组方法制备，如美国专利第5,354,847和5,500,362号，以及科学文献(Couto et al.(1993)，Hybridoma，12：485-489)中所述。
人源化抗体是一类抗体，其中只有负责抗原结合和特异性的补体决定区是非人来源的，而抗体分子的其余部分基本上是人源的。人源化抗体及其制备同样是本领域所属技术人员公知的，参见例如美国专利第5,225,539、5,585,089、5,693,761和5,693,762号。
单链抗体是能够与肽或抗原决定簇特异结合的多肽序列，其中该单链抗体衍生自单克隆抗体或多克隆抗体的轻链或重链。单链抗体包括衍生自人源化抗体、嵌合抗体或完整人抗体的多肽，其中该单链抗体衍生自这些抗体的轻链或重链。
抗体
多克隆抗体
为制备多克隆抗体，应获得纯化的人或非人的GPC3。
利用常规的方法，例如Bonneh-Barkay et al.(1997)，J.Biol.Chem.v.272，pp.12415-12421中所述的方法，可从如人胎盘中纯化出GPC3。
如果需要，如本领域所属技术人员公知的，可将该纯化蛋白结合到诸如钥孔(虫戚)血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)的载体蛋白上，然后与Freund氏佐剂混合，并注入家兔或其它适合的实验动物体内。
可选择地，通过对插入到适合的克隆载体中的适当的DNA序列进行表达，可在诸如细菌的适合宿主中重组合成全部或部分该GPC3蛋白。使用以往报道的方法(Filmus et al.(1988)，Molec.& Cell Biol.v.8，pp.4243-4249；Linsley et al.(1993)，Ann.Rev. Immunol.v.ll，pp.191-212；Peach et al.(1994)，J.Exp.Med.v.180，pp.2049-2058)，可克隆编码GPC3的DNA。使用相似的方法能以融合蛋白的形式表达GPC3或其部分。
用于在大肠杆菌E.coli中产生融合蛋白的两种广泛应用的表达系统是使用pUR系列载体的谷胱甘肽转移酶(gluthathione-S-transferase)或麦芽糖结合蛋白融合体，以及使用pATH载体的trpE融合体。
然后，可例如使用谷胱甘肽柱纯化表达的GPC3蛋白，如果需要可将其结合到载体蛋白上，并与Freund氏佐剂(辅助刺激动物的抗原反应)混合，并注入家兔或其它适合的实验动物体内。每过一周进行加强注射，采集家兔或其它实验动物的血液并分离血清。该血清可直接使用，或者在使用前通过各种方法(包括使用蛋白-A-Sepharse、抗原琼脂糖(Sepharose)或抗小鼠-Ig-琼脂糖的亲和层析)进行纯化。
使用GPC3的片段作为抗原可制备其多克隆抗体。可使用源自GPC3氨基酸序列的含3个或更多个连续氨基酸的片段。优选的抗原是含有70个氨基酸的羧基末端氨基酸序列的GPC3片段或其部分。如本文所述，可选择地将片段重组生成融合蛋白。可将这种肽抗原与钥孔(虫戚)血蓝蛋白连接来增强体内的免疫原性。
单克隆抗体
通过常规的方法，向小鼠体内注射纯化的GPC3或其片段(可选为融合蛋白)后，可制备单克隆抗-GPC3抗体，所述GPC3蛋白或其片段可通过如上述多克隆抗体制备中所述的方法获得。
简单说来，向小鼠体内注射与Freund佐剂混合的该纯化的蛋白或肽，例如3周的时间注射9次。取该小鼠的脾脏，并重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中。
将脾细胞作为淋巴细胞的来源，其中一些淋巴细胞可产生具有适当特异性的抗体。随后将这些细胞与永生的骨髓瘤伙伴细胞融合，将融合产物杂交瘤细胞接种到一定数量的存在有诸如HAT的选择试剂的组织培养孔中。使用ELISA进行筛选，以识别含有能产生GPC3特异性抗体的细胞的小孔。再次接种这些细胞，培养一段时间后，再次筛选这些小孔，来识别产生抗体的细胞。进行多个克隆的步骤，直到超过90％小孔中包含能够产生抗体的单克隆。通过此步骤，建立了能够产生抗体的稳定的克隆细胞株。然后，使用蛋白A琼脂糖亲和层析或离子交换层析以及这些技术的变化和组合，来纯化该单克隆抗体。
在进一步的实施方案中，从GPC3特异单克隆抗体中制备抗体片段，该片段包括但不限于F(ab)2、F(ab1)2及Fv片段或单链成分。使用完整抗GPC3抗体的蛋白水解产物(如Lin et al.(1978)，PNAS，75(6)；2649-2653中所述)，或对编码这些片段的基因进行遗传学处理，以及对能够分泌这些抗GPC3抗体片段的转染生成系统进行发酵可生成这样的片段。
优选抗原亲和性至少为1×108的抗GPC3抗体。
可使用各种类型的分析方法来分析样本中的GPC3。这些方法包括夹心ELISA、放射免疫分析、荧光免疫分析、斑点杂交(dot-blot)、试纸条法(dip-stick)及Western印记。
在优选的实施方案中，使用特异结合GPC3或其片段并携带可检测标记的抗体，并通过测量该可检测标记对生成的GPC3-抗体复合物进行测定，从而测定样本中GPC3的水平。可选择地，使用对GPC3或其片段有特异性的第一抗体，然后使用对第一抗体有特异性并携带标记的第二抗体，该标记可以是可直接检测的标记或是信号产生系统的成分。此标记抗体和系统是本领域所属技术人员公知的。
将所述标记和信号产生系统所产生信号的检测或测定结果，与适当的校准标准比较，可确定样本中存在GPC3-抗体复合物并以此确定存在GPC3。
所述第二抗体携带的标记是任意适合的可直接检测的标记或任意适合的信号产生系统的成分。
许多这种例子是免疫分析领域所公知的。
可通过本领域所属技术人员公知的技术，使用可检测的标记物(label)或是信号产生系统的成分对第二抗体进行标记。可用于使抗体变为可检测的标记物的例子包括放射性同位素、酶、荧光素及化学发光物质。例如，可使用放射性元素作为可直接检测的标记物；放射性标记物的例子包括γ射线发射物质(124I、125I、128I及131I)。还可使用荧光标记物作为可直接检测的标记；例如适合的荧光物质包括coumarine、稀土金属离子、鳌合物或鳌合复合物、荧光素、若丹明(rhodamine)及若丹明衍生物。
适合的标记物还包括金属复合物、稳定的自由基、囊泡(vesicles)、脂质体、胶质颗粒(colloidal particles)、乳胶颗粒(latex particles)、spin标记物(spin labels)、生物素/抗生物素蛋白(biotin/avidin)以及它们的衍生物。
可使用酶联信号产生系统，包括碱性磷酸酶、淀粉酶、荧光素酶、过氧化氢酶(catalase)、β半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、辣根过氧化物酶、内酰胺酶(lactamase)、尿素酶及苹果酸脱氢酶。用适当的底物与所述酶反应，然后通过测量吸光度、荧光或发光密度来检测酶的活性。当使用酶作为标记物时，可通过诸如戊二醛、过碘酸(periodic acid)及马来酰亚胺(maleimide)的常规方法实现酶与抗体的连接。
固体基质可作为适用于固化抗体的固体支持物，其包括各种微滴定板(microtitre plates)，如从Falcon Plastics，Oxnard，Calif.获得的微滴定板，或例如常规的ELISA微滴定板(Immulon II、Dynax、Chantilly、VA)和链霉亲和素(Streptavidin)-包被的ELISA微滴定板(Reacti-Bind、Pierce、Rockford、IL)，以及诸如从Dynatech、Alexandria、VA获得的微滴定条(microtitre strips)。这些微滴定条或微滴定板的小孔由洁净的塑料材料制作，优选聚氯乙稀、聚苯乙烯。其它用于固化抗体的固体基质包括任何适合尺寸的聚苯乙烯小管、杆或桨，或者聚苯乙烯小珠或聚丙烯酰胺基质。
通过本领域所属技术人员公知的常规方法可在固体支持物上进行抗体的固化，例如，美国专利第5,352,583号中所述。
根据本发明优选的实施方案，将体液样本与可与GPC3特异结合形成复合物的第一抗体接触，该第一抗体固化在固体支持物上。通过足够长的时间来使样本中的GPC3与该固化的抗体结合。随后洗涤该固体支持物，然后将其与第二抗体接触，该第二抗体能够与第一抗体特异结合，并已标记了可检测的标记或附加了信号产生系统。通过测定结合到固体支持物上的标记或产生的信号，测量该样本中存在的复合物，从而测定该样本中GPC3的水平。
根据进一步的实施方案，该样本同时与固体支持物上的固化第一抗体和标记的第二抗体接触。
在进一步的实施方案中，该第二抗体可缺乏标记和信号产生系统成分，而通过第三抗体的方法来测定该与固体支持物结合的第二抗体，所述第三抗体结合有检测标记或信号产生系统成分，并选择性地与该第二抗体结合。
根据进一步的实施方案，将该样本同时或分步与特异结合GPC3并附加有捕获对成员之一的第一抗体，及已标记的可与第一抗体结合的第二抗体接触。生成的混合物随后与固化了捕获对其它成员的固体支持物接触。在充分的反应时间后，通过捕获对成员间的相互作用，使标记复合物能够结合到固体支持物上，洗涤该固体支持物并测定其上结合的标记物含量，从而确定样本中GPC3的水平。适合的捕获对包括生物素/抗生物素蛋白。其它适合的捕获对是本领域所属技术人员公知的。可颠倒抗体的特异性，该第一抗体可特异结合该复合物而标记的第二抗体可特异结合GPC3。
本文所述的筛查方法对HCC具有较高的特异性，该方法检测不到正常个体和肝炎患者样本中的GPC3，而在偶发性肝炎合并肝硬化的患者中检测到GPC3表现为可忽略的水平。
在确诊为HCC的个体的试验中，53％～55％的个体具有可检测的血清GPC3水平，其范围为151ng/ml～2924ng/ml。
当使用血清AFP作为相同的病人样本中的HCC标志物时，以20ng/ml为异常的阈值，可检测到59％的HCC病人。如果将提示患病的阈值水平提高到100ng/ml，只能检测到32％的HCC病例。然而，因为除HCC外许多慢性肝病的AFP水平也会高于20ng/ml，因此使用20ng/ml作为AFP的阈值时，会包括一定数量的假阳性。
本发明者发现，HCC病人GPC3水平的升高与其AFP水平并没有较强的相关性(表4)。因此本发明方法提供了有用的附加手段，其可不通过AFP筛查而识别HCC病例。本发明的方法可单独使用，或通过常规方法与APF筛查结合，从而提高识别早期和可治疗阶段的HCC的能力。
在本发明进一步的实施方案中，将GPC3与AFP筛查结合使用，从而提供了将高水平AFP筛查的特异性与增强的GPC3筛查的敏感性相结合的检测方法。例如，如表4中的数据显示，如果测定AFP与GPC3血清水平，并使用100ng/ml AFP作为显著性阈值，则70％的HCC病人显示出AFP和GPC3中至少一种升高，而单独使用100ng/ml AFP作为HCC标志时只有32％，单独使用GPC3时只有53％。如果同时考虑AFP和GPC3并使用20ng/ml AFP作为阈值，则82％的病人显示出AFP和GPC3中至少一种升高。
本发明的血清学GPC3分析对进一步评价显示肝肿物临床症状的个体特别有作用。该分析也可用于筛查HCC高危人群，例如慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者或携带者。
在进一步的实施方案中，本发明提供了诊断HCC的免疫组化方法，该方法通过检查出现肝肿物的病人的肝活检样本进行诊断。通过活检获得的肝组织样本常发生形态学变形，导致难以进行常规的组织学诊断。通过抗GPC3抗体标记此活检的组织切片，如本文实施例所述，在该切片中检测到GPC3即提示该活检肿物为HCC。该抗GPC3抗体可自身携带诸如荧光标记的可检测标记，或者该第一抗GPC3抗体可通过带可检测标记的第二抗体来检测。
本发明还提供可特异结合GPC-3的抗体。与这些抗体结合相同抗原决定簇的抗体同样属于本发明的范围。所述抗体可以是包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD及其任意亚型在内的任意免疫球蛋白类抗体。
在进一步的实施方案中，本发明提供了包括基本纯化的抗体或其片段的试剂盒，该抗体或其片段可与GPC3或其片段特异结合。
在进一步的实施方案中，该试剂盒可用于常规的二-抗体夹心分析，其中第一GPC3特异抗体捕获液体样本中的GPC3，第二抗体检测被捕获的GPC3的存在。该捕获抗体通常固化在固体支持物上，该固体支持物如ELISA板、硝化纤维素膜、小珠或任何其它本领域所属技术人员公知的支持物。该检测抗体可直接用比色标记或放射性同位素标记，或者通过对该检测抗体的同型抗体具有特异性的第二标记抗体来对其进行检测。
实施例
下列实施例的描述是为了说明目的，而不意于限制本发明的范围。
在本说明书和实施例中所参考的但没有清楚说明的化学、分子生物学、蛋白和肽生物化学及免疫学方法已在科学文献中报道，并且是本领域所属技术人员公知的。
方法
病人组织：从多伦多总医院病理科(Department of Pathology，TorontoGeneral Hospital)获得肝组织样本。所有肝组织样本均是手术切除的肿瘤及邻近软组织的大块样本。所有组织用10％福尔马林固定并用石蜡包埋，从而用于常规组织检查。
病人血清：血液样本来自签订同意书的34例HCC患者(患者特征如表3所示)、20例肝炎合并肝硬化患者(12例HCV和8例HBV)、18例肝炎患者(12例HCV、1例HCV合并HIV、1例HCV合并Thalesemia、1例HCV与HBV共感染及3例HBV)(多伦多总医院)、以及53例健康血液捐献者(Sunnybrook and Women′s College Health Sciences Centre，Toronto，Canada)。根据肝病研究欧洲委员会20(European Association forStudy of Liver Disease20)的指南，通过肝活检对HCC进行组织学诊断或通过临床资料对HCC进行诊断。通过离心立即分离该血清并在-20℃冻存。已诊断为非恶性肝病(肝炎合并肝硬化和肝炎)的病人血清，只有在收集后6个月没有恶性疾病指征的情况下，才纳入本研究。
细胞株：含10％胎牛血清(FBS)的MEM(minimum essential medium)培养液(Gibco BRL)中对HCC细胞株(HepG2、Hep3B及PLC-PRF-5)进行培养，并补充非必需氨基酸溶液和丙酮酸钠(1mM)。用含10％FBS的DMEM培养293细胞株。所有细胞株均从American Type CultureCollection获得，并在37℃下保持在含5％CO2的饱和湿度空气中。为收集条件培养液，将该细胞株在无血清条件下以高密度生长过夜。通过Centricon YM-10,000过滤器(Millipore)浓缩该收集培养液。
GPC3的转染：使用诱导进入pEF载体(或以空载体作为对照)的血球凝集素A(HA)-标签-GPC3cDNA21来转染293细胞株，并用800μg/mlG418(Gibco BRL)来筛选转染的细胞。在通过抗HA 12CA5单克隆抗体和FITC-连接的第二抗体对G418选择的细胞进行标记后，通过FACS分选高水平表达GPC3的细胞。随后通过组织培养扩增分选的细胞。抗GPC3小鼠单克隆抗体制备：通过给Balb/C雌性小鼠单剂量腹腔(i.p.)注射50μg含核心蛋白末端70个氨基酸的His标签GPC3片段，使其免疫。该免疫原通过Titermax Gold(Cedarlane)佐剂乳化。21天后，用50μg不含佐剂的相同免疫原对该小鼠进行强化。2天后，从尾静脉收集血液样本，并获得相应的血清。通过ELISA，并用来自同一小鼠的免疫前血清作为阴性对照，来评估该血清样本中抗GPC3的滴定度。使用常规的方法，在聚乙二醇4000(Sigma)存在的情况下，将具有最高滴定度的2只小鼠的脾细胞与SP2/0 Ag14小鼠的骨髓瘤细胞(比例6∶1)融合。将融合细胞接种于96孔培养板并在加有Nutridoma-CS(Roche)及次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶核苷(HAT补充剂，Gibco BRL)的α-MEM、10mMHepes、50μM 2-巯基乙醇及含20％FBS的培养液中扩增。为选择产生的杂交瘤，使用每孔加载0.05μg GPC3免疫原的96孔板进行ELISA，来筛选扩增的克隆。用溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的1％牛血清白蛋白(BSA)将该培养板封闭2h，并加入来源于每个克隆的条件培养液。以O-苯二胺(Sigma)和过氧化氢为底物，使用辣根过氧化物酶连接的山羊抗小鼠IgG和山羊抗小鼠IgM(StressGen)，来检测结合抗原的抗GPC3抗体的存在。随后进一步扩增阳性克隆，并用免疫荧光来检测其标记GPC3转染293细胞的能力。将名为1G12和8H5的该阳性杂交瘤再克隆2次，并使用Isostrip(Roche)测定其同型性(IgG1，K)。使用蛋白A柱(Affi-Gel Protein A MAPS II kit，Bio-Rad)从条件培养液上清中纯化抗体。
免疫荧光：将GPC3-或载体单独转染的293细胞接种在用多聚L赖氨酸处理的玻片上，并用含4％多聚甲醛的PBS来固定。以抗GPC3单克隆抗体或普通的小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)(15μg/ml)孵育1小时后，用PBS洗涤该玻片3次，然后用FITC连接的绵羊抗小鼠IgGF(ab′)2片段(StressGen)来检测结合的第一抗体。
Westem印记分析：在冰上通过含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(2mMPMSF、10μg/ml leupeptin、10μg/ml aprotinin)将细胞裂解30分钟。将该蛋白样本在6％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移至PVDF膜(Pall Corporation)上。室温下，将该膜在封闭缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl 0.1％Tween20，5％脱脂奶粉)中封闭1小时，随后在4℃用1μg/ml1G12或12CA5单克隆抗体孵育过夜。在使用辣根过氧化物酶抗小鼠IgG第二抗体孵育1小时后，用化学发光ECL试剂(DuPontNEN)来检测蛋白带。
免疫组织化学：石蜡包埋的组织切片通过二甲苯脱蜡，并用一系列梯度乙醇溶液再水化。将该玻片在10mM pH6的柠檬酸缓冲液中通过Kenmore微波炉加热(功率水平10、2分钟，功率水平6、1.5分钟，及功率水平9、2.5分钟，并重复此3个步骤2次)进行抗原修复。使用蒸馏水洗涤该玻片，并用一系列梯度乙醇脱水，并浸入溶于甲醇的10％过氧化氢中，来阻断内源性过氧化氢酶。再水化该玻片，然后根据Histostain-SP试剂盒(Zymed Laboratories)和TSATM生物素系统(NENLife Science Products)的说明书，用20μg/ml的抗GPC3单克隆抗体(或用普通的小鼠IgG和PBS作为阴性对照)进行免疫标记。用1/400稀释的抗AFP的家兔多克隆抗体(Dako，A008)标记连续切片。通过过氧化氢水溶液来阻断内源性过氧化物酶，并通过Ultra HRP系统(ID Labs)检测抗体的结合。
夹心ELISA：每孔用溶于50μl PBS的0.5μg抗GPC3单克隆抗体1G12来包被96孔ELISA培养板。用含1％BSA的PBS将该培养板封闭2小时，加入50μl稀释的血清样本(用PBS以1∶3稀释)并在4℃孵育过夜。用含1％BSA的PBS洗涤未结合的物质后，使用抗GPC3绵羊多克隆抗体22来检测结合的GPC3，随后以O-苯二胺(Sigma)和过氧化氢为底物，用辣根过氧化物酶连接的驴抗绵羊IgG(Sigma)孵育。为量化血清中的GPC3，通过向一组相同稀释度的正常血清中平行加入纯化的GPC3得到校准曲线。为测定正常血清中GPC3的含量，在PBS中制作GPC3校准曲线。每个样本分成4份，测量3次。
统计学分析：用Mann-Whitney检验测定各组间的显著性差异。
AFP的血清浓度：使用商业销售的ELISA试剂盒(Axsym，Abbott)测定平行血清样本中的AFP水平。
实施例1：抗GPC3多克隆抗体的纯化及特性
编码人GPC3的70个连续C末端氨基酸的GPC3cDNA克隆(如上文的Filmus et al.所述)的一部分以谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白形式在常规的Ecoli表达系统中表达。
使用谷胱甘肽柱纯化的上述融合蛋白，可通过常规的方法使绵羊免疫。如″Antiboby，a Laboratory Manual″，(1988)，Ed.Harlow et al.ColdSpring Harbor中所述，可通过常规的方法来对抗此70个氨基酸免疫原的多克隆抗体进行亲和纯化。该多克隆抗体可用于Western印记和免疫共沉淀的研究。
实施例2：产生抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤的制备
使用相同的免疫原，即使用包括人GPC3的C末端70个氨基酸的GST融合蛋白来制备单克隆抗体。此70个氨基酸区域是物种间最少的保守序列，因此能够用于产生人GPC3特异抗体。如Kohler and Milstein，Nature，256：495-497，(1975)中所述，使用本领域所属技术人员公知的方法产生杂交瘤细胞。
简单说来，通过给Balb/C雌性小鼠单剂量腹腔(i.p.)注射50μg His标签的含羧基末端70个氨基酸的人GPC3片段，使其免疫，其中该免疫原通过Titermax GoldTM(Cedarlane)佐剂乳化。21天后，该小鼠用50μg不含佐剂的相同免疫原进行强化。2天后，从其尾静脉收集血液样本，并获得相应的血清。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)，并用来自同一小鼠的免疫前血清作为阴性对照，来检测该血清样本中抗GPC3的滴定度。使用常规的方法1(Parkin，D.M.Pisani，P.& Ferlay，J.Global cancerstatistics.CA.Cancer J. Clin，49，33-64，1，(1999))，在聚乙二醇4000(Sigma)存在的情况下，将具有最高滴定度的2只小鼠的脾细胞与SP2/0Ag14小鼠骨髓瘤细胞(比例6∶1)融合。将融合的细胞接种于96孔培养板并在加有作为生长因子来源的Nutridoma-CSTM(Roche)及用于杂交选择的次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶核苷的α-MEM、10mM Hepes、50μM2-巯基乙醇及含20％FBS的培养液中扩增。通过ELISA，用加载了0.05μg羧基末端GPC3片段/每孔的96孔板来筛选获得的克隆。用溶于PBS中的1％BSA将该培养板封闭2h，并在所述条件培养液上清中孵育。以O-苯二胺(Sigma)和过氧化氢作底物，通过辣根过氧化物酶连接的山羊抗小鼠IgG和山羊抗小鼠IgM(StressGenTM)，来检测第一抗体的结合。使用GPC3转染的细胞通过免疫荧光再次筛选该阳性克隆。将所选择的杂交瘤(1G12和8H5)克隆2次，并通过IsostripTM(Roche)测定其同型性(IgG1，K)，使用蛋白A柱层析Affi-Gel Protein A MAPS II试剂盒(Bio-RadTM)从条件培养液上清中纯化该杂交瘤。
使用ELISA筛选该杂交瘤细胞产生的抗体对70个氨基酸GPC3片段的抗性。随后检测阳性克隆特异标记GPC3转染细胞的能力。两株杂交瘤细胞(1G12和8H5)所产生的抗体显示了较强地和特异地免疫标记GPC3转染细胞的能力。图1所示为用1G12抗体标记293细胞，随后用荧光第二抗体标记。照片A和C为相差显微照片而照片B和D为荧光显微照片。照片A和B所示为只用载体转染的293细胞显微照片，而照片C和D所示为含GPC3的载体转染的293细胞照片。在此实施例中，细胞用10μg/ml单克隆抗体(mAb)1G12来标记。照片D清楚地显示mAb 1G12的特异性标记。在只有载体转染的细胞中未见标记(照片B)。
实施例3：单克隆抗体的特性
通过对HA-标签-GPC3-转染细胞来源的蛋白裂解液进行Western印记分析，确认由1G12和8H5杂交瘤产生的两种单克隆抗体的特异性。如图2所示，抗体1G12检测的条带对应此GPC3核心蛋白，该smear对应GPC3的糖基化形式。作为对照，用抗HA抗体(12CA5)进行了平行Western印记分析。
实施例4：组织切片中的GPC3
利用上述抗GPC3单克隆抗体1G12对HCC肿瘤与其周围的非恶性细胞的石蜡切片进行免疫组织化学标记。利用生物素化的抗小鼠免疫球蛋白第二抗体来检测该抗GPC3抗体，并用streptavidin连接的辣根过氧化物来检测该结合的第二抗体。
如图3所示，该抗GPC3单克隆抗体1G12，较强地结合到肿瘤细胞上，而却完全没有与正常肝细胞结合。除预计的细胞膜上存在的GPC3外，还观察到细胞浆中有明显标记。该细胞浆标记多数为颗粒状并靠近细胞表面。偶而观察到核周围的标记。除巨噬细胞外，非实质细胞(Non-parenchymal cells)通常为阴性。这些结果表明通过检测GPC3，抗GPC3单克隆抗体可用来从肝组织切片中诊断HCC。
实施例5：恶性与良性病灶中GPC3表达的离体测定
表1总结了抗GPC3单克隆抗体与15例不同肝细胞癌反应的免疫组织化学研究结果。这些HCC中的12例(80％)与抗GPC3单克隆抗体反应。在每种肿瘤中，与该抗GPC3单克隆抗体反应的标记细胞数量有所不同。阳性细胞通常集簇在集落样(clone-like)区域。在所有病例中，环绕在肿瘤周围的非恶性细胞为阴性。
表1.在HCC中的GPC3表达
HCC的Acc.编号 单克隆抗体1G12 单克隆抗体8H5 阳性细胞的％
  2188-96I   3  3   70
  21914-   3  3   80
  4865-99   3  3   90
  7530-93A   3  3   100
  7590-98B   3  2   90
  28828-99A   3  -   100
  12056-97   2  2   40-60
  19626-98A   1  1   1-5
  18891-96   1  1   5
  6301-99B   1  1   20
  2978-97B   1   1   1
  5940-96   1   1   5-10
  21424-98A   0   0   -
  10355-97D   0   0   -
  10865-01C   0   0   -
表2所示为抗GPC3单克隆抗体与恶性及良性肝组织反应结果的总结。6例肝脏腺瘤与9例肝脏发育不良对GPC3反应阴性。
表2.在非恶性肝脏组织中的GPC3表达
  肝组织类型   检测的肝组织类型的数量   GPC3表达(％)
  HCC   23   19(83％)
  高度发育不良   3   0(0％)
  低度发育不良   6   0(0％)
  肝细胞腺瘤   6   0(0％)
  正常肝脏   34   0(0％)
这些数据表明，在正常肝脏和良性病灶中，不表达GPC3，而多数HCCs表达可检测水平的glypican-3。
实施例6：GPC3检测的免疫学分析
通过夹心ELISA来测定确诊为HCC的病人血清中的GPC3。在此ELISA中，用抗GPC3单克隆抗体1G12来包被96孔培养板，并加入一份待测血清。通过洗涤除去未结合的物质，利用如实施例1制备的抗GPC3绵羊多克隆抗体来检测结合的GPC3，使用直接或间接复合的检测试剂检测该免疫复合物的存在。测量该样本的光密度并与标准曲线进行比较。图4显示了用于分析的标准曲线。在检测的范围内将分析结果线性化。
建立收集病人血清的试验方案，这些病人正在多伦多总医院接受HHC治疗，并签署了同意书。在初始研究中，收集了9例HCC患者的血清。同样从血液捐献者和储存库中收集了38例正常血清。通过夹心ELISA分析，使用1∶3(血清∶PBS)稀释的样本测定GPC3水平。每个样本分析重复4次。通过比较每个样本与标准曲线的OD值得出GPC3的浓度，该标准曲线是通过在一组相同稀释度的正常血清中加入不同剂量的GPC3而产生的。
表3总结了该研究的结果。9例HCC病人中的5例(55％)表现出GPC3值明显升高。没有病人的AFP水平显著增加。在任意正常样本中没有检测到GPC3。
表3.
  病人编号#   GPC3水平(ng/ml)   标准误差  P值
  1   100.6   17.7  0.0027(<sup>*</sup>)
  2   292.4   16.7  ＜0.0001(<sup>*</sup>)
  4   84.9   19.3  0.0081(<sup>*</sup>)
  5   0   9.6  NS
  6   75.4   9.0  0.0014(<sup>*</sup>)
  7   14.9   3.5  NS
  8   44.4   54.3  NS
  9   102.6   12.9  0.0001(<sup>*</sup>)
  10   0   12.9  NS
  储存的正常血清   0   10.1
*与正常血清比较具有显著性差异
通过使用夹心ELISA测量53例健康者、18例肝炎患者、20肝炎合并肝硬化患者、34肝细胞癌患者(HCC)血清中GPC3的水平进行了额外的研究。发现在所有健康者中没有检测到GPC3，并且34例HCC患者中有18例(53％敏感性)表现出血清GPC3水平显著升高，其GPC3值的范围为151～2924ng/ml(图5和表4)。此外，在所有肝炎病人中没有检测到GPC3，而在20例肝炎合并肝硬化患者中只有1例(5％)检测到GPC3，其水平为117ng/ml(95％特异性)。使用Mann-Whithey检验进行统计学分析显示，HCC患者的血清GPC3平均水平(ng/ml)显著高于肝炎合并肝硬化患者、肝炎患者和健康捐献者，而在后三组中没有显著性差异。
实施例7：GPC3与AFP水平的比较
使用商业销售的ELISA试剂盒(Axsym，Abbott)，对与实施例6中所述相同的34例HCC患者进行了血清AFP水平的测量。表4显示了测得的AFP与GPC3值的比较。
表4.HCC患者血清中GPC3与AFP的含量
Figure C0381079100251
Figure C0381079100261
本发明并不限于本文描述的实施方案的特征，还包括在本发明权利要求范围内的所有变化或修改。

Claims (17)

1.通过检测体液样本中的GPC3存在来诊断肝细胞癌的试剂盒，包括：
与所述体液样品中GPC3或其片段特异结合的抗体或其片段。
2.如权利要求1所述的试剂盒，进一步包括：
与人甲胎球蛋白特异结合的抗体或其片段。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其中检测到下列两种情况中至少一种则诊断患有肝细胞癌：所述样本中GPC3达到可检测水平；所述样本中甲胎球蛋白水平高于正常对照个体的甲胎球蛋白水平。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述抗体或其片段与人GPC3的70个连续羧基末端氨基酸中的抗原决定簇特异结合。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述抗体或片段是单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述抗体或片段选自Fab、F(ab′)2及Fv片段。
7.如权利要求1所述的试剂盒，还包括用于检测或测定GPC3-抗体复合物或GPC3-抗体片段复合物含量的装置。
8.如权利要求1-7中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述抗体或抗体片段携带检测用的标记。
9.如权利要求1-7中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述抗体或抗体片段附着在固体基质上。
10.如权利要求1-7中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述体液是血清或血浆。
11.与GPC3或其片段特异结合的抗体或其片段在通过检测体液样本中的GPC3存在来诊断肝细胞癌的试剂盒制备中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或片段能够与人GPC3的70个连续羧基末端氨基酸中的抗原决定簇特异结合。
13.如权利要求11或12所述的用途，其中所述抗体或片段为单克隆抗体。
14.如权利要求11或12所述的用途，其中所述抗体或片段选自Fab、F(ab′)2和Fv的片段。
15.如权利要求11或12所述的用途，其中所述抗体或抗体片段携带检测用的标记。
16.如权利要求11或12所述的用途，其中所述抗体或抗体片段附着在固体基质上。
17.如权利要求11或12所述的用途，其中所述体液是血清或血浆。
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