CN102331504A - Abo-cde血型鉴定试剂卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ABO-CDE血型鉴定试剂卡，试剂卡上具有8个微柱凝胶管，分别是：一管为含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶管、一管为用于阴性对照的含有凝胶缓冲液的凝胶管、两管为用于反定型含有凝胶缓冲液的凝胶管。本发明的实施为ABO-CDE血型鉴定提供了标准化，各大医院和采供血机构可以用本标准一致的ABO-CDE血型鉴定试剂卡，进行准确的ABO-CDE血型鉴定，为保证输血安全创造了条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种血型定型卡的制备及其应用。更具体的说，本发明涉及一种ABO-CDE血型定型试剂卡的组成、制备方法及其应用，涉及输血医学领域。
背景技术
ABO血型系统和Rh血型系统是人类最为重要的两个血型系统，高度的免疫原性使它们具有重要的临床意义，尤其是与临床急救输血、器官移植等关系较为密切。因此，开展ABO血型及Rh血型抗体的研究对临床血型鉴定、血型理论研究及应用血型抗体预防和治疗新生儿溶血病等具有重要意义。
自1900年发现ABO血型以来，Hoktoen1907年先提出了血型鉴定在输血治疗中的重要性。Ottenberg等再1908年进一步提出了交叉配血实验的概念，强调了血型鉴定对临床输血的深远意义。输血是临床抢救病人生命的重要医疗手段之一，正确鉴定血型是安全输血的首要步骤，ABO血型不相容在临床输血中会导致严重的即发性溶血性输血反应，危及患者生命。因此，ABO血型的准确定型至关重要，是安全输血的基础和保障。
Levine等于1939年发现了人类的Rh血型，之后证明该血型是仅次于ABO血型的重要血型，也是红细胞系统中最为复杂的一个系统，目前国际输血协会(ISBT)已确认Rh血型抗原有49个。Rh血型系统的5种主要抗原为D、C、E、c、e抗原，其中抗原D抗原性最强。红细胞表面含有Rh阳性抗原，红细胞表面不含有Rh阴性抗原，当Rh阴性患者接受Rh阳性血液后，至少有20％患者会对Rh抗原发生免疫应答，在第二次或多次输入Rh阳性血液时即可发生溶血反应。
另外，Rh阴性妊娠妇女在孕育Rh阳性胎儿或孕前接受过Rh阳性的血液，可产生Rh抗体，Rh抗体主要是不完全抗体IgG，分子能透过胎盘。若再次妊娠的胎儿为Rh阳性时，此抗体通过胎盘键入胎儿体内，与相应的Rh阳性红细胞发生反应，可能发生新生儿溶血病。
2000年卫生部颁发的《临床输血技术规范》(卫医法[2000]184号)第四章第十五条明确规定：“输血科(血库)要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型(正反定型)。并常规检查患者的Rh血型，正确无误时可进行交叉配血。
在国内外，有些产家已采用的凝胶为葡聚糖凝胶，此凝胶颗粒的直径大约在20-50微米，生产了用于ABO血型定型和Rh系列定型的ABO/Rh血型定型检测试剂卡，但已有的卡仅进行ABO正定型，不进行ABO反定型，降低了ABO血型定型的准确性，容易导致ABO血型的错误。此外，已有的ABO/Rh血型检测卡仅进行D(Rh1)的鉴定，但没有Rh(Rh2、Rh3)系列的定型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用方便、灵敏度高、准确性好的ABO-CDE血型鉴定试剂卡及其制备方法。
本发明的技术解决方案是：
一种ABO-CDE血型鉴定试剂卡，其特征是：试剂卡上具有8个微柱凝胶管，分别是：一管为含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶管、一管为用于阴性对照的含有凝胶缓冲液的凝胶管、两管为用于反定型含有凝胶缓冲液的凝胶管。
一种ABO-CDE血型鉴定试剂卡的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
1)凝胶缓冲液的配制
所述缓冲液配方如下：
20mL的0.15M磷酸盐缓冲液
氯化钠 1.75g
甘氨酸 18g
其中20mL的0.15M磷酸盐缓冲液由11.3mL的0.15M KH2PO4和8.7mL的0.15M Na2HPO4组成；
以上试剂用800毫升蒸馏水溶解，用1M氢氧化钠调节pH至6.7，最后定容至1升；再添加0.6g对羟基苯甲酸甲酯和0.13g对羟基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量为使牛血清白蛋白的终浓度为3％；得到凝胶悬浮缓冲液；
2)凝胶的准备
选用颗粒大小为20-50微米的葡聚糖凝胶，用步骤1)配制的凝胶缓冲液充分浸泡后再用该缓冲液洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀完整呈球形的凝胶；
3)抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64
选择IgM性质的单克隆抗C抗体，效价≥64
选择IgM性质的单克隆抗E抗体，效价≥64
4)凝胶的配制
将步骤2)制备的凝胶与步骤3)所选择的各个抗体按照体积65％∶35％的比例混合，分别配制成一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶；将2)制备的凝胶与1)配制的凝胶缓冲液按照上面相同的比例混合，配制成三管含有凝胶悬浮介质的凝胶，其中一管用于阴性对照，两管用于反定型鉴定；
5)分装
将步骤4)中含各种抗体或含有凝胶缓冲液的凝胶管分别加入到一空白卡片的8个微柱管中，形成具有8个微柱凝胶管的ABO-CDE血型定型检测试剂卡。
本发明的优点是：
一个方面：标准化的凝胶缓冲液体系用于凝胶的溶胀、悬浮和洗涤，并可以长时间维持抗体以及凝胶的稳定，其特点在于：
①使用具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸盐和氨基酸组成的缓冲体系，体系的pH维持在6.7左右。与常规输血领域使用的枸橼酸缓冲体系相比，具有更强的缓冲能力，有利于保证整个体系处于合适的缓冲范围。
②本发明的凝胶缓冲液具有低离子浓度体系，用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助微量的磷酸盐维持低离子强度环境，保持凝胶颗粒呈圆球颗粒并充分溶胀，使凝胶颗粒的直径大小控制在一定的范围内。同时低离子强度盐水可以增加抗原抗体之间的引力，使原来在盐水介质中不能凝集红细胞的抗体能够发生凝集。可加快反应速度，缩短保温的时间。
③本缓冲液具有润滑体系，采用一定浓度的牛血清白蛋白，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。
④具有防腐作用，大量文献证实选择有机物苯甲酸酯类作为防腐剂，能有效防止细菌的繁衍，相对于叠氮钠不仅具有更长时间的保存期，而且可以避免使用叠氮钠化学防腐剂对凝胶悬浮介质体系的离子强度提升，从而对ABO-CDE血型鉴定试剂卡的灵敏度和特异性产生的不良影响。
另一方面，为了保证本发明ABO-CDE血型鉴定试剂卡的质量，在凝胶准备过程中需要选择适当的凝胶，现所选择的凝胶颗粒直径为20-50微米。通过对葡聚糖凝胶颗粒进行充分溶胀，洗涤去除破损的凝胶颗粒和超大或超小凝胶颗粒。洗涤后的凝胶用悬浮缓冲液来悬浮凝胶。除了筛选凝胶的颗粒外，另外还需选择合适效价的抗体。
本发明的ABO-CDE血型鉴定试剂卡之所以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年半的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用，凝胶颗粒排列于一张卡上可以保证仅使用一张卡就能完成ABO-CDE血型定型，缓冲体系可以维持反应体系需要的pH，低盐弄许体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证凝胶颗粒之间的润滑能力。有机防腐剂可以防止凝胶或抗体因细菌污染而失效。呈球形的凝胶可以保证凝胶颗粒之间合适的间隙。合适的抗体为抗原的检测提供有效的保障。
本ABO-CDE血型鉴定试剂卡可以用于ABO-CDE血型鉴定，产生的阳性反应不低于3+。一般在2-25℃条件下保存有效期不低于18个月。
本发明的实施为ABO-CDE血型鉴定提供了标准化，各大医院和采供血机构可以用本标准一致的ABO-CDE血型鉴定试剂卡，进行准确的ABO-CDE血型鉴定，为保证输血安全创造了条件。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一种ABO-CDE血型鉴定试剂卡的制备方法，包括下列步骤：
1)凝胶缓冲液的配制
所述缓冲液配方如下：
20mL的0.15M磷酸盐缓冲液
氯化钠 1.75g
甘氨酸 18g
其中20mL的0.15M磷酸盐缓冲液由11.3mL的0.15M KH2PO4和8.7mL的0.15M Na2HPO4组成；
以上试剂用800毫升蒸馏水溶解，用1M氢氧化钠调节pH至6.7，最后定容至1升；再添加0.6g对羟基苯甲酸甲酯和0.13g对羟基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量为使牛血清白蛋白的终浓度为3％；得到凝胶悬浮缓冲液；
2)凝胶的准备
选用颗粒大小为20-50微米的葡聚糖凝胶，用步骤1)配制的凝胶缓冲液充分浸泡后再用该缓冲液洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀完整呈球形的凝胶；
3)抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64
选择IgM性质的单克隆抗C抗体，效价≥64
选择IgM性质的单克隆抗E抗体，效价≥64
4)凝胶的配制
将步骤2)制备的凝胶与步骤3)所选择的各个抗体按照体积65％∶35％的比例混合，分别配制成一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶；将2)制备的凝胶与1)配制的凝胶缓冲液按照上面相同的比例混合，配制成三管含有凝胶悬浮介质的凝胶，其中一管用于阴性对照，两管用于反定型鉴定；
5)分装
将步骤4)中含各种抗体或含有凝胶缓冲液的凝胶管分别加入到一空白卡片的8个微柱管中，形成具有8个微柱凝胶管的ABO-CDE血型定型检测试剂卡。
6)半成品检测
要求分装好的微柱凝胶管具有抗体与相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。而与不含抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶缓冲液和凝胶混合物的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。
7)封口
用铝箔纸微柱管上口密封。贴标签标记后于2-25℃保存。
8)保存实验
上述完成的ABO-CDE血型鉴定试剂卡可以在于2-25℃下保存18个月，保存期间，该ABO-CDE血型鉴定试剂卡具有以下检测结果：
(1)外观：
ABO-CDE血型鉴定试剂卡是由8个微柱管组成，凝胶均为乳白色，胶面上端有1-2mm清澈透明的液体，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物。
(2)灵敏度
含有抗体的微柱凝胶管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，且红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。
(3)特异性
含抗体的微柱凝胶管中具有与抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型；与不含抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶缓冲液的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。
上述ABO-CDE血型鉴定试剂卡使用方法：
1、ABO-CDE血型鉴定试剂卡由8个凝胶管组成，其中一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶、两管用于反定型的含凝胶缓冲液的凝胶管和一管用于阴性对照的含有凝胶缓冲液的凝胶管。即第一管是含抗A抗体的凝胶，第二管是含抗B抗体的凝胶，第三管是含抗D抗体的凝胶，第四管是含抗C抗体的凝胶、第五管是含抗E抗体的凝胶、第六管是用于阴性对照、第七、八管用于反定型鉴定。
2、用低离子盐溶液(LISS)或生理盐水(NS)将待测者红细胞配制成0.8％(v/v)，分别加入第一、第二、第三、第四、第五和第六支微管中，50μL/管。
3、将A型、B型红细胞试剂用LISS溶液或NS调节至终浓度为0.8％，分别加到第七和第八支微管中，50μL/管。
4、将待检者血清/血浆分别加入第七和第八支微管中，50μL/管。混匀后，室温孵育10min。
5、用微柱凝胶卡专用离心机离心，900rpm 2min，1500rpm3min，取出后肉眼判定结果，记录。
6、结果判断
阳性结果：红细胞悬浮在凝胶表面或胶中。
阴性结果：红细胞沉积于微柱凝胶的底部。
7、血型判断见下表
ABO系列
| 管A | 管B | 管(对照) | 管NA | 管NA | ABO |
| 0 | 0 | 0 | + | + | O |
| 0 | + | 0 | + | 0 | B |
| + | 0 | 0 | 0 | + | A |
| + | + | 0 | 0 | 0 | AB |
由此可以看出本发明的优异效果。
Claims (2)
1. 一种ABO-CDE血型鉴定试剂卡，其特征是：试剂卡上具有8个微柱凝胶管，分别是：一管为含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶管、一管为含有IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶管、一管为用于阴性对照的含有凝胶缓冲液的凝胶管、两管为用于反定型含有凝胶缓冲液的凝胶管。
2. 一种权利要求1所述的ABO-CDE血型鉴定试剂卡的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
1）凝胶缓冲液的配制
所述缓冲液配方如下：
20 mL的0.15 M 磷酸盐缓冲液
氯化钠 1.75 g
甘氨酸 18 g
其中20 mL的0.15 M 磷酸盐缓冲液由11.3 mL的0.15 M KH2PO4和8.7 mL的0.15 M Na2HPO4组成；
以上试剂用800毫升蒸馏水溶解，用1 M 氢氧化钠调节pH至 6.7，最后定容至1升；再添加0.6g对羟基苯甲酸甲酯和0.13g对羟基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量为使牛血清白蛋白的终浓度为3%；得到凝胶悬浮缓冲液；
2）凝胶的准备
选用颗粒大小为20-50微米的葡聚糖凝胶，用步骤1）配制的凝胶缓冲液充分浸泡后再用该缓冲液洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀完整呈球形的凝胶；
3）抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64
选择IgM性质的单克隆抗C抗体，效价≥64
选择IgM性质的单克隆抗E抗体，效价≥64
4）凝胶的配制
将步骤2）制备的凝胶与步骤3）所选择的各个抗体按照体积65%∶35%的比例混合，分别配制成一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、一管含有IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶；将2）制备的凝胶与1）配制的凝胶缓冲液按照上面相同的比例混合，配制成三管含有凝胶悬浮介质的凝胶，其中一管用于阴性对照，两管用于反定型鉴定；
5）分装
将步骤4）中含各种抗体或含有凝胶缓冲液的凝胶管分别加入到一空白卡片的8个微柱管中，形成具有8个微柱凝胶管的ABO-CDE血型定型检测试剂卡。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 225300 Taizhou national pharmaceutical hi tech Zone, Jiangsu, Taizhou, China G90 Applicant after: Jiangsu Zhongsheng Medical Diagnostic Reagent Co., Ltd. Address before: 226000 No. 111 worker peasant Road, Jiangsu, Nantong Applicant before: Jiangsu Zhongsheng Medical Diagnostic Reagent Co., Ltd. |
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| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120125 |