ES2625881T3 - Inmunoensayos de flujo lateral para la detección de anticuerpos contra fármacos biológicos - Google Patents

Abstract

Inmunoensayo de flujo lateral para la detección de anticuerpos anti-fármaco contra un fármaco biológico que comprende: una membrana que comprende: - un área de captura; - un área de aplicación de muestra; - una trayectoria de flujo del área de aplicación de muestra al área de captura; y - un área de conjugado situada en la trayectoria de flujo, caracterizado por que el área de conjugado comprende dicho fármaco biológico marcado de forma detectable y el área captura comprende dicho fármaco biológico inmovilizado.

Description

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Inmunoensayos de flujo lateral para la deteccion de anticuerpos contra farmacos biologicos

La presente invencion se refiere al area de diagnostico in vitro. Mas precisamente, la presente invencion se refiere a inmunoensayos de flujo lateral para la deteccion de anticuerpos contra farmacos biologicos y metodos y usos de los mismos.

En la ultima decada se ha producido una revolucion en el tratamiento de pacientes con diversas enfermedades inmunoinflamatorias, por ejemplo enfermedades artrfticas (por ejemplo, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante), enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), enfermedades de la piel (por ejemplo, psoriasis, hidradenitis supurativa), enfermedades no infecciosas del ojo (por ejemplo, el edema macular diabetico, degeneracion macular relacionada con la edad) y asma refractaria (Furst, DE., y otros, Arthritis Care Res, 2011, 63, 856-864; Jemec, GB., Br J Dermatol, 2013, 168, 233). La citoquina proinflamatoria Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-V) desempena un papel crucial en la patogenesis de estas y otras enfermedades inflamatorias y autoinmunes (Kopylov, U., y otros, Alimentary pharmacology & therapeutics, 2011, 33, 349-357).

En los ultimos anos, han emergido farmacos biologicos (por ejemplo anticuerpos monoclonales) como una alternativa prometedora y se espera que ganen importancia en los proximos anos (Nelson, T y Smith, D.L., Corporacion de informacion de salud al consumidor, 2008,1-2). Desde la aprobacion del primer anticuerpo monoclonal terapeutico contra el TNF-V hace quince anos, el uso de farmacos biologicos en la practica clfnica ha crecido constantemente. El tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes que son generalmente refractarias a los tratamientos convencionales ha mejorado considerablemente desde que se introdujeron los regfmenes de combinacion de estos nuevos farmacos biologicos y los farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (FARME) clasicos (Krieckaert, CL., y otros, Arthritis Res Ther, 2010, 12, 217).

El Infliximab (IFX) es un anticuerpo monoclonal quimerico raton-humano dirigido contra el TNF-V. Ademas, el IFX constituye la primera terapia basada en anticuerpos que fue aceptada para el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide (Ra por sus siglas en ingles). En la actualidad, su utilizacion se ha generalizado mas y se administra a un numero creciente de pacientes en una etapa temprana de la enfermedad. Algunos pacientes responden inicialmente al tratamiento pero su capacidad de respuesta disminuye posteriormente (Bendtzen, K., y otros, Arthritis Rheum, 2011, 63, 867-870). Una de las supuestas razones de este fenomeno es la inmunogenicidad asociada con el propio farmaco en si; es decir, la respuesta inmunologica del paciente contra el farmaco.

Los farmacos biologicos pueden inducir la formacion de anticuerpos neutralizantes (Vincent, FB. y otros, Ann Rheum Dis, 2013, 72, 165-178), lo que da como resultado una perdida o reduccion de la eficacia del tratamiento y la aparicion de efectos secundarios, tales como reacciones relacionadas con la infusion (Korswagen, LA., y otros, Arthritis Rheum, 2011,63, 877-883). Se ha descrito que existe una correlacion significativa entre los niveles en suero de los farmacos biologicos (DL), los niveles de anticuerpos contra dichos farmacos (LADA) y la respuesta clfnica (Pascual-Salcedo, D., y otros, Rheumatology, 2011, 50, 1445-1452; Plasencia, C., y otros, Ann Rheum Dis, 2012, 71, 1955-1960).

Mientras la cantidad relativa de los anticuerpos contra el farmaco (ADA) sea menor que el nivel mfnimo de IFX en suero, el farmaco puede proporcionar un beneficio clfnico (de Vries, MK., y otros, Ann Rheum Dis, 2007, 66, 12521254). Sin embargo, cuando la produccion endogena de anticuerpos excede la cantidad de farmaco en el suero, este ultimo se elimina de la circulacion (de Vries, MK., y otros, Ann Rheum Dis, 2007, 66, 1252-1254) y la terapia se vuelve ineficaz. La eliminacion acelerada de los farmacos biologicos que forman complejos con anticuerpos puede dar como resultado una disminucion de la disponibilidad farmacologica y, finalmente, en la perdida de eficacia terapeutica del farmaco (Jamnitski, A., y otros, Ann Rheum Dis, 2011, 70, 284-288). Por lo tanto, es muy probable que el equilibrio entre DL (por ejemplo, niveles de IFX) y el LADA regule la eficacia global del farmaco (de Vries, Mk., y otros, Ann Rheum Dis, 2007, 66, 1252-1254). Ademas, la formacion de anticuerpos contra farmacos biologicos esta fuertemente relacionada con el desarrollo de reacciones relacionadas con la infusion (Pascual- Salcedo, D., y otros, Rheumatology, 2011, 50, 1445-1452). Los pacientes con altos niveles de anticuerpos contra farmacos biologicos tienen un mayor riesgo de padecer una reaccion relacionada con la infusion que los pacientes con niveles bajos de anticuerpos contra farmacos biologicos. Las reacciones relacionadas con la infusion se definen como efectos adversos de hipersensibilidad que ocurren durante la infusion de farmacos biologicos o unas pocas horas despues de la infusion. Las reacciones relacionadas con la infusion son reacciones de hipersensibilidad de tipo III, que se producen por la deposicion en los tejidos de complejos inmunes de farmaco biologico - anticuerpo contra farmaco biologico. Esas deposiciones pueden inducir inflamacion y los sfntomas incluyen taquicardia, eritema, dificultad para respirar, dolor de cabeza, fiebre, prurito, entre otros.

En la actualidad, se han dado a conocer varios ensayos y tecnologfas para el analisis de DL y LADA mfnimos (Gorovits, B., AAPS J, 2009, 11, 133-138). Mientras que la mayorfa de los metodos proporcionan resultados precisos y sensibles para la medicion de DL, se encuentran discrepancias o diferencias entre los diferentes ensayos de ADA dados a conocer en el estado de la tecnica:

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- El ELISA puente es el analisis mas comunmente utilizado para la deteccion de inmunogenicidad tanto en el desarrollo de farmacos clmicos como en contextos clmicos (Gorovits, B., AAPS J, 2009, 11, 133-138). El ELISA puente posee una alta especificidad, sensibilidad adecuada y puede ser automatizado. Sin embargo, el ELISA puente es un metodo altamente susceptible a la interferencia por el farmaco y normalmente no es capaz de detectar ADA de baja afinidad o baja avidez debido a la dilucion de la muestra y los multiples etapas de lavado requeridos por la tecnica (Pan, J. y otros, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 2011,63, 150-159).

- Los radioinmunoensayos (RIA) de fase lfquida y solida son metodos sensibles para cuantificar el LADA y son menos propensos a la interferencia de farmacos (Hart, MH., y otros, J Immunol Methods, 2011, 372, 196-203). Sin embargo, estos metodos requieren el uso de instalaciones adaptadas para el uso de radioisotopos. Los RIA de fase solida para medicion de LADa utilizan una estrategia en la que las IgG del suero se unen a protema A inmovilizada en agarosa y se incuban durante la noche con IFX marcado con 125I, antes de medir la radiactividad (Jamnitski, A., y otros, Ann Rheum Dis, 2011, 70, 284-288). No obstante, hasta la fecha, no existe un estandar humano disponible para construir una curva de calibracion para la medicion de LADA, por lo que la mayona de los ensayos proporcionan resultados de respuesta inmune (es decir, LADA) como unidades arbitrarias.

- Los ensayos basados en celulas pueden proporcionar informacion sobre la importancia biologica de la respuesta inmune, (es decir, deteccion de anticuerpos neutralizantes) (Lallemand, C., y otros, J Immunol Methods, 2011, 373, 229-239). Ademas, se sabe que todos los anticuerpos humanos contra farmacos biologicos tales como IFX y adalimumab son antiidiotipicos y, por lo tanto, neutralizantes por definicion (van Schouwenburg, PA., y otros, Ann Rheum Dis, 2012, 72, 104-109). La principal limitacion de los ensayos basados en celulas es que pueden requerir instalaciones para el cultivo celular, almacenamiento a -80°C y un luminometro, los cuales no estan disponibles en un laboratorio clmico.

- Recientemente, se ha dado a conocer que otros metodos, incluidos los ensayos de cambio de movilidad homogenea (HMSA), tienen una tolerancia al farmaco muy alta y detectan ADA en presencia de practicamente cualquier concentracion de farmaco. Por lo tanto, dichos metodos no se limitan a la medicion de niveles mmimos (Wang, SL., y otros, J Immunol Methods, 2012, 382, 177-188). Sin embargo, la aplicabilidad de la tecnologfa espedfica subyacente a estos metodos en un laboratorio clmico normal es cuestionable.

Para la determinacion de LADA, el ensayo basado en ELISA mas comunmente utilizado es el ELISA puente, que se aprovecha de la bivalencia de las inmunoglobulinas (IgG) tipos 1, 2 y 3 para entrecruzar el ADA con moleculas de farmaco tanto inmovilizadas como marcadas (Pascual-Salcedo, D., y otros, Rheumatology, 2011, 50, 1445-1452; Plasencia, C., y otros, Ann Rheum Dis, 2012, 71, 1955-1960). Este es tambien el formato de ensayo implementado en ensayos ELISA disponibles comercialmente (Llinares-Tello, F., y otros, Rheumatol Int, May 10th, 2014; Chen, DY. y otros, January 17th, 2014). El ELISA puente es tambien una de las estructuras de ensayo divulgadas en Tornetta, M., y otros. (Tornetta, M., y otros, Journal of Immunological Methods, 2017, 328, 34-44). En dicho documento, se describe la siguiente estructura y etapas para el ensayo de ELISA puente: 1. recubrimiento de la placa: Ab1 (anticuerpo humano dirigido contra IL-13 humana); 2. incubacion con anticuerpos anti-farmaco (mAb2, mAb4, dos anticuerpos de hibridoma murino espedficos de Ab1 (C188, C189) o anti-suero de mono inmunizado con Ab1 (poly- 35); 3. incubacion con Ab1 biotinilado; 4. incubacion con estreptividina-HRP; y 5. adicion de tetrametilbenzidina. Una estructura de ensayo ELISA puente similar se muestra en Abd Serotec (Abd Serotec, “Effective Tools for Drug Monitoring Assays”, 2008, 1-2).

Dicho ELISA puente tambien se muestra como un metodo con potencial para la adaptacion rutinaria en un entorno clmico hospitalario para la monitorizacion de pacientes con la prueba de anticuerpos anti-farmaco, de Ruiz-Arguello, B., y otros. (Ruiz-Arguello, B., y otros., Clin Chem Lab Med, 2013, 51(12), e287-e289).

Las pruebas de DL y LADA se realizan principalmente utilizando muestras de sangre recogidas inmediatamente antes de la administracion de una nueva infusion para medir los llamados niveles mmimos, es decir, la medicion realizada cuando el paciente tiene los niveles mas bajos de farmaco presente en el cuerpo cuando a dicho paciente se le administra un farmaco periodicamente.

Las pruebas actuales requieren una extraccion clmica de la muestra de suero seguida de un ELISA, lo que precisa de mucho tiempo y trabajo y solo se realiza en laboratorios especializados. Como consecuencia, los resultados no estan inmediatamente disponibles para actuar cuando se administra la infusion programada.

Los nuevos metodos con el formato de prueba en el punto de atencion (POC por sus siglas en ingles) proporcionan ventajas sobre las tecnicas anteriormente mencionadas, en cuanto a simplicidad y rapidez de la prueba. Aunque se han descrito dispositivos POC para aplicaciones relacionadas con monitorizacion de terapias con farmacos biologicos, subsisten varios inconvenientes. Por ejemplo, se ha descrito un dispositivo POC como un ensayo rapido de flujo lateral para la monitorizacion in situ de los niveles mmimos de IFX en suero (Corstjens, PL., y otros, Anal Bioanal Chem, 2013, 405, 7367-7375). El metodo incluye un procedimiento de tres etapas en tiras con TNF-V inmovilizado como molecula de captura: flujo de muestra diluida, flujo de tampon de lavado y flujo de reactivo de marcado. El marcador, partmulas de fosforo convertidor luminescente (“up converting phosphor” o UCP) que

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recubren la protefna-A, emite una luz visible de 550 nm cuando es excitado con luz infraroja de 980 nm. Las concentraciones de IFX se determinan mediante medicion de la fluorescencia de UCP en la lfnea de prueba. Otro ejemplo es un ensayo inmunocromatografico desarrollado para la deteccion de anticuerpos contra el virus de la rabia y con la siguiente configuracion o estructura: almohadilla de muestra (en la que se aplica la muestra); almohadilla de conjugado (con el conjugado oro coloidal-RABV G); lfnea de ensayo (con protefna A estafilococica) y lfnea de control (con anticuerpos monoclonales anti-RABV G purificados por afinidad).

Tambien se ha descrito un ensayo de flujo lateral para la deteccion de ADA generados contra IFX (Pan, J. et.al., Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 2011, 63, 150-159). El ensayo comprende una etapa de preincubacion de las muestras de suero tanto con farmaco (por ejemplo IFX) covalentemente ligado a biotina como farmaco (por ejemplo IFX) covalentemente ligado a hapteno organico. Dicha mezcla se aplica a una tira de prueba que contiene partfculas de oro liberables recubiertas de estreptavidina que se han secado en una almohadilla unida a una membrana que comprende una zona o lfnea de prueba con anticuerpos anti-haptenos. El resultado de la prueba se puede detectar mediante la presencia o ausencia de una lfnea roja visible formada en la zona o lfnea de prueba. Sin embargo, tal como se menciono anteriormente, este ensayo requiere una etapa de preincubacion que dura varias horas y no permite, por lo tanto, obtener resultados inmediatos para la toma de decisiones sobre la aplicacion de la siguiente dosis del tratamiento.

Por lo tanto, todavfa existe la necesidad de una herramienta de diagnostico que permita la deteccion rapida o casi instantanea y simple de LADA con la minima manipulacion de la muestra, permitiendo asf una monitorizacion mas frecuente y una administracion personalizada y mejor del farmaco biologico, basada en los niveles mfnimos del paciente justo antes de la proxima administracion.

Los inventores de la presente invencion han encontrado una estructura de inmunoensayo de flujo lateral que supera todos los inconvenientes del estado de la tecnica. Mas especfficamente, el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion es pequeno, portatil, simple, rapido, facil de usar y rentable. Ademas, no necesita de un operario cualificado, equipo adicional o manipulacion adicional de la muestra extrafda del paciente y, por lo tanto, reduce dramaticamente el tiempo y los recursos necesarios para determinar si un individuo tiene ADA. Por lo tanto, la presente invencion permite una deteccion cualitativa rapida, casi instantanea, in situ de ADA en pacientes que simplifica y acelera las decisiones clfnicas en el curso de una terapia biologica en enfermedades autoinmunes e inflamatorias, dando la posibilidad de tomar decisiones sobre la administracion de la siguiente dosis de farmacos biologicos sobre la base de los resultados del ensayo.

Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un inmunoensayo de flujo lateral para la deteccion de ADA basado en un sistema inmunocromatografico.

En otras realizaciones, la presente invencion da a conocer un dispositivo para llevar a cabo dicho inmunoensayo de flujo lateral.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un kit para llevar a cabo el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion.

En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere al uso del inmunoensayo de flujo lateral segun la presente invencion para la deteccion de ADA en una muestra de un paciente y, por lo tanto, a la prediccion de una reduccion o perdida en la efectividad de la terapia que se administra a dicho paciente.

En otra realizacion, la presente invencion da a conocer un metodo de modulacion de un tratamiento con farmaco biologico administrado a un paciente que lo precisa basandose en el resultado del inmunoensayo de flujo lateral mencionado anteriormente.

Ademas, la presente invencion tambien se refiere a un metodo de predecir si un paciente respondera o no a un tratamiento o una dosis adicional de un tratamiento en base al resultado del inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para determinar si un paciente debe recibir una dosis adicional de un tratamiento en base al resultado del inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion.

Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos "muestra biologica", "muestra" y sus plurales se utilizan indistintamente y se refieren a una muestra obtenida de un paciente o un individuo que debe ensayarse para la presencia de ADA.

Tal como se utilizan en el presente documento, "farmaco", "farmaco biologico" y sus plurales se utilizan indistintamente y se refieren a farmacos que comprenden o consisten en moleculas biologicas o material biologico, es decir, protefnas, polipeptidos, peptidos, polinucleotidos, oligonucleotidos, polisacaridos, oligosacaridos y fragmentos de los mismos, asf como celulas, tejidos, fluidos biologicos o extractos de los mismos, y que inducen anticuerpos en pacientes.

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Tal como se utilizan en el presente documento, el termino "infliximab" se refiere al anticuerpo monoclonal quimerico infliximab, el cual es la parte activa de muchas moleculas de marca y farmacos biosimilares, tales como, pero sin limitacion a los mismos, Remicade®, Remsima® e Inflectra®, y tambien a los fragmentos de dicha molecula que inducen una respuesta inmunologica en pacientes que es similar a la obtenida con IFX completo.

Tal como se utilizan en el presente documento, el termino "membrana" y su plural se refieren a una superficie de apoyo en la que el farmaco biologico y, si es necesario, el farmaco biologico conjugado con un marcador detectable puede aplicarse segun metodos conocidos en el estado de la tecnica, por ejemplo, union covalente y/o secado, respectivamente.

Tal como se utilizan en el presente documento, el termino "modular" y su plural y derivados se refieren a aumentar, disminuir o mantener una determinada cantidad.

Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos "paciente" e "individuo" y sus plurales se usan indistintamente para referirse a sujetos a los que se realizan pruebas de la presencia de ADA.

Tal como se utilizan en el presente documento, "tratamiento" y su plural se refieren a tratamientos basados en farmacos biologicos o que comprenden el uso de uno o mas de los mismos.

Tal como se utilizan en el presente documento, "nivel minimo" y su plural se refieren al nivel de concentracion mas bajo en el que un farmaco esta presente en el cuerpo. Los farmacos biologicos, tales como Infliximab, se administran periodicamente (por ejemplo, cada ocho semanas, aproximadamente), por lo tanto, un nivel minimo de un farmaco biologico, como Infliximab, se produce en el momento justo antes de la infusion de la siguiente dosis. El momento optimo para la prueba de los niveles mfnimos es el dfa en que el paciente acude al hospital de dfa para recibir el tratamiento, antes de la infusion, o dentro de las 24 horas anteriores a la infusion, o dentro de las 48 horas anteriores a la infusion, o dentro de las 72 horas anteriores a la infusion.

La figura 1 muestra una vista esquematica del inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion con las, como minimo, tres areas que comprende la membrana o tira reactiva: una primera area llamada almohadilla de muestra en la que se aplica la muestra que va a ser examinada para detectar la presencia de ADA (1); una segunda area denominada area de conjugado en la que se coloca el farmaco biologico conjugado a un marcador (2); y una tercera area en la que el farmaco biologico esta inmovilizado en la membrana o tira reactiva para actuar como reactivo de captura (3).

La figura 2 muestra una estructura ejemplar de un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion en la que A es la almohadilla absorbente distal, B es la membrana de nitrocelulosa, C es la almohadilla de conjugacion y D es la almohadilla de separacion de sangre.

La figura 3 muestra los resultados de un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion para una muestra de suero negativa obtenida de un individuo sano (A) y una muestra de suero positiva obtenida de un paciente tratado con infliximab y que contiene 753 U/ml de ADA contra IFX (B).

La figura 4 muestra los resultados de un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion para un una muestra de sangre entera negativa (A) y positiva dopada con suero que contiene 241 U/ml de ADA contra IFX (B).

La figura 5 muestra resultados de un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion con una serie de diluciones 1:1 a partir de una muestra de suero positiva que contiene 506 U/ml de ADA contra IFX, preparada mediante dilucion seriada en un suero negativo (A) (CL indica lfnea control; TL indica lfnea de prueba). Dichos resultados fueron analizados mediante interpretacion visual por puntuacion Rann (B) y por lectura con un escaner (puntuacion Camag) (C). En la figura 5 (B) el eje x muestra U de ADA contra IFX/ml de suero y el eje y muestra la puntuacion Rann. En la figura 5 (C) el eje x muestra U de ADA contra IFX/ml de suero y el eje y muestra los datos Camag. De derecha a izquierda en la figura 5 (A), (B) y (C), las concentraciones de ADA en las muestras aplicadas a las tiras son de: 506 U/ml, 253 U/ml, 127 U/ml, 63 U/ml, 32 U/ml, 16 U/ml y 0 U/ml).

La figura 6 muestra los resultados de un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion con una muestra de sangre positiva para anticuerpos contra infliximab, preparada dopando sangre entera con un suero positivo que contiene 384 U/ml de ADA contra IFX y posteriores diluciones seriadas 1:1 de la muestra de sangre dopada con sangre negativa contra IFX, preparada mediante dilucion seriada en un suero negativo (A) (CL indica lfnea control; TL indica lfnea de prueba). Dichos resultados se analizan mediante interpretacion visual por puntuacion Rann (B) y por lectura con un escaner (puntuacion Camag) (C). Las figuras 6 (B) y (C) tambien muestran los resultados obtenidos para la misma dilucion seriada realizada solamente con suero. En la figura 6 (B), el eje x muestra U de ADA contra IFX/ml de suero o sangre entera dopada y el eje y muestra la puntuacion Rann. En la figura 6 (C) el eje x muestra U de ADA contra IFX/ml de suero o sangre entera dopada y el eje y muestra los datos Camag. De derecha a izquierda en la figura 6 (A), (B) y (C), las concentraciones de ADA en las muestras aplicadas a las tiras son: 384 U/ml, 192 U/ml, 96 U/ml, 48 U/ml, 24 U/ml, 12 U/ml y 0 U/ml). Ademas, en las figuras 6 (B) y (C), las barras blancas

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hacen referencia a muestras de serum y las barras en diagonal hacen referencia a muestras de sangre entera (ambas dopadas o no suero positivo).

Por lo tanto, tal como se indico anteriormente, uno de los aspectos de la presente invencion se refiere a un inmunoensayo de flujo lateral para la deteccion de ADA contra un farmaco biologico, basado en un sistema de inmunocromatograffa, que comprende: una membrana que comprende:

- un area de captura;

- un area de aplicacion de muestra;

- una trayectoria de flujo desde el area de aplicacion de muestra al area de captura; y

- un area de conjugado en la trayectoria de flujo, caracterizada porque el area de conjugado comprende dicho farmaco biologico marcado de forma detectable y el area de captura comprende dicho farmaco biologico inmovilizado.

En una realizacion preferente, el farmaco biologico es un anticuerpo monoclonal, quimerico, humano, humanizado fragmentos humanos Fab o fusion de moleculas utilizadas en la terapia contra la enfermedad autoinmune y/o inflamatoria. En la realizacion mas preferente, el farmaco biologico es IFX. Por lo tanto, en la realizacion preferente, la presente invencion se refiere a un inmunoensayo de flujo lateral para la deteccion de ADA contra IFX que comprende IFX marcado de forma detectable en el area de conjugado e IFX inmovilizado en el area de captura. La membrana utilizada en el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion puede estar hecha de una variedad de materiales por los que la muestra que va a ser examinada puede pasar o moverse y que son conocidos por una persona experta en la materia. Por ejemplo, los materiales utilizados para formar la membrana pueden incluir, pero sin limitacion a los mismos, materiales naturales, sinteticos o que ocurren naturalmente y son modificados sinteticamente, tales como los polisacaridos (por ejemplo, materiales de celulosa como papel y derivados de celulosa como acetato de celulosa y nitrocelulosa); sulfona polieter; nilon; sflice; materiales inorganicos, tales como alumina desactivada, tierra de diatomeas, MgSO4 u otros materiales inorganicos finamente divididos uniformemente dispersados en una matriz de polfmero porosa tales como cloruro de vinilo, copolfmero de cloruro de vinilo-propileno y copolfmero de cloruro de vinilo-acetato de vinilo; pano, tanto de origen natural (por ejemplo, algodon) como sintetico (por ejemplo, rayon); geles porosos, tales como gel de sflice, agarosa, dextrano y gelatina; pelfculas polimericas, como poliacrilamida; y similares. En una realizacion preferente, la membrana es una membrana de nitrocelulosa. Existen diferentes tipos de membranas de nitrocelulosa comercialmente disponibles segun su capacidad absorbente y flujo capilar, por ejemplo, MDI® 15 p SS12 Sartorius® CN140, Millipore® HF180, Sartorius® CN150, MDI® 5 p SN12, MDI® 8 p SN12, MDI® 10 p SN12, MDI® 150-SS40, MDI® 200-CNPH-SS60, Whatman® FF170, Whatman FF120 y similares. En la realizacion mas preferente, la membrana de nitrocelulosa es MDI 8 p SN12.

En una realizacion preferente, el area de captura comprende una o mas lfneas de prueba que comprenden el farmaco biologico inmovilizado. En la realizacion preferente, el area de captura comprende una lfnea de prueba.

Dicho farmaco puede ser inmovilizado en la membrana por medios conocidos por la persona experta en el estado de la tecnica. En una realizacion particular, el farmaco biologico (por ejemplo, IFX) esta inmovilizado en la membrana en una concentracion de 1 mg/ml a 3 mg/ml, preferentemente de 1 mg/ml, utilizando una solucion tampon de inmovilizacion apropiada, por ejemplo, solucion tampon salina de borato (BBS), sacarosa, tampon carbonato pH 10,5 mas sacarosa y NaCl 150 mM, solucion salina tamponada con borato mas 1 mg/ml de IgG de conejo, tampon carbonato pH 10,5 mas sacarosa, BBS mas 3% de sacarosa, BBS mas 1% albumina de suero bovino, BBS mas 3% trehalosa, BBS mas 1% casefna (alcalizada), BBS mas 1% casefna, o similares, preferentemente BBS. IFX se diluye en dicho tampon de inmovilizacion apropiado y las tarjetas laminadas con tiras de nitrocelulosa se laminan para producir la lfnea de ensayo con la solucion de IFX mencionada anteriormente a una velocidad calculada para proporcionar un rendimiento optimo utilizando una maquina de isoflujo de mesa “bench-top iso-flow machine”. Una vez recubiertas, las tiras de nitrocelulosa se colocan inmediatamente en un horno de secado a 37°C para incubacion durante la noche (por ejemplo, durante 16-24 horas) para asegurar que IFX se inmoviliza adecuadamente a la nitrocelulosa.

Tambien se contempla que el area de captura comprenda una o mas lfneas de control que comprendan moleculas de control inmovilizadas, para confirmar que el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion ha funcionado correctamente y, por tanto, los resultados proporcionados por una o mas lfneas de prueba son crefbles y correctos. La inmovilizacion de dichas moleculas de control se realiza tal como se explico anteriormente. En una realizacion preferente, el area de captura comprende una lfnea de control que comprende anticuerpos contra IgY de pollo inmovilizados por cualquiera de los medios mencionados anteriormente. En una realizacion preferente, el area de conjugado esta formada por una almohadilla de conjugado que comprende el farmaco biologico marcado de forma detectable. Se contempla que dicha almohadilla este hecha de un material esponjoso, poroso o fibroso capaz de absorber el lfquido rapidamente. La porosidad del material puede ser unidireccional (por ejemplo, con los poros o fibras total o predominantemente paralelas a un eje de la estructura) o multidireccional (por ejemplo, omnidireccional, de manera que el miembro tenga una estructura parecida a una esponja amorfa). Puede utilizarse material plastico poroso, como polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno, poliester, vinilacetato de etileno, acrilonitrilo y politetrafluoroetileno. Puede ser ventajoso tratar previamente el material con un agente surfactante durante su

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fabricacion, ya que esto puede reducir cualquier hidrofobicidad inherente en el material y, por lo tanto, mejorar su capacidad para recoger y entregar una muestra humeda rapida y eficientemente. La estructura porosa tambien puede hacerse de papel u otros materiales celulosicos, tales como nitrocelulosa. Preferentemente, el material elegido es tal que el material poroso puede saturarse con el lfquido acuoso en cuestion de segundos. Tambien, preferentemente, el material se mantiene robusto cuando se humedece. En una realizacion preferente, la almohadilla de conjugado esta hecha de poliester.

En una realizacion, dicha almohadilla de conjugado esta posicionada en comunicacion fluida con la membrana y, mas preferentemente, dicha almohadilla de conjugado esta montada en la membrana cubriendo parcialmente o totalmente la membrana.

Se contempla que el farmaco biologico marcado de forma detectable se deposite en la membrana. En una realizacion, dicho farmaco biologico marcado de forma detectable se deposita en la almohadilla superficialmente formando, asf, una capa superficial. En otra realizacion, el farmaco biologico marcado de forma detectable depositado en la almohadilla puede penetrar hasta la membrana y, en algunos casos, tambien puede penetrar en dicha membrana.

En otra realizacion, el farmaco biologico marcado de forma detectable se deposita directamente en la membrana.

En una realizacion adicional, el farmaco marcado de forma detectable se coloca en la membrana o en la almohadilla de conjugado por medio de tecnicas y procedimientos conocidos por la persona experta en el estado de la tecnica. En la realizacion mas preferente, dicho farmaco biologico marcado de forma detectable se rocfa o deposita sobre la membrana en el area de conjugado o en la almohadilla situada en el area de conjugado, mas preferentemente se rocfa. A continuacion, el farmaco biologico marcado de forma detectable que se ha depositado se seca. Dicho secado se realiza preferentemente a 37°C durante 20 minutos.

Ademas, el farmaco biologico situado en el area de conjugado puede marcarse con cualquier parte o reactivo que permite la deteccion directa, es decir, sin necesidad de aplicar mas reactivos, reduciendo, por lo tanto, la manipulacion de la muestra y el numero de interacciones o reacciones necesarias para obtener una senal detectable.

Dicho marcado detectable puede ser enlazado/unido al farmaco biologico de manera covalente o no-covalente. El acoplamiento/union puede realizarse por cualquier metodo conocido en el estado de la tecnica.

En una realizacion preferente, el marcador detectable es una partfcula coloidal de metal, mas preferentemente una partfcula coloidal de oro, por ejemplo, micropartfculas de oro o nanopartfculas de oro. En la realizacion mas preferente, las partfculas coloidales de oro utilizadas como marcador detectable tienen un diametro de entre 20 nm y 80 nm, incluso mas preferentemente, de 20 nm a 40 nm. En la realizacion mas preferente, se utilizaron partfculas coloidales de oro de 40 nm de diametro para marcar el farmaco biologico (por ejemplo, IFX) y se utilizaron partfculas coloidales de oro de 20 nm de diametro para marcar la molecula de control (por ejemplo, IgY de pollo).

En una realizacion preferente, cuando las partfculas coloidales de oro se utilizan como marcador detectable, la concentracion del farmaco biologico conjugado con dichas partfculas depositadas en el area de conjugado o la almohadilla de conjugado es de 10 unidades de oro a 120 unidades de oro, mas preferentemente 70 unidades de oro, segun unidades internacionales. En otra realizacion preferente, la concentracion del farmaco biologico (por ejemplo, IFX) conjugado con dichas partfculas coloidales de oro depositadas en la area del conjugado es de 40 unidades de oro y la concentracion de la molecula control (por ejemplo, IgY) conjugado con dichas partfculas coloidales de oro depositadas en la area del conjugado es de 15 unidades de oro, de acuerdo con las unidades internacionales.

Brevemente, las Unidades de Oro se miden diluyendo el concentrado de farmaco biologico conjugado con el tampon de resuspension conjugado (por ejemplo, tampon sodio fosfato) y midiendo la densidad optica (DO) a una longitud de onda especffica de 520 nm utilizando un espectrofotometro, habiendo realizado previamente un blanco contra el tampon de re-suspension de conjugado. La DO del farmaco biologico conjugado es posteriormente utilizada como una medida de la cantidad total de oro anadido en cada ensayo. Por ejemplo, 1 pl de DO de 20 unidades de conjugado es igual a 20 Unidades de Oro. Por lo tanto, para un requerimiento de 70 unidades de oro por ensayo, 3,5 pl de lfquido conjugado se requieren para una tira de prueba a partir de una DO calculada de 20 unidades del concentrado de farmaco biologico conjugado.

La deteccion del marcador detectable dependera de la molecula o reactivo elegido y puede hacerse por cualquiera de los metodos conocidos en el estado de la tecnica, por ejemplo, inspeccion visual, espectrofotometrfa ultravioleta y visible, fluorimetrfa, conteo de radiactividad o similares. En una realizacion preferente, cuando las partfculas de oro se utilizan como marcados detectables, los resultados del ensayo son obtenidos y analizados mediante inspeccion visual.

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En otra realizacion, el area de conjugado comprende tambien moleculas de control marcadas de forma detectable que fluiran con la muestra sin reaccionar con el contenido de la misma y se unen a la una o mas lmeas de control para confirmar si el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion ha funcionado correctamente y, por tanto, los resultados proporcionados por una o mas lmeas de prueba son crefbles y correctos. La molecula utilizada depende de la que este inmovilizada en la, como mmimo, una lmea de control del area de captura. Ademas, los marcadores utilizados para las moleculas de control y marcado son tal como se explico anteriormente.

En una realizacion preferente, tal como se menciono anteriormente, el area de captura comprende una lmea de control que comprende anticuerpos contra IgY de pollo inmovilizados y, por lo tanto, el area de conjugado comprende inmunoglobulina Y (IgY) de pollo marcada de forma detectable.

En una realizacion, el marcador utilizado para las moleculas de control puede ser el mismo que el utilizado para los uno o mas farmacos biologicos probados, siempre y cuando sea posible distinguir los resultados obtenidos para cada farmaco por otros medios, por ejemplo, a traves de la posicion de la lmea de prueba. En otra realizacion, el marcador utilizado para las moleculas de control es diferente al utilizado para los uno o mas farmacos biologicos probados, lo que proporciona una senal distinguible.

En una realizacion preferente, el area de aplicacion de muestra esta formada por una almohadilla de muestra que se encuentra antes del area de conjugado y esta en comunicacion fluida con dicha area de conjugado, mas preferentemente, dicha almohadilla de muestra recubre parcialmente o totalmente el area de conjugado o esta recubierta parcial o totalmente por el area de conjugado. En otra realizacion, la almohadilla de muestra esta montada en la membrana o en la almohadilla de conjugado.

Ademas, se contempla que el area de aplicacion de muestra este adaptada a la muestra biologica que se pretende analizar. Por ejemplo, en el caso de la muestra biologica para el analisis sea sangre entera, el area de aplicacion de muestra puede comprender una almohadilla de separacion de sangre para la recepcion de la muestra, en la que el sistema de separacion de sangre se acopla de manera fluida a la estructura de conjugado. En una realizacion, la almohadilla de separacion de sangre recubre parcial o totalmente la almohadilla de conjugado.

En una realizacion preferente, la muestra de sangre entera se deposita en la almohadilla de separacion de sangre hecha, por ejemplo, de material/ almohadilla absorbente que se acopla de manera fluida al area de conjugado. Por ejemplo, la almohadilla de separacion de sangre puede funcionar como un filtro, por ejemplo, para eliminar los globulos rojos y otros componentes celulares y solidos como fibrina y coagulos son separados de la muestra. A continuacion, la muestra filtrada puede llegar al area de conjugado. La almohadilla de separacion de sangre tambien puede funcionar como un absorbente que elimina de la muestra por adsorcion factores que interfieren. Existen varias almohadillas de separacion de sangre disponibles comercialmente, por ejemplo, MDI® FR-1 (0,6), MDI® FR-1 (0,35), Whatman® MF-1, Ahlstrom® Cytosep 1660, Ahlstrom® Cytosep 1662, almohadilla de papel tratada con PHA, o similares. En la realizacion mas preferente, la almohadilla de separacion de sangre utilizada es MDI® FR-1 (0,6).

En otra realizacion preferente, se proporciona una almohadilla absorbente distal unida de manera fluida a la membrana. Dicha almohadilla absorbente distal esta configurada para absorber el lfquido o fluido proveniente de la membrana y, por lo tanto, hace que la muestra se mueva desde el area de aplicacion de muestra a dicha almohadilla absorbente distal circulando a traves de toda la estructura del inmunoensayo de flujo lateral, es decir, pasando por el area de conjugado y el area de captura. Por lo tanto, esta almohadilla absorbente distal puede estar hecha de cualquier material absorbente, por ejemplo, papel Whatmann®, papel de filtro o papel de cromatograffa. En una realizacion preferente, el material absorbente es papel de filtro, mas preferentemente el papel de filtro es una almohadilla de papel de Ahlstrom® (codigo de producto 222), que tiene un comportamiento o rendimiento ventajoso porque es relativamente delgada y tiene un caracter altamente absorbente ya que esta hecha de papel comprimido.

En una realizacion adicional, el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion puede detectar ADA contra dos o mas farmacos biologicos. En este caso, el area de captura comprendena, como mmimo, una lmea de prueba para cada uno de los farmacos biologicos analizados, con el farmaco biologico correspondiente inmovilizado en cada una. Ademas, en el area de conjugado se proporcionanan cada uno de los farmacos biologicos marcados de forma detectable. El marcador utilizado para cada uno de los farmacos biologicos y el marcado pueden ser tal como se ha descrito anteriormente. Ademas, se contempla que los marcadores utilizados para los diferentes farmacos biologicos probados sean el mismo, siempre y cuando sea posible distinguir los resultados obtenidos para cada farmaco por otros medios, por ejemplo, mediante la posicion de la lmea de prueba. En otra realizacion, los marcadores utilizados para cada uno de los farmacos biologicos son diferentes, de manera que cada una de ellos de una senal distinguible.

En una realizacion preferente, el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion permite la deteccion de ADA de cualquier isotipo presente en un paciente, es decir, IgG, IgA, IgE, IgM e IgD. Mas preferentemente, el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion permite la deteccion de ADA del isotipo IgG y, aun mas preferentemente, IgG de tipos 1, 2 y/o 3, que es el isotipo principal que caracteriza la respuesta inmune a un farmaco biologico.

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En otra realizacion, el inmunoensayo de flujo lateral basado en un ensayo de inmunocromatograffa descrito anteriormente, es en forma de una tira de prueba de inmunocromatograffa.

En una realizacion particular, para los inmunoensayos de flujo lateral y tiras de prueba de inmunocromatograffa de la presente invencion, la muestra biologica, preferentemente sangre entera, se deposita directamente en el area de aplicacion de muestra. Por ejemplo, una gota de sangre entera (de 20 pl a 40 pl, preferentemente 30 pl) obtenida de un pinchazo de dedo (por ejemplo utilizando una aguja), sin ningun tipo de dilucion previa o tratamiento previo de la muestra con reactivos o soluciones, es suficiente para el uso y analisis con el inmunoensayo de flujo lateral y tiras de prueba de inmunocromatograffa descritas anteriormente. No se requiere extraccion adicional de suero o plasma.

A continuacion, un simple tampon de arrastre, mas preferentemente, tampon PBS estandar, se deposita en el area de aplicacion de muestra para permitir que la muestra de sangre fluya por capilaridad a lo largo del ensayo o la tira por la trayectoria del flujo para reaccionar con los reactivos qufmicos y componentes utilizados en el inmunoensayo de flujo lateral. Preferentemente, se anaden 100 pl de tampon de arrastre. Dicho tampon de arrastre puede agregarse por cualquier medio disponible para una persona experta en el estado de la tecnica, por ejemplo una pipeta de laboratorio ajustada a 100 pl o una pipeta de plastico mas simple. El tampon de arrastre puede agregarse 60 segundos despues de depositar la muestra, mas preferentemente 50 segundos despues de depositar la muestra, aun mas preferentemente 40 segundos despues de depositar la muestra y de la forma mas preferente 30 segundos despues de depositar la muestra.

Cuando se utiliza suero o plasma para el analisis con cualquiera de los inmunoensayos de flujo lateral de la presente invencion, se pueden anadir entre 10 pl y 20 pl, preferentemente 15 pl de muestra al area de aplicacion de muestra y se realiza el mismo procedimiento descrito anteriormente.

Para usar cualquier otra muestra biologica con el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion, por ejemplo lfquido intersticial, saliva, fluido ocular, lfquido cefalorraqufdeo, sudor, orina, leche, lfquido ascftico, lfquido sinovial, lfquido peritoneal, semen, fluido vaginal, lfquido amniotico o similares, la persona experta en el estado de la tecnica posee habilidades para determinar la cantidad de muestra necesaria para realizar correctamente los ensayos descritos anteriormente. En primer lugar, tal como se menciono anteriormente, la muestra biologica se deposita en el area de aplicacion de muestra y el fluido entrara en contacto con la almohadilla de muestra, si esta presente. La almohadilla de muestra (por ejemplo, una almohadilla de muestras de sangre) actua como un filtro para los componentes solidos, permitiendo el flujo del componente lfquido. El area de conjugado, mas preferentemente en la forma de una almohadilla de conjugado en la que se deposita el farmaco biologico conjugado, preferentemente IFX, se encuentra despues del area de aplicacion de muestra (puede estar situada parcialmente superpuesta con la almohadilla de muestra), con ambas almohadillas montadas en la tira de membrana, preferentemente hecha de nitrocelulosa. El farmaco biologico conjugado con un marcador detectable, preferentemente partfculas coloidales de oro, reconocera, reaccionara con y se unira a los ADA contra dichos farmacos biologicos presentes en la muestra biologica, si estan presentes. Por lo tanto, se formaran inmunocomplejos farmaco biologico-ADA que estaran conjugados con partfculas coloidales de oro.

Como se ha mencionado anteriormente, opcionalmente, una molecula de control, tambien conjugada con un marcador detectable, preferentemente partfculas coloidales de oro, pueden depositarse tambien en la almohadilla de conjugado. En un realizacion preferente, dicha molecula de control es inmunoglobulina Y (IgY) de pollo. Si esta presente, esta molecula de control, en esta etapa, no reconocera, reaccionara con ni se unira especfficamente a los componentes presentes en la muestra biologica.

La muestra de lfquido que contiene los inmunocomplejos farmaco-ADA conjugados con partfculas coloidales de oro y, opcionalmente, la molecula de control conjugada con partfculas coloidales de oro, fluira por la trayectoria de flujo desde la almohadilla de conjugado hacia la tira de nitrocelulosa en la que los elementos de captura estan inmovilizados en la que, como mfnimo, una lfnea de prueba y, opcionalmente, tambien en la, como mfnimo, una lfnea de control.

La, como mfnimo, una lfnea de prueba comprende un reactivo de captura especffico que, tal como se ha mencionado anteriormente, es la misma molecula de farmaco biologico presente en la almohadilla de conjugado, preferentemente IFX, inmovilizada en la tira de la membrana. La naturaleza bivalente de las moleculas de ADA presentes en la muestra, preferentemente IgG, permite la reaccion de los inmunocomplejos farmaco-ADA conjugados con partfculas coloidales de oro con el farmaco biologico inmovilizado que se unira a dichos inmunocomplejos por el epftopo disponible en las moleculas de ADA, si estan presente en la muestra biologica. Se deja que la prueba o ensayo se desarrolle de 5 a 60 minutos, mas preferentemente 30 minutos.

Por lo tanto, cuando las reacciones descritas ocurren, una banda roja sera visualmente distinguible en la, como mfnimo, una lfnea de prueba del inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion como resultado del puente de union especffico entre los ADA y el farmaco biologico presentes en el area de conjugado y en el area de captura. Este resultado positivo sera indicativo de la presencia de Ada en la muestra biologica probada.

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La, como minimo, una linea de control opcional comprende un reactivo de captura especffico que es una molecula, inmovilizada en la tira de la membrana, que reacciona con la molecula de control. En una realizacion preferente, dicho reactivo es anticuerpo contra IgY de pollo. Tendra lugar una reaccion entre el anticuerpo contra IgY de pollo inmovilizado y el anticuerpo IgY de pollo que migra con el lfquido de la muestra. Una banda roja sera visualmente distinguible en la linea de control del dispositivo como resultado de esta union entre las moleculas de control y validara el resultado en la linea de prueba. Dichos resultados se miden de manera visual, preferentemente mediante puntuacion Rann; y/o mediante un lector o escaner que utiliza un metodo desitometrico para el analisis, preferentemente mediante analisis Camag.

La justificacion, la fundamentacion y la interpretacion de las tecnicas de deteccion mencionadas anteriormente son conocidas por el experto en la materia. Brevemente, la puntuacion de Rann determina la intensidad de la linea en una escala de cuantificacion que varfa de 0 a 10 unidades en comparacion con una tarjeta de referencia bien definida y el analisis de Camag determina la intensidad de la linea escaneando las tiras de arriba hacia abajo y realizando asf un analisis densitometrico en una escala de 0 a 1000 unidades.

En el caso de que la muestra biologica, preferentemente una muestra de sangre entera, no contenga ADA contra el farmaco biologico, no aparecera ninguna banda roja en la, como minimo, una linea de prueba como resultado de la falta de formacion de immunocomplejos de farmaco-ADA en la almohadilla de conjugado y la falta de reaccion posterior con el farmaco biologico inmovilizado en la tira de la membrana en el area de captura. Si la, como minimo, una linea de control opcional existe en el dispositivo, una banda roja sera visualmente distinguible en la por lo menos una linea de control como consecuencia de la reaccion entre las moleculas de control IgY de pollo conjugados con partfculas coloidales de oro y los anticuerpos contra IgY de pollo inmovilizados en la tira de la membrana en el area de captura.

Si la, como minimo, una linea de control esta presente y no da ninguna senal, el resultado del inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion no sera valido.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un dispositivo para llevar a cabo el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion que comprende:

- una membrana de inmunoensayo de flujo lateral tal como se ha descrito anteriormente; y

- un envase.

El envase puede estar hecho de cualquier material conocido en el estado de la tecnica que permita la proteccion de la membrana utilizada para llevar a cabo el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion. Preferentemente, el envase esta hecho de plastico.

Ademas, se hace hincapie en que el recipiente tiene una estructura que permite la aplicacion de la muestra y la visualizacion de los resultados de la prueba sin quitar dicho envase.

En una realizacion preferente, el dispositivo de la presente invencion es un dispositivo de un unico uso.

En una realizacion adicional, el dispositivo de la presente invencion comprende tambien una lanceta y un componente para la recogida de sangre.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un kit para llevar a cabo el inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion que comprende:

- un dispositivo tal como se ha descrito anteriormente; y

- instrucciones para realizar el ensayo.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de los inmunoensayos de flujo lateral de la presente invencion y, por ende, de los dispositivos y equipos que comprenden dichos inmunoensayos de flujo lateral o que permiten llevarlos a cabo, para detectar aDa contra un farmaco biologico en una muestra biologica de un paciente. La presencia de ADA en la muestra biologica de un paciente indicarfa o predecirfa que es de esperar una perdida o reduccion de la efectividad del farmaco si dicho farmaco se vuelve a administrar al paciente.

La muestra biologica utilizada puede ser sangre entera, plasma, suero, lfquido intersticial, saliva, fluido ocular, lfquido cefalorraqufdeo, sudor, orina, leche, lfquido ascftico, lfquido sinovial, lfquido peritoneal, semen, fluido vaginal, lfquido amniotico o similares. En una realizacion preferente, la muestra biologica utilizada es sangre entera, plasma o suero, mas preferentemente sangre entera.

Como se ha mencionado anteriormente, en la realizacion mas preferente de la presente invencion, el uso del inmunoensayo de flujo lateral permite la deteccion de la presencia o ausencia de ADA contra IFX en una muestra biologica de un paciente. La presencia de ADA contra IFX en dicha muestra biologica del paciente indica o predice que una perdida o reduccion de la eficacia del IFX es de esperar si se administra IFX adicional al paciente.

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En otra realizacion preferente, el uso del inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion mencionado anteriormente se realiza para medir los niveles mmimos de ADA en el paciente. Por esta razon, la medicion de los niveles se realiza dentro de las 72 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, preferentemente dentro de las 48 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, mas preferentemente dentro de las 24 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico y aun mas preferentemente justo antes de la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico. Por lo tanto, en la realizacion preferente se miden los niveles mmimos de ADA contra el farmaco biologico.

En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a un metodo de modulacion de un tratamiento con farmaco biologico administrado a un paciente que precisa del mismo, que comprende las etapas de:

a) una primera etapa de obtencion de una muestra biologica del paciente;

b) una segunda etapa de analizar la muestra biologica utilizando un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion tal como se ha descrito anteriormente configurado para detectar ADA contra dicho farmaco biologico; y

c) una tercera etapa de modulacion de la siguiente dosis de farmaco biologico que se ha de administrar al paciente sobre la base de los resultados obtenidos en la etapa b).

La muestra biologica utilizada puede ser sangre entera, plasma, suero, lfquido intersticial, saliva, fluido ocular, lfquido cefalorraqrndeo, sudor, orina, leche, lfquido asdtico, lfquido sinovial, lfquido peritoneal, semen, fluido vaginal, lfquido amniotico o similares. En una realizacion preferente, la muestra biologica utilizada es sangre entera, plasma o suero, mas preferentemente sangre entera.

En una realizacion preferente, la etapa c) comprende mantener la dosis de farmaco biologico en caso de que el resultado del inmunoensayo de flujo lateral realizado en la etapa b) sea negativo. En otra realizacion preferente, la etapa c) comprende incrementar la dosis de farmaco biologico en caso de que el resultado del inmunoensayo de flujo lateral realizado en la etapa b) sea positivo.

En una realizacion preferente adicional, la etapa c) comprende detener la administracion de farmaco biologico en caso de que el resultado del inmunoensayo de flujo lateral realizado en la etapa b) sea positivo.

Se contempla que la muestra biologica para la primera etapa se obtenga dentro de las 72 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, preferentemente dentro de las 48 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, mas preferentemente dentro de las 24 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico y aun mas preferentemente justo antes de la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico. En la realizacion mas preferente, en la etapa b) el metodo mide los niveles mmimos de ADA contra el farmaco biologico en el paciente.

En otra realizacion preferente, el paciente tiene una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria y esta siendo tratado con un farmaco biologico, mas preferentemente, el paciente tiene psoriasis, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, artritis psoriasica, artritis reumatoide o colitis ulcerosa y esta siendo tratado con un farmaco biologico.

En la realizacion mas preferente, el farmaco biologico es IFX.

Ademas, en otra realizacion, la presente invencion tambien se refiere a un metodo de predecir si un paciente respondera o no a un tratamiento con un farmaco biologico o una dosis adicional de un tratamiento con un farmaco biologico que comprende las etapas de:

a) una primera etapa de obtencion de una muestra biologica del paciente;

b) una segunda etapa de analizar la muestra biologica utilizando un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion tal como se ha descrito anteriormente, configurado para detectar ADA contra dicho farmaco biologico; y

c) una tercera etapa de determinar si un paciente respondera o no a un tratamiento con un farmaco biologico o una dosis adicional de un tratamiento con un farmaco biologico sobre la base de los resultados obtenidos en la etapa b).

La muestra biologica utilizada puede ser sangre entera, plasma, suero, lfquido intersticial, saliva, fluido ocular, lfquido cefalorraqrndeo, sudor, orina, leche, lfquido asdtico, lfquido sinovial, lfquido peritoneal, semen, fluido vaginal, lfquido amniotico o similares. En un realizacion preferente, la muestra biologica utilizada es sangre entera, plasma o suero, mas preferentemente sangre entera.

Un resultado negativo del inmunoensayo de flujo lateral realizado en la etapa b) significa que el paciente es susceptible de responder a un tratamiento con el farmaco biologico o a una dosis adicional de dicho farmaco biologico.

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Un resultado positivo del inmunoensayo de flujo lateral realizado en la etapa b) significa que el paciente es susceptible de no responder a un tratamiento con el farmaco biologico o a una dosis adicional de dicho farmaco biologico.

Se contempla que la muestra biologica para la primera etapa se obtenga dentro de las 72 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, preferentemente dentro de las 48 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, mas preferentemente dentro de las 24 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico y aun mas preferentemente justo antes de la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico. En la realizacion mas preferente, en la etapa b) el metodo mide los niveles mfnimos de ADA contra el farmaco biologico en el paciente.

En otra realizacion preferente, el paciente tiene una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria y esta siendo tratado con un farmaco biologico, mas preferentemente, el paciente tiene psoriasis, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, artritis psoriasica, artritis reumatoide o colitis ulcerosa y esta siendo tratado con un farmaco biologico.

En la realizacion mas preferente, el farmaco biologico es IFX.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para determinar si un paciente debe recibir una dosis adicional de un farmaco biologico que comprende las etapas de:

a) una primera etapa de obtencion de una muestra biologica del paciente;

b) una segunda etapa de analizar la muestra biologica utilizando un inmunoensayo de flujo lateral de la presente invencion tal como se ha descrito anteriormente, configurado para detectar ADA contra dicho farmaco biologico; y

c) una tercera etapa de determinar si el paciente recibe una dosis adicional de farmaco biologico sobre la base de los resultados obtenidos en la etapa b)

La muestra biologica utilizada puede ser sangre entera, plasma, suero, lfquido intersticial, saliva, fluido ocular, lfquido cefalorraqufdeo, sudor, orina, leche, lfquido ascftico, lfquido sinovial, lfquido peritoneal, semen, fluido vaginal, lfquido amniotico o similares. En un realizacion preferente, la muestra biologica utilizada es sangre entera, plasma o suero, mas preferentemente sangre entera.

Un resultado negativo del inmunoensayo de flujo lateral realizado en la etapa b) significa que se debe administrar al paciente una dosis adicional de dicho farmaco biologico.

Un resultado positivo del inmunoensayo de flujo lateral realizado en la etapa b) significa que no debe administrarse al paciente una dosis adicional de dicho farmaco biologico.

Se contempla que la muestra biologica para la primera etapa se obtenga dentro de las 72 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, preferentemente dentro de las 48 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico, mas preferentemente dentro de las 24 horas anteriores a la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico y aun mas preferentemente justo antes de la infusion de la siguiente dosis del farmaco biologico. En la realizacion mas preferente, en la etapa b) el metodo mide los niveles mfnimos de ADA contra el farmaco biologico en el paciente.

En otra realizacion preferente, el paciente tiene una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria y esta siendo tratado con un farmaco biologico, mas preferentemente, el paciente tiene psoriasis, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, artritis psoriasica, artritis reumatoide o colitis ulcerosa y esta siendo tratado con un farmaco biologico.

En la realizacion mas preferente, el farmaco biologico es IFX.

Por lo tanto, los inmunoensayos de flujo lateral y ensayos de inmunocromatograffa descritos anteriormente tienen un formato de union puente, en el cual los ADA, si estan presentes en la muestra del paciente, actuan de puente que une el farmaco biologico marcado de forma detectable presente en el area de conjugado y el farmaco biologico inmovilizado en el area de captura. Ademas, sorprendentemente, este tipo de estructura se obtiene sin la necesidad de tratamientos previos o incubaciones de la muestra, solo mediante la aplicacion de la muestra en una membrana o tira de prueba con la estructura descrita en el presente documento. Ademas, dicha estructura de puente, sorprendentemente, puede formarse de manera eficaz en un lapso de tiempo corto, es decir de 5 a 60 minutos, un marco de tiempo mas corto que el descrito en el estado de la tecnica.

Por lo tanto, la principal ventaja de los ensayos de la presente invencion es que la estructura del ensayo propuesto no necesita ninguna manipulacion especffica o reaccion de la muestra obtenida con los reactivos antes de ser aplicada a la tira. Por lo tanto, permite la obtencion de resultados en un marco de tiempo muy corto (5 a 60 minutos). Estas caracterfsticas permiten el uso de los ensayos descritos en el presente documento para tomar decisiones sobre la administracion de la siguiente dosis de un farmaco biologico a un paciente sobre la base de los resultados obtenidos en el ensayo.

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Ademas, la configuracion de la prueba o ensayo proporciona un dispositivo pequeno, portatil, simple, rapido, facil de usar y rentable que no necesita de un operador calificado, ni equipo adicional para obtener informacion cualitativa sobre si un paciente tiene ADA que puede utilizarse para la toma decisiones clfnicas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral para la deteccion de ADA contra IFX.

En este caso, el uso del ensayo estaba destinado a detectar ADA contra IFX. Por lo tanto, el farmaco biologico depositado en la almohadilla de conjugado e inmovilizado en el area de captura fue infliximab. El farmaco infliximab se obtuvo como polvo liofilizado para concentrado de perfusion, reconstituido en agua a una concentracion de 10 mg/ml y el 0,05% de azida sodica e inmovilizado en las tiras de nitrocelulosa. Para llevar a cabo esta inmovilizacion, IFX se diluyo en tampon de inmovilizacion BBS a una concentracion de 1 mg/ml y tarjetas laminadas con tiras de nitrocelulosa MDI® 8 p SN12 se laminaron para producir una lfnea de ensayo con la solucion de IFX mencionada anteriormente utilizando una maquina de isoflujo de mesa (“bench-top iso-flow machine”) (1 pl por tira).

Se genero una lfnea de control para detectar IgY de pollo conjugada en el area de captura con la inmovilizacion de una solucion de 0,5 mg/ml de anticuerpos IgY anti-pollo utilizando una maquina de isoflujo de mesa (“bench-top isoflow machine”) (1 pl por tira).

Una vez recubiertas, la nitrocelulosa se coloco inmediatamente en un horno de secado a 37°C para incubacion durante la noche (durante 16-24 horas) para asegurar que IFX se inmoviliza en la nitrocelulosa.

El mismo stock del farmaco infliximab en solucion se uso para la conjugacion con partfculas coloidales de oro de 40 nm de diametro. Ademas, se conjugo IgY de pollo con partfculas coloidales de oro de 20 nm de diametro.

Despues de la conjugacion, ambos conjugados de IFX y IgY de pollo se depositaron en la almohadilla de conjugado de poliester dispuesta en una tira de nitrocelulosa mediante la pulverizacion con el isoflujo de mesa (“bench-top isoflow”) con un cabezal de atomizacion a presion, a una velocidad de pulverizacion calculada para aplicar 40 Unidades de Oro de IFX y 15 Unidades de Oro de IgY de pollo por tira de prueba. Las tiras pulverizadas se dejaron secar durante 20 minutos a 37°C.

En el inmunoensayo de flujo lateral probado, la almohadilla de separacion de sangre fue MDI® FR-1 0,6 almohadilla de separacion de sangre (MDI®, India). Ademas, una almohadilla absorbente distal de papel de Ahlstrom® (codigo de producto 222) (Ahlstrom®, Finland) se coloco en posicion distal a la membrana para ayudar a que la muestra fluyera a traves de la membrana.

En primer lugar, se ensayaron una muestra de suero humano de un individuo sano y una muestra positiva de suero obtenida de un paciente tratado con IFX que contenfa 753 U/ml (determinado con un kit de ELISA Promonitor® anti- IFX) (1 unidad/ml corresponde a 10 ng/ml de anticuerpos IgG) de ADA contra IFX. En ambos casos se utilizaron 20 ml de serum de las muestras. Tras 30 segundos de la aplicacion de la muestra, se anadio 100 ml de tampon PBS (0,01 M tampon fosfato, 0,0027 M cloruro de potasio y 0,137 M cloruro de sodio, pH 7,4) La muestra se movio a traves del area de aplicacion de muestra, la almohadilla de conjugado y a traves de la tira de nitrocelulosa hasta el area de captura. Se dejo que el ensayo o prueba se desarrollase o reaccionase durante 30 minutos y luego se analizo visualmente. La figura 3 muestra los resultados obtenidos. En la figura 3A puede verse que el suero derivado de un individuo sano solo produjo una senal visual en la lfnea de control (lfnea roja en la parte superior de la tira). Por el contrario, en la figura 3B se aprecia que el suero positivo mencionado anteriormente produjo senal visual tanto en la lfnea de control como en la lfnea de prueba, es decir, dos lfneas rojas, una en la parte superior de la tira y otra en la parte inferior (lfneas de control y de prueba, respectivamente), mostrando la presencia de ADA contra IFX.

Tambien se probaron muestras de sangre con la prueba o ensayo mencionados anteriormente. Se utilizo sangre entera de una muestra negativa y una muestra positiva generada dopando sangre entera negativa con suero que contenfa 241 U/ml de ADA contra IFX (determinada con un kit de ELISA Promonitor® anti-IFX) (1 unidad/ml corresponde a 10 ng/ml de anticuerpos IgG). Para el mencionado dopaje, se centrifugo un volumen de 500 pl de sangre entera (1500 rpm; 10 minutes) y el sobrenadante (160 ml) fue reemplazado por un volumen igual de suero que contenfa 241 U/ml de ADA contra IFX. Se utilizaron 40 ml de sangre entera de una muestra negativa y una muestra positiva dopada.

Tras 30 segundos de la aplicacion de muestra, se anadieron 100 ml de tampon PBS (composicion mencionada anteriormente). La muestra se movio a traves del area de aplicacion de muestra, la almohadilla de conjugado y a traves de la tira de nitrocelulosa hasta el area de captura. Se dejo que el ensayo o prueba se desarrollase o reaccionase durante 30 minutos y luego se analizo visualmente. La figura 4 muestra los resultados obtenidos. En la figura 4A se aprecia que la muestra negativa de sangre entera produce una senal visual en la lfnea de control (lfnea roja en la parte superior de la tira). Por el contrario, en la Figura 4B se aprecia que la muestra positiva mencionada anteriormente produjo senal visual tanto en la lfnea de control como en la lfnea de prueba, es decir, dos lfneas rojas,

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una en la parte superior de la tira y otra en la parte inferior (lineas de control y de prueba, respectivamente), mostrando la presencia de ADA contra IFX.

Ejemplo 2. Sensibilidad del dispositivo de flujo lateral en muestras de suero

La sensibilidad de un inmunoensayo de flujo lateral tal como se ha explicado en el ejemplo 1 se determino analizando una muestra de suero positiva para anticuerpos contra infliximab en diluciones seriadas (vease figura 5). Una muestra de suero que contenfa 506 U/ml de ADA contra IFX (determinada con un kit de ELISA Promonitor® anti-IFX) se diluyo 1:1 de manera seriada en otra muestra de suero negativa para obtener niveles decrecientes de ADA de 506 U/ml a 16 U/ml. Tambien se analizo la muestra de suero negativa como control negativo del experimento. Despues de la preparacion de muestras, se agregaron 20 pl de cada muestra de suero al area de aplicacion de muestra de cada dispositivo utilizando una micropipeta. Despues de 30 segundos, se agregaron 100 pl de tampon de arrastre PBS a cada dispositivo y se dejaron en la poyata a temperatura ambiente durante 30 minutos. De todas las muestras se hizo triplicado.

Los resultados se analizaron siguiendo dos metodos de interpretacion diferentes. En primer lugar, se realizo un analisis visual de las tiras puntuando las intensidades de lfnea en una escala de 0 a 10 unidades utilizando una tarjeta de comparacion (puntuacion Rann). En segundo lugar, se leyeron las tiras utilizando un escaner especffico y se cuantificaron las intensidades de lfnea en una escala numerica de 0 a 1.000 unidades (analisis Camag). Los resultados aparecen resumidos en la figura 5. El analisis de dichos resultados revelo una disminucion de la intensidad de senal en la lfnea de prueba (parte inferior de la tira reactiva) a lo largo de la serie de diluciones preparada, tanto en la puntuacion Rann visual como en la puntuacion Camag. Si se define un valor umbral para la positividad de 2 unidades en la puntuacion de Rann y 50 unidades en la puntuacion Camag, 32 U/ml de anticuerpos contra infliximab se detectan bien por encima de esos valores umbral (figuras 5B, 5C). En este experimento, el lfmite de deteccion del inmunoensayo de flujo lateral fue entre 16 U/ml y 32 U/ml para el analisis visual y 16 U/ml cuando el inmunoensayo de flujo lateral se leyo utilizando un escaner.

Ejemplo 3. Sensibilidad del dispositivo de flujo lateral en muestras de sangre

La sensibilidad de un inmunoensayo de flujo lateral tal como se ha explicado en el ejemplo 1 se determino analizando una muestra de sangre dopada con un suero positivo que contenfa 384 U/ml de ADA contra IFX (determinado con un kit de ELISA Promonitor® anti-IFX) (vease figura 6), y diluida 1:1 de manera seriada en una muestra de sangre negativa para obtener niveles decrecientes de ADA de 384 U/ml a 12 U/ml. Tambien se analizo la muestra de sangre negativa como control negativo del experimento. La misma dilucion seriada se realizo con suero y el suero negativo. Despues de la preparacion de muestras, se agregaron 15 pl de cada suero y 30 pl de cada muestra de sangre al area de aplicacion de muestra de cada dispositivo utilizando una micropipeta. Despues de 30 segundos, se agregaron 100 pl de tampon de arrastre PBS a cada dispositivo y se dejaron en la poyata a temperatura ambiente durante 30 minutos. De las muestras de sangre dopada y sangre negativa se hizo triplicado y de las muestras de suero se hicieron cinco replicas.

Los resultados se analizaron siguiendo dos metodos de interpretacion diferentes. En primer lugar, se realizo un analisis visual de las tiras puntuando las intensidades de lfnea en una escala de 0 a 10 unidades utilizando una tarjeta de comparacion (puntuacion Rann). En segundo lugar, se leyeron las tiras utilizando un escaner especffico y se cuantificaron las intensidades de lfnea en una escala numerica de 0 a 1000 unidades (analisis Camag). Los resultados aparecen resumidos en la figura 6. El analisis de los resultados revelo una clara intensidad de senal por encima de los valores umbral tanto en la puntuacion Rann visual como en la puntuacion Camag, establecidos en 2 unidades y 50 unidades, respectivamente (Figuras 6B, 6C). El lfmite de deteccion del inmunoensayo de flujo lateral fue 12 U/ml para el analisis visual y con escaner tanto para muestras de suero como de sangre.

Claims (14)

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   1. Inmunoensayo de flujo lateral para la deteccion de anticuerpos anti-farmaco contra un farmaco biologico que comprende: una membrana que comprende:

   - un area de captura;

   - un area de aplicacion de muestra;

   - una trayectoria de flujo del area de aplicacion de muestra al area de captura; y

   - un area de conjugado situada en la trayectoria de flujo, caracterizado por que el area de conjugado comprende dicho farmaco biologico marcado de forma detectable y el area captura comprende dicho farmaco biologico inmovilizado.
2. 2. Inmunoensayo de flujo lateral, segun reivindicacion 1, caracterizado por que el farmaco biologico es infliximab.
3. 3. Inmunoensayo de flujo lateral, segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, caracterizado por que el area de conjugado comprende una almohadilla de conjugado.
4. 4. Inmunoensayo de flujo lateral, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la membrana es una membrana de nitrocelulosa.
5. 5. Inmunoensayo de flujo lateral, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el farmaco biologico comprendido en el area de conjugado esta marcado de forma detectable con partfculas coloidales de oro.
6. 6. Inmunoensayo de flujo lateral, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el area de aplicacion de muestra comprende una almohadilla de separacion de sangre.
7. 7. Inmunoensayo de flujo lateral, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que ademas comprende una almohadilla absorbente distal.
8. 8. Dispositivo que comprende:

   - una membrana de inmunoensayo de flujo lateral segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

   - un envase.
9. 9. Kit que comprende:

   - un dispositivo segun la reivindicacion 8; e

   - instrucciones para llevar a cabo el ensayo.
10. 10. Uso de un inmunoensayo de flujo lateral segun cualquiera de las reivindicaciones anti-farmaco contra un farmaco biologico en una muestra biologica de un paciente.
11. 11. Metodo de modulacion de un tratamiento con farmaco biologico administrado mismo, que comprende las etapas de:

    a) una primera etapa de analizar la muestra biologica utilizando un inmunoensayo de flujo lateral segun cualquiera de Las reivindicaciones 1 a 7 configurado para detectar anticuerpos anti-farmaco contra dicho farmaco biologico; y

    b) una segunda etapa de modulacion de la siguiente dosis de farmaco biologico que se ha de administrar al paciente sobre la base de los resultados obtenidos en la etapa a).
12. 12. Metodo de predecir si un paciente respondera o no a un tratamiento con un farmaco biologico o una dosis adicional de un tratamiento con un farmaco biologico que comprende las etapas de:

    a) una primera etapa de analizar la muestra biologica utilizando un inmunoensayo de flujo lateral segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 configurado para detectar anticuerpos anti-farmaco contra dicho farmaco biologico; y

    b) una segunda etapa de determinar si un paciente respondera o no a un tratamiento con un farmaco biologico o una dosis adicional de un tratamiento con un farmaco biologico sobre la base de los resultados obtenidos en la etapa a).
13. 13. Metodo para determinar si un paciente debe recibir una dosis adicional de un farmaco biologico que comprende las etapas de:

    1 a 7 para detectar anticuerpos a un paciente que precisa del

    a) una primera etapa de analizar la muestra biologica utilizando un inmunoensayo de flujo lateral segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 configurado para detectar anticuerpos anti-farmaco contra dicho farmaco biologico; y

    b) una segunda etapa de determinar si el paciente recibe una dosis adicional de farmaco biologico sobre la base

    5 de los resultados obtenidos en la etapa a).
14. 14. Metodo, segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado por que la muestra biologica es sangre entera o suero.

    10 15. Metodo, segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado por que en la etapa a) el metodo mide

    los niveles mfnimos de los anticuerpos anti-farmaco contra el farmaco biologico.