ES2259290T3

ES2259290T3 - Deteccion del cancer de prostata midiendo la relacion psa/igf-1.

Info

Publication number: ES2259290T3
Application number: ES00966291T
Authority: ES
Inventors: Keith Griffiths; Atilla T. Turkes
Original assignee: JOKEN Ltd
Current assignee: JOKEN Ltd
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 2000-10-09
Publication date: 2006-10-01
Anticipated expiration: 2020-10-09
Also published as: EP1218749B1; DE60027176D1; DE60027176T2; EP1218749A1; ATE322687T1; WO2001025790A1; PT1218749E; AU781669B2; AU7673600A; CA2388706A1

Abstract

Un ensayo que asista en la detección de cáncer de próstata en un paciente, comprendiendo dicho ensayo el paso de medición simultánea mediante el inmunoensayo sándwich de IGF-1 libre y PSA libre en una muestra de fluido biológico tomada de dicho paciente, o la relación entre estas cantidades en la mencionada muestra.

Description

Detección del cáncer de próstata midiendo la relación PSA/IGF-1

El presente invento se relaciona con un método para el análisis de los niveles de antígeno prostático específico (PSA) libre y de factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1) libre a fin de proporcionar un diagnóstico diferencial más preciso para el cáncer de próstata. La ventaja es que el análisis de PSA libre y de IGF-1 libre se hace simultáneamente, siendo también monitorizados los cambios temporales, utilizando un inmunoensayo de anticuerpo doble modificado (ensayo sándwich).

Hasta hace poco, el antígeno prostático específico (PSA) total estaba reconocido como el índice más sensible y fiable del carcinoma prostático (Oesterling, 1993; J Urol 145: 907-923). De hecho, durante la última década, en particular en los EE.UU., se ha convertido en el principal punto de enfoque de los programas de estudios de detección de cáncer. Sin embargo, ha crecido la preocupación general en relación con la fidelidad y la reproductibilidad de su medición, y en consecuencia, del valor de los procedimientos de ensayo tradicionales.

Está bien documentado el hecho de que diferentes ensayos comerciales para el PSA total dan resultados cuantitativamente diferentes con las mismas muestras de pacientes (Nakamura et al 1997. En la 4^{th} International Consultation of BPH; Committee on The Detection of Prostate Cancer in a patient with BPH; Ed Denis et al; SCI, Plymouth:

\hbox{381-387).}

Esto da lugar a un considerable grado de incertidumbre y falta de confianza en la precisión del diagnóstico de cáncer de próstata. Sobre esta base, el comité recomendó que el PSA libre, en lugar del total, sería una herramienta de diagnóstico más fiable. Sólo recientemente se ha podido lograr una metodología para la cuantificación fiable del PSA libre. El valor del diagnóstico con PSA solo puede mejorarse mediante el análisis del cambio en los niveles de PSA libre durante un período de tiempo (velocidad de PSA) (Oesterling et al 1993; JAMA 270: 860-864).

Existe ahora evidencia considerable que relaciona el factor de crecimiento peptídico, factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF-1) al desarrollo de hiperplasia y carcinoma prostáticos. Trabajos recientes han señalado que los niveles de IGF-1 son más elevados en los hombres con cáncer de próstata, aún cuando los niveles de PSA se encuentren dentro de los límites "normales". En un estudio reciente sobre cáncer de próstata en el condado de Gwent, se midieron los niveles de PSA en más de 3000 hombres de 55 a 75 años de edad, siendo el cáncer de próstata identificado en un 3% del grupo analizado. Una determinación retrospectiva del IGF-1 en las muestras de suero de los pacientes analizados con niveles bajos de PSA total (menos de 4 ng/l), con lesiones preneoplásticas (PIN) identificadas, y con diagnóstico de cáncer de próstata, revelaron una estrecha relación entre los niveles de PSA y de IGF-1 (ver Figura 1).

Además de la variabilidad entre los distintos ensayos, el mayor problema con el uso de PSA como marcador de predicción y comprobación del cáncer de próstata es que ciertos cánceres (alrededor del 30%) no secretan PSA, y que pacientes con altos niveles de PSA tienen hiperplasia prostática benigna (BPH), y no cáncer. Por lo tanto, la tecnología existente permite la posibilidad de que se obtengan resultados negativos falsos y resultados positivos falsos, con lo cual se reduce tanto la fidelidad como el valor del diagnóstico.

Cuando los niveles de PSA son superiores a 20 ng/ml, la probabilidad de cáncer de próstata es de aproximadamente un 90%. Niveles de PSA entre 10 y 20 ng/ml pueden indicar cáncer o una hiperplasia prostática benigna (BPH). La dificultad, sin embargo, está en la evaluación de pacientes con niveles de PSA que se encuentran dentro de la denominada "zona gris de diagnóstico", es decir, entre 4 y 10 ng/ml. Estos niveles pueden ser normales en razón de edad avanzada, o pueden indicar una condición de enfermedad, o pueden deberse a cáncer, BPH o prostatitis. En el ensayo doble que aquí se describe podemos efectuar el diagnóstico diferencial del cáncer de próstata y eliminar biopsias innecesarias, en particular para los pacientes que presentan niveles de PSA dentro de la "zona gris de diagnóstico".

Las dificultades analíticas y la falta de precisión del diagnóstico están bien reconocidas, y hasta hace poco, tanto los médicos como los pacientes y los proveedores de atención médica aceptaban sus limitaciones.

Más recientemente, se ha defendido el uso de marcadores dobles, incluyendo PSA e IGF-1 (ver Djavan et al, 1999, Urology 54: 603-606; WO-A-99/38011). Sin embargo, el diagnóstico diferencial de cáncer de próstata descrito se basa en mediciones en un solo punto temporal tanto para PSA como para IGF-1, se relaciona con la medición de PSA total (en lugar del PSA libre), y utiliza diferentes condiciones de ensayo.

Otros artículos relacionados con la propuesta de medir tanto IGF-1 como PSA del mismo grupo que Djavan et al
(como antes) fueron publicados en el J. Urology 161/4 Suppl. 04/1999, pág. 321, Abstract N. 1236. Djavan et al midieron el IGF-1 total y concluyeron que la relación IGF-1/PSA es útil para la predicción de cáncer de próstata.

El invento proporciona un método para obtener un diagnóstico diferencial más preciso y menos ambiguo del cáncer de próstata.

En consecuencia, un objetivo del invento consiste en proporcionar un ensayo para asistir en la detección de cáncer de próstata en un paciente, comprendiendo dicho ensayo un paso de medición simultánea, a través de un inmunoensayo sándwich, de la cantidad de IGF-1 y PSA libres en una muestra de fluido biológico de dicho paciente, o la relación entre estas cantidades en la mencionada muestra.

Preferentemente se extraen varias muestras en períodos de tiempo separados y predeterminados para su ensayo según se acaba de describir. Es una ventaja el uso de técnicas de anticuerpos dobles para la medición simultánea del PSA libre y del IGF-1 libre en una misma muestra de fluido biológico. Este ensayo representa una mejora cualitativa y cuantitativa en relación con la metodología existente, y por lo tanto ofrece la oportunidad de obtener un diagnóstico diferencial preciso del cáncer de próstata. Dado que se miden tanto el IGF-1 como el PSA de las hormonas peptídicas de una misma muestra, consecuentemente bajo idénticas condiciones de ensayo, esto asegura la precisión de la medición. La fidelidad del enfoque también se ve considerablemente realzada ya que el diagnóstico se basa en los niveles libres y en la relación de concentración de IGF-1 y PSA.

Se prefiere emplear un inmunoensayo sándwich para medir la cantidad de IGF-1 libre y PSA libre, o su relación. Este ensayo puede también incluir los siguientes pasos:

\ding{226}: provisión de primeros anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con el PSA libre y segundos anticuerpos que puedan formar inmunocomplejos con el IGF-1 libre, estando estos primeros y segundos anticuerpos ligados a una matriz de fase sólida; y

\ding{226}: contacto de la matriz de fase sólida y una muestra bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de inmunocomplejos;

\ding{226}: subsiguiente contacto de la matriz de fase sólida con terceros anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con el PSA libre o los mencionados primeros anticuerpos, y cuartos anticuerpos que puedan formar inmunocomplejos con el IGF-1 libre o los segundos anticuerpos, estando estos terceros y cuartos anticuerpos etiquetados, y con el paso de contacto efectuado bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de inmunocomplejos; y

\ding{226}: medición, preferentemente simultánea, de la cantidad de etiquetas de los terceros anticuerpos y los cuartos anticuerpos, y/o de la relación entre ambos.

También se prefiere que estos terceros y cuartos anticuerpos estén etiquetados con primeras y segundas etiquetas.

Otro aspecto del invento es un dispositivo para asistir en la detección o el diagnóstico de cáncer de próstata. Dicho dispositivo incorpora una matriz de fase sólida con una superficie y primeros anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con el PSA libre, y segundos anticuerpos que puedan formar inmunocomplejos con el

\hbox{IGF-1}

libre allí colocados.

Por ejemplo, los anticuerpos pueden estar químicamente ligados y atrapados físicamente en la superficie. Alternativamente, los anticuerpos pueden localizarse mediante atracción electrostática o fónica. Lo deseable es que la relación de anticuerpos anti-PSA y los anticuerpos anti-IGF-1 situados en la mencionada superficie estén en la gama de 1:2 a 2:1, preferentemente siendo 1:1.

En un aspecto adicional, el presente invento provee un kit para asistir en la detección o diagnóstico de cáncer de próstata. El kit consta de un dispositivo como el antes definido, y envasados por separado, tercer anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con PSA libre o los mencionados primeros anticuerpos, y cuartos anticuerpos que puedan formar inmunocomplejos con IGF-1 libre o los mencionados segundos anticuerpos, estando estos terceros y cuartos anticuerpos etiquetados con primeras y segundas etiquetas respectivamente. Ventajosamente, el kit también podría contener medios adicionales para detectar y medir la cantidad de etiquetas retenidas en el mencionado aparato tras su exposición a los mencionados anticuerpos etiquetados.

Lo antepuesto describe en términos generales el presente invento, el cual puede entenderse mejor haciendo referencia al ejemplo a continuación.

Breve descripción de la figura

La figura 1 muestra los niveles medios de PSA y IGF-1 para pacientes con bajos niveles de PSA, y la correlación con el cáncer de próstata.

Ejemplo

El principio del inmunoensayo de dos sitios convencional (sándwich) que se prefiere requiere dos anticuerpos: uno vinculado con una matriz de fase sólida a fin de proporcionar un medio de separación, y el otro "etiquetado" para permitir la determinación en el punto final. Ambos anticuerpos reconocen el analito a medir, y forman un inmunocomplejo anticuerpo-analito-anticuerpo. La cantidad de complejo formado se relaciona directamente con la concentración de analito presente en la muestra de suero.

Dos anticuerpos diferentes enfrentados a PSA y IGF-1 se vinculan con una matriz de fase sólida y se usan dos anticuerpos correspondientes etiquetados para medir ambos analitos, PSA e IGF-1, simultáneamente en una misma muestra de fluido biológico. Las condiciones de ensayo pueden optimizarse para aportar la sensibilidad analítica necesaria para la detección de PSA libre E IGF-1 libre.

La muestra puede diluirse con una sustancia adecuada tal como BSA (albúmina de suero bovino), PBS (tampón fosfato salino), o BSA (gamaglobulina bovina) antes de su contacto con la matriz de fase sólida. Luego se deja incubar la muestra durante cierto tiempo, digamos unas horas, para permitir la formación de inmunocomplejos, y luego se lava la matriz de fase sólida con, por ejemplo, PBS, para eliminar el material que no ha formado inmunocomplejo. La matriz de fase sólida se pone en contacto con los anticuerpos etiquetados, y se la incuba y lava antes de medir la cantidad de etiquetas.

Los anticuerpos mono y/o policlonales enfrentados a PSA e IGF-1 pueden purificarse mediante el uso de fraccionamiento salino, o procedimientos de purificación por afinidad o Proteína A, y juntos se unen a una matriz de fase sólida. La matriz de fase sólida puede prepararse mediante la vinculación de anticuerpos y tubos de ensayo de plástico, cuentas, tiras/placas de microtitulación, celulosa microcristalina, partículas de cristal o magnéticas, o membranas empleadas en ensayos semicuantitativos. El soporte preferido en particular son los tubos o las placas de microtitulación.

Anticuerpos anti-PSA adecuados comercialmente disponibles incluyen los Nros. 7820-0004 y 7820-0350 de
Biogenesis Ltd., Poole, Dorset, RU; MAB4082 de Chemicon International Inc., Temecula, CA, EE.UU.; SC-7638 y SC-7816 de Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, EE.UU.; y MAS 343cf de Harlan Sera-Lab Ltd., Loughborough, Leicestershire, RU.

Anticuerpos anti-IGF-1 adecuados comercialmente disponibles incluyen los Nros. 5345-0329 y 5345-0209 de
Biogenesis Ltd., Poole, Dorset, RU; GF006 de Chemicon International Inc., Temecula, CA, EE.UU.; SC-7144 y SC-1422 de Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, EE.UU.; y MAS 974p de Harlan Sera-Lab Ltd.,
Loughborough, Leicestershire, RU.

El segundo par de anticuerpos que reconocen los diferentes determinantes antigénicos de PSA libre e IGF-1 libre pueden usarse con etiquetas. Los anticuerpos etiquetados pueden prepararse mediante la conjugación con enzimas (peroxidasa de rábano picante o fosfato alcalino), o un agente fluorogénico (fluoroceína), o un agente quimiluminiscente (luminol o un derivado del acridinio). Se propone emplear quelatos terrestres raros, tales como el europio y samario, para la preparación de los anticuerpos etiquetados. Sobre la base de sus diferentes características de absorción/emisión, se los puede utilizar al mismo tiempo en un sistema de ensayo: el europio para el anticuerpo etiquetado de IGF-1, y el samario para el PSA, o viceversa. No obstante, otros pares de etiquetas tales como eritrina/hierro también pueden ofrecer emisiones diferentes fáciles de diferenciar.

El principio en el que se apoya el invento, en consecuencia, es que los anticuerpos enfrentados a PSA libre e IGF-1 libre en la misma matriz sólida forman complejos anticuerpo-analito con PSA libre e IGF-1 libre en la misma muestra, y que el PSA y el IGF-1 etiquetados se ligan a sus respectivos analitos. Esto completa el sándwich anticuerpo-analito-anticuerpo. El análisis de punto final se lleva a cabo en un instrumento capaz de determinar la fluorescencia de transcurso temporal o resolución temporal, tal como un espectrofotómetro.

Claims

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1. Un ensayo que asista en la detección de cáncer de próstata en un paciente, comprendiendo dicho ensayo el paso de medición simultánea mediante el inmunoensayo sándwich de IGF-1 libre y PSA libre en una muestra de fluido biológico tomada de dicho paciente, o la relación entre estas cantidades en la mencionada muestra.
2. El ensayo descrito en la Reivindicación 1, en el cual se someten al ensayo más de una muestra tomada del mismo paciente a intervalos temporales separados y predeterminados.
3. El ensayo de la Reivindicación 2, en el cual dicho ensayo comprende también los siguientes pasos:

\ding{226}

provisión de primeros anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con el PSA libre y segundos anticuerpos que puedan formar inmunocomplejos con. el IGF-1 libre, estando estos primeros y segundos anticuerpos ligados a una matriz de fase sólida; y

\ding{226}

contacto de la matriz de fase sólida y una muestra bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de inmunocomplejos;

\ding{226}

subsiguiente contacto de la matriz de fase sólida con terceros anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con el PSA libre o los mencionados primeros anticuerpos, y con cuartos anticuerpos que puedan formar inmunocomplejos con el IGF-1 libre o los segundos anticuerpos, estando estos terceros y cuartos anticuerpos etiquetados, y con el paso de contacto efectuado bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de inmunocomplejos; y

\ding{226}

medición, preferentemente simultánea, de la cantidad de etiquetas de los terceros anticuerpos y los cuartos anticuerpos, y/o de la relación entre ambos.
4. El ensayo de la Reivindicación 3, en el cual los mencionados terceros y cuartos anticuerpos estén etiquetados con distintas primeras y segundas etiquetas.
5. Un dispositivo para asistir en la detección de cáncer de próstata, constando dicho dispositivo de una matriz fase sólida con una superficie y primeros anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con PSA libre, y segundos anticuerpos que puedan formar inmunocomplejos con IGF-1 libre.
6. El dispositivo descrito en la Reivindicación 5, en el cual la relación del los primeros y segundos anticuerpos provistos en la superficie está en la gama de 1:2 a 2:1.
7. El dispositivo de la Reivindicación 6, en el cual la mencionada relación es de 1:1.
8. El dispositivo descrito en cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7 en el cual la mencionada matriz de fase sólida es un tubo de ensayo de plástico, cuentas, tiras/placas de microtitulación, celulosa microcristalina, partículas de cristal o magnéticas, o una membrana empleada en un ensayo semicuantitativo.
9. Un kit para asistir en la detección de cáncer de próstata, incorporando dicho kit un dispositivo como el descrito en cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7, y, envasados por separado, terceros anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con PSA libre o los mencionados primeros anticuerpos, y cuartos anticuerpos que puedan específicamente formar inmunocomplejos con el IGF-1 libre o los mencionados segundos anticuerpos, estando dichos terceros y cuartos anticuerpos etiquetados con primeras y segundas etiquetas respectivamente.
10. El kit de la Reivindicación 9, en el cual las primeras y segundas etiquetas sean distintas entre sí y sean etiquetas de color que bajo condiciones adecuadas generen distintas características de absorción/emisión, de modo tal de poder medir simultáneamente la cantidad de primeras y segundas etiquetas.
11. El kit de la Reivindicación 9 ó 10 en el cual las mencionadas primeras y segundas etiquetas sean distintas entre sí y sean elegidas del grupo consistente de enzimas, agentes fluorogénicos y agentes quimiluminiscentes.
12. El kit de la Reivindicación 9 ó 10 en el cual las mencionadas primeras y segundas etiquetas sean distintas entre sí y sean quelatos terrestres raros.
13. El kit de la Reivindicación 12 en el cual las mencionadas primeras y segundas etiquetas sean distintas entres sí y sean quelatos de europio o de samario.
14. El kit de la Reivindicación 9 ó 10 en el cual las mencionadas primeras y segundas etiquetas sean distintas entre sí y sean eritrina o hierro.
15. El kit de cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12 en el cual el mencionado kit incluya también un medio para detectar la cantidad de etiquetas retenidas en el dispositivo tras su exposición a los mencionados anticuerpos etiquetados.