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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren der
Spiegel von freiem prostataspezifischem Antigen (PSA) und freiem
insulinähnlichen
Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), um eine genauere Differentialdiagnose
von Prostatakrebs bereitzustellen. Vorteilhafterweise wird die Analyse
von freiem PSA und freiem IGF-1 gleichzeitig durchgeführt, zeitbezogene Änderungen
werden jedoch ebenfalls überwacht
und es wird ein modifizierter Doppelantikörperimmunassay (Sandwichimmunassay)
verwendet.
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Bis
vor kurzem war das totale prostataspezifische Antigen (PSA) als
der empfindlichste und verlässlichste
Index von Prostatakrebs anerkannt (Oesterling, 1993; J. Urol 145:
907-923). In der Tat ist es im letzten Jahrzehnt besonders in den
USA zum Hauptgesichtspunkt von Prostatakrebs-Screeningprogrammen
geworden. Jedoch sind steigende Bedenken geäußert worden bezüglich der
Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Messwerts bei den, und deshalb
dem Wert der, herkömmlichen
Assayverfahren.
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Es
ist gut dokumentiert, dass verschiedene handelsübliche Assays auf totales PSA
bei den gleichen Patientenproben zu quantitativ unterschiedlichen
Ergebnissen führen
(Nakamura et al 1997. In 4th International Consultation of BPH;
Committee on The Detection of Prostate Cancer in a patient with BPH:
Ed Denis et al; SCI, Plymouth: 381-387 (Komitee für die Erfassung von Prostatakrebs
bei einem Patienten mit BPH)). Das ruft einen beträchtlichen Grad
an Ungewissheit und Unverlässlichkeit
bezüglich
der Genauigkeit der Diagnose bei Prostatakrebs hervor. Auf dieser
Basis hat das Komittee empfohlen, dass ein freies anstatt totales
PSA ein verlässlicheres diagnostisches
Werkzeug wäre.
Erst vor kurzem ist die Methodologie für die verlässliche Quantifizierung von
freiem PSA verfügbar
geworden. Der Diagnosewert bei Anwendung von PSA als solchem kann durch
Analysieren der Änderung
der freien PSA-Spiegel über
eine Zeitspanne (PSA-Geschwindigkeit)
noch weiter verbessert werden (Oesterling et al 1993; JAMA 270:
860-864).
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Es
bestehen nun beträchtliche
Beweise, die den Peptidwachstumsfaktor, den insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1
(IGF-1) mit der Entwicklung von Prostatavergrößerung und -krebs in Verbindung
bringen. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit hat darauf hingewiesen,
dass die IGF-1-Spiegel bei Männern mit
Prostatakrebs höher
sind, selbst wenn das PSA im „normalen" Bereich liegt. Bei
einer kürzlichen
Prostatakrebsstudie in der Grafschaft Gwent sind die PSA-Spiegel
bei mehr als 3000 Männern
im Alter zwischen 55 und 75 gemessen und Prostatakrebs bei circa
3 % der gescreenten Gruppe identifiziert worden. Eine rückblickende
Bestimmung von IGF-1 in den Serumproben gescreenter Patienten mit
geringen totalen PSA-Spiegeln (weniger als 4 ng/l) brachten diejenigen
mit identifizierten vorneoplastischen Läsionen (PIN) und diejenigen,
bei denen Krebs der Prostata diagnostiziert wurde, einen engen Zusammenhang
zwischen den PSA- und IGF-1 Spiegeln zum Vorschein (man vergleiche 1).
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Außer der
Variabilität
zwischen Assays liegt das Hauptproblem bei der Verwendung von PSA
als Voraussagemarker und Test auf Prostatakrebs darin, dass gewisse
Krebse (circa 30 %) kein PSA absondern und dass andere Patienten
mit hohen PSA-Spiegeln eine gutartige Prostatavergrößerung (GPV)
anstatt Krebs aufweisen. So bietet die bestehende Technologie die
Möglichkeit
sowohl falscher negativer als auch falscher positiver Ergebnisse,
wodurch sowohl die Genauigkeit als auch der Wert der Diagnose reduziert
wird.
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Wenn
die PSA-Spiegel höher
als 20 ng/ml sind, so liegt die Wahrscheinlichkeit von Prostatakrebs
bei circa 90 %. PSA-Spiegel zwischen 10 und 20 ng/ml könnten Krebs
oder eine gutartige Prostatavergrößerung (GPV) anzeigen. Die
Schwierigkeit liegt jedoch darin, Patienten mit PSA-Spiegeln in
der sogenannten „diagnostischen
Grauzone", nämlich zwischen
4-10 ng/ml, zu beurteilen. Die Spiegel könnten aufgrund von fortgeschrittenem
Alter normal sein oder sie könnten
einen Krankheitszustand anzeigen und aufgrund von Krebs, GPV oder
Prostatitis hoch sein. Beim hier beschriebenen Doppelassay können wir
Prostatakrebs differentiell diagnostizieren und unnötige Biopsien
besonders bei denjenigen Patienten eliminieren, die PSA-Spiegel
in der „diagnostischen
Grauzone" aufweisen.
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Die
analytischen Schwierigkeiten und die Ungenauigkeit der Diagnose
sind allgemein bekannt und bis vor kurzem haben Ärzte, Patienten und Gesundheitsfürsorgepersonal
die Einschränkungen
akzeptiert.
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In
letzter Zeit ist die Verwendung von Doppelmarkern, einschließlich PSA
und IGP-1 empfohlen worden (man vergleiche Djavan et al, 1999; Urology
54: 603-606; WO-A-99/38011). Jedoch basiert die beschriebene Differentialdiagnose
von Prostatakrebs auf der Messung, zu einem einzigen Zeitpunkt, sowohl
des PSA als auch des IGP-1; sie betrifft das Messen des totalen
PSA (anstatt des freien PSA) und involviert verschiedene Assaybedingungen.
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Weitere
Arbeiten an dem Vorschlag, sowohl IGF-1 als auch PSA aus der gleichen
Gruppe wie Djavan et al (oben) zu messen, wurde in J. Urology 161/4,
Zusatz 04/1999, Seite 321, Zusammenfassung N 1236, veröffentlicht.
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Djavan
et al maßen
den totalen IGF-1 und kamen zur Schlussfolgerung, dass das IGP-1/PSA-Verhältnis zu
Vorhersagen von Prostatakrebs nützlich
ist.
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Die
Erfindung bietet ein Verfahren für
eine genauere und weniger zweideutige Differentialdiagnose des Prostatakrebses.
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Es
ist daher eine Aufgabe der Erfindung, einen Assay bereitzustellen
zum Erleichtern des Erfassens von Prostatakrebs bei einem Patienten,
wobei der Assay den Schritt des gleichzeitigen Messens, durch einen
Sandwichimmunassay, der Menge an freiem IGF-1 und an freiem PSA
in einer Probe von biologischem Fluid des Patienten oder des Verhältnisses
zwischen diesen Mengen in der Probe umfasst.
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Bevorzugt
werden mehrere Proben zu einzelnen vorbestimmten Zeitpunkten genommen,
um wie oben beschrieben untersucht zu werden. Vorteilhafterweise
werden Doppelantikörpertechniken
zum gleichzeitigen Messen von freiem IGP-1 und freiem PSA in einer
einzigen Probe von biologischem Fluid verwendet. Ein derartiger
Assay stellt eine wesentliche qualitative und quantitative Verbesserung
der bestehenden Methodologie dar und bietet daher die Gelegenheit
für eine
genaue Differentialdiagnose von Prostatakrebs. Da sowohl die Peptidhormone
PSA als auch IGF-1 in einer Probe und deshalb unter identischen
Assaybedingungen gemessen werden, wird die Genauigkeit der Messung
geliefert. Die Genauigkeit des Ansatzes wird ebenfalls durch Basieren
der Diagnose auf freie Spiegel und das Verhältnis der Konzentration von
PSA/IGF-1 wesentlich verbessert.
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Es
wird bevorzugt, einen Sandwichimmunassay zum Messen der Menge von
freiem IGF-1 und freiem PSA oder ihres Verhältnisses zu verwenden. Ein
derartiger Assay kann des Weiteren folgende Schritte umfassen:
- – Bereitstellen
erster Antikörper,
die mit freiem PSA spezifisch Immunkomplexe bilden können, und
zweiter Antikörper,
die mit freiem IGF-1 Immunkomplexe bilden können, wobei diese ersten und
zweiten Antikörper
an eine Festphasenmatrix gebunden sind; und
- – Kontaktieren
der Festphasenmatrix mit der Probe unter Bedingungen, die geeignet
sind, die Bildung von Immunkomplexen zu erlauben;
- – darauffolgendes
Kontaktieren der Festphasenmatrix mit dritten Antikörpern, die
mit freiem PSA oder den ersten Antikörpern spezifisch Immunkomplexe
bilden können,
und vierten Antikörpern, die
mit freiem IGF-1 oder zweiten Antikörpern Immunkomplexe bilden
können,
wobei diese dritten und vierten Antikörper gelabelt sind, und der
Kontaktierschritt unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird,
um die Immunkomplexbildung zu erlauben; und
- – Messen,
bevorzugt gleichzeitig, der Menge an Labeln der dritten Antikörper und
der vierten Antikörper
und/oder des Verhältnisses
dazwischen.
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Es
wird auch vorgezogen, dass diese dritten und vierten Antikörper mit
verschiedenen ersten und zweiten Labeln gelabelt werden.
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Eine
andere Ausgestaltung der Erfindung ist ein Gerät zum Erleichtern der Erfassung
oder Diagnose von Prostatakrebs. Ein derartiges Gerät umfasst
eine Festphasenmatrix mit einer Oberfläche und erste Antikörper, die
mit freiem PSA spezifisch Immunkomplexe bilden können, und zweite Antikörper, die
mit freiem IGF-1 Immunkomplexe bilden können.
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Beispielsweise
können
die Antikörper
chemisch an die Oberfläche
gebunden oder physikalisch darin eingefangen sein. Als Alternative können die Antikörper durch
elektrostatische oder Ionenanziehung positioniert sein. Wünschenswerterweise
liegt das Verhältnis
von Anti-PSA-Antikörpern:Anti-IGF-1 Antikörper, die
sich auf der Oberfläche
befinden, im Bereich von 1:2 bis 2:1, bevorzugt circa 1:1.
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Bei
einer weiteren Ausgestaltung bietet die vorliegende Erfindung einen
Kit zum Unterstützen der
Erfassung oder Diagnose von Prostatakrebs. Der Kit umfasst ein Gerät, wie oben
definiert und getrennt verpackt dritte Antikörper, die mit freiem PSA oder den
ersten Antikörpern
spezifisch Immunkomplexe bilden können, und vierte Antikörper, die
mit freiem IGF-1
oder zweiten Antikörpern
Immunkomplexe bilden können,
wobei die dritten und vierten Antikörper jeweils mit ersten und
zweiten Labeln gelabelt sind. Vorteilhafterweise kann der Kit des
Weiteren eine Möglichkeit
zum Erfassen und Messen der Menge von Label(n), die in dem Apparat
auf dessen Exposition den gelabelten Antikörpern gegenüber zurückgehalten werden.
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Obiges
beschreibt die vorliegende Erfindung, die unter Bezugnahme auf das
folgende Beispiel besser verstanden werden kann.
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Kurze Beschreibung
der Figur
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1 zeigt
durchschnittliche Spiegel von PSA und IGF-1 bei Patienten mit niedrigen PSA-Spiegeln
und die Korrelation mit Prostatakrebs.
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Beispiel
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Das
Prinzip des herkömmlichen
Zweistellen-(Sandwich-)Immunassays, das bevorzugt ist, erfordert
zwei Antikörper,
von denen einer mit einer Festphasenmatrix verknüpft ist, um eine Möglichkeit der
Trennung bereitzustellen, und der andere „gelabelt" ist, um die Endpunktbestimmung zu gestatten. Beide
Antikörper
erkennen den zu messenden Analyten und bilden einen Antikörper-Analyt-Antikörper-Immunkomplex. Die
Menge an gebildetem Komplex steht in direkter Beziehung zu der Konzentration des
in der Serumprobe vorliegenden Analyten.
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Zwei
verschiedene Antikörper,
die gegen PSA und IGF-1 gezüchtet
wurden, werden mit der Festphasenmatrix verknüpft und zwei entsprechend gelabelte
Antikörper
werden zum gleichzeitigen Messen beider Analyte, PSA und IGF-1,
in einer einzigen Probe von biologischem Fluid verwendet. Die Assaybedingungen
können
optimiert werden, um die analytische Empfindlichkeit zu bieten,
die zur Erfassung von freiem PSA und freiem IGF-1 erforderlich ist.
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Die
Probe kann mit einer geeigneten Substanz wie RSA (Rinderserumalbumin),
PBS (Phosphatpufferkochsalzlösung)
oder RSA (Rindergammaglobulin) verdünnt werden, bevor sie mit der
Festphasenmatrix in Kontakt gebracht wird. Man lässt die Probe dann über eine
Zeitspanne, wie einige Stunden, inkubieren, um die Bildung von Immunkomplexen
zu gestatten, und die Festphasenmatrix wird dann beispielsweise
mit PBS gewaschen, um Nichtimmunkomplexmaterial zu entfernen. Dann kann
die feste Matrix mit gelabelten Antikörpern kontaktiert und dann
inkubiert und gewaschen werden, bevor die Menge an Labeln gemessen
wird.
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Gegen
PSA und IGF-1 gerüchgtete
mono- und/oder polyclonale Antikörper
können
entweder durch Anwendung von Salzfraktionierung oder Protein-A-
oder Affinitätsreinigungs-Verfahren
gereinigt werden und werden zusammen an einer Festphasenmatrix befestigt.
Die Festphasenmatrix kann durch Verbinden von Antikörpern mit
Kunststoffreagenzgläsern,
Perlen, Mikrotiterplatten/-streifen, mikrokristalliner Cellulose,
Glas oder magnetischen Teilchen oder Membranen, die bei halbquantitativen Assays
verwendet werden, zubereitet werden. Ein besonders bevorzugtes Stützmaterial
besteht aus Röhren
oder Mikrotiterplatten.
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Geeignete
im Handel erhältliche
Anti-PSA-Antikörper
umfassen Nr. 7820-004
und 7820-0350 von Biogenesis Ltd., Poole, Dorset, Großbritannien;
MAB4082 von Chemicon International Inc, Temecula, CA, USA; SC-7638
und SC-7816 von Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, USA und
MAS 343cf von Harlan Sera-Lab Ltd, Loughborough, Leistershire, Großbritannien.
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Geeignete
im Handel erhältliche
Anti-IGF-Antikörper
umfassen Nr. 5345-0329
und 5345-0209 von Biogenesis Ltd., Poole, Dorset, Großbritannien;
GF006 von Chemicon International Inc, Temecula, CA, USA; SC-7144
und SC-1422 von Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, USA und
MAS 974p von Harlan Sera-Lab Ltd, Loughborough, Leicestershire,
Großbritannien.
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Das
zweite Paar Antikörper,
das verschiedene Antigendeterminanten von freiem PSA und freiem IGF-1
erkennt, kann mit Labeln verwendet werden. Gelabelte Antikörper können durch
Konjugieren mit Enzymen (Meerrettichperoxidase oder alkalischem Phosphat)
oder einem fluorogenen Mittel (Fluorocein) oder ein Chemilumeneszenzmittel
(Luminol oder ein Acridinderivat) zubereitet werden. Es wird vorgeschlagen,
Seltenerdechelate wie Europium und Samarium bei der Zubereitung
der gelabelten Antikörper
zu verwenden. Auf der Basis ihrer verschiedenen Absorptions-/Emissionscharakteristiken,
können sie
gleichzeitig in einem Assaysystem verwendet werden: Europium für gelabelten
IGF-1-Antikörper und
Samarium für
PSA oder umgekehrt.
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Jedoch
können
andere Labelpaare wie Erythrin/Eisen ebenfalls wirksam sein, verschiedene leicht
zu differenzierende Emissionen zu ergeben.
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Das
Prinzip der zugrundeliegenden Erfindung besteht deshalb darin, das
Antikörper
gegen freien PSA und IGF-1 auf der gleichen festen Matrix Antikörper-Analyt-Komplexe
mit freiem PSA und freiem IGF-1 in der gleichen Serumprobe bilden
und gelabelter PSA und IGF-1 sich an ihre entsprechenden Analyte
binden. Dadurch wird das Antikörper-Analyt-Antikörpersandwich
vervollständigt.
Die Endpunktanalyse wird an einem Instrument durchgeführt, das in
der Lage ist, Zeitraffer- oder Zeitauflösungsfluoreszenz zu determinieren/festzulegen,
wie beispielsweise einem Spektrophotometer.