AT368287B

AT368287B - Verfahren zur diagnostizierung von viruserkrankungen

Info

Publication number: AT368287B
Application number: AT0693079A
Authority: AT
Inventors: Helmut Dr Wachter; Arnulf Dr Hausen; Nikolaus Dr Grassmayr
Original assignee: Helmut Dr Wachter
Priority date: 1979-10-25
Filing date: 1979-10-25
Publication date: 1982-09-27
Also published as: ATA693079A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnostizierung von Viruserkrankungen im menschlichen oder tierischen Organismus, wobei eine dem Organismus entnommene Körperflüssigkeit untersucht wird.

Die klinische Laboratoriumsdiagnostik der Viruskrankheiten beruht derzeit im wesentlichen auf drei Verfahrensprinzipien :
1. Isolierung, Züchtung und Identifizierung des Virus vom Kranken (Dauer der Untersuchung zirka 6 Wochen) ;
2. Nachweis von virusspezifischen Antikörpern im Serum oder Liquor des Kranken (Dauer der
Untersuchung zirka 3 Wochen) ;
3. Züchtung und Identifizierung von Bakterien des Kranken, bei negativem Ergebnis Ausschluss der bakteriellen Erkrankung und Annahme einer viralen Erkrankung (indirekter Nach- weis - Dauer der Untersuchung 2 bis 3 Tage, Wiederholungsuntersuchungen erforderlich).

Die unter Punkt 1 genannten Methoden, die auch als "grosse Virusdiagnostik" bezeichnet werden, sind kostspielig und mühevoll. Sie sind auch für die Klinik nicht immer befriedigend ; dies gilt z. B. dann, wenn Erkrankungen der oberen Luftwege oder meningoencephalitische Syndrome aufgeklärt werden sollen. Die Isolierung und Identifizierung bedeutet in diesen Situationen für den Einzelfall keine diagnostische Hilfe, weil ihre Resultate zu spät ablesbar sind.

Die unter Punkt 2 genannten Methoden sind einfacher auszuführen und für den Klinikbetrieb von grösserer Bedeutung. Sie umfassen vor allem drei Methoden, diese sind : a) Der Neutralisationstest b) Der Hämagglutinations-Hemmungstest (Hirst-Test) c) Die Komplementbindungsreaktion (KBR).

Für alle diese Untersuchungen ist es notwendig, dass sie gleichzeitig an zwei Serumproben der gleichen Kranken quantitativ ausgeführt werden. Die erste Serumprobe soll sogleich nach dem Erscheinen der klinischen Symptome entnommen werden, die zweite Serumprobe nach etwa 14 Tagen. Die Serumproben werden sofort nach Entnahme eingeschickt und im Laboratorium eingefroren.

Die Untersuchung des Serumpaares erfolgt stets am gleichen Tag. Auch bei dieser "kleinen Virusdiagnostik" ergibt sich ein wesentlicher Zeitfaktor und erheblicher diagnostischer und kostspieliger Aufwand.

Beim dritten Verfahren handelt es sich um ein Ausschlussverfahren mit allen diesen Verfahren anhaftenden Mängeln. Die Viruserkrankung selbst wird dabei nicht direkt nachgewiesen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein gegenüber den bisherigen Vorschlägen verbessertes klinisch chemisches Verfahren zur Diagnose und Verlaufskontrolle von Viruserkrankungen in menschlichen oder tierischen Organismen zu schaffen.

Dies wird erfindungsgemäss dadurch erreicht, dass in der Körperflüssigkeit ein konjugiertes oder unkonjugiertes, gegebenenfalls derivatisiertes Pteridin oder sein Abbauprodukt, sein Oxydationsprodukt bzw. sein Reduktionsprodukt qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird. Im Rahmen des Nachweisverfahrens können diese Verbindungen selbstverständlich weiter oxydiert, reduziert, substituiert, derivatisiert, aber auch weiter abgebaut werden.

Das Pteridin hat folgende Formel :
EMI1.1

EMI2.1

EMI2.2

EMI3.1

EMI3.2

EMI3.3

EMI3.4

sein eines viralen Infektes in die zu untersuchende Körperflüssigkeit kein Pteridin abgibt. Andernfalls ist eine quantitative bzw. halbquantitative Bestimmung des konjugierten oder unkonjugierten Pteridins bzw. seiner Abbauprodukte, seiner Oxydationsprodukte oder Reduktionsprodukte nötig, wobei diese Werte mit Normalwerten (von Gesunden) je nach der speziellen Untersuchungsmethode der Körperflüssigkeit zu vergleichen sind.

Zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung der erfindungsgemässen Pteridinderivate einschliesslich ihrer Abbauprodukte, Oxydations- oder Reduktionsprodukte eignen sich übliche Analyseverfahren wie : -Niedervolt- oder Hochspannungselektrophorese auf Trägern oder trägerfrei kombiniert mit in-situ-Fluorometrie bzw. Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung ; -Dünnschichtchromatographie kombiniert mit in-situ-Fluorometrie oder Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung ;
EMI4.1
bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung ; - Gaschromatographie ; - Gaschromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie ; - Felddesorptionsmassenspektrometrie ; -Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Fluoreszenzdetektion bzw.

Detektion im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach chemischer Reaktion bzw. elektrochemische Detektion ; -Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ; - Flüssigohromatographie an Ionenaustauschern ; - Photometrie ; - Fluorometrie ; "Spektroskopie (UV-, IR-, kernmagnetische Resonanz, Massenspektrometrie) ; - Immunologische Methoden (Radio-Immuno-Assay (RIA), Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA), Enzym-Immuno-Assay (EMIT), Immunelektrophorese u. a. ; - Isotopenverdünnung ; - Enzymtest, z.

B. mittels Xanthinoxydase ; - Farbtest ; - Biologischer Test (Crithidia-Wachstumstest u. a.). ; - iso-elektrische Fokussierung ; - kinetische Nephelometrie.

Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren an Hand von Beispielen näher erläutert :
Beispiel 1 : Zum Nachweis eines Virusinfektes beim Menschen eignet sich z. B. die quantitative Bestimmung des Neopterins im Harn durch hoohdruckflüssigchromatographische (HPLC) Trennung des nativen Harnes und Fluoreszenzdetektion. Gegebenenfalls kann vor der chromatographischen Trennung eine Vortrennung mittels Vorsäule od. dgl. erfolgen.

5 J11 Humanharn bzw. die äquivalente Menge nach der Vorreinigung werden in das HPLC-System eingegeben. Am HPLC-System wird isokratisch gefahren. Als Puffer wird Ammonacetat/Essigsäure (30 mMol/l, p = 6, 0) mit 5% Methanolzusatz verwendet. Benutzt wird eine 30 cm-Säule mit reversed-phase-Material als Füllmittel. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 2 ml/min.

Durch das HPLC-System erfolgt eine klare Abtrennung des Neopterins von andern Substanzen, so dass das Neopterin mittels Fluoreszenzdetektor und angeschlossenem Schreiber quantitativ erfasst werden kann. Die Anregungswellenlänge beträgt hiebei 380 nm, die Messwellenlänge 450 nm.

Gleichzeitig mit der Bestimmung des Neopterins wird das im Harn ausgeschiedene Kreatinin quantitativ bestimmt, so dass die Angabe in ng Neopterin/mg Kreatinin erfolgen kann.

Beispiel 2 : Ein weiteres mögliches Analysenverfahren zur Bestimmung des Neopterins besteht in Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit dem Laufmittel 5%ige Essigsäure. Der hRf-Wert des Neopterins liegt in diesem System bei 65. Die quantitative Bestimmung des Neopterins erfolgt durch Direktfluorometrie bei 364 nm Anregung und 456 nm Messung mit einem Chromatogrammspektralfluorometer.

Beispiel 3 : Ein weiteres mögliches Analysenverfahren zur Bestimmung des Neopterins besteht in Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit dem Laufmittel n-Butanol/Eisessig/Wasser (20/3/7). Der hRf-Wert des Neopterins liegt in diesem System bei 37. Auch hier erfolgt die quantitative Bestimmung des Neopterins durch Direkt-Fluorometrie bei 356 nm Anregung und 440 nm Messung mit einem Chromatogrammspektralfluorometer.
EMI5.1
ten Papierbogen strichförmig auf 3 cm Länge aufgetragen. Der Lauf erfolgt in einer kommerziellen Hochspannungselektrophoresekammer bei 2700 V und 45 min Dauer. Nach Lufttrocknung wird der Elektrophoresebogen 16 cm weit in einem Chromatogrammfluoreszenzspektralphotometer gescannt, wobei das Fluoreszenzsignal mit einem Millivoltschreiber aufgezeichnet wird.

Die Anregungswellenlänge beträgt hiebei 372 nm, die Messwellenlänge 456 nm. Gemessen wird hiebei die Fluoreszenz eines Oxydationsproduktes des 7, 8-Dihydro-6-hydroxylumazins, nämlich des 6-Hydroxylumazins. Die Fläche der Bande bei der relativen elektrophoretischen Mobilität (bezogen auf 4-Hydroxyhippursäure = 100) hrM = 55 ist/proportional dem im Harn ausgeschiedenen 7,8-Dihydro-6-hydroxylumazin.

Beispiel 5 : Weiters können 7, 8-Dihydro-6-hydroxylumazin und sein Oxydationsprodukt 6-Hydroxylumazin simultan quantitativ flüssigchromatographisch bestimmt werden. Hiebei wird 1 ml vorgereinigte Probelösung auf eine Niederdrucksäule von 82 cm Länge und 6 mm innerem Durchmesser, gefüllt mit reversed-phase-Material Bondapak C, Teilohengrösse 37 bis 75 um, aufgegeben. Anschliessend wird isokratisch mit einer 25 mM Ammoniumacetatlösung, p =4, 5, bei einem Durchfluss von 100 ml/h eluiert.

7,8-Dihydro-6-hydroxylumazin hat ein Retentionsvolumen von 47 bis 53 ml und wird durch seine UV-Absorption bei 254 nm detektiert, 6-Hydroxylumazin wird von 54 bis 60 ml eluiert und fluorometrisch bei 366 nm Anregung und Messung oberhalb 400 nm detektiert.

Beispiel 6 : Zum Nachweis eines Virusinfektes beim Menschen eignet sich auch die quantitative Bestimmung des 2-Amino-4-oxo-pyrimidins im Harn durch hochdruckflüssigchromatographische (HPLC) Trennung des nativen Harnes und durch Messung mittels UV-Absorption. Gegebenenfalls kann vor der chromatographischen Trennung eine Vortrennung mittels Vorsäule od. dgl. erfolgen.

5 lil Humanharn bzw. die äquivalente Menge nach der Vorreinigung werden in das
EMI5.2

Durch das HPLC-System erfolgt eine klare Abtrennung des 2-Amino-4-oxo-pyrimidins von andern Substanzen, so dass das 2-Amino-4-oxo-pyrimidin mittels UV-Absorption und angeschlossenem Schreiber quantitativ erfasst werden kann. Die Absorption wird bei 240 nm gemessen.

In gleicher Weise kann Guanosin-triphosphat (GTP) quantitativ bestimmt werden. Gemessen wird in diesem Fall bei 260 nm.

Beispiel 7 : (Radioimmunoassay)
EMI5.3
tere 1, 5 h inkubiert. Nach Zugabe von 500 pl Wasser wird zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Der Niederschlag wird in 1 ml Wasser resuspendiert, erneut zentrifugiert und der Überstand
EMI5.4
chen überführt und im Zählgerät (Packard) gemessen.

Beispiel 8 : (Enzymimmuno-Assay)
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05Xanthopterin-Antiserum (Kaninchen 1 : 1000) und 100 pl Xanthopterin- ss -D-galactosidase-Konjugat (zirka 50 ng) 5 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 100 pl 2. Antikörper (Ziege, Anti-Kaninchen) wird 3 h bei Raumtemperatur (oder über Nacht im Kühlschrank) inkubiert. Nach Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt, das Sediment in 1 ml PBS-Puffer resuspendiert. Nach Wiederholung des Zentrifugierens und Absaugens wird 0, 1 ml Enzymsubstrat (0, 1 M Phosphat
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den 1, 5 ml 0, 2 M Na2CO, zugegeben und die optische Dichte bei 420 nm bestimmt.

Beispiel 9 : (Xanthopterinhemisuccinat-ss-D-Galactosidase-Konjugat)
14 mg Xanthopte1"in-N 2 -hemisuccinat und 9, 2 mg Tri-n-butylamin werden in 500 ul absol. DMF im Eisbad gekühlt, nach Zugabe von 6, 6 mg Chlorameisensäureisobutylester wird 30 min gerührt.

Danach werden 5 mg ss-D-Galactosidase in 5 ml Wasser zugesetzt ; die Reaktion wird durch Zugabe
EMI6.2
schrank aufbewahrt. Das Enzymkonjugat kann durch Chromatographie an Sephadex G 25 gereinigt werden.

Beispiel 10 : Die enzymatische Bestimmung des 7, 8-Dihydroxanthopterins (ein 7, 8-Dihydro-
EMI6.3

EMI6.4

EMI6.5

Claims

<Desc/Clms Page number 7> EMI7.1 pterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 7, 8-Dihydroxanthopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn Biopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird. EMI7.2 wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 6-Hydroxymethylpterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis bzw. die Bestimmung des Pteridins bzw. seiner Abbauprodukte, seiner Oxydations- oder Reduktionsprodukte unter Bestrahlung und Messung der dabei entstehenden Fluoreszenzstrahlung erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die quantita- EMI7.3 metrischer Direktauswertung erfolgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung des Pteridins bzw. seiner Abbauprodukte, seiner Oxydations- oder Reduktionsprodukte durch Dünnschichtchromatographie und anschliessender fluorometrischer Direktauswertung erfolgt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pteridin bzw. seine Abbauprodukte, seine Oxydations- oder Reduktionsprodukte quantitativ flüssigkeitschromatographisch insbesondere hochdruckflüssigkeitschromatographisch bestimmt und fluorometrisch und/oder durch seine UV-Absorption detektiert werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pteridin bzw. seine Abbauprodukte, seine Oxydations- oder Reduktionsprodukte immunologisch durch Radio-Immuno-Assay bestimmt werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pteridin EMI7.4 oder ReduktionsprodukteEnzym-Immuno-Assay bestimmt werden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pteridin EMI7.5 <Desc/Clms Page number 8>

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Pteridins bzw. seiner Abbauprodukte, seiner Oxydations- oder Reduktionsprodukte z. B. mittels HPLC unter Beziehung auf den Kreatiningehalt fluorometrisch erfolgt.