DE68903884T2

DE68903884T2 - Mittel und methode zur bestimmung von spurenmengen an proteinen.

Info

Publication number: DE68903884T2
Application number: DE8989109612T
Authority: DE
Inventors: Arthur L Y Lau
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1988-06-06
Filing date: 1989-05-27
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2009-05-28
Also published as: JPH0244256A; EP0345582B1; EP0345582A3; AU606283B2; AU3602789A; EP0345582A2; US4960710A; JPH0670632B2; CA1333251C; DE68903884D1

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe auf Anwesenheit und Konzentration von geringen bis Spurenmengen an Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues und verbessertes Verfahren und eine Zusammensetzung zur Untersuchung einer Flüssigkeit wie Urin für geringe bis Spurenmengen an Proteinen unter Verwendung eines Mittels, welches einen Wolframatfarbstoffkomplex als Reaktionsindikator enthält . Das Mittel ist in eine Trägermatrix integriert, so daß eine nachweisbare und/oder meßbare Reaktion nach Kontakt des Mittels mit einer Probe, welche eine geringe bis eine Spurenmenge an Protein enthält, auftritt. Das Mittel zeigt ausreichende Empfindlichkeit gegenüber Proteine und ausreichende Farbauflösung zwischen verschiedenen Proteinkonzentrationen für einen genauen Nachweis und/oder Messung des Proteingehalts einer flüssigen Probe, entweder mit dem Auge oder instumentell. Zusätzlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines Mittels, welches einen Wolframatfarbstoffkomplex als Indikator umfaßt, in einer Methode zum Nachweis des Vorliegens und/oder Konzentration von geringen bis Spurenmengen an Proteinen in einer Probe durch ein Teststreifennachweisverfahren in der Trockenphase oder durch ein Lösungstestverfahren in der Naßphase.
Albumin ist das häufigste Plasmaprotein, welches im allgemeinen etwas mehr als die Hälfte des Gesamtproteins im Säugerplasma ausmacht. Im Menschen spielt Albumin eine wichtige Rolle bei der Regulation des Wasserhaushalts zwischen dem Blut und Geweben und der Funktion als Transportmolekül für verschiedene Verbindungen, wie z. B. Bilirubin, Fettsäuren, Kortison, Thyroxin und Arzneimittel, wie Sulfonamide und Barbiturate die nur gering wasserlöslich sind. Ein Albuminmangel kann den Transport von gering wasserlöslichen Substanzen durch den Körper einschränken, und der Mangel zeigt sich bei einem Patienten durch eine abnorme Ansammlungen von seriösen Flüssigkeiten oder Ödemen. Daher ist es klinisch wichtig zu untersuchen, ob ein Patient an einem Mangel an Serumalbumin leidet.
Ebenso ist es klinisch wichtig festzustellen, ob ein Patient einen Überschuß an Protein ausscheidet. Eine normal funktionierende Niere bildet Urin in einen im wesentlichen zweistufigen Prozeß. Das Blut fließt durch den Glomerulus oder die Glomerulareregion der Niere. Die Kapillarwände des Glomerulus sind für Wasser und Bestandteil des Blutplasmas mit niedrigem Molekulargewicht äußerst durchlässig. Albumin und andere Proteine von hohem Molekulargewicht können nicht durch diese Kapillarwände treten und werden im wesentlichen aus dem Urin ausfiltriert, so daß das Protein zur Verwendung für den Körper zu Verfügung steht. Die Flüssigkeit, welche die Bestandteile von niedrigem Molekulargewicht enthält, tritt in die Tubulen oder tubulare Region der Niere, wo Reabsorption einiger Urinbestandteile, wie Proteine von niedrigem Molekulargewicht und Sekretion anderer Urinbestandteile und Konzentrierung des Urins erfolgt. Als Ergebnis des kombinierten Prozesses von Glomerulus und Tubula sollte die Konzentration an Proteinen im Urin minimal oder Null sein. Daher müssen abnorm hohe Werte an Albumin und/oder Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht im Urin nachgewiesen werden und einer physiologischen Fehlfunktion zugeordnet werden.
Die relativ hohe Konzentration an Albumin im Urin eines Patienten ist im allgemeinen ein Hinweis auf eine Krankheit. Z. B. variiert die normale mittlere Proteinkonzentration im Urin von ca. 2 mg/dl bis ca. 8 mg/dl, wobei ca. 1/3 des gesamten Urinproteins Serumalbumin ist. Bei der Mehrzahl von Krankheiten jedoch steigt der Proteingehalt deutlich an, so daß Albumin von ca. 60 % bis ca. 90 % des ausgeschiedenen Proteins ausmacht. Das Vorliegen einer abnormen erhöhten Menge an Protein im Urin, als Proteinurie bekannt, ist eines der wichtigsten Indikatoren einer Nierenkrankheit und kann auf eine Reihe anderer Nicht-Nierenkrankheiten hinweisen.
Zum Nachweis, ob ein Patient an einem Albuminmangel leidet und/oder zum Nachweis, ob ein Patient einen Überschuß an Protein ausscheidet, und um den Verlauf einer medikamentösen Behandlung zur Kontrolle der Wirksamkeit der Behandlung festzustellen, sind daher genaue und billige Proteinnachweisverfahren entwickelt worden. Von mehreren verschiedenen Nachweisverfahren die zum Nachweis und/oder Bestimmung von Protein im Urin und Serum entwickelt wurden, haben sich Verfahren auf der Grundlage einer Farbstoffbindung besonders geeignet herausgestellt, da Farbstoffbindungsverfahren leicht automatisiert werden können und reproduzierbare und genaue Ergebnisse liefern.
Im allgemeinen verwenden Farbstoffbindungstechniken pH-Indikatorfarbstoffe, die zur Reaktion mit einem Protein, wie z. B. Albumin in der Lage sind und die eine Farbveränderung nach Reaktion mit einem Protein ohne pH-Veränderung eingehen können. Wenn ein pH-Indikatorfarbstoff mit einem Protein reagiert oder an dieses bindet, verändert sich die scheinbare pKa (Säuredissoziationskonstante) des Indikatorfarbstoffs und der Farbstoff zeigt eine Farbveränderung was zum sogenannten "Proteinfehler"-Phänomen führt. Bei Verfahren unter Einsatz der Farbstoffbindungstechnik hält ein geeigneter Puffer den pH-Indikatorfarbstoff auf einen konstanten pH, um eine Farbveränderung des pH-Indikatorfarbstoffs aufgrund einer wesentlichen pH-Veränderung zu verhindern. Aufgrund des "Protenfehler"-Phänomens nach Reaktion mit dem Protein zeigt der pH-Indikatorfarbstoff eine Farbveränderung, die mit der Farbveränderung aufgrund einer pH-Veränderung identisch ist. Beispiele von pH-Indikatorfarbstoffen, die in einem Trockenphasentest auf Proteine verwendet werden, die zur Reaktion mit, oder Bindung an Proteine in der Lage sind und "Proteinfehler"-Farbübergänge zeigen, umfassen Tetrabromphenol-Blau und Tetrachlorphenol-3,4,5,6-tetrabromsulfophthalein.
Obwohl pH-Indikatorfarbstoffe häufig in Proteintest verwendet werden, treten noch immer mehrere Probleme und Nachteile bei Proteintestverfahren, die Indikatorfarbstoffe verwenden, auf. Z. B. können Verfahren auf der Grundlage von pH-Indikatorfarbstoffen entweder nicht verschiedene Proteinkonzentrationen unter ca. 15 mg/dl nachweisen, oder nicht quantitativ zwischen ihnen unterscheiden. Zusätzlich erfordert die Mehrheit dieser Testverfahren, obwohl mehrere einfache semiquantitative Tests und mehrere komplexe quantitative Tests zum Nachweis des Gesamtproteingehalts in einer Probe zur Verfügung stehen, die Präzipitation des Proteins zur Durchführung quantitativer Proteinbestimmungen, mit jedoch der bemerkenswerten Ausnahme des einfachen kolometrischen Reagenzteststreifens.
Der Farbreagenzteststreifen verwendet die zuvor diskutiertes Fähigkeit der Proteine zur Wechselwirkung mit gewissen Säure-Basen-Indikatoren und die Veränderung der Farbe des Indikators ohne pH-Veränderung. Z. B. zeigt der Indikator Tetrabromphenol blau, wenn dieser in einem konstanten pH von ca. 3 gepuffert ist, eine gelbe Farbe in Lösungen, die kein Protein enthalten. Bei Lösungen, die jedoch Proteine enthalten, bewirkt die Anwesenheit von Protein, daß der gepufferte Farbstoff der Lösung entweder grün oder blau, je nach Konzentration des Proteins in der Lösung wird.
Einige Farbteststreifen zur Verwendung bei Proteintests haben ein einzelnes Testfeld, welches aus einem kleinen quadratischen Kissen aus einer mit einem gepufferten pH-Indikatorfarbstoff wie z. B. Tetrabromphenol-Blau, getränkten Trägermatrix besteht. Andere Farbteststreifen sind Vielfach-Bestimmungsreagenzstreifen, die ein Testfeld zum Proteinnachweis, wie oben beschrieben, umfassen, und ferner mehrere zusätzlich Testbereiche auf demselben Streifen enthalten, die den gleichzeitigen Test anderer Urinbestandteile erlauben. Bei beiden Typen von Farbteststreifen wird der Test auf Protein im Urin durch einfaches Eintauchen des Farbteststreifen in eine gut gemischte nicht zentrifugierte Urinprobe und anschließendes Vergleichen der erhaltenen Farbe des Testbereiches auf dem Teststreifen mit einer standardisierten Farbkarte auf dem Behälter mit dem Farbteststreifen durchgeführt.
Für Teststreifen mit Tetrabromphenol blau, gepuffert bei pH 3 als Indikatorfarbstoff, können halbquantitative Proteintests durchgeführt werden und liefern als Ergebnis für den Proteingehalt: negativ, Spuren, oder ein "Plus" bis vier "Plus". Ein negatives Ableseergebnis oder eine gelbe Farbe zeigt, daß der Urin kein Protein enthält, wie durch das Fehlen eines Farbveränderung des Indikatorfarbstoffes hervorgeht. Ein "Spuren"-Ableseergebnis kann auf ca. 5 bis 20 mg/dl Protein im Urin hinweisen. Ein "Plus" bis vier "Plus"-Ergebnis, dargestellt durch eine Farbveränderung von grün über zunehmende Schattierungen von blauen Punkten, entspricht ca. Urinproteinkonzentrationen von 30, 100, 300 und über 2000 mg/dl, und sind als Indikatoren einer zunehmend ernsten Proteinurie geeignet.
In Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren kann ein Patient leicht mit dem Auge feststellen, daß der Proteingehalt einer Urinprobe im Bereich von 0 mg/dl bis 30 mg/dl liegt. Die Farbunterscheidung, wie sie durch die gegenwärtig käuflich erhältlichen Teststreifen zur Verfügung gestellt wird, ist jedoch ungenügend, um eine genaue Bestimmung des Proteingehalts im Urin zwischen 0 mg/dl und ca. 15 mg/dl zu erlauben. Die Unfähigkeit, niedrige Proteinkonzentrationen nachzuweisen und zwischen ihnen zu unterscheiden ist von wichtiger klinischer Bedeutung, da ein Gesunder im allgemeinen einen Proteingehalt im Bereich von ca. 10 mg/dl bis ca. 20 mg/dl hat. Daher könnte es klinisch wichtig sein, den Urinproteingehalt eines Patienten genauer zu kennen, als nur den Proteingehalt auf einen Wert weniger als ca. 30 mg/dl zu schätzen.
Natürlich kann der Proteingehalt einer Urinprobe genauer durch halbquantitative Proteinpräzipitationstechniken oder durch quantitative 24-Stunden-Proteinpräzipitationstechniken bestimmt werden. Diese Tests sind jedoch zeitaufwendig und relativ teuer. Ferner müssen die Präzipitationstests in einem Labor durch geschultes Personal durchgeführt werden und stehen daher für einen Patienten zur Durchführung einer schnellen Bestimmung des Urinproteingehaltes zu Hause und zur Überwachung des Erfolgs oder Nicht-Erfolgs einer bestimmten medizinischen Behandlung nicht zur Verfügung.
Es würde daher äußerst vorteilhaft sein, ein einfaches, genaues und vertrauenswürdiges Verfahren zum Urintest auf niedrige bis Spurenproteinmengen zu haben, die eine visuelle Unterscheidung von Proteingehalten im Bereich von 0 mg/dl bis ca. 5 mg/dl, ca. 5 mg/dl bis ca. 10 mg/dl, ca. 10 mg/dl bis ca. 20 mg/dl und ca. 20 mg/dl bis ca. 30 mg/dl und aufwärts bis zwischen ca. 100 mg/dl bis ca. 300 mg/dl, erlaubt. Durch zur Bereitstellung eines solchen genauen Verfahrens zur Bestimmung einer niedrigen bis Spurenurinproteinkonzentration in einer einfach zu verwendeten Form, z. B. als Eintauch- und Ableseteststreifen, kann der Urintest auf niedrige bis Spurenmengen an Protein durch Laborpersonal durchgeführt werden, was sofortige Testergebnisse erlaubt, so daß eine Diagnose ohne Wartezeit bis zu einem Tag auf die Testergebnisse erfolgen kann und mit der medizinischen Behandlung sofort begonnen werden kann. Zusätzlich kann das Teststreifenverfahren von einem Patienten zu Hause eingesetzt werden, um genaue niedrige bis Spurenproteingehalte im Urin, und/oder den Erfolg einer medizinischen Behandlung, der sich der Patient gerade unterzieht, zu überwachen.
Wie im folgenden näher ausgeführt wird, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren den schnellen genauen und sicheren Test auf niedrige bis Spurenmengen an Protein im Urin unter Verwendung eines Teststreifens, der ein Reagenz mit einem Wolframatfarbstoffkomplex, umfaßt. Das Wolframatfarbstoffkomplexmittel verbessert die Empfindlichkeit des Tests und liefert eine ausreichende visuelle Farbauflösung zwischen verschiedenen Proteinkonzentrationen und erlaubt daher die genaue Bestimmung von Urinproteinkonzentrationen bei Gehalten von ca. 30 mg/dl oder weniger. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung des Vorliegens und/oder Konzentrationen von höheren Konzentrationen an Proteinen, sowie z. B. von ca. 100 mg/dl bis ca. 2000 mg/dl in einer Probe eingesetzt werden.
Das Ausmaß der Proteinurie in einem Patienten hängt von der genauen Natur der klinischen und pathologischen Fehlfunktion und der Schwere der bestimmten Krankheit ab. Proteniurie kann zweitweise oder chronisch auftreten, wobei vorübergehende zwischenzeitliche Proteinurie gewöhnlich durch physiologische oder funktionelle Zustände als durch Nierenerkrankungen ausgelöst wird. Daher müssen genaue und umfassende Urintests und andere Tests flüssiger Proben auf Urin sowohl für den Labor- und Hausgebrauch zur Verfügung stehen. Die Tests müssen den Nachweis und Messung auch von geringen bis Spurenkonzentrationen an Proteinen erlauben, so daß eine korrekte Diagnose erstellt und die richtige medizinische Behandlung eingeleitet, überwacht und aufrechterhalten werden kann. Zusätzlich ist es vorteilhaft, wenn das Proteintestverfahren auf niedrige bis Spurenkonzentrationen an Protein als Eintauch- und Ableseformat zum leichten und ökonomischen quantitativem und/oder semiquantitativem Nachweis auf Protein im Urin oder andern flüssigen Proben eingesetzt werden kann.
Ferner muß jedes Verfahren zum Proteinnachweis im Urin oder anderen Proben genaue verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse durch die Verwendung eines Mittels, welches eine Farbveränderung als Ergebnis einer Reaktion mit dem Protein, und nicht als Ergebnis einer konkurrierenden chemischen oder physikalischen Reaktion, wie einer pH-Veränderung, oder mit einer bevorzugt ablaufenden Reaktion mit einem anderen Bestandteil der Probe als dem Protein eingeht, liefern. Darüber hinaus wäre es vorteilhaft, falls das Proteintestverfahren zur Verwendung sowohl in nassen Tests wie auch in trockenen Reagenzstreifen zur raschen ökonomischen und genauen Bestimmung von Protein oder anderen Proben geeignet ist. Zusätzlich sollte das im Proteintest eingesetzte Verfahren und Zusammensetzung nicht negativ andere Testreagenzkissen auf einem Mehrfachtestreagenzstreifen beeinflussen oder mit diesem reagieren.
Vor der vorliegenden Erfindung enthielt kein bekanntes Verfahren zum Test von Urin oder anderen Proben auf Proteine ein Mittel, welches ausreichende Empfindlichkeit und Farbauflösung des Tests bei niedrigen oder Spurenproteinkonzentrationen lieferte, so daß genaue und verlässliche Proteintests auf Proteinkonzentrationen von ca. 30 mg/dl und darunter nicht durchgeführt werden konnen. Zusätzlich enthielt kein Trockenphasenteststreifen, obwohl ein Trockenphasenteststreifen unter Verwendung eines einzelnen Farbstoffes, wie z. B. Tetrabromphenolblau oder Tetrachlorphenol-3,4,5,6-tetrabromsulophthalein seit mehreren Jahren häufig verwendet wird, einen Wolframatfarbstoffkomplex, der ausreichende Empfindlichkeit, und daher ausreichende visuelle Farbauflösung zwischen Proteingehalten bei einer niedrigen bis Spurenproteinkonznetration lieferte.
Der Stand der Technik enthält zahllose Hinweise auf Naßphasen und Trockenphasenchemie, die in der pH-Indikatorfarbstoffmethode zum Test von Urin auf Protein eingesetzt wird. Z. B. offenbart Keston im US-Patent Nr. 3 485 587 die gundlegende Farbstoffbindungstechnik, die zum Test auf Proteinen bei einem konstanten pH eingesetzt wird. Keston klärt die Verwendung eines einzelnen Indikatorfarbstoffes, der bei einem konstanten pH gering unterhalb der pKa (der Säuredissoziationskonstante) des Farbstoffs gehalten wird, um das Vorliegen und/oder die Konzentration von Albumin durch Beobachtung der Farbveränderung des Farbstoffes nachzuweisen. Die Veröffentlichung "Color Reaction Between Pyrogallol Red-Molybdenum (VI) Complex and Protein", Y. Fujita, I. Mori, und S. Kitano, Bunseki Kagaku, 32, Seiten E379-E386 (1983) beschreibt die Proteinwechselwirkung mit einem Pyrogallol-Rot-Molybdänkomplex, der den Einbau eines Komplexreagenzes oder Metallion in den Komplex zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen erfordert.
In gleicher Weise offenbart das japanische Patent Nr. 61/155757 (1986) ein kolorimetrisches Verfahren zum Nachweis von Spurenmengen von Proteinen in einer Probe unter Verwendung einer Zusammensetzung die einen Molybdänfarbstoffkomplex und entweder ein Komplexbildner oder bestimmte Metallione enthält. Es wurde jedoch gefunden, daß das im japanischen Patent Nr. 61/155757 offenbarte Verfahren von einer hohen Ionenstärke und Wechselwirkungen mit der spezifischen Dichte negativ beeinflußt wird, so daß das Ausmaß der Molybdat-Farbstoffbindung an das Protein und daher die Tiefe der Farbbildung in umgekehrter Beziehung zur Ionenstärke der Probe steht. Daher ruft der Test einer Urinprobe mit niedriger Ionenstärke (niedrige spezifische Dichte) eine größere Farbveränderung in der Testvorrichtung hervor (und weist daher auf einen größeren Proteingehalt hin) als der Test einer Urinprobe mit demselben Proteingehalt, jedoch einer höheren Ionenstärke (höhere spezifische Dichte) . Unerwarteter Weise zeigt der in der vorliegenden Erfindung verwendete Wolframatkomplex keine Beeinflussung durch die Ionenstärke bzw. spezifischen Dichte und liefert einen genauen Proteintest ohne Berücksichtigung der Ionenstärke der Probe. Es wurde daher gefunden, daß der Einschluß eines Komplexbildners, das der Zusammensetzung, offenbart in dem japanischen Patent zur Unterdrückung der Leerreaktion zugesetzt wird, unnötig ist und eigentlich dem erfindungsgemäßen Verfahren abträglich ist.
Das im japanischen Patent Nr. 61/155757 offenbarte Verfahren wurde ebenfalls in der Veröffentlichung "Urinary Protein as Measured with a Pyrogallol Red-Molybdate Complex, Manually and in a Hitachi 726 Automated Analyzer", N. Watanabe, S. Kamei, A. Ohkubo, M. Yamanaka, S. Ohsawa, K. Makino und K. Tokuda, Clin. Chem., 32/8, Seiten 1551 bis 1554 (1986) beschrieben. Diese Veröffentlichung beschreibt den automatisierten oder manuellen Nachweis von Proteinen in Urin unter Verwendung eines Molybdat-Farbstoffkomplexes. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Nachteilen berichtet die Veröffentlichung ferner, daß die erwünschte Reaktion von Protein mit dem Molybdat-Farbstoffkomplex mindestens 8 Min. braucht und innerhalb 10 Min. bei 37ºC in einem automatischen Test abgeschlossen ist. Im manuellen Test ließ man die Reaktion jedoch für 20 Min. fortschreiten bevor der Test auf eine Reaktion geprüft wurde. Solche langen Reaktionszeiten für den kompletten Farbübergang sind unbequem und können zu fehlerhaften Testergebnissen führen, sollte das Ausmaß des Farbübergangs und daher der Proteingehalt zu rasch gemessen werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem Wolframatfarbstoffkomplex in weniger als 2 Min. abgeschlossen und liefert daher schnellere Ergebnisse mit einer deutlich verminderten Fehlerhäufigkeit.
Im Gegensatz zum Stand der Technik und im Gegensatz zu gegenwärtig käuflich erhältlichen Teststreifen bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine erhöhte Empfindlichkeit beim Nachweis und der Messung von Proteinen im Urin, insbesondere von niedrigen bis Spurenmengen von Urinprotein durch Verwendung eines Reagenz, welches einen Wolframatfarbstoffkomplex enthält, so daß ein genauer Test für Proteingehalte von ca. 30 mg/dl und darunter erreicht wird. Unerwarteter und überraschender Weise erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren, ebenfalls im Gegensatz zum Stand der Technik, den einfachen und schnellen Nachweis und die Messung niedriger und Spurenmengen von Proteinen in einer flüssigen Probe. Daher werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren neue unerwartete Ergebnisse im Trockenphasen-Reagenzstreifentest und im Naßtest von Urin und anderen Proben auf Proteine, insbesondere auf niedrige oder Spurenkonzentrationen von Proteinen unter Verwendung eines Reagenz mit einem Wolframatfarbstoffkomplex erreicht.
Die Erfindung betrifft ein neues und verbessertes Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis des Vorliegens und/oder der Konzentration eines Bestandteils in einer Probe, insbesondere niedriger oder Spurenmengen der Komponente. Das Verfahren umfaßt die Verwendung eines Reagenz, das zur Reaktion mit einer Probenkomponente unter Auslösung eines nachweisbaren Signals in der Lage ist. Für den Hausgebrauch liefert das Reagenz ein sichtbar nachweisbares Signal. Für die Laborverwendung liefert das Reagenz ein Signal, das visuell oder mit einem Instrument nachweisbar ist. Dieses Verfahren ist für einen Naßtest und Trockentest geeignet, worin das Reagenz in eine Trägermatrix in einer Analysiervorrichtung eingebracht ist. Die Trägermatrix der Analysiervorrichtung umfaßt saugfähige poröse Materialien, wie Filterpapier oder nicht-saugfähige poröse Materialien, wie einen permeablenen Streifen, Schicht oder Membran aus einen polymeren Material. Das Reagenz ist homogen in der Trägermatrix eingebracht und die Trägermatrix enthält das Reagenz homogen über die gesamte Trägermatrix in einer bestimmten Konzentration verteilt, während die stützende Trägermatrix für die flüssige Probe durchlässig ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Urintest oder anderer Proben auf Proteine, insbesondere auf niederer oder Spurenmengen von Proteinen unter Verwendung eines neuen und verbesserten Reagenz. Es wurde dargelegt, daß die Verwendung des Reagenz mit einem Wolframatfarbstoffkomplex die Empfindlichkeit und Farbauflösung bei niedrigen Proteinkonzentrationen genügend steigert und so den Nachweis und die Messung niedriger bis Spurenproteinkonzentrationen in einer flüssigen Probe ermöglicht. In Übereinstimmung mit diesem wesentlichen Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine qualitative und/oder halbqantitative Bestimmung von Protein zwischen 0 mg/dl und ca. 2000 mg/dl und insbesondere zwischen 0 mg/dl und ca. 30 mg/dl in Urin und anderen Proben ermöglicht. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Wolframatfarbstoffkomplex-Reagenz bei klinischen Testverfahren kann die qualitative oder semiquantitative Konzentration von Proteinen, wie Albumin im Urin oder anderen Proben, genauer bestimmt werden, da eine verbesserte Empfindlichkeit des Verfahrens und eine verbesserte Farbauflösung bei niedrigen bis Spurenproteinkonzentrationen durch das Wolframatfarbstoffkomplex-Reagenz ermöglicht wird. Ferner erlaubt das Wolframatfarbstoffkomplex-Reagenz, das in der Analysatoreinrichtung eingebracht ist, den Nachweis und die Messung niedriger bis Spurenproteinkonzentrationen, so z. B. zwischen 0 mg/dl und ca. 10 mg/dl und ebenfalls zwischen 0 mg/dl und ca. 5 mg/dl und zwischen ca. 5 mg/dl und ca. 10 mg/dl im Urin oder anderen Proben.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein neues und verbessertes Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung der relativen Konzentration einer chemischen Verbindung in einer Flüssigkeit zur Verfügung zu stellen.
Damit verbunden ist die Aufgabe ein einfaches, verlässliches, genaues und reproduzierbares Verfahren zum Urintest oder anderer Proben auf Proteine zur Verfügung zu stellen. Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die zur Verfügungstellung eines einfachen, verlässlichen, genauen und reproduzierbaren Verfahrens zum Test von Urin oder anderen Proben auf niedrige Konzentrationen und Spurengehalte von Proteinen.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist es, eine neue und verbesserte Testvorrichtung für die Reaktion mit dem Protein zur Wechselwirkung mit Protein in einer Testflüssigkeit unter Erzeugung einer sichtbaren Veränderung, wie einer Farbveränderung in der Testvorrichtung, zur Verfügung zu stellen, die Proteinkonzentration in der Testflüssigkeit anzeigt.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist es, ein Verfahren zum Untersuchen von Urin und anderen flüssigen Proben zur Verfügung zu stellen, welches eine ausreichende Empfindlichkeit und ausreichende visuelle Farbauflösung ermöglicht, um einen Nachweis und Messung von niedrigen bis Spurenproteinkonzentrationen zu erlauben.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Test von Urin oder anderen flüssigen Proben zur Verfügung zu stellen, welches empfindlich auf Proteinkonzentrationen von weniger als ca. 10 mg/dl ist und welches halbquantitativ zwischen Proteingehalten von 0 mg/dl bis ca. 2000 mg/dl und insbesondere von 0 mg/dl bis ca. 30 mg/dl unterscheidet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Untersuchung von Urin und anderen Testflüssigkeiten zur Verfügung zu stellen, welches eines Indikatorreagenz verwendet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Test von Urin oder anderen Flüssigkeiten unter Verwendung eines Indikatorreagenz zur Verfügung zu stellen, das mit Proteinen reagiert und eine sichtbare und meßbare Farbveränderung zum Nachweis der Anwesenheit und der Konzentration von Protein in der Probe zeigt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Indikatorreagenz zur Verfügung zu stellen, das mit Proteinen reagieren kann und eine sichtbare und/oder instrumentell unterscheidbare Farbveränderung hervorrufen kann, was einen halbquantitativen Nachweis der Proteinkonzentration im Urin oder anderen flüssigen Proben bei Gehalten zwischen 0 mg/dl und ca. 2000 mg/dl und insbesondere zwischen 0 mg/dl und ca. 30 mg/dl erlaubt.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist es, ein Verfahren zum Nachweis von Protein durch Einsatz eines Indikatorreagenz zur Verfügung zu stellen, welches einen Wolframatfarbstoffkomplex in einer Trockenphasen-Analytnachweisvorrichtung enthält.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues und verbessertes Verfahren zum Test von Protein zur Verfügung zu stellen unter Einsatz einer Analyttestvorrichtung, welche eine Trägermatrix mit einem darin eingeschlossenen Reagenz enthält, das zur Reaktion mit dem Proteingehalt in der Probe in der Lage ist, wobei die Trägermatrix eine saugfähige Matrix, wie Filterpapier, und eine nicht-saugfähige Matrix, wie einen Schichtfilm oder Membran eines permeablen polymeren Materials umfaßt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen neuen und verbesserten Trocken-Farbteststreifen zur Verfügung zu stellen, der mit einem Wolframatfarbstoffkomplex-Reagenz in der Trägermatrix getränkt werden kann, um so einen Teststreifen von neuer und unerwarteter Genauigkeit für das Proteinsignal zu erhalten.
Die obige und die weiteren Aufgaben und die Vorteile und neuen Merkmale der Erfindung wird aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich.
Erfindungsgemäß wird der qualitative und/oder halbqualitative Test auf Proteine, wie z. B. Albumin und insbesondere auf niedrige bis Spurenkonzentrationen an Proteinen im Urin und flüssigen Proben durch Verwendung eines Indikatorreagenz verwirklicht, das einen Wolframatfarbstoffkomplex enthält. Durch Einsatz des Indikatorreagenz, das einen Wolframatfarbstoffkomplex enthält, wird eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber Proteinen und eine ausreichende visuelle Farbveränderung zwischen Proteingehalten erreicht, was dem Test von niedrigen bis Spurenkonzentrationen von Proteinen in flüssigen Proben erlaubt. Die verbesserte Empfindlichkeit und Farbauflösung bei niedrigen Proteingehalten, wie sie durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht wird, ist besonders bei Urintests nützlich.
Heutzutage käuflich erhältliche Testverfahren sind nicht in der Lage, zwischen Proteingehalten im Bereich von 0 mg/dl bis ca. 30 mg/dl, und insbesondere zwichen 0 mg/dl bis ca. 15 mg/dl zu unterscheiden. Die Unterscheidung zwischen niedrigen Proteinkonzentrationsgehalten ist klinisch wichtig, da ein Bereich von 10 mg/dl bis ca. 20 mg/dl als normaler Urin-Proteingehalt für einen Gesunden angenommen wird, und daher Urin-Proteingehalte von 0 mg/dl bis ca. 10 mg/dl auf einen möglichen Proteinmangel hinweisen können, der durch ein physiologisches Ungleichgewicht verursacht sein kann, und Urin-Proteingehalte größer als ca. 20 mg/dl können überschüssige Ausscheidung von Proteinen anzeigen, was auf einen Krankheitszustand hinweisen kann. Es sollte Beachtung finden, daß im Hinblick auf Proteinkonzentrationen im Urin in einem relativ hohen Bereich so z. B. von ca. 100 mg/dl bis ca. 2000 mg/dl das erfindungsgemäße Verfahren immer noch eine verbesserte Empfindlichkeit und Farbauflösung bei Urin-Proteinkonzentrationen bietet, obwohl solche klinischen Vorteile weniger wichtig in diesem Konzentrationsbereich sind, da solche hohe Proteingehalte definitiv auf einen abnormalen physiologischen Zustand hinweisen, der weiter untersucht werden muß. Ferner ist es offensichtlich, daß zusätzlich zum Nachweis von Urin, das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Reagenz ebenfalls zum Nachweis des Auftretens und der halbquantitativen Konzentration von Albumin im Blutplasma und Serum und ganz allgemein auch bei der Albuminbestimmung von vielen anderen Albumin-haltigen Flüssigkeiten eingesetzt werden kann. In Übereinstimmung mit einem weiteren wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmal kann das erfindungsgemäße Verfahren und Reagenz sowohl in wässrigen Flüssigphasentests, und um den vollen Vorteil der Erfindung auszunutzen, in einen Trockenphasen-Testkissen zum Nachweis des Vorliegens und/oder der Proteinkonzentration, insbesondere bei einer niedrigen bis Spurenkonzentration von Proteinen im Urin oder anderen flüssigen Proben nachzuweisen, eingesetzt werden. Überraschender Weise und unerwartet wurde gefunden, daß ein Reagenz mit einem Wolframatfarbstoffkomplex eine verbesserte und gesteigerte Empfindlichkeit und visuelle Farbauflösung gegenüber niedrigen bis Spurenproteinkonzentrationen zeigt, wenn es in einer Farbstoffbindungstechnik verwendet wird, um das Vorliegen und/oder die Proteinkonzentration in einer Probe zu bestimmen. Die Farbstoffbindungstechnik unter Verwendung des Wolframatfarbstoffkomplex-Reagenz liefert einen genaueren, verlässlicheren und klinisch bedeutsameren halbquantitativen Test, insbesondere für niedrige bis Spurenkonzentrationen von Protein.
Die heutzutage in Tests auf Proteine verwendeten Farbstoffe zeigen eine Reaktion mit Proteinen und erleiden eine Farbveränderung aufgrund des Protein-Fehlerphänomens, wenn sie in einem geeigneten konstanten pH gehalten werden. Das Protein-Fehlerphänomen wird vollständig von Keston im US-Patent Nr. 3 485 587 beschrieben, worin die verschiedenen Farbstoffe, der korrekte pH-Bereich und die erforderlichen Puffer offenbart sind, um das Protein-Fehlerphänomen zu beobachten. Das Keston-Patent beschreibt imgrundegenommen die heutigen Trockenphasenteststreifen zum Test vom Gesamtproteingehalt im Urin. Diese Gesamtproteinteststreifen enthalten im allgemeinen den Indikatorfarbstoff, der normalerweise eine Farbveränderung bei einem stark sauren pH von 5 und niedriger erleidet und einen Puffer, um den pH des Indikatorfarbstoffs gering unterhalb des pH-Werts für den Farbübergang für den Farbstoff aufrecht zu erhalten. Eine ausreichende Pufferung des Indikators stellt im wesentlichen sicher, daß der Farbstoff seine Farbe aufgrund der Reaktion mit dem Protein, und nicht aufgrund einer pH-Veränderung nach dem Kontakt mit der Probe ändert.
Das japanische Patent Nr. 61/155757 (1986) beschreibt die Verwendung eines Molybdat-Farbstoffkomplexes und entweder eines Komplexbildners oder eines bestimmten Metalliones zum Protein-Test in flüssigen Proben. Wie jedoch oben erörtert, zeigt das japanische Verfahren den ernsten Nachteil einer Beeinflussung durch die Ionenstärke/spezifische Dichte, so daß flüssige Proben mit dem gleichen Proteingehalt, jedoch von verschiedener Ionenstärke/spezifischer Dichte, verschiedene Proteintestergebnisse liefern. Erfindungsgemäß wurde jedoch nachgewiesen, daß die Beeinflussung aufgrund der Ionenstärke/spezifischen Dichte durch einen Wolframatfarbstoffkomplex als Indikatorbestandteil im Reagenz beseitigt werden kann. Überraschender Weise und unerwartet liefert der Wolframatfarbstoffkomplex einen genaueren und verlässlicheren Test auf den Gesamtproteingehalt in flüssigen Proben als das in dem japanischen Patent offenbarte Molybdat-Farbstoffkomplexverfahren. Zusätzlich zu einem verlässlicheren Proteintest liefert das erfindungsgemäße Wolframatfarbstoffkomplexverfahren die Testergebnisse 4 bis 5 mal schneller als das Molybdat-Farbstofftestverfahren. Daher wird ein Verfahren zu einem schnellen, genauen, wiederholbaren und verlässlichen Proteintest, der zu Hause oder im Labor durchgeführt werden kann und im wesentlichen sofortige Testergebnisse auf Protein liefert, sowohl für niedrige bis Spurenkonzentrationen von Protein zur Verfügung gestellt.
Um die Vorteile der Erfindung nutzbar zu machen, ist es wichtig, daß das Indikatorreagenz einen Wolframatfarbstoffkomplex als Indikatorfarbstoff enthält. Im Gegensatz sowohl zum Stand der Technik und den heutzutage käuflich erhältlichen Tests verbessert der Einsatz eines Wolframatfarbstoffkomplexes als Indikatorverbindung im Reagenz die Farbauflösung und -unterscheidung, sowohl visuell wie instrumentell, der Farbveränderung, die aufgrund der Reaktion des Indikators der Proteinen auftritt. Daher ist die Empfindlichkeit des Proteintests, insbesondere bei niedrigen bis Spurenproteinkonzentrationen, erhöht.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt das Protein-Fehlerphänomen wie zuvor dargelegt. Der Einsatz eines Wolframatfarbstoffkomplexes als Indikatorfarbstoff des Reagenz erlaubt jedoch den Nachweis und Messung niedriger bis Spurenproteinkonzentrationen. Wie zuvor beschrieben, verändert sich die scheinbare pKa des Farbstoffes, wenn der pH-Indikatorfarbstoff mit einem Protein reagiert, und es tritt eine Farbveränderung auf, welche zum sogenannten Protein-Fehlerphänomen führt. In gleicher Weise reagiert erfindungsgemäß der Wolframatfarbstoffkomplex mit dem Proteingehalt einer Probe und eine deutlichere Farbentwicklung wird erreicht, wobei die Farbempfindlichkeit und die Farbauflösung und Unterscheidung aufgrund der Reaktion mit den Proteinen verbessert wird, was folglich die Messung und Nachweis der niedrigeren Proteinkonzentrationen erlaubt. Im allgemeinen ist die Indikatorkomponente des Reagenz zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren ein Komplex, der durch Wechselwirkung zwischen einem Wolframat und einer Farbstoffverbindung gebildet wird. Es ist von hauptsächlicher Bedeutung, daß der Wolframatfarbstoffkomplex in der Lage ist mit dem Protein zu reagieren, und eine nachweisbare und meßbare Farbveränderung aufgrund der Reaktion mit dem Protein zu zeigen. Der im Indikatorreagenz verwendete Wolframatfarbstoffkomplex muß vorzugsweise mit Proteinen reagieren und darf keine konkurrierenden chemischen und physikalischen Wechselwirkungen mit Nicht-Proteinbestandteilen in der Probe zeigen. Jede bedeutsame konkurrierende Wechselwirkung mit Nicht-Proteinbestandteilen könne zu falschen und fehlerhaften Ergebnissen, was das Vorliegen und die Menge vom Protein in der Probe betrifft, führen. Z. B. schließt eine richtige pH-Einstellung und Pufferung des Indikatorreagenzes die Möglichkeit einer Farbveränderung aufgrund einer pH-Veränderungaus, außer wenn die Probe genügend alkalisch ist, aus, um die Pufferwirkung zu kompensieren. Erfindungsgemäß wird der pH des Wolframatfarbstoffkomplexes auf einen pH-Wert eingestellt und auf diesen gepuffert, der gerade unterhalb des pH-Bereiches ist, worin der Farbstoffwolframatkomplex seine Farbe verändert, um sicher zu stellen, daß der Wolframatfarbstoffkomplex seine maximale Farbveränderung zeigt und daher der maximale Anstieg der Testempfindlichkeit und die maximale Verbesserung der Farbauflösung sichergestellt ist. Daher werden niedrige bis Spurenkonzentrationen an Proteinen in der Probe einfacher und genauer gemessen.
Ferner muß der im Wolframatfarbstoffkomplex des Indikatorreagenz verwendete Farbstoff eine ausreichend intensive Farbveränderung zeigen, so daß relativ geringe Konzentrationen an Protein in der Probe eine nachweisebare und meßbare Farbveränderung hervorrufen. Z. B. können die Vorteile der verbesserten Farbauflösung und der gesteigerten Testempfindlichkeit zu Nichte gemacht oder eingeschränkt werden, falls der Wolframatfarbstoffkomplex eine unzureichende Farbveränderung von einer weniger intensiven zu einer intensiveren Farbe zeigt. Daher sind die in dem Wolframatfarbstoffkomplex des Indikatorreagenzes verwendeten Farbstoffe so ausgewählt, um den vollen erfindungsgemäßen Vorteil zu erreichen, nämlich daß der Farbstoff eine ausreichende Farbveränderung entweder von einer intensiveren Farbe zu einer weniger intensiveren Farbe oder von einer weniger intensiveren Farbe zu einer intensiveren Farbe zeigt, so daß der Analysator entweder visuell oder instrumentell den Proteingehalt der Probe nachweisen und Messen kann.
Es wurde gefunden, daß der Farbstoff des Wolframatfarbstoffkomplexes, welcher besonders vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, ein Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff ist, mit einer Struktur ähnlich den Farbstoffen Pyrocatecholviolett und Pyrogallolrot, wie in dem unteren Strukturformeln I und II dargestellt.
Geeignete Farbstoffe mit Polyhydroxy-substituierten Benzolen und einer Sulfonphthaleinstruktur zusätzlich zum Pyrocatecholviolett und Pyrogallolrot umfassen Brompyrogallolrot, Xylenolorange und Pyrogallolphthalein und Mischungen davon. In gleicher Weise können ebenfalls Polyhydroxybenzolphthalein-Indikatoren wie Pyrogallolphthalein, dargestellt durch Formel III und o-Hydroxyhydrochinonphthalein im erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenz verwendet werden.
Diese polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoffe und Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoffe können Metalloxide komplexieren, wie z. B. Wolframate, können an Proteinen nach der Komplexierung mit dem Metalloxid binden und können eine ausreichende Farbveränderung nach Komplexierung zeigen, und anschließend an ein Protein binden, was einen visuellen oder instrumentellen Nachweis und/oder Messung des Proteingehalts in einer Probe einschließlich niedriger bis Spurenkonzentrationen des Proteins in der Probe erlaubt. In Abhängigkeit von verschiedenen chemischen und physikalischen Parametern, wie der Fähigkeit mit Proteinen in Wechselwirkung zu treten, der Farbe der Probe, der Intensität der Farbveränderung und der chemischen Kompatibilität wird ein bestimmter Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff zur Komplexierung mit dem Wolframat ausgewählt, unter Bildung der Indikatorkomponente der Reagenzzusammensetzung ausgewählt. Die genaue Auswahl des Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoffes oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoffes als Farbstoffverbindung für die Wolframatfarbstoffkomplexverbindung im Indikatorreagenz kann durch den Fachmann, welcher Testkits entwickelt, erfolgen, um einen Proteintest mit maximaler visueller Farbauflösung mit maximaler Empfindlichkeit zu erhalten. Der in der Wolframatfarbstoffkomplexverbindung des erfindungsgemäßen Indikatorreagenzes verwendete Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff und Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Ferner sind mehrere im erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Farbstoffe bekannte Indikatorfarbstoffe, die gegenwärtig käuflich erhältlich sind. Erfindungsgemäß muß der Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff mit einem Wolframatsalz unter Herstellung eines Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorbestandteils des Reagenzes vereinigt werden. Das japanische Patent 61/155757 beschreibt einen Proteintest unter Verwendung eines Molybdän-Farbstoffkomplex der ebenfalls einen Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff verwendet, jedoch unter Einsatz eines Molybdatsalzes, das als Komplexreagenz oder eines Metallions, welches in der Zusammensetzung vorliegen muß, um die Leerreaktion zu unterdrücken. Zusätzlich ist die Genauigkeit des japanischen Verfahrens wegen der Beeinflussung aufgrund der Variationen in der Ionenstärke und spezifischen Dichte der Probe anzuzweifeln. Das Molybdatverfahren erfordert ebenfalls unnormal lange Kontaktzeiten zur vollen Farbentwicklung der Testvorrichtung. Überraschend und unerwartet vermeidet die Verwendung eines Wolframatsalzes das Problem der Ionenstärke und der spezifischen Dichte in der Probe, verkürzt dramatisch die für volle Farbentwicklung der Testvorrichtung erforderliche Zeit und erfordert nicht und toleriert auch nicht die Gegenwart eines Komplexbidners oder Metalliones zur Unterdrückung der Leerreaktion.
Das bestimmte Wolframatsalz zur Verwendung im Wolframatsalzkomplex ist nicht besonders eingeschränkt. Jedoch muß das Wolframatsalz eine genügende Wasserlöslichkeit zeigen, so daß das Wolframatsalz zur Komplexierung mit dem Polyhydroxybenzolsulfonphthalein oder Polyhydroxybenzolphthalein gelöst werden kann. Ferner ist es bevorzugt, daß in der Erfindung eingesetzte Kation des Wolframatsalzes im wesentlichen farblos ist, um Beeinträchtigungen des Tests aufgrund eines hochgefärbten Kations zu vermeiden. Wolframatsalze, die eine ausreichende Wasserlöslichkeit zeigen, um eine Komplexierung mit dem Polyhydroxybenzolsulfonphthalein oder Polyhydroxybenzolphthalein zu erlauben, umfassen Ammoniumwolframat, Ammoniumparawolframat, Wismutwolframat, Kadmiumwolframat, Kalziumwolframat, Lithiumwolframat, Magnesiumwolframat, Kaliumwolframat, Natriummetawolframat, Natriumwolframat, Strontiumwolframat, Zinkwolframat, Phosphowolframate mit einem Alkalimetall und/oder einem Ammonium- und/oder einem Alkyl-, Dialkyl-, Trialkyl- oder Tetraalkylammoniumkation, Alkylammonium- oder Hydroxyalkylammoiumwolframate, Dialkylammonium- oder Di(hydroxyalkyl)ammoniumwolframate und Trialkylammonium- oder Tri(hydroxyalkyl)ammoniumwolframate, oder Kombinationen davon, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Erfindungsgemäß sind bevorzugte Wolframatsalze zur Verwendung bei der Komplexierung mit dem Polyhydroxybenzolsulfonphthalein- oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff hoch wasserlösliche Wolframatsalze, und solche Wolframatsalze umfassen nicht-komplexierende und nicht-störende Metalle und Ammoniumkationen. Zur Erzeilung der vollen Vorteile der Erfindung werden Ammoniumwolframat, Kaliumwolframat, Natriumwolframat, Lithiumwolframat, Strontiumwolframat und das Alkyl- oder Hydroxyalkyl-substituierte Ammoniumwolframat oder Kombinationen davon als Wolframatsalz zur Herstellung des erfindungsgemäßen Wolframatfarbstoffkomplexes eingesetzt.
Ein Komplex aus einen Polyhydroxybenzolsulfonphthalein- oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff mit einem geeigneten Wolframatsalz wird als Indikatorkomponente des Reagenzes in einer verbesserten Methode zum Nachweis des Vorliegens und/oder der halbquantitativen Konzentration von Protein, und insbesondere von niedrigen bis Spurenkonzentrationen von Protein im Urin oder flüssigen Proben verwendet. Es wurde gezeigt, daß das erfindungsgemäße Indikatorreagenz mit Proteinen reagiert, wobei eine unterscheidbare und meßbare Farbveränderung, entweder visuell oder instrumentell aufgrund des Protein-Fehlerphänomens, auftritt. Zusätzlich zum Wolframatfarbstoffkomplex kann das erfindungsgemäße Indikatorreagenz eine ausreichende Menge an geeignetem Puffer erfordern, so daß der Wolframatfarbstoffkomplex keine Farbveränderung als Ergebnis einer pH-Veränderung eingeht, jedoch seine Farbe nach Kontakt und Reaktion mit Proteinen ändert, um genau das Vorliegen und/oder halbquantitative Konzentration vom Protein in der Probe zu bestimmen.
Ferner wurde gezeigt, daß beliebige bekannte Puffertypen in der erfindungsgemäßen Indikatorreagenzzusammensetzung Verwendung finden können. Die Funktion des Puffers ist, einen im wesentlichen konstanten pH im Reagenzsystem aufrecht zu erhalten, um die erwünschte Farbveränderung des Indikatorreagenzes aufgrund des Vorliegens von Proteinen sicherzustellen, und im wesentlichen Farbveränderungen aufgrund einer Variation des pH-Werts der Protein-haltigen Probe zu vermeiden. Daher hängt die in der Reagenzzusammensetzung enthaltenen Puffermenge von der Natur der Probe ab. Die Menge an Puffer liegt üblicherweise zwischen 100 Millimolar (mM) und ca. 500 Millimolar (mM), obwohl in bestimmten Fällen die Puffermenge oberhalb oder unterhalb dieses Bereichs liegen kann. Die Art des verwendeten Puffers hängt von dem im Indikatorreagenz enthaltenen Wolframatfarbstoffkomplex ab und ändert sich mit diesem. Für optimale Ergebnisse wurde daher gefunden, daß der pH-Wert des Reagenzes im allgemeinen auf einen Bereich nur wenig unterhalb des pH-Bereiches aufrechterhalten werden soll, bei dem der Wolframatfarbstoffkomplex des Reagenzes eine Farbveränderung zeigt, normalerweise im pH-Bereich von ca. 2 bis ca. 4, und vorzugsweise im Bereich von ca. 2 bis ca. 3. Ein Verfahren zur Bestimmung des geeigneten gepufferten pH-Werts für bestimmte Indikatorfarbstoffe in der Reagenzzusammensetzung und zur Auswahl der bestimmten Puffer, die im dualen Indikatorreagenz verwendet werden können, findet sich in Keston US-Patent Nr. 3 485 587.
Obwohl die Verwendung eines Puffers in der vorliegenden Reagenzzusammensetzung bevorzugt ist, ist ein Puffer nicht in allen Fällen erforderlich. Z. B. kann es in bestimmten Fällen erwünscht sein, einen Puffer zum Urin oder anderen Proben zuzugeben, bevor die Probe mit der Reagenzzusammensetzung in Kontakt gebracht wird. Ebenfalls kann die Probe bereits einen Puffer vom geeigneten Typ und in einer geeigneten Menge enthalten, um die Reagenzzusammensetzung auf einen konstanten pH einzustellen, oder das Wolframatfarbstoffkomplex-Reagenz kann gegenüber pH-Veränderungen unempfindlich sein. In solchen Fällen kann der Wolframatfarbstoffkomplex der einzige wirksame Bestandteil im Indikatorreagenz sein. Es sollte jedoch klargestellt werden, daß wahlweise Bestandteile, wie Benetzungsmittel, die nicht das Wesen und die Funktion des Indikatorwolframatfarbstoffkomplexes und/oder des Puffers verändern und auch nicht den Proteintest stören, ebenfalls in der indikatorreagenzzusammensetzung enthalten sein können. In gleicher Weise umfassen andere solche nicht wesentlichen Bestandteile Polymerverbindungen, Weichmacher und nicht-aktive Hintergrundfarbstoffe.
Nach Kontakt mit Urin oder einer anderen Probe zeigt eine Farbveränderung des Wolframatfarbstoffkomplexindikator-Reagenz das Vorliegen von Protein an. Ferner kann die Intensität und das Ausmaß der Farbveränderung verwendet werden, die halbquantitative Konzentration des Proteins in der Probe, durch Vergleich oder Beziehung mit der Farbe, hervorgerufen durch die Probe, mit Farben von Lösungen mit bekannten Proteinkonzentrationen verwendet werden. Erfindungsgemäß wurde gezeigt, daß das Indikatorreagenz eine ausreichend aufgelöste und unterscheidbare Farbveränderung zeigt, so daß die Proteinmenge einschließlich niedriger bis Spurenmengen an Protein in der Probe genau bestimmt werden kann, ohne die Verwendung eines Farb-messenden Instruments, wie einem Spektralphotometer oder einem Kolorimeter gemessen. Falls jedoch erwünscht, kann ein solches Farbmessungsinstrument zur Messung der Farbe und der Intensität zwischen der Probe und einer Lösung von bekannter Albuminkonzentration verwendet werden. Entsprechend verbessert ein Proteintest ein geeignet gepuffertes Indikatorreagenz mit einem Wolframatfarbstoffkomplex verwendet die Genauigkeit und Verläßlichkeit des Tests, und erhöht das Vertrauen des Arztes in den Test. Zusätzlich ist es wichtig, aufgrund der Zahl der Urintests auf Protein, die zu Hause durch einen nicht ausgebildeten Patienten erfolgen, im Gegensatz zu ausgebildeten Ärzten oder Technikern im Labor, genaue und verlässliche halbquanitative Testverfahren auf den Proteingehalt einschließlich niedriger bis Spurenproteinmengen im Urin zur Verfügung zu stellen.
Im allgemeinen wurden Proteintests bei einem sauren pH und unter Verwendung eines Indikatorfarbstoffes, der eine Farbveränderung in einem sauren pH-Wert aufgrund der Fähigkeit des Indikatorfarbstoffes zur stärkeren Wechselwirkung des Proteins bei einem niedrigen, sauren pH-Wert zeigt, durchgeführt. Die verbesserte Wechselwirkung zwischen dem Indikatorfarbstoff und dem Protein bei niedrigen pH-Werten erfolgt wegen der starken Anziehung zwischen dem positiv geladenen kationischen Proteinmolekül und dem negativ geladenen anionischen Indikatorfarbstoffmoleküls, und zusätzlich deswegen, weil die sauren Bedingungen zur teilweisen Denaturierung der Proteine führen und daher die Fähigkeit des Proteins der Wechselwirkung mit dem Indikatorfarbstoff steigern. Daher wird der Wolframatfarbstoffkomplex des Indikatorreagenzes auf einen sauren pH eingestellt und aufrechterhalten. Im allgemeinen wird der pH des Systems auf einen Wert zwischen ca. 2,0 und 4,0 eingestellt und aufrechterhalten; um die vollen Vorteile der Erfindung auszunutzen, wird der pH auf zwischen 2,5 und 3,5 eingestellt und aufrechterhalten.
Um die neuen und unerwarteten Ergebnisse, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erzielt werden können aufzuzeigen, wurde ein Indikatorreagenz, das einen Komplex von einem Ammoniumwolframat und einem Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff, Pyrocatecholviolett, hergestellt und anschließend in einem wässrigen Flüssigphasentest auf den Gesamtproteingehalt einer Probe verwendet. Der Wolframatpyrocatecholviolett-Komplex reagiert mit Proteinen und zeigt eine Farbveränderung in einem pH von ca. 2,5. Eine wässrige Lösung des Wolframatpyrocatecholviolett-Komplexes zeigt eine dunkle purpurbraune Farbe in Abwesenheit von Proteinen, und verändert die Farbe von rotbraun über gelb, hellgrün, grün bis tief blau in Gegenwart von ansteigenden Proteinmengen. Ein Indikatorreagenz mit geeigneten Mengen an Wolframat, wie Ammoniumwolframat und Pyrocatecholviolett, das auf einen geeigneten pH mit einem geeigneten Puffer eingestellt und aufrechterhalten wurde, zeigte die Farbveränderungen, die in Tabelle I nach Kontakt mit standardisierten Proteinlösungen dargestellt sind. Die Farbveränderungen in Tabelle I zeigen, daß eine Probe mit 5 mg/dl Albumin von einer Probe mit 0 mg/dl und von einer Probe mit 10 mg/dl unterschieden werden kann. Die Farbveränderungen sind deutlicher, wenn die Konzentration des Farbstoffwolframatkomplexes im Indikatorreagenz erhöht ist. Daher wird erfindungsgemäß eine Zusammensetzung und ein Verfahren zum Messen von nierdigen bis Spurenproteinmengen in einer Probe und zur Unterscheidung von Proben mit beinahe identischen Albuminkonzentrationen erhalten. Tabelle I Farbveränderung eines Ammoniumwolframatpyrocatecholviolett- Komplexindikatorreagenz nach Reaktion mit standardisierten Proteinlösungen (pH = 2,5) Konzentration der standardisierten Proteinlösung (mg/dl) Beobachtete Farbe (leer bis negativ) (Spuren bis niedrig) (niedrig) dunkelpurpurbraun dunkelrotbraun schwach rotbraun gelblich braun hellgrün grün dunkelblau
Erfindungsgemäß erlaubt die verbesserte Farbauflösung durch Verwendung des Wolframatpyrocatecholviolett-Komplexindikatorreagenz den Nachweis und die Unterscheidung zwischen Proteinkonzentrationen von 0, 5, 10, 20 und 30 mg/dl. Im Gegensatz hierzu sind alle Verfahren aus dem Stand der Technik, die einen Indikatorfarbstoff verwenden, nicht in der Lage, zwischen Proteingehalten im Bereich von 0 bis ca. 15 mg/dl zu unterscheiden, und zeigen nur eine minimale Unterscheidungskraft zwischen Proteingehalten im Bereich von 0 bis ca. 30 mg/dl. Erfindungsgemäß wird jedoch eine erhöhte Testempfindlichkeit erreicht, insbesondere bei Proben mit Proteingehalten von ca. 30 mg/dl und darunter, was schließlich zu genaueren und aussagekräftigeren Testergebnissen führt.
Zur Durchführung eines wässrigen Flüssigphasentests auf den Gesamtproteingehalt wird zunächst das Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz hergestellt. Z. B. durch Lösen von 0,010 g (0,026 Millimol) Pyrocatcholviolett, 0,024 g (0,085 Millimol) Ammoniumwolframat und 0,75 g Glycin in ausreichender Menge (ca. 70 bis 80 ml) destilliertem Wasser. Der pH der erhaltenen Lösung wird mit einer wässrigen Salzsäurelösung (HCl) auf 2,5 titriert. Die Lösung mit dem eingestellten pH wird in einem 100 ml Meßkolben überführt, das Gesamtvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Endlösung enthält eine 0,3 mM Konzentration von Pyrocatecholviolett und 0,8 mM Konzentration von Wolframat. 0,75 g Glycin wurden zum Indikatorreagenz als Puffer zugegeben. Die Anwesenheit und Konzentration von Protein in einer Urinprobe wurde anschließend durch Zugabe eines Tropfens (ca. 50 Mikroliter) Urins zu einem ml des Wolframatpyrocatecholviolett-Komplexindikatorreagenzes bestimmt. Die Farbe der erhaltenen wässrigen Lösung änderte sich von dunkelpurpurbraun über gelb nach grün, was die Anwesenheit von ca. 100 mg/dl Protein in der Urinprobe anzeigte.
Es ist festzustellen, daß keine Komplexbildner, wie Weinsäure oder Oxalsäure im Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz enthalten sind. Es wurde gezeigt, daß die Anwesenheit eines Komplexbildners in der Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz wirksam die Fähigkeit des Reagenzes zum Nachweis von Albumin zerstört. Unerwartet und überraschend zeigt jedoch das Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz in Abwesenheit eines Komplexbildners eine deutliche Farbveränderung nach Kontakt und Wechselwirkung mit Proteinen. Diese deutliche Farbentwicklung ist deswegen unerwartet, da das japanische Patent 61/155757, welches das Molybdatreagenz beschreibt, einen Komplexbildner erfordert, um eine Farbveränderung nach Kontakt mit dem Molybdat-Farbstoffkomplex und Wechselwirkung mit Proteinen hervorzurufen.
Im allgemeinen liegt das Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz im wässrigen Flüssigphasentest auf Protein in einer ausreichenden Menge vor, um den visuellen und/oder instrumentellen Nachweis und Messung einer Farbveränderung zu ermöglichen. Ein Überschuß des Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenzes sollte jedoch vermieden werden, so daß nicht-spezifische Wechselwirkungen mit Nicht-Protenkomponenten in der Probe im wesentlichen ausgeschlossen sind. Im allgemeinen ist eine Gesamtkonzentration des Wolframatfarbstoffkomplexes im Indikatorreagenz im Bereich von ca. 0,3 mM bis ca. 5 mM ausreichend, eine nachweisbare und unterscheidbare Farbveränderung, sowohl sichtbar und/oder instrumentell, sogar für niedrige bis Spurenmengen von Protein in der Probe, hervorzurufen und Beeinträchtigung des Tests durch Wolframatfarbstoffkomplex-Wechselwirkungen mit Nicht-Proteinbestandteilen der Probe zu eliminieren oder minimieren. Um die vollen Vorteile der vorliegenden Erfindung zu nutzen, wurde gefunden, daß eine Gesamtwolframatfarbstoff-Komplexkonzentration im Indikatorreagenz im Bereich von ca. 1 mM bis ca. 4 mM besonders bevorzugt ist. Zusätzlich wurde ebenfalls gefunden, daß die Testempfindlichkeit gegenüber niedrigen bis Spurenproteinmengen, wie z. B 5 mg/dl, weiter gesteigert werden kann, indem die Konzentration des Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz in dem Flüssigphasentest von ca. 1 mM bis ca. 4 mM erhöht wird.
Ferner wurde gefunden, daß zusätzlich zum im obigen Beispiel verwendeten Glycinpuffer der erwünschte pH bei einem im wesentlichen konstanten Wert durch Verwendung jedes geeigneten Puffers aufrechterhalten werden kann, der kein komplexierendes Anion enthält, wie z. B. Laktat, Phthalat, Trichloracetat, Sulfosalicylat, Phosphate, Acetate, Natriumchlorid/Salzsäure, Piperazin-N,N'-bis(2-hydroxypropan)sulfonsäure (POPSO), N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 3-N-(Tris-hydroxymethyl)methylamino-2-hydroxypropansulfonsäure (TAPSO), 2-([Tris-(hydroxymethyl)methyl]-amino)ethansulfonsäure (TES), oder andere im Stand der Technik geeignete Puffer.
Ferner muß das bestimmte Wolframat und der bestimmte Polyhydroxybenzolsulfonphthalein- oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff im Indikatorreagenz nicht notwendiger Weise in einem Molverhältnis von ca. 1 bis 3,25 des Farbstoffs zum Wolframat, wie in dem vorangehenden Beispiel, vorliegen. Wie im einzelnen wie folgt diskutiert wird, nimmt die Empfindlichkeit des Proteintests durch steigende Konzentration von sowohl Wolframat wie auch dem bestimmten Polyhydroxybenzolsulfonphthalein- oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff im Indikatorreagenz gegenüber niedrigen bis Spurenmengen von Proteinen in der Probe zu. Es wurde gefunden, daß Anstieg der Ammoniumwolframatkonzentration auf 0,03 g/dl oder 0,078 mM und Anstieg der Konzentration von Pyrocatecholviolett auf 0,075 g/dl oder 0,255 mM oder einem Molverhältnis von Farbstoff zu Wolframat von ca. 1 zu 3,25 eine vergesserte Farbauflösung zwischen Proben mit niedrigen bis Spurenmengen von Protein ermöglicht. Es wurde ebenfalls gefunden, daß ein Molverhältnis von Farbstoff zu Wolframat innerhalb eines Bereiches von ca. 1 zu 1 bis ca. 1 zu 10, und vorzugsweise im Bereich von ca. 1 zu 2 bis ca. 1 zu 5, die vollen Vorteile und Vorzüge der Erfindung ermöglicht. Zusätzlich wurde gefunden, daß, wenn das Molverhältnis durch Anstieg der Farbstoff- und Wolframatkonzentration im Indikatorreagenz konstant gehalten wird, eine verbesserte Farbauflösung zwischen Proben mit einem niedrigen bis einer Spurenkonzentration von Protein erreicht wird.
Ferner liegt es innerhalb der experimentellen Möglichkeiten des Fachmanns erfindungsgemäß eine Testvorrichtung zu entwickeln, die für ein System zum wässrigen halbquantitativen Proteintest im Urin und anderen flüssigen Proben durch Variation der relativen Mengen von wässrigen Lösungsmitteln, Wolframatindikator-Reagenz und Urinprobe, und durch Variation und des Wolframatfarbstoffkomplexes und des Puffers und deren Mengen zu entwickeln, um nachweisbare und unterscheidbare Farbveränderungen zu ermöglichen, so daß ein Vergleich entweder visuell oder instrumentell mit Farbstandards von Lösungen gekannter Proteinkonzentration möglich wird.
Zusätzlich zum wässrigen Naßphasentest auf Proteine, kann das Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz in der Trockenphase eingesetzt werden; ein Proteintest mit einem Testkissen, der ein Wolframatindikatorreagenz verwendet, wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Im allgemeinen erfolgt der Proteintest durch in Kontaktbringen von Urin oder einer anderen Testprobe mit der Nachweisvorrichtung, welche ein Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz enthält. Die Testvorrichtung kann in die Probe eingetaucht werden oder die Probe kann auf die Testvorrichtung aufgetropft werden. Die erhaltene Farbveränderung der Testvorrichtung zeigt das Vorliegen von Protein an, und je nach Ausstattung kann die erhaltene Farbveränderung mit einer standardisierten Farbkarte verglichen werden, um so eine semi-quantitative Messung der Proteinkonzentration im Urin oder der Probe zu ermöglichen.
Typischerweise ist die Testvorrichtung ein mit dem Reagenz imprägnierter Teststreifen, entweder als Einzelkissenteststreifen (zum Nachweis von nur einem einzigen Analyten) oder als ein Mehrfachkissenteststreifen (zum Nachweis von mehreren Analyten gleichzeitig) ausgebildet. Für jeden Typ eines Reagenz-imprägnierten Teststreifens enthält dieser einen Trägerstreifen oder Halter normalerweise aus einem hydrophoben Plastik, und ein Reagenztestkissen, das eine saugfähige oder nicht-saugfähige Trägermatrix enthält. Im allgemeinen ist die Trägermatrix ein aufnahmefähiges Material, das der Probe ermöglicht, aufgrund von Kapillarkräften durch die Matrix zu wandern, um einen Kontakt mit dem Reagenz herzustellen, und um eine nachweisbare und meßbare Farbveränderung hervorzurufen. Die Trägermatrix kann jede Substanz sein, die zur Aufnahme der chemischen Reagenzien, die für den bestimmten Test erforderlich sind, geeignet ist, solange wie die Trägermatrix im wesentlichen gegenuber den chemischen Reagenzien inert ist und nicht den Urin oder andere Proben weder durch Ausbluten von Bestandteilen aus der Trägermatrix in die Probe, noch durch Veränderung des Urins oder der Probe in einer Weise, welche den anschließenden Test nicht eindeutig, ungenau oder zweifelhaft macht, verunreinigt. Die Trägermatrix muß porös oder adsorbierend gegenüber der flüssigen Probe sein. Der Ausdruck "Trägermatrix" bezieht sich auf entweder eine saugfähige oder nicht-saugfähige Matrix, die in Wasser und anderen physiologischen Flüssigkeiten unlöslich ist und ihren strukturellen Aufbau in Wasser oder anderen physiologischen Flüssigkeiten beibehält. Eine geeignete saugfähige Matrix umfaßt Filterpapier, Schwammaterialien, Zellulose, Holz, Filze und Fliese und ähnliche. Eine nicht-saugfähige Matrix umfaßt Glasfaser, Polymerfilme und vorgeformte oder mikroporöse Membranen. Andere geeignete Trägermatrixes umfassen hydrophile anorganische Pulver, wie Kieselgel, Aluminiumoxid, Diatomenerde und ähnliche, tonhaltige Substanzen, Gewebe, hydrophile natürliche Polymermaterialien, bestimmte Zellulosematerialien, wie Zelluloseperlen und insbesondere faserhaltige Papiere, wie Filterpapier oder Chromatographiepapier, synthetische oder modifizierte natürliche Polymere, wie Zelluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, Polyacrylate, Polyurethane, quervernetztes Dextran, Agarose und andere, wie quervernetzte und nicht-quervernetzte wasserunlösliche hydrophile Polymere. Hydrophobe und nicht-adsorptive Substanzen sind zur Verwendung als Trägermatrix in der vorliegenden Erfindung nicht geeignet. Die Trägermatrix kann von verschiedener chemischer Zusammensetzung oder eine Mischung von chemischen Zusammensetzungen sein. Die Matrix kann auch im Hinblik auf Glätte und Rauhheit zusammen mit Härte und Weichheit variieren. In jedem Fall muß jedoch die Trägermatrix ein hydrophiles oder aufnahmefähiges Material enthalten. Der Halter ist normalerweise aus hydrophobem Material, wie Zelluloseacetat, Polyethylen, Terephthalat, Polycarbonat oder Polystyrol gebildet, und die Trägermatrix ist vorteilhaft aus saugfähigem Filterpapier oder nicht-saugfähigen permeablen polymeren Filmen gefertigt.
Um die Vorteile der Erfindung voll auszunutzen, wird das Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz in eine geeignete Trägermatrix imprägniert und in einem Trockenphasenteststreifen zum Test auf Protein in einer Probe verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert einen ökonomischen, genauen und verläßlichen Test auf die Gesamtproteinkonzentration in einer Probe, der zu Hause oder im Labor durchgeführt werden kann. Zusätzlich erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis, die Unterscheidung und Messung niedriger bis Spurenproteinkonzentrationen in einer Probe, und verbessert daher die klinische Eignung des Tests.
Erfindungsgemäß wird zur Durchführung des Trockenphasentest auf Protein mit einem Teststreifen eine wässrige Lösung mit von ca. 0,3 mM bis ca. 5 mM Gesamtkonzentration von Wolframatfarbstoffindikator, wie z. B. Wolframatpyrocatecholviolett-Indikator, der auf einen pH von 2,5 eingestellt und gepuffert ist, hergestellt. Eine saugfähige Matrix, wie Filterpapier (WHATMAN CCP500 Filterpapier, handelsüblich erhältlich von Whatman Ltd., Maidstone, Kent, U.K.) wird mit der wässrigen, das Wolframatfarbstoff-Indikatorreagenz enthaltende Lösung, entweder durch Ausbreiten, Eintauchen oder Sprühen der wässrigen Lösung auf Bögen oder vorgeschnittene Streifen des Filterpapiers gesättigt und imprägniert. Nach Entfernung des wässrigen Lösungsmittels durch Trocknung in einem Luftofen bei ca. 50ºC für ca. 15 bis 20 Min. wird das mit dem Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz imprägnierte Filterpapier auf die geeignete Größe geschnitten, so z. B. als Kissen mit den Dimensionen von ca. 0,25 cm mal 0,5 cm bis ca. 0,5 cm mal ca. 1 cm. Das mit dem Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz imprägnierte Filterpapier wird anschließend auf einen opaken oder transparenten hydrophoben Plastikhalter mit einem doppelseitigen Klebeband befestigt.
Der erhaltene Teststreifen wurde anschließend in die frische unzentrifugierte Urinprobe für einen ausreichenden Zeitraum, um den Teststreifen mit der Probe zu sättigen, getaucht. Nach Verstreichen einer bestimmten Zeit, z. B. von ca. 1 Min. bis 2 Min. wird der Teststreifen entweder visuell oder instrumentell auf ein Signal geprüft. Die Farbveränderung des Teststreifens, falls eine auftritt, zeigt die Anwesenheit und/oder Konzentration vom Protein in der Urinprobe.
Analog zum zuvor beschriebenen wässrigen Flüssigphasentest auf Protein gehört es zu den experimentellen Fähigkeiten des Fachmanns, Testvorrichtungen zur Bestimmung des optimalen Verhältnisses zwischen der Größe des Reagenzkissens, der Stärke des Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz, der Menge der Probe und des Verfahrens des Aufbringens der Probe auf den Teststreifen, entweder durch Pipettieren anstelle von Eintauchen für einen halbquantitativen Test auf Protein unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens und Zusammensetzung zu entwickeln.
In vielen Fällen liefert die einfache, visuelle Untersuchung des Streifens die gewünschte Information. Falls eine genauere Information erforderlich ist, kann eine Farbkarte mit Farbfeldern, die verschiedenen bekannten Proteinkonzentrationen entsprechen, für das bestimmte, im Teststreifen verwendete Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz entwickelt werden. Die Farbe des Teststreifens nach Kontakt mit der Urinprobe kann dann mit den Farbfeldern auf der Karte verglichen werden, um die Proteinkonzentration der Probe zu ermitteln.
Falls eine noch genauere Messung erforderlich ist, kann ein Spektralphotometer oder ein Kolorimeter zur präziseren Bestimmung der Farbveränderung eingesetzt werden. Zusätzlich kann sowohl der wässrige Flüssigphasentest und der Trockenphasen-Reagenstreifentest halbquantitativ durch Einsatz spektralphotometrischer oder kolorimetrischer Techniken, im Gegensatz zu visuellen Techniken gemacht werden, unter Erhalt einer verläßlicheren und genaueren Messung der Farbveränderung, und daher einer genaueren Messung der Proteinkonzentration in der Probe, insbesondere bei niedrigeren Proteinkonzentrationen, so z. B. unter 20 mg/dl und insbesondere unter 15 mg/dl. Wie im folgenden in Einzelheiten erörtert, ermöglicht die Fähigkeit des Nachweises, der Unterscheidung und der Messung niedriger bis Spurenkonzentrationen von Proteinen in einer Probe durch Verwendung ein Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz überraschenderweise und unerwartet ein verbessertes Verfahren zum Messen des Gesamtproteingehalts einer flüssigen Probe. Z. B. erfordert bei heutigen Methoden der genaue Nachweis und Messung von Proteinkonzentrationen im Urin unterhalb 30 mg/dl ein Hitze- und Präzipitationsverfahren, das teuer und zeitaufwendig ist. Daher war vor dem erfindungsgemäßen Verfahren keine Trockenphasent-Teststreifentechnik zum genauen Nachweis und Messung von niedrigen bis Spurenkonzentrationen von Protein zugänglich, so z. B. unter ca. 15 mg/dl, wie es oft im Urin gefunden wird. Daher wurde erfindungsgemäß gezeigt, daß durch Imprägnieren eines Wolframatfarbstoffkomplex- Indikatorreagenzes in eine geeignete Trägermatrix die Anwesenheit und Konzentration von niedrigen bis Spurenproteinkonzentrationen in einer Urinprobe durch Verwendung eines Trockenphasenteststreifens erzielt werden kann.
Zur Demonstration der neuen und unerwarteten Ergebnisse, aufgrund der Verwendung ded Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz zum Nachweis und Messung von Proteinmengen in einer Probe, wurden Farbabstandsauftragungen aus normalen Proteintests, welche Trockenphasenteststreifen verwenden, die entweder ein Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz oder eine in eine Filterpapiermatrix imprägnierte Molybdat-Farbstoffkomplex-Indikatorzusammensetzung verwenden, gemacht. Farbabstandsauftragungen wurden erhalten durch Kontaktieren standardisierter Albuminlösungen mit verschiedenen Trockenphasenteststreifen, die entweder ein Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz, oder ein in eine Filterpapierträgermatrix inprägniertes Molybdat-Farbstoffkomplex-Indikatorreagenz enthielten.
Im allgemeinen enthält eine Farbstoffabstandsauftragung drei Achsen, die L*-, A*- und B*-Achse. Die Werte von L*, aufgetragen auf der vertikalen Achse, sind ein Meßwert für die Farbintensität, wogegen ein großer Wert für L* eine helle Farbe und L* = 0 eine vollständig schwarze Farbe bedeutet. Die horizontale Achse A* ist ein Meßwert für die Farbveränderung von grün nach rot, wobei ein positiverer A*-Wert für eine Rotvertiefung und analog ein negativerer A*-Wert eine Grünvertiefung bedeutet. In gleicher Weise ist die dritte Achse B* ein Meßwert für die Farbveränderung von blau nach gelb, wobei ein größerer Wert von B* eine mehr gelbe und entsprechend ein kleinerer Wert von B* eine mehr blaue Farbe bedeutet.
Farbabstandsdifferenz (Delta E) wird nach der folgenden Gleichung (Gleichung 1) berechnet:
Delta E =
L&sub1;*, A&sub1;* und B&sub1;* sind die Farbabstandswerte, bestimmt aus einer ersten standardisierten Proteinlösung;
L&sub2;*, A&sub2;* und B&sub2;* sind die Farbabstandswerte bestimmt aus einer zweiten standardisierten Proteinlösung, mit einer von der ersten standardisierten Proteinlösung verschiedenen Proteinkonzentration und
Delta E ist die Farbabstandsdifferenz zwischen den Farbabstandsauftragungen zwischen den ersten und zweiten standardisierten Proteinlösungen.
Die Farbabstandsdifferenz (Delta E) ist die gerade Linie zwischen zwei Punkten in einer drei-dimensionalen Farbabstandsauftragung. Theoretisch entspricht eine Farbabstandsdifferenz von 1 der kleinsten Farbdifferenz, die das menschliche Auge unterscheiden kann. Aufgrund der Unterschiede zwischen den visuellen Fähigkeiten von Menschen ist jedoch eine Farbabstandsdifferenz (Delta E) von ca. 5 erforderlich, um praktisch und sicher zwischen Farben zu unterscheiden.
Die in den Farbabstandsauftragungen angezeigten Werte für L*, A* und B*, werden aus den Prozentreflektionsmessungen, aufgenommen bei sechzehn verschiedenen Wellenlängen mit gleichem Abstand zwischen 400 nm und 700 nm unter Verwendung üblicher Standardgleichungen aufgenommen, berechnet. Im allgemeinen wird die Prozentreflektion einer jeder der sechzehn verschiedenen Wellenlängen mit der Intensität des Lichts bei dieser Wellenlänge multipliziert. Diese Werte werden dann mit Standardgewichtungsfunktionen für die Farben rot, grün und blau multipliziert und schließlich zusammengezählt. Diese Berechnungen ergeben drei Spektralwerte X, Y und Z und L*, A* und B* werden aus den Spektralwerten X, Y und Z nach den folgenden Gleichungen berechnet:
L* = 116 x [(Y/Y&sub0;)1/3 - 16)] (Gleichung 2)
A* = 500 x [(X/X&sub0;)1/3 - (Y/Y01/3)] (Gleichung 3)
B*= 200 x [(Y/Y&sub0;)1/3 - (Z/Z01/3)] (Gleichung 4)
worin
X&sub0;, Y&sub0; und Z&sub0; die Spektralwerte für reinweiß (d. h. Reflektion 100 % bei allen Wellenlängen), und X, Y und Z die Spektralwerte, berechnet wie oben beschrieben aus den sechzehn Wellenlängen zwischen 400 nm und 700 nm.
Aus den Farbabstandsauftragungen wurden die Farbabstandsdifferenzen (Delta E) berechnet, und werden im folgenden in Einzelheiten zusammengefaßt und diskutiert. Bei der Interpretation der darzustellenden Daten bedeutet der Term Delta E (Alb 15-0) die Farbabstandsdifferenz zwischen Proteintests für standardisierte Proteinlösungen mit 15 mg/dl Albumin und 0 mg/dl Albumin. In gleicher Weise bedeutet der Term Delta E(Alb 30-0) die Farbabstandsdifferenz zwischen Proteintests für Proteinlösungen mit 30 mg/dl Protein und 0 mg/dl Protein. Der Term Delta E(Alb 100-0) ist analog definiert, worin Alb das Protein Albumin bezeichnet. In gleicher Weise betrifft der Term, wie z. B. Delta E (1,007-1,0012) die Farbabstrandsdifferenz zwischen Proteintests auf standardisierte Urinlösungen mit der gleichen Proteinkonzentration, jedoch verschiedenen spezifischen Dichten von 1,007 und 1,0012 und daher verschiedenen Ionenstärken.
Um zunächst die Nachteile und Rückschläge bei der Verwendung des bekannten Molybdat-Farbstoffkomplexes zum Urintest auf Proteingehalt darzustellen, faßt Tabelle II eine Reihe von Tests von Urinproben zusammen, die die gleiche Menge an Proteinalbumin enthalten, jedoch verschiedene Ionenstärken und verschiedene Dichten aufgrund der Zugabe von Natriumchlorid zeigen. Tabelle II Abhängigkeit des bekannten Molybdat-Farbstoffindikator-Reagenzsystems von der Ionenstärke (spezifische Dichte) Spezifische Dichte von Urin ohne Albumin Farbveränderung des Molybdat-Farbstoffindikators (Reagenz A) Farbveränderung des Wolframat-Farbstoffindikators (Reagenz B) blau hellblau und etwas grau grau und etwas braun und gelb
In Tabelle 2 wurde der Molybdat-Farbstoffindikator (Reagenz A) durch Zugabe von 0,075 g Humanalbumin zu einem 25 ml Meßkolben und Auffüllen des Kolbens auf ein Volumen von 25 ml mit einer Molybdat-Pyrocatecholviolett-Weinsäureindicatorlösung, die auf einem pH von 2,5 eingestellt und gepuffert wurde, hergestellt. Diese Lösung enthält das Äquivalent von 300 mg/dl Albumin. Der Wolframatfarbstoffindikator (Reagenz B) wurde in gleicher Weise hergestellt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Ammoniummolybdat Ammoniumwolframat eingesetzt wurde und die Weinsäure weggelassen wurde. Reagenz A und Reagenz B wurden in getrennte Stücke von WHATMAN CCP500 Filterpapier imprägniert. Die imprägnierten Filterpapierabschnitte wurden getrocknet und in Streifen geschnitten, wie oben beschrieben. Die Teststreifen wurden anschließend kurz in Urinproben, die kein Albumin enthielten, jedoch mit einer verschiedenen spezifischen Dichte und Ionenstärke aufgrund von Zugabe von Natriumchlorid eingetaucht. Aus den in Tabelle II aufgeführten Beobachtungen ist ersichtlich, daß der Wolframatfarbstoffindikator (Reagenz B) keine Abhängigkeit von der spezifischen Dichte/Ionenstärke zeigte, wogegeben der Molybdat-Farbstoffindikator (Reagenz A) seine Farbe von blau nach graubraun nach Anstieg der Ionenstärke und der spezifischen Dichte von 1,007 auf 1,020 änderte, obwohl der Albumingehalt in der Probe unverändert blieb. Ein Molybdat-Farbstoffindikatorreagenz mit 400 mg/dl Albumin ergab identische Ergebnisse wie das Molybdat-Farbstoffreagenz A, sowohl in einem Test von Proben mit 0 mg/dl Protein und 15 mg/dl Protein.
Es ist festzustellen, daß eine identische Paralleltestserie durchgeführt wurde, durch Herstellung von Teststreifen, wie oben beschrieben, jedoch ohne Humanserumalbumin. Wenn diese Teststreifen kurz in Urinproben, die jeweils 0 mg/dl Albumin mit einer verschiedenen Ionenstärke/spezifischen Dichte eingetaucht wurden, zeigten die Teststreifen ähnliche Ergebnisse, wie die in Tabelle II aufgeführten, jedoch mit der Ausnahme, daß die Farbe der Probe mit der niedrigen Ionenstärke/spezifischen Dichte rotgrau anstelle von blau war. Diese Tests zeigen, daß die mit dem Molybdat-Farbstoffindikator (Reagenz A) imprägnierten Teststreifen ihre Farbe aufgrund von Veränderungen der Ionenstärke/spezifischen Dichte verändern.
Falls ferner die spezifische Dichte der Urinprobe erhöht wird, jedoch die Ionenstärke konstant gehalten wird, z. B. durch Zusatz von Glucose anstelle von Natriumchlorid zur Urinprobe, tritt keine Farbänderung aufgrund des Anstiegs der Ionenstärke auf, was zeigt, daß der Molybdat-Farbstoffindikator empfindlicher gegenüber Veränderungen der Ionenstärke der Probe als gegenüber Veränderungen der spezifischen Dichte der Probe ist. Wie oben gezeigt und wie im folgenden ausgeführt, wurde überraschend und unerwartet gefunden, daß ein Urinproteintest unter Verwendung von Teststreifen mit dem erfindungsgemäßen Wolframatfarbstoffkomplex im Indikatorreagenz weder durch die Ionenstärke noch durch die spezifische Dichte der Probe beeinflußt wird.
Zur Demonstration der Unabhänigkeit des Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz von Auswirkungen der Urin-Ionenstärke und spezifischen Dichte wurde ein Indikatorreagenzstreifen durch Eintauchen eines Filterpapierträgermatrix in 100 ml einer wässrigen Lösung mit 0,0102 g (0,026 Millimol) Pyrocatecholviolett, 0,0151 g (0,005 Millomol) Ammoniumwolframat und 250 mM Glycin, auf einen pH von 2,5 eingestellt und gepuffert, hergestellt. Teststreifen mit dem Wolframat-Pyrocatecholfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz wurden zur Prüfung standardisierter Urinproben mit 0 mg/dl, 15 mg/dl, 30 mg/dl und 100 mg/dl Albumin verwendet. Für jede Albuminkonzentration wurde die spezifische Dichte der Urinprobe auf 1,007, 1,012, 1,020, 1,028 und 1,032 mit Natriumchlorid oder Glucose eingestellt. Farbabstandsauftragungen wurden aufgenommen und die Farbabstandsdifferenzen (Delta E) wurden für jede Albuminkonzentration über einen Bereich der spezifischen Dichte von 1,007 bis 1,032 berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. Tabelle III Farbabstandsdifferenzen (Delta E) für Proteintests unter Verwendung des Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenzes als Reaktion auf Proben mit gleichem Albumingehalt, jedoch verschiedenen Ionenstärken (spezifischen Dichten) Delta E Albuminkonzentration
Wie in Tabelle III gezeigt, liegen die Variationen der Farbabstandsdifferenz aufgrund einer Veränderung der Ionenstärke (spezifischen Dichte) der Urinprobe im Bereich von 0,80 Einheiten bis zu einem Maximum von 3,24 Einheiten, das sind Werte die genügend unterhalb des normal anerkannten Minimumwerts von 5 Einheiten liegen, der für das menschliche Auge zur Unterscheidung einer Farbveränderung notwendig ist. Es wurde insgesamt gezeigt, daß das Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz nur einer geringen oder keiner Beeinflussung aufgrund der Ionenstärke oder spezifischen Dichte der Probe unterworfen ist, da aus Tabelle III der maximale Effekt der spezifischen Dichte ca. 3 Delta E-Einheiten beträgt. Solch kleine Farbabstandsdifferenzwerte stehen im direkten Kontrast zu tatsächlich sichtbar nachweisbaren Farbveränderungen, wie in Tabelle II für den bekannten Molybdat-Farbstoffkomplex aufgrund von Veränderungen der spezifischen Dichte (Ionenstärke) in Urinproben gezeigt. Es ist festzustellen, daß Zusatz von Glukose zur Erhöhung der spezifischen Dichte der Urinprobe einen Farbabstandsdifferenz Delta E von 2,37 Einheiten, eine Veränderung der spezifischen Dichte des Urins von 1,007 auf 1,015, und ein Delta E von 3,84 Einheiten für eine Veränderung der spezifischen Dichte des Urins von 1,007 bis 1,022 ergab, wenn ein Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz als Indikator im Urin-Proteintest verwendet wurde. Wieder liegen diese Delta E-Werte unterhalb der normal sichtbar nachweisbaren Grenze von 5 Einheiten und zeigen daher die Unabhängigkeit eines Proteintests, der ein Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz verwendet, von den Auswirkungen der spezifischen Dichte allein. Die in Tabelle II zusammengefaßten Ergebnisse für das Molybdat-Farbstoffindikatorreagenz A sind in Tabelle IV quantifiziert, worin Farbabstandsauftragungen für Proteintests von Urinproben mit verschiedenen Albuminkonzentrationen in verschiedenen spezifischen Dichten und Ionenstärken erhalten wurden. Es wurde gefunden, daß Variation der spezifischen Dichte der Urinprobe durch Zugabe von Glukose keinen Einfluß auf den Proteintest unter Verwendung des Molybdat-Farbstoffkomplexverfahrens aus dem Stand der Technik bewirkte, da Delta E (1,007-1,015) 2,24 Einheiten und Delta E (1,007-1,022) 1,21 Einheiten betrug, beide Werte liegen unter der minimalen nachweisbaren Grenze von ca. 5 Einheiten. Tabelle IV zeigt jedoch, daß die Verwendung von Natriumchlorid zur Erhöhung der spezifischen Dichte der Urinprobe ebenfalls die Ionenstärke der Urinprobe erhöht und als Ergebnis, im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Verfahren, negative Einflüsse auf den Proteintest beobachtet werden. Eine sorgfältige Überprüfung von Tabelle IV zeigt, daß die Farbabstandsdifferenzen aus den Testproben mit demselben Albumingehalt, jedoch unterschiedlichen Ionenstärken und spezifischen Dichten im allgemeinen 5 Einheiten übersteigt, und sie daher einen sichtbaren Farbunterschied zeigen, und ein möglicherweise falsches Ergebnis für Proteintest vom menschlichen Analysator abgelesen wird. Tabelle IV Delta E-Unterschiede bei Proteintests unter Verwendung des Molybdat-Farbstoffkomplex-Indikatorreagenzes zwischen Proben mit denselben Albumingehalt und verschiedenen spezifischen Dichten und Ionenstärken Delta E Albuminkonzentration
Überraschend und unerwartet stehen die in Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse für Urinproteintests, die den im Stand der Technik beschriebenen Molybdat-Farbstoffkomplex verwenden, im direkten Kontrast zu den in Tabelle III aufgeführten Ergebnissen für Proteintests unter Verwendung des erfindungsgemäßen Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz. Ein Vergleich der Daten aus Tabelle III mit denen aus Tabelle IV zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren frei von Beeinträchtigungen des Tests aufgrund der Ionenstärke und spezifischen Dichte der Probe ist. In Tabelle III, unter Verwendung eines Wolframatfarbstoffkomplexes liegen die Farbabstandsdifferenzen insgesamt unterhalb 5 Einheiten, die im allgemeinen als minimale Nachweisgrenze anerkannt wird. In Tabelle IV jedoch, unter Verwendung des Molybdat-Farbstoffkomplexes liegen im wesentlichen alle Farbabstandsdifferenzen oberhalb der minimalen Nachweisgrenze von 5 Einheiten und liefern daher einen variablen Proteintest in Abhängigkeit von der spezifischen Dichte (Ionenstärke) der Probe.
Weiter wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Erhöhung der Menge des Ammoniumwolframats zur Herstellung des Ammoniumwolframatkomplexindikators von 0,0151 g Ammoniumwolframat, wie in allen vorherigen Tests verwendet, auf 0,075 g, und Erhöhung der Pyrocatecholviolett-Menge von 0,015 g auf 0,03 g bei der Herstellung von 100 ml des auf pH 3 eingestellten und gepufferten wässrigen Wolframatfarbstoffkomplexes, die Empfindlichkeit des Testes gegenüber niedrigen bis Spurenmengen an Protein in der Probe steigert. Tabelle V zeigt eine weitere Verbesserung beim Urintest auf niedrige bis Spurenmengen von Protein, worin eine Konzentration von 10 mg/dl Albumin in einer Probe leicht von einer Kontrollprobe mit 0 mg/dl Albumin, und worin eine Konzentration von 5 mg/dl in einer Probe leicht von einer Kontrollprobe mit 0 mg/dl Protein unterschieden werden kann. Tabelle V zeigt, daß die Farbabstandsdifferenz zwischen der Probe mit 10 mg/dl Protein und einer Leerprobe (0 mg/dl) ca. 16 Einheiten ausmacht, und die Farbabstandsdifferenz zwischen einer Probe mit 5 mg/dl Protein und einer Leerprobe ca. 9 Einheiten ausmacht. Solche Farbabstandsdifferenzen können vom menschlichen Auge erkannt werden. Daher ergibt der Vergleich einer Probe mit 5 mg/dl Albumin zu einer Leerprobe eine Farbabstandsdifferenz von ca. 5 Einheiten, oder ca. einem Farbblock. Dies ist eine ausreichende Farbabstandsdifferenz, um den Nachweis und Messung einer Spurenmenge von Urin-Protein zu erlauben, da die Farbabstandsdifferenz oberhalb der Unterscheidungsschwelle für das menschliche Auge liegt. Zusätzlich zeigt Tabelle V, daß eine Probe mit 10 mg/dl Albumin von einer Probe mit 5 mg/dl Albumin unterschieden werden kann, da die Farbabstandsdifferenz zwischen den Proben mit diesen Albuminwerten ca. 8 ist, oder überhalb der Unterscheidungsschwelle des menschlichen Auges liegt.
Die in Tabelle V gezeigten Daten wurden von Teststreifen mit WHATMAN CCP500 Filter erhalten, der mit einer wässrigen Lösung von 30 mg/dl Pyrocatecholviolett, 75 mg/dl Ammoniumwolframat und 250 mM Glycinpuffer auf pH 3 eingestellt, imprägniert wurde. Tabelle V zeigt ebenfalls die Farbabstandsdifferenzen nach 2 Min. Reaktionszeit. Tabelle V Farbabstandsdifferenzen (Delta E), für Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenzien unter Verwendung steigender Mengen an Wolframat und Farbstoff gegenüber variierenden Albuminkonzentrationen Reaktionszeit Delta E
Es ist festzuhalten, daß der Fachmann für die Entwicklung von Testkits in der Lage ist, einen optimalen Teststreifen, der eine ausreichende Menge und ein besonders wirksames Wolframatfarbstoff-Indikatorreagenzsystem enthält, zu entwerfen, dad den Nachweis und Messung von 5 mg/dl Albumin in einer Probe erlaubt, da die vorliegenden Testergebnisse unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens und Zusammensetzung eine Farbabstandsdifferenz von ca. 5 Einheiten zeigen. Dieser Delta E-Wert ist beinahe ausreichend zum Nachweis durch das menschliche Auge und kann durch heutige Kolorimeter und/oder Spektralphotometer gemessen werden. In gleicher Weise erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren und Zusammensetzung die Unterscheidung zwischen Proben mit 10 mg/dl Albumin in einer Probe mit 5 mg/dl Albumin oder zwischen Proben mit 15 mg/dl und 10 mg/dl Albumin.
Es wurde gefunden, daß erfindungsgemäß die volle Farbentwicklung der Teststreifen mit dem Wolframatfarbstoffkomplexindikator innerhalb ca. 1 Min. bis ca. 2 Min. nach Kontaktbringen des Teststreifens mit der Probe abgeschlossen ist. Die maximale Farbentwicklung, wie in Tabelle V gezeigt, erfolgt ca. 2 Min. nach Kontakt. Es werden jedoch akzeptable und verlässliche Ergebnisse erzielt, wenn der Teststreifen auf eine Farbveränderung ca. 1 Min. nach Kontakt mit der Probe geprüft wird. Nur eine leichte und visuell nicht nachweisbare Veränderung der Farbentwicklung tritt zwischen einer und 2 Min. auf. Eine solch kurze Zeit zur vollen Farbentwicklung des Teststreifens ist ein zusätzlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Wolframatfarbstoffkomplexes gegenüber dem Wolframatfarbstoffkomplex aus dem Stand der Technik der ca. 10 Min. für die maximale Farbentwicklung erfordert. Daher können Teststreifen mit dem erfindungsgemäßen Wolframatfarbstoff-Indikatorreagenz und zum Erhalt schneller Ergebnisse und möglicherweise genauerer Testergebnisse, insbesondere im Vergleich zu Tests, worin ein Teststreifen auf Basis eines Molybdat-Farbstoffkomplexes auf eine Farbreaktion innerhalb weniger als 10 Min. Reaktionszeit geprüft wird, verwendet werden. In diesem Fall ist die maximale Farbveränderung noch nicht eingetreten, wodurch falsche Testergebnisse erhalten werden. Es sollte für alle Proteintests, die in den Tabelle zusammengefaßt sind, mit der Ausnahme für Tabelle V festgestellt werden, daß die Teststreifen mit dem Wolframatfarbstoffkomplex auf eine Farbveränderung nach einer 1,5-minütigen Kontaktzeit mit der Probe, und die Molybdat-Farbstoffkomplextests nach einer Reaktion nach 2 Min. Kontaktzeit geprüft wurden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß die Farbveränderung aufgrund der Reaktion von Albumin mit Wolframatfarbstoffkomplex zeitlich stabil ist.
Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß eine Urinprobe mit einer Spurenmenge von 5 mg/dl Albumin durch visuellen Nachweis und in Meßverfahren untersucht werden kann, da die Farbabstandsdifferenz parktisch dem Minimum entspricht, das für eine Unterscheidung durch das menschliche Auge erforderlich ist. In gleicher Weise zeigen die Delta E-Werte von Tabelle V, insbesondere Delta E(Alb 10-5) und Delta E(Alb 15-10), daß eine erhöhte Menge an Ammoniumwolframat im Wolframatfarbstoffkomplex ein Indikatorreagenz mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber dem Proteingehalt, und insbesondere gegenüber niedrigen bis Spurenproteingehalt in einer flüssigen Probe liefert.
Insgesamt zeigen Tabellen II bis V, daß ein Wolframatfarbstoff-Indikatorreagenz, das in eine geeignete Trägermatrix wie Filterpapier imprägniert ist, die Farbauflösung zwischen Proben mit verschiedenen Proteinkonzentrationen verbessert, und die Testempfindlichkeit auf den gesamten Proteingehalt einer flüssigen Probe, insbesondere bei niedrigen Proteingehalten von weniger als 30 mg/dl verbessert. Zusätzlich zur gesteigerten Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und Zusammensetzung gegenüber dem Molybdat-Farbstoffkomplexverfahren aus dem Stand der Technik unterliegt die erfindungsgemäße Zusammensetzung keiner Beeinflussung durch Ionenstärke oder spezifische Dichte und zeigt eine volle Farbentwicklung und genaue Testergebnisse in kürzerer Zeit. Das erfindungsgemäße Verfahren und Zusammensetzung erlaubt jedenfalls visuelle Unterscheidung von Farbveränderungen aufgrund des Kontakts der Trägermatrix, die mit dem Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz imprägniert ist, mit einer Probe, die Proteingehalte von zwischen 0 mg/dl und 10 mg/dl und bis hinunter zu 5 mg/dl enthält, wodurch genaue und verlässliche Tests der Proben mit niedrigen bis Spurenmengen an Proteinen ermöglicht werden.
Daher kann erfindungsgemäß ein genauerer und verlässlicherer Test auf den Gesamtproteingehalt, auf den Proteingehalt mit niedrigem Molekulargewicht, und insbesondere auf den niedrigen bis Spurengehalt an Gesamtprotein im Urin und andere Proben, durch Verwendung eines Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenz durchgeführt werden. Das Wolframatfarbstoffkomplex-Indikatorreagenzverbessert die Farbauflösung zwischen Proteinkonzentrationen und verbessert daher die Testempfindlichkeit, insbesondere bei niedrigen bis Spurenmengen von Albumin von ca. 15 mg/dl und darunter.

Claims

1. Zusammensetzung, die eine ausreichende Farbveränderung nach Kontakt mit einer Protein-haltigen flüssigen Probe zum Nachweis des Vorliegens und/oder der Konzentration von Protein in der Probe zeigen kann, enthaltend ein wasserlösliches Wolframat, einen Polyhydroxybenzolsulonphthalein-Farbstoff und/oder einen Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff und einen nicht Komplex-bildenden Puffer zur Aufrechterhaltung eines sauren pH-Wertes in der Zusammensetzung.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das wasserlösliche Wolframat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumwolframat, Ammoniumparawolframat, Wismutwolframat, Kadmiumwolframat, Kalziumwolframat, Lithiumwolframat, Magnesiumwolframat, Kaliumwolframat, Natriummetawolframat, Natriumwolframat, Strontiumwolframat, Zinkwolframat, Phosphowolframaten mit einem Alkalimetall und/oder einem Ammonium- und/oder einem Alkyl-, Dialkyl-, Trialkyl- oder Tetraalkylammoniumkation, Alkylammonium- oder Hydroxyalkylammoiumwolframaten, Dialkylammonium oder Di(hydroxyalkyl)ammoniumwolframaten und Trialkylammonium- oder Tri(hydroxyalkyl)ammoniumwolframaten, oder Kombinationen davon.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Polyhydroxybenzolsulfonphthalat-Farbstoff oder der Polyhydroxybenzolphthalat-Farbstoff aufgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pyrocatecholviolett, Pyrogallolrot, Brompyrogallolrot, Xylenolorange, Pyrogallolphthalein und O-Hydroxyhydrochinonphthalein, oder Kombinationen davon.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Puffer ausgewählt ist aus der Gruppe von Laktat, Phthalat, Trichloracetat, Sulfosalycilat, Phosphaten, Acetaten, Natriumchlorid/Salzsäure,

Piperazin-N,N'-bis(2-hydroxypropan)sulfonsäure (POPSO),

N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES),

3-N-(Tris-hydroxymethyl)methylamino-2-hydroxypropansul fon-säure (TAPSO) und 2-([Tris-(hydroxymethyl)methyl]-amino)ethansulfonsäure (TES), oder Mischungen davon.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Molverhältnis des Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoffes und/oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoffes zum wasserlöslichen Wolframat innerhalb des Bereiches von 1 zu 1 bis 1 zu 10 liegt.

6. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens und/oder Konzentration von Protein in einer flüssigen Probe, umfassend:

(a) in Kontaktbringen einer flüssigen Probe mit einer Reagenzzusammensetzung, die ein wasserlösliches Wolframat, einen Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff und/oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff und einen nicht-komplexbildenden Puffer zur Aufrechterhaltung eines sauren pH-Wertes in der Reagenzzusammensetzung enthält, und

(b) Nachweis des Vorliegens und/oder der Konzentration des Proteins in der Probe aufgrund der Intensität und/oder des Ausmaßes der Farbveränderung der Reagenzzusammensetzung.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Molverhältnis von Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff und/oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff zum wasserlöslichen Wolframat innerhalb des Bereiches von 1 zu 1 bis 1 zu 10 liegt.

8. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens und/oder Konzentration von Protein in einer flüssigen Probe, umfassend:

(a) in Kontaktbringen der flüssigen Probe mit einer Nachweisvorrichtung, die ein Reagenztestkissen umfaßt, das eine Reagenzusammensetzung mit einem wasserlöslichen Wolframat, einem Polyhydroxysulfonphthalein-Farbstoff und/oder einem Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff und einen nicht-komplexbildenden Puffer zur Aufrechterhaltung in der Reagenzzusammensetzung eines sauren pH-Wertes enthält, und

(b) Prüfung der Nachweisvorrichtung auf eine Farbveränderung als Reaktion auf den Proteingehalt der flüssigen Probe.

9. Nachweisvorrichtung zum Nachweis des Vorliegens und/oder der Konzentration von Protein in einer flüssigen Probe umfassend.

einen Trägerstreifen,

ein Reagenztestkissen und

eine Reagenzzusammensetzung die in das Reagenztestkissen eingebracht ist,wobei die Reagenzzusammensetzung ein wasserlösliches Wolframat, ein Polyhydroxybenzolphtalein-Farbstoff und/oder ein Polyhydroxybenzolphtalein-Farbstoff und einen nicht-komplexierenden Puffer zur Aufrechterhaltung eines sauren pH-Wertes in der Reagenzzusammensetzung enthält.

10. Verwendung der Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 5 oder der Vorrichtung nach Anspruch 9 bei der Bestimmung von Proteinen.