-
Die Erfindung betrifft eine verbesserte Einwegvorrichtung für die chemische Analyse von
Flüssigkeiten. Insbesondere betrifft sie mehrschichtige Elemente zur Bestimmung der
Konzentration eines Analyten in einer Flüssigkeit.
-
Mehrschichtige Testelemente werden im Laboratoriumsumfeld in großem Umfang
verwendet, um einen Analyten von Interesse nachzuweisen. Halbquantitative oder qualitative
Analysen, die keine Kontrolle des Probenumfangs umfassen, etwa Schwangerschaftstests,
sind erfolgreich für die Anwendung zuhause oder in der Arztpraxis angepaßt worden.
Allerdings hat sich die Anpassung quantitativer Tests für die Anwendung durch Personal
ohne Laborerfahrung oder ohne relativ aufivendige Ausrüstung als schwierig erwiesen.
Leider erfordert der Nachweis bestimmter Analyten wie etwa Glucose, Alkohol oder
Cholesterin quantitative Tests, die relativ genau sein mussen, um brauchbar zu sein.
-
Eine Schwierigkeit bei der Anpassung quantitativer Tests ist die genaue Dosierung der
Testprobe in oder auf die Assay-Vorrichtung. Eine Methode zur Umgehung der
Erfordernis nach einer Kontrolle des Probenumfangs besteht in der Durchführung von Analysen,
bei denen die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt wird und nicht die Menge an Analyt in
der Probe. Da sich Reaktionsgeschwindigkeiten mit der Temperatur und einer Reihe
anderer Variablen ändern, ist häufig eine gleichzeitige Auswertung von Kontrollen
erforderlich. Zudem sind zwei oder mehr Ablesungen zur Berechnung einer Geschwindigkeit
nötig.
-
Für den Assay von Analyten wie Glucose, Cholesterin und Alkohol ist eine Blutprobe die
bevorzugte Probe. Um die Aufarbeitung des Bluts - um Serum oder Plasma zu
erhalten -zu umgehen, werden viele Tests mit Vollblut durchgeführt. Ein spezielles Problem, das bei
der Quantifizierung von Analyten in Vollblut auftritt, ist das Vorhandensein roter
Blutkörperchen, das Störungen bei der Erfassung von Farbänderungen von Farbstoffen
hervorruft, die im gleichen Wellenlängenbereich wie Hämoglobin absorbieren. Zelluläre
Bestandteile im Blut werden von der Schicht für die Bestimmung mit Hilfe einer Reihe
von Methoden ferngehalten oder filtriert, zu denen die Verwendung von Cellulose,
Aminosäuren, Glasfasern oder Kohlenhydrat zählt. Angewandt wird auch die
Flüssigkeitsmessung unter gleichzeitiger Entfernung der zellulären Bestandteile des Bluts.
-
Zudem werden sperrende oder blockierende Schichten verwendet, um zelluläre
Bestandteile aus dem Serumanteil einer Vollblutprobe abzutrennen. Derartige Barrieren, die bei
Elementen im Stand der Technik verwendet werden, müssen im allgemeinen für den
Liganden, die Reagenzien der Reagensmatrixschicht oder die Produkte ihrer
Wechselwirkung durchlässig sein. Bei diesen Vorrichtungen geschieht die Bestimmung der
nachweisbaren Spezies von der Oberfläche der Nachweisschicht oder der
Bestimmungsoberfläche der Reagensmatrixschicht aus, die sich auf der der Dosieroberfläche
gegenüberliegenden Seite der Reagensmatrixschicht befindet. Alternativ kann dazu auf dem
Element eine Barriere vorhanden sein, um eine aufgetragene Probe auf einen
vorbestimmten Bereich der Elementoberfläche zu begrenzen.
-
Es besteht Bedarf an einer Vorrichtung, die leicht zu betreiben ist und Analyten wie etwa
Glucose, Cholesterin und Alkohol in Vollblut genau mißt.
-
Mehrschichtige Reagensstreifen sind in US-Patent 3 672 845 gezeigt. Die US-Patente
3 993 451 und 4 438 067 offenbaren die Verwendung teilchenförmiger Reagenzien, und
US-Patent 3 723 064 offenbart die Verwendung einer Membran mit Bereichen
unterschiedlicher Permeabilität US-Patent 3 783 105 demonstriert die Verwendung
gefriergetrockneter Reagenzien. Weitere mehrschichtige Testausführungen sind in den
US-Patenten 3 980437, 4 042 335, 4 144 306, 4 160008, 4 178 153, 4292272, 4318 985,
4 387 990, 4 427 632, 4 452 887, 4 532 107, 4 604 264 und 4 668 472 gezeigt. Eine
weitere Alternative zum Ansatz der mehrschichtigen Testvorrichtung ist in US-Patent
3 476 515 gezeigt, das aufreißbare Proben- und Reagensbeutel offenbart. US-Patent
3 158 532 lehrt die Herstellung eines Filters, der Poren abgestufter Größe und
Filtrationsleistung aulweist.
-
Spezielle Reagenzien haben sich in Assays auf Anwesenheit von Glucose, Cholesterin,
Alkohol und anderen Analyten als brauchbar erwiesen (siehe zum Beispiel US-Patente
2 912 309 und 2 981 606). Puffer, Stabilisatoren, Farbstoffe sowie weitere nachweisbare
Komponenten sind in mehrschichtigen Vorrichtungen und Teststreifen eingebracht.
-
Zelluläre Bestandteile im Blut werden durch Verwendung von Cellulose (US-Patent
3 092 465), Aminosäuren (US-Patent 3 552 928), Glasfasern (US-Patent 4 477 575) und
Kohlenhydrat (US-Patent 4 678 757) von der Reagensmatrixschicht ferngehalten oder
filltriert. Die Flüssigkeitsmessung unter gleichzeitiger Entfernung der zellulären
Bestandteile des Bluts wird in den US-Patenten 4 250 257 und 4 260 392 angesprochen.
-
Sperrschichten in mehrschichtigen Elementen sind in den US-Patenten 3 992 158,
4 166093, 4255384, 4 256 693, 4 363 874, 4 390 343, 4 478 944, 4 631 174und
4 066 403 (erneut erteiltes Patent 30 267) gezeigt.
-
Das US-Patent Nr.4 552 925 beschreibt eine Vollblut-Trennmethode und einen Test
unter Anwendung derselben. Bei dieser Methode wird Vollblut in eine im wesentlichen
farblose Flüssigkeit und einen Anteil, der die roten Blutkörperchen enthält, aufgetrennt.
-
US-Patent Nr.4 774 192 beschreibt ein trockenchemisches Reagenziensystem zum
Nachweis von Analyten wie etwa Glucose, Cholesterin, Harnstoff, Antigen oder
Antikörper. Das Reagenziensystem ist eine poröse Membran oder saugfähige Folie mit einem
Porositätsgradienten von einer planaren Oberfläche zur anderen. Die Probe wird auf die
dichte Seite der Membran aufgetragen, die verhindert, daß Zellen biologischer Proben in
die Membran mit dem Reagenziensystem eindringen.
-
Das US-Patent Nr.4 738 823 beschreibt einen Teststreifen mit einstellbarem
Probenabsorptionsvermögen, das vorwählbar ist.
-
Die EPA-Patentanmeldung Nr.0 256 851 (veröffentlicht am 24. Februar 1988) beschreibt
ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten zusammen mit einer
Vorrichtung, die speziell zur Durchführung des Verfahrens ausgelegt ist. Bei diesem
Verfahren wird eine Ablesung der Remission von einer Oberfläche einer inerten porösen
Matrix vorgenommen, die mit einem Reagens imprägniert ist, das mit dem Analyten in
Wechselwirkung tritt, um ein lichtabsorbierendes Reaktionsprodukt zu ergeben, wenn die
Probe auf eine andere Oberfläche aufgetragen wird und durch die Matrix an die
abzulesende Oberfläche wandert. Obwohl bei dieser Methode keine Reaktionsgeschwindigkeit
berechnet wird, werden Ablesungen bei zwei Wellenlängen vorgenommen, um Störungen,
insbesondere durch Blutzellen in der Probe, zu beseitigen. Verwendet wird das
Farbstoffpaar MBTH/DMAB mit Reagenzien für die Glucose-Messung.
-
Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines
Analyten in einer flüssigen Probe verfügbar, umfassend das Aufbringen der Probe auf die
obere Fläche einer Reagensmatrixschicht, die asymmetrisch porös ist und Poren aufweist,
deren Durchmesser von der oberen Fläche zur unteren Fläche der Reagensmatrixschicht
hin immer kleiner wird, und das Bestimmen der Analytmenge aus der Unterseite der
Reagensmatrixschicht. Des weiteren ist die Verwendung der asymmetrisch porösen
Reagensmatrixschicht in einer Testvorrichtung vorgesehen. Ein Beispiel für eine geeignete
Testvorrichtung umfaßt drei Schichten: eine absorbierende Schicht, eine wasserdichte
Sperrschicht und eine Reagensmatrixschicht mit definiertem Sättigungsvolumen. Die
Schichten in der Vorrichtung sind so angeordnet, daß die untere Fläche der
absorbierenden Schicht die obere Fläche der Sperrschicht berührt und die untere Fläche der
Sperrschicht
die obere Fläche der Reagensmatrixschicht berührt. Gegebenenfalls steht eine
Trägerschicht mit der unteren Fläche der Reagensmatrixschicht in Berührung.
Absorbierende Schicht und Sperrschicht umfassen eine Öffnung, die sich durch die
absorbierende Schicht und die Sperrschicht erstreckt, wodurch der Probenauftrag auf die obere
Fläche der Reagensmatrixschicht ermöglicht wird. Die Reagensmatrixschicht enthält
Reagenzienhilfsmittel, um eine Menge einer nachweisbaren Spezies zu erzeugen, die mit
der Konzentration des Analyten in der Reagensmatrixschicht korreliert. Die absorbierende
Schicht absorbiert Flüssigkeit, die mit der Reagensmatrixschicht und mit der
absorbierenden Schicht in Kontakt ist, hinreichend langsam, um Sättigung der Reagensmatrixschicht
zu ermöglichen. Die Sperrschicht verhindert den Kontakt von Flüssigkeit in der
absorbierenden Schicht mit Flüssigkeit in der Reagensmatrixschicht.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die absorbierende Schicht ein hydrophiles
Papier, die Sperrschicht umfaßt einen Polymerfilm, der auf seiner Ober- und Unterseite
mit einem Klebstoff beschichtet ist, und die Reagensmatrixschicht umfaßt eine
asymmetrisch poröse Membran, die von der oberen Fläche der Reagensmatrixschicht zur unteren
Fläche der Reagensmatrixschicht hin zunehmend kleinere Poren aufweist. Bei einer
meistbevorzugten Ausführungsform erfaßt die Testvorrichtung Glucose in einer Vollblutprobe
quantitativ.
-
In den Zeichnungen ist:
-
Fig. 1 eine auseinandergezogene Perspektivansicht einer bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Testvorrichtung;
-
Fig. 2 eine Draufsicht der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung;
-
Fig. 3 eine Querschnittansicht der Vorrichtung längs der Linie 3-3 in Fig. 2.
-
Fig. 4 eine Querschnittansicht einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Testvorrichtung.
-
Fig. 1 zeigt eine auseinandergezogene Perspektivansicht einer erfindungsgemäßen
Testvorrichtung. Die absorbierende Schicht 2 ist von der Dosierfläche 4 der
Reagensmatrixschicht 6 durch die Sperrschicht 8 getrennt. Die optionale Trägerschicht 12, in der
Beziehung eines Trägers zur Reagensmatrixschicht 6 und zur Sperrschicht 8, umfaßt eine
Öffnung 10, durch die sich die nachweisbare Spezies an der Fläche zur Bestimmung,
Nachweisschichtfläche oder Bestimmungsfläche 16 bestimmen läßt. Die Öffnung 14
erstreckt sich jeweils durch die ab so rbierende Schicht 2 und die Sperrschicht 8 und gestattet
das Auftragen einer Testprobe auf die Dosierfläche 4 der Reagensmatrixschicht 6.
-
Fig. 2 ist eine Draufsicht der Vorrichtung von Fig. 1.
-
Fig. 3 ist eine Querschnittansicht einer bevorzugten Ausführungsform einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung längs der Linie 3-3 in Fig. 2. Die absorbierende Schicht 2 und die
Sperrschicht 8 auf der Oberfläche der Nachweisschicht definieren die Öffnung 14 für das
Auftragen der Testprobe auf die Dosierfläche 4 der Reagensmatrixschicht 6, die ein
defimertes, vorbestimmtes Sättigungsvolumen aufweist. Eine Öffnung 10 in der Trägerschicht
12 erlaubt die visuelle Bestimmung einer nachweisbaren Spezies an der
Bestimmungsfläche 16 der Reagensmatrixschicht 6.
-
Fig. 4 ist eine Querschnittansicht einer alternativen Ausführungsform der Testvorrichtung,
bei der die Trägerschicht eine Umhüllung bildet, die die absorbierende Schicht 18, die
Sperrschicht 20 und die Reagensmatrixschicht 22 dicht beisammen hält. Eine im
wesentlichen durchsichtige Trägerschicht 24 wird durch eine umhüllende Trägerschicht 28
angrenzend an die Reagensmatrixschicht 22 an deren Bestimmungsfläche 26 gehalten. Die
Trägerschichten 24 und 28 können zweckmäßigerweise als eine Einheit hergestellt sein.
-
Die obere Fläche der Reagensmatrixschicht, auf die die Probe aufgetragen wird, wird als
Dosierfläche bezeichnet. Die untere Fläche der Reagensmatrixschicht, wo die Menge der
nachweisbaren Spezies bestimmt wird, wird als Bestimmungsfläche bezeichnet.
Angrenzend an die Dosierfläche der Reagensmatrixschicht befindet sich ein
Sperrschichtmedium. Angrenzend an das Sperrschichtmedium befindet sich eine absorbierende
Schicht. Sperrschicht- und Absorptionsschichtmedium umfassen jeweils eine Öffnung
oder ein Loch zum direkten Auftragen der Testprobe auf die Dosierfläche der
Reagensmatrixschicht.
-
Die Reagensmatrixschicht ist schnellabsorbierend, und eine auf ihrer Oberfläche
vorhandene Probe sättigt rasch die Reagensmatrixschicht. Überschüssige Probe bleibt an der
Oberfläche der Reagensmatrixschicht, wo sie von der absorbierenden Schicht langsamer
absorbiert wird. Die Sperrschicht trennt die Reagensmatrixschicht von der absorbierenden
Schicht, so daß die zwei absorbierenden Schichten nur dann in Flüssigkeitskontakt stehen,
wenn nichtabsorbierte Probe an der Dosierfläche der Reagensmatrixschicht vorliegt.
-
Die auf die Reagensmatrixschicht aufgebrachte Probenmenge sollte größer sein als die zur
vollständigen Sättigung der Reagensmatrixschicht benötigte. Wenn die
Reagensmatrixschicht gesättigt wird, hört der Probenfluß in die Reagensmatrixschicht auf Der Rest der
Probe wird durch die absorbierende Schicht absorbiert. Überschüssige Probe in der
absorbierenden Schicht bleibt durch die Sperrschicht von der Reagensmatrixschicht getrennt
und beeinflußt somit die Reaktion nicht.
-
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist für einen weiten Bereich
volumenempfindlicher Festphasentests geeignet. Hierzu gehören Assays auf Glucose, Alkohol, AST
(Cholesterin), ALT (Phenobarbital), Theophyllin und andere chemische Analysen.
-
An einer Oberfläche der Reagensmatrixschicht, angeordnet zwischen der
Reagensmatrixschicht und der absorbierenden Schicht, befindet sich die Sperrschicht. Bei der
Sperrschicht
handelt es sich um ein wasserdichtes oder im wesentlichen wasserdichtes Material,
das wenigstens eine Öffnung aufweist. Die Öffnung kann irgendeine Form aufweisen, zum
Beispiel quadratisch, rechteckig, achteckig, ellipsenförmig etc., und ist
zweckmäßigerweise rund. Die Öffnung der Sperrschicht kann von ähnlicher Größe, Form oder Gestalt
sein wie die der absorbierenden Schicht - muß jedoch nicht. Allerdings müssen die
Öffnungen der beiden Schichten funktionell so ausgerichtet sein, daß eine flüssige Probe
bequem durch die Öffnungen in der absorbierenden und in der Sperrschicht und auf die
freiliegende Oberfläche der Reagensmatrixschicht aufgetragen werden kann.
Zweckmäßigerweise beträgt der Durchmesser der Öffnung wenigstens 0,127 cm (0,050 inch), im
allgemeinen wenigstens 0,381 cm (0,150 inch) und vorzugsweise 0,457 cm bis 1,27 cm
(0,180 bis 0,500 inch).
-
Die Sperrschicht kann aus irgendeinem zweckmäßigen wasserdichten Material sein,
insbesondere in Form einer Lage oder Folie. Zu den Metallblechen oder -folien gehört z.B.
Aluminium-Folie. Zu den polymeren Materialien, die zur Verwendung geeignet sind,
gehören Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Celluloseacetate,
Polyethylenterephthalate, Polycarbonate oder Polystyrole. Geeignet sind verschiedene Arten Papier,
darunter paraffinimprägniertes Papier, polymerlaminiertes Papier, wasserfestes Papier und
Wachspapier, aber auch Glas. Die Sperrschicht kann aus dem gleichen Material
zusammengesetzt sein wie die Trägerschicht, sofern vorhanden, muß aber nicht. Alternativ
kann auch eine Lösung eines wasserdicht machenden Materials, das die Sperrschicht
bildet, auf die absorbierende Schicht aufbeschichtet werden. Eine geeignete Dicke für die
wasserdichte Sperrschicht ist etwa 3 µm bis etwa 1 mm oder weniger, vorzugsweise etwa
10 µm bis etwa 0,4 mm.
-
Es können Haft- und Thermokleber, Klebstoffe auf Lösungsmittelbasis und
Reaktionskleber als Klebstoffe verwendet werden, um die Sperrschicht an der absorbierenden
Schicht, der Reagensmatrixschicht und/oder der Trägerschicht zu befestigen.
Vorzugsweise
wird ein doppelseitiges Klebeband verwendet, um die wasserdichte Sperrschicht
bereitzustellen und um den Zusammenbau der Testvorrichtung einfach zu machen.
-
Bei der absorbierenden Schicht handelt es sich vorzugsweise um ein hydrophiles Papier,
doch können auch andere absorbierende Materialien verwendet werden. Es können
offenporige Kunstharzschäume, Mattpolymere, flüssigkeitsbeständige Gele, Gewebe, Filze und
dergleichen verwendet werden. Anorganische Stoffe, zum Beispiel Gips, sind weniger
bevorzugt, da sie normalerweise keine ausreichende Stabilität besitzen. Das
Absorptionsvermögen dieser Stoffe sollte derart sein, daß bei Kontakt einer Testprobe mit der
Oberfläche der Reagensmatrixschicht der Rand der absorbierenden Schicht befeuchtet wird,
aber die Testprobe im wesentlichen von der Reagensmatrixschicht absorbiert wird, bis die
Reagensmatrixschicht gesättigt ist. Die absorbierende Schicht absorbiert die Probe
langsamer als die Reagensmatrixschicht. Die Sättigung der Reagensmatrixschicht sollte in
etwa einer halben Sekunde bis zwei Sekunden oder weniger erreicht sein. Überschüssige
Probe, die auf der Oberfläche der Reagensmatrixschicht verbleibt, sollte innerhalb 0,5 bis
60 Sekunden, vorzugsweise innerhalb 1 bis 30 Sekunden, stärker bevorzugt innerhalb 1
bis 5 Sekunden von der absorbierenden Schicht absorbiert sein.
-
Die absorbierende Schicht ist so ausgelegt, daß ein Überschußvolumen, zum Beispiel das
zweifache, vorzugsweise das 10fache oder mehr der angenommenen Beladung für die
Sättigung der Reagensmatrixschicht von der absorbierenden Schicht absorbiert werden
kann. Die Beseitigung überschüssiger Probe von der Dosierfläche verhindert, daß
zusätzlicher Analyt in der Probe in die Reagensmatrixschicht eindringt und sich an der
Quantifizierungsreaktion beteiligt, und hindert auch die durch die
Quantifizierungsreaktion gebildete nachweisbare Spezies daran, aus der Reagensmatrixschicht
herauszudiffundieren. Die Testvorrichtungen können so ausgelegt sein, daß sie eine breite Vielfalt
von Probenbeladungen aufnehmen, und für erfahrene Fachleute werden spezielle
Ausgestaltungen angesichts der Lehren hierin offenkundig sein.
-
Die absorbierende Schicht umfaßt wenigstens eine Öffnung, durch die eine Probe auf die
Dosierfläche der Reagensmatrixschicht aufgetragen werden kann. Diese Öffnung sollte im
allgemeinen mit der Öffnung in der Sperrschicht zusammenfallen, so daß eine funktionale
Einheit gebildet wird. Um funktional zu sein, müssen die jeweiligen Öffnungen der
absorbierenden und der Sperrschicht jedoch nicht von identischer Größe oder relativer Lage
zueinander sein.
-
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Öffnung durch die Trägerschicht
bereitgestellt, um die Atmosphäre auf die Bestimmungsfläche 16 der Reagensmatrixschicht 6
einwirken zu lassen und die visuelle oder spektrophotometrische Bestimmung der
nachweisbaren Spezies zu ermöglichen. Analysen, die vorzugsweise unter Einwirkung von
atmosphärischem Sauerstoff durchgeführt werden, sind leicht anzupassen durch
Minimierung der Trägerschichtoberflächen und Maximieren der Oberfläche der
Reagensmatrixschicht, die der Atmosphäre ausgesetzt ist.
-
Die Beschaffenheit der Trägerschicht ist nicht speziell eingeschränkt, solange sie für
Flüssigkeit undurchlässig ist und Licht oder andere für die Bestimmung der nachweisbaren
Spezies erforderlichen Mittel übertragen kann. Für diesen Zweck sind zum Beispiel
verschiedene polymere Materialien geeignet, etwa Polyethylenterephthalate,
Polycarbonate oder Polystyrole, oder Materialien wie etwa Glas oder Wachspapier. Die verwendete
Trägerschicht kann jede gewünschte Dicke aufweisen, aber im allgemeinen ist eine Dicke
von etwa 50 µm bis etwa 2 mm angemessen. Die Reagensmatrixschicht kann direkt auf
die Trägerschicht aufbeschichtet werden. Ist die Reagensmatrixschicht ein
schwammähnliches Material, so kann es wünschenswert sein, die Reagensmatrixschicht an die
Trägerschicht zu kleben oder anderweitig zu laminieren oder zu befestigen. Alternativ
kann die Trägerschicht eine Umhüllung bilden, die die Reagensmatrixschicht, die
Sperrschicht und die absorbierende Schicht dicht beisammen hält.
-
Geeignete Trägerschichten können opak oder transparent sein. Ist keine Öffnung durch
die Trägerschicht bereitgestellt, so ist es wesentlich, daß die Trägerschicht im
wesentlichen transparent ist, so daß die Bestimmung der nachweisbaren Spezies durch die
Trägerschicht erfolgen kann, und daß sie luftdurchlässig ist.
-
Bei einer alternativen Ausführungsform der Testvorrichtung ist keine Trägerschicht, kein
Träger oder Halter bereitgestellt, und die Testvorrichtung besteht aus einer
Reagensmatrixschicht, einer Sperrschicht und einer absorbierenden Schicht, die in dieser
Reihenfolge zusammenlaminiert sind. Solche Vorrichtungen können aufjede zweckmäßige
Oberfläche gesetzt werden, wenn der Assay durchgeführt wird. Bei einer anderen
Ausführungsform ist die Reagensmatrixschicht in einer Trägerschicht eingeschlossen, die als
Halter fungiert, so daß lediglich die Oberfläche freiliegt, die mit der Öffnung in der
absorbierenden und der Sperrschicht zusammenfällt. Eine solche Anordnung ist in Fig. 4
gezeigt.
-
Die Reagensmatrixschicht ist ein schnell absorbierender, hydrophiler Bereich, der drei
Funktionen ausübt: (1) er liefert ein bestimmtes Volumen für Reagenzien und die
Testprobe; (2) er filtriert die zellulären Bestandteile der Testprobe, so daß die zellulären
Bestandteile an der Oberfläche der Schicht oder in der deren Nähe zurückgehalten werden,
während nichtzelluläre, flüssige Bestandteile der Probe durch die gesamte
Reagensmatrixschicht transportiert werden; und (3) er liefert eine Meßzone für die Bestimmung
der Gegenwart nachweisbarer Spezies, wodurch Hintergrundstörungen durch rote
Blutkörperchen und andere zelluläre Bestandteile der Testprobe minimiert werden.
-
Die Reagensmatrixschicht kann eine einzelne Membran sein oder kann aus mehreren
Schichten gebildet sein, die die gewünschten Funktionen verrichten und
zusammenlaminiert sind. Der obere Teil der Reagensmatrixschicht, der die Dosierfläche der
Reagensmatrixschicht umfaßt, enthält Poren, die teilchenförmige Stoffe in der Probe,
insbesondere rote Blutkörperchen, herausfiltrieren oder festhalten. Der unter Teil der
Reagensmatrixschicht stellt einen Bereich mit einer geeigneten Farbe bereit, um die
Bestimmung der nachweisbaren Spezies zu erleichtern.
-
Die Reagensmatrixschicht liefert einen definierten Raum, der ein vorbestimmtes Volumen
der Probe absorbiert. Zudem ist die Reagensmatrixschicht im wesentlichen oder
vollkommen undurchsichtig, um eine Beeinflussung der nachweisbaren Spezies durch rote
Blutkörperchen zu verhindern. Ist die Reagensmatrixschicht nicht erheblich undurchsichtig, so
kann eine Membran beigegeben werden, die für rote Blutkörperchen optisch dicht und
porös ist und dem flüssigen Teil der Probe ermöglicht, die Reagensmatrixschicht zu
sättigen. Vorzugsweise befindet sich die undurchsichtige Membran im oberen Teil der
Reagensmatrixschicht, jedoch unterhalb des Bereichs, wo die roten Blutkörperchen
festgehalten werden.
-
Zu den Materialien, die zur Verwendung als Unterteil der Reagensmatrixschicht geeignet
sind, gehören Glasfasern und Schaumfilter des Standes der Technik. Die Unterseite der
Reagensmatrixschicht macht einen Bereich verfügbar, wo die nachweisbare Spezies unter
minimaler Störung durch Pigmentierung durch rote Blutkörperchen bestimmt wird. Der
untere Teil kann die gleichen Materialien wie der obere Teil umfassen.
-
Die Reagensmatrixschicht umfaßt ein poröses Element, das asymmetrisch porös ist und
Poren mit fortlaufend abnehmendem Durchmesser beim Übergang von der oberen
(Dosier-) Fläche zur unteren (Bestimmungs-) Fläche der Reagensmatrixschicht aufweist.
Eine porösporige oder offenporige Struktur, etwa die wie in der Membran BTS
Asymmetric von Filtrite (San Diego, Californien, USA) anzutreffende oder die von US-
Patent 3 158 532, ausgegeben an Pall et al., gezeigte ist besonders bevorzugt und kann
ohne Verwendung von zusätzlichen Membranen oder Schichten als Reagensmatrixschicht
dienen. Derartige Membranen haben den Vorteil, daß sie die zellulären Blutbestandteile
abtrennen. Wird Vollblut auf die Testvorrichtung aufgebracht, so befinden sich rote
Blutkörperchen
an der Dosierfläche. Die Bestandteile des Blutserums wandern durch das
gesamte poröse Medium, und die Reagens/Analyt-Reaktion tritt überall in der Matrix ein.
-
Zudem ist das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen der asymmetrischen Membranen
sehr groß, was eine rasche Absorption der Probe ergibt. Durch die schnelle, gleichmäßige
Benetzung der Reagensmatrixschicht werden die getrockneten Reagenzien gelöst und der
Analyt wird in nächste Nähe zu den Reagenzien gebracht, wodurch sich die zum
Erreichen des Endpunkts der Reaktion erforderliche Zeitspanne verringert. Die schnelle,
gleichmäßige Benetzung der Reagensmatrixschicht ermöglicht eine Bestimmung, die
durch die Anwesenheit überschüssiger Probe auf der Dosierfläche der
Reagensmatrixschicht nicht wesentlich beeinflußt wird.
-
Ein Vorteil dieser Erfindung ist, daß sich das Volumen der Reagensmatrixschicht nach
Sattigung mit Probe genau berechnen läßt, da jegliche überschüssige Probe entweder von
der absorbierenden Schicht absorbiert oder so schnell analysiert wird, daß keine Störung
der Quantifizierungsreaktion beobachtet wird. Auf diese Weise läßt sich die Menge an
Analyt in der Probe auf der Grundlage einer einzigen Bestimmung berechnen, die das
Ausmaß der Reaktion mit Probenanalyt angibt, und nicht zweier Bestimmungen, die zur
Berechnung der Geschwindigkeit der Reaktion angewandt werden. Außerdem kann die
genaue Menge an Reagens, die für die quantitative Analyse des Analyten in der Testprobe
erforderlich ist, berechnet und in der Reagensmatrixschicht verfügbar gemacht werden.
-
Bei der Anwendung wird die auf die freiliegende Oberfläche der Matrix aufgetragene
Menge an überschüssiger Probe innerhalb weiter Toleranzen unwichtig. Nichtzelluläre
Bestandteile der Probe, die auf die Dosierfläche der Reagensmatrixschicht aufgetragen sind,
dringen in die Schicht vor, bis die Reagensmatrixschicht gesättigt ist. Nach Sättigung
verbleibt überschüssige Probe auf der Schicht, wo sie von der absorbierenden Schicht
absorbiert und durch die Sperrschicht daran gehindert wird, mit den Reagenzien in der
Reagensmatrixschicht zu reagieren. Demzufolge wird, ungeachtet der auf die
Testvorrichtung
aufgebrachten Probenmenge, mit der Testvorrichtung ein definiertes Beschicken
mit Probe pro Einheit erzielt, und man erhält eine Testvorrichtung mit definiertem
Volumen. Eine Vorrichtung läßt sich leicht so ausgestalten, daß nur ein Bruchteil eines
Standardtropfens an Probe erforderlich ist, um die Reagensmatrixschicht vollständig zu
sättigen.
-
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Reagensmatrixschicht ein
Einmembran- oder Filtermedium, das beim Übergang von der Dosierfläche zur Unterseite hin
zunehmend feinere Filtrat ion aufweist, so daß sich die zellulären Bestandteile der
Testprobe an der Oberseite der Membran befinden. Dieses Medium sollte lichtundurchlässig
sein und helle oder dunkle Farbeigenschaften aufweisen. Handelt es sich bei der
nachweisbaren Spezies um einen Farbstoff, so wird zur Farberfassung ein undurchsichtiger,
hell gefärbter oder weißer Hintergrund bevorzugt.
-
Die Reagensmatrixschicht enthält ein oder mehrere chemische Reagenzien, die direkt oder
indirekt mit dem fraglichen Analyten unter Bildung einer nachweisbaren Spezies reagieren
können. Zum leichten Ablesen werden Reagenzien bevorzugt, die ein gefärbtes
Reaktionsprodukt ergeben oder eine deutliche Farbänderung hervorrufen. Geeignet zur
Verwendung sind auch Reagenzien, die Chemilumineszenz oder andere erfaßbare
Produkte ergeben. Zur Bestimmung des Reaktionsgrads können bei Produkten, die nicht
visuell bestimmbar sind, spezielle Geräte erforderlich sein.
-
Zu den Substanzen in Blut, Serum, Urin, der zerebrospinalen Flüssigkeit, Lymphe oder
anderen Körperflüssigkeiten, die mit Hilfe der Testvorrichtung dieser Erfindung gemessen
werden können, gehören Glucose, Galactose, Brenztraubensäure, Aminosäuren,
Cholesterin, Milchsäure, Alkohol, Harnstoff etc.. Je nach dem zu messenden Analyten
können die zur Messung verwendeten Reagenzien unterschiedlich sein und unterscheiden
sich nicht von denen, die in anderen mehrschichtigen Auflage-Analysevorrichtungen
verwendet werden.
-
Die nachweisbare Spezies bildet sich vollständig, und der Assay wird zur Bestimmung der
nachweisbaren Spezies nach 1 Minute oder weniger, vorzugsweise 30 bis 45 Sekunden,
stärker bevorzugt weniger als 30 Sekunden abgelesen. Das heißt, wenn der Analyt im
Durchschnitts- oder normalen Wertebereich liegt, ist der Endpunkt des Assay in 1 Minute
oder weniger erreicht. Bei Proben mit einer hohen Konzentration an Analyt ist der
Endpunkt vorzugsweise in weniger als zwei Minuten, vorzugsweise in einer Minute oder
weniger erreicht. Alternativ können mehrere Ablesungen vorgenommen werden, um zu
bestimmen, ob der Endpunkt erreicht worden ist, insbesondere bei Konzentrationen am
oberen Ende des normalen Bereichs. Der Endpunkt läßt sich bestimmen, indem
Ablesungen vorgenommen werden, bis keine weiteren Anderungen eintreten, oder durch
Ausführen einfacher Berechnungen auf der Grundlage zweier oder mehrerer Ablesungen,
wenn die Reaktion im wesentlichen vollständig ist, d.h., zu etwa 70 bis 90% vollständig.
-
Zum Beispiel kann eine Testvorrichtung zur Messung von Glucose im Blut
Glucoseoxidase, eine Substanz mit Peroxidase-Wirkung und einen oxidierbaren Indikator als
Bestandteile enthalten. In ähnlicher Weise kann eine Testvorrichtung zur Messung von
Galactose im Blut Galactoseoxidase, eine Substanz mit Peroxidase-Wirkung und einen
oxidierbaren Indikator enthalten. Soll der Alkoholgehalt im Blut bestimmt werden, so
kann eine Testvorrichtung mit einem Reagenziensystem imprägniert werden, das
Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Diaphorase und ein Tetrazolium-
Salz umfaßt.
-
Zur Erleichterung des Nachweisverfahrens kann die nachweisbare Spezies der
Reagensmatrixschicht variiert werden. Die Begriffe "nachweisbare chemische Spezies" und
"nachweisbare Spezies" beziehen sich auf eine chemische Spezies, die ein erfaßbares
Signal oder eine Veränderung ergibt, das bzw. die direkt oder indirekt in Beziehung steht
zur Konzentration eines gewunschten Analyten in der Reagensmatrixschicht oder eines
Reaktions- oder Zersetzungsprodukts des Analyten, z.B. der optischen Dichte einer
gebildeten Farbe, der fluorimetrischen Dichte, der elektromagnetischen (einschließlich
Strahlung) Intensität oder einer Änderung dieser Dichten oder Intensitäten. Vorzugsweise
ist die nachweisbare Spezies optisch nachweisbar, z.B. visuell nachweisbar oder mit Hilfe
der Spektrophotometrie nachweisbar.
-
Die bevorzugten Farbstoffe oder anderen nachweisbaren chemischen Spezies sind für
unterschiedliche Assays verschieden und sind Fachleuten wohlbekannt. Beispielhaft für
Farbstoffe, die zur Verwendung bei einem Assay auf Glucose in einer Körperflüssigkeit
geeignet sind, sind 3,5-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB),
3-Methyl-2-benzothiazolonhydrazon-hydrochlorid (MBTH) und/oder Tetramethylbenzidin (TMB).
-
Ein bevorzugter Farbstoff ist DMAB, das ein Absorptionsmaximum bei 570-600 nm zeigt.
Zwar ist der Farbstoff visuell nachweisbar, doch wird zur Bestimmung des gebildeten
Farbstoffs vorzugsweise ein Gerät wie etwa ein Spektrophotometer verwendet.
Insbesondere wurde nun geftinden, daß, wenn die Remission bei einer Wellenlänge bestimmt
wird, die größer ist als der Farbstoff-Peak, die Auswirkung der roten Blutkörperchen
minimiert wird, insbesondere bei niedrigen Glucose-Konzentrationen. Der Farbstoff wird
bei 600-620 nm bestimmt, vorzugsweise bei etwa 610 nm. Dieser bevorzugte Farbstoff
und die bevorzugte Wellenlänge zur Bestimmung bewirken, daß die Störung bei
Vorhandensein roter Blutkörperchen an der Dosierfläche der Reagensmatrixschicht minimiert
wird, wie in Beispiel 7 ausführlich beschrieben.
-
In den meisten Fällen ist das Mittel zum Messen eines speziellen Analyten nicht auf einen
Satz Reagenzien beschränkt, und es sind mehrere geeignete Reagenzien bekannt. Es kann
jedes chemische Verfahren angewandt werden, solange die Reagenzien in der
Reagensmatrixschicht stabil sind. Des weiteren kann eine Substanz zugesetzt werden, um die
Reagenszusammensetzung auf einen konstanten pH zu puffern, eine Substanz für ihre
Stabilisierung, eine hydrophile Substanz zur Unterstützung der Absorption der Testprobe in die
Reagensmatrixschicht etc.. Derartige Abwandlungen sind Fachleuten wohlbekannt.
-
Zu den geeigneten Puffersubstanzen gehören physiologische Puffer, die den pH zwischen
6,5 und 8,5 halten, vorzugsweise zwischen 7 und 8, etwa Tris-Puffer, HEPES-Puffer und
dergleichen. Zu den beispielhaften Stabilisatoren gehören Proteinsubstanzen wie etwa
Rinderserumalbumin und Casein, Akazin, PVP und EDTA. Zu den hydrophilen
Substanzen, die die Absorption der Testprobe unterstützen, gehören Tenside, vorzugsweise
fluorierte Tenside.
-
Zur Herstellung der Reagensmatrixschicht werden die Reagenzien und Additive in Wasser
gelöst, um eine wäßrige Lösung zu bilden. Die Reagensmatrixschicht wird in die Lösung
eingetaucht und getrocknet. Vor dem Trocknen kann die Reagensmatrixschicht zur
Verkürzung der Trockenzeit ausgedrückt werden. Bei Verwendung von wasserunlöslichen
oder im wesentlichen wasserunlöslichen Reagenzien werden die Reagenzien in einem
geeigneten Lösungsmittel gelöst, und die Reagensmatrixschicht wird entweder nach oder
vorzugsweise vor dem Eintauchen in die wäßrige Lösung und dem Trockenschritt in das
Lösungsmittel eingetaucht. Um geeignet zu sein, muß ein Lösungsmittel die Reagenzien
lösen und die Reagensmatrixschicht muß in dem Lösungsmittel stabil sein. Reagenzien
wie etwa Celluloseacetat, das die gleichmäßige Benetzung der Reagensmatrixschicht und
die Kontrolle der Porengröße erleichtert, sind unlöslich in Wasser, aber löslich in Eisessig
sowie einer Mischung aus Eisessig und Isopropanol. Bei Verwendung des Farbstoffpaares
DMAB und MBTH wird DMAB vorzugsweise im nichtwäßrigen Lösungsrnittel gelöst,
um die Reaktion von DMAB und MBTH in Lösung zu unterbinden. Die beschichtete
Reagensmatrixschicht kann zur Herstellung der Testvorrichtungen dieser Erfindung in
kleinere Einheiten geschnitten oder anderweitig verarbeitet werden.
-
Zur Herstellung der Vorrichtung können die Öffnungen in den bedeckenden Schichten
zum Absorbieren und Sperren gebildet werden entweder bevor oder nachdem (aber
normalerweise bevor) die absorbierende und die Sperrschicht auf die Reagensmatrixschicht
aufgebracht oder mit dieser zusammengefügt worden sind. Die Schichten können
zusammenlaminiert werden, durch chemische Abscheidung aufgetragen werden oder in
einem umschließenden Halter enthalten sein. Bei einer besonders bevorzugten
Ausführungsform umfaßt die Sperrschicht ein doppelseitiges Band, welches die Reagensmatrixschicht,
die absorbierende Schicht und die Trägerschicht zusammenlaminiert.
-
Die globale Struktur und Funktion der Elemente der Testvorrichtung sind nun
beschrieben. Zur Erläuterung sollen die Vorrichtung und die Verfahren zur Herstellung und
Verwendung der Vorrichtung für einen Glucose-Assay beschrieben werden.
-
Bei einem Assay auf Glucose werden ein Enzymsystem mit Glucoseoxidase-Wirkung
zusammen mit einer Substanz mit Peroxidase-Wirkung sowie eine Substanz bereitgestellt,
die auf Reaktion mit einer oder mehreren der Verbindungen, die bei der Einwirkung der
Enzyme auf Glucose-haltige Flüssigkeiten gebildet werden, eine Farbänderung erfährt.
Derartige Reagenziensysteme sind wohlbekannt und im Handel erhältlich.
-
Zur Messung von Glucose wird ein Tropfen Blut aus dem Ohrläppchen, der Fingerspitze
oder anderer Herkunft auf die Dosierfläche der Reagensmatrixschicht aufgebracht. Die
Glucose in der Blutprobe wird durch die Glucoseoxidase in Gluconsäure überführt. Der
durch diese Reaktion freigesetzte Wasserstoff verbindet sich enzymatisch mit
atmosphärischem Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid. In Gegenwart einer Peroxidase
oxidiert Wasserstoffperoxid den Indikator unter Bildung einer nachweisbaren Spezies.
Vom Zeitpunkt der Dosierung der Testprobe ab wird die nachweisbare Spezies im
allgemeinen in zwei Minuten oder weniger, vorzugsweise in drei Sekunden oder weniger
gebildet. Wird die nachweisbare Spezies visuell bestimmt, so wird die Konzentration an
Glucose errechnet durch Vergleichen der gebildeten Farbe mit einer Standardfarbtabelle,
die separat erstellt wird.
-
Soll zur optischen Bestimmung der Glucose-Konzentration eine elektromechanische
Vorrichtung verwendet werden, so wird die Remission der erzeugten Farbe bei einer
vorbestimmten
Wellenlänge mit Hilfe eines geeigneten Detektors, etwa einer
Lichtdetektordiode, gemessen. Vorzugsweise wird die Bestimmungsfläche mit Hilfe einer Lichtquelle
mit einer vorbestimmten, spezifischen Wellenlänge beleuchtet. Die Konzentration an
Glucose wird bestimmt unter Bezugnahme
aufkonzentrations/Remissions-Standardwerte, die separat bestimmt werden. Die Herstellung und Verwendung einer
beispielhaften Glucose-Testvorrichtung wird in den Beispielen ausführlich beschrieben.
-
Eine Vorrichtung, die für einen Assay auf Alkohol in einer Testprobe verwendet werden
soll, umfaßt aufeinanderfolgend eine absorbierende Schicht, eine Sperrschicht und eine
Reagensmatrixschicht, enthaltend ein in Gegenwart von Alkohol eine nachweisbare
Spezies erzeugendes chemisches System, etwa Alkoholoxidase, Peroxidase und einen
geeigneten Farbstoff. Öffnungen durch die absorbierende Schicht und die Sperrschicht sind
vorhanden. Eine Testprobe, etwa ein Tropfen Vollblut, Serum, Urin oder einer anderen
Körperflüssigkeit wird durch die Öffnungen auf die Dosierfläche der
Reagensmatrixschicht gebracht. Das Vorhandensein und die Menge an nachweisbarer Spezies werden
bestimmt entsprechend der verwendeten nachweisbaren Spezies. Ist die nachweisbare
Spezies ein Farbstoff, etwa Tetramethylbenzidin (TMB), so kann die Bestimmung visuell,
mit einem Spektrophotometer oder mit einer Lichtdetektordiode oder einem anderen
Lichtsensor erfolgen.
-
Die Vorrichtung für den Alkohol-Assay ergibt einen schnellen, quantitativen Assay, ohne
daß die auf die Dosierfläche gebrachte Probe genau gemessen werden muß. Eine kleine
Probe, z.B. ein Tropfen Vollblut, ist ausreichend, um Ergebnisse zu liefern. Die
Vorrichtung kann als eine Einheit zum einmaligen Gebrauch hergestellt sein. Bei Verwendung
eines farbechten Farbstoffs kann die Vorrichtung als Beleg für den Assay aufbewahrt
werden. Die Vorrichtung ist nicht sonderlich temperaturempfindlich und kann unter vielen
verschiedenen Umgebungsbedingungen verwendet werden, z.B. bei Straßenkontrollen auf
Alkoholgenuß beim Führen eines Kraftfahrzeugs. Abgesehen von den Enzymen braucht
sich die Vorrichtung nicht von einer Glucose-Testvorrichtung zu unterscheiden. Die
Vorrichtung
kann auch eine Substanz enthalten, die Alkohol stabilisiert, etwa Zucker, z.B.
Mannit.
-
Eine Vorrichtung, die für einen Assay auf Cholesterin in einer Testprobe verwendet
werden soll, umfaßt aufeinanderfolgend eine absorbierende Schicht, eine Sperrschicht und
eine Reagensmatrixschicht, enthaltend ein in Gegenwart von Cholesterin eine
nachweisbare Spezies erzeugendes chemisches System, etwa Cholesterinesterase,
Cholesterinoxidase und Peroxidase mit einem geeigneten Farbstoff Öffnungen durch die
absorbierende Schicht und die Sperrschicht sind vorhanden. Eine Testprobe, etwa ein Tropfen
Vollblut, Serum oder Plasma wird durch die Öffnungen auf die Dosierfläche der
Reagensmatrixschicht gebracht. Das Vorhandensein und die Menge an nachweisbarer Spezies
werden bestimmt entsprechend der verwendeten nachweisbaren Spezies. Ist die
nachweisbare Spezies ein Farbstoff wie etwa TMB, so kann die Bestimmung visuell oder mit einem
Spektrophotometer erfolgen.
-
Die Vorrichtung kann zur fortlaufenden Überwachung des Cholesterin-Spiegels eines
Patienten in einem Heimtest zum Einmalgebrauch verwendet werden. Die Vorrichtung für
den Cholesterin-Assay ergibt einen schnellen, quantitativen Assay, ohne daß die auf die
Dosierfläche gebrachte Probe genau gemessen werden muß. Eine kleine Probe, z.B. ein
Tropfen Blut, ist ausreichend. Die Gebrauchsanleitung ist einfach, und es bedarflediglich
minimaler Übung für die korrekte Anwendung der Vorrichtung. Die Vorrichtung kann
ähnlich sein wie die Glucose- oder Alkohol-Testvorrichtungen, außer daß die Enzyme
andere sind. Zudem wird der Vorrichtung eine Substanz beigegeben, die Cholesterin
löslich macht. Zu den brauchbaren Lösungsvermittlern gehören Tenside, vorzugsweise
Methylglucamide wie etwa MEGA 8 (Behring, La Jolla, Californien, USA).
-
Die Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden speziellen, aber nicht einschränkenden
Beispiele veranschaulicht. Sofern nicht abweichend vermerkt, sind Temperaturen in Grad
Celsius und Prozente als Gewichtsprozente angegeben. Beispiele, die in vorteilhafter
Weise auf die Praxis hierin zugeschnitten sind, werden in der Gegenwartsform
dargeboten, und Beispiele, die bereits früher auf die Praxis zugeschnittene Laborexperimente
darstellen, werden in der Vergangenheitsform dargeboten.
BEISPIEL 1
Herstellung einer Glucose-Reagensmatrixschicht
-
Die Lösungen A und B wurden nach folgender Vorschrift hergestellt.
Lösung A:
-
Unter einem Abzug werden 600 ml Eisessig in einen Behälter eingemessen. Es werden
6,0 g Celluloseacetat abgewogen. Unter konstantem Rühren wird das Celluloseacetat dem
Eisessig langsam zugesetzt. Man vermeide Klumpenbildung. Es wird bis zur Auflösung
gerührt. 36 g DMAB werden abgewogen und zugegeben. Es wird bis zur Auflösung
gerührt.
-
Es werden 600 ml Isopropanol abgemessen und der Lösung unter Rühren tropfenweise
zugesetzt. Bei zu schneller Zugabe fällt das Celluloseacetat aus. Eine örtliche Trübung an
der Stelle der Isopropanol-Zugabe ist ein Anzeichen entweder für zu schnelle Zugabe
oder für ungenügendes Mischen.
-
Es werden 1,2 ml Tensid FC-129 (3M, St. Paul, Minnesota, USA) zugesetzt. Es wird 3
bis 7 Minuten lang gemischt.
Lösung B:
Verdünnungsmittel
-
Vor der Verwendung werden Akazin und PVP K-30 (GAF, New York, New York,
USA) wenigstens 4 Stunden lang auf ungefähr 90ºC erhitzt. Vor dem Wägen wird in
einem Exsikkator gekühlt.
-
Es werden ungefähr 0,8 1 destilliertes Wasser einem Behälter zugegeben, der einen
Rübrstab aufweist. 2,75 g EDTA-dinatrium werden abgewogen und zugesetzt; es wird bis
zur Auflösung gerührt. 10,56 g Citronensäure und 13,32 g Tris (0,1 M) werden
abgewogen und zugesetzt. Es wird bis zur Auflösung gerührt.
-
33,00 g des getrockneten Akazins werden abgewogen und der Lösung langsam zugesetzt.
Man vermeide Klumpenbildung, die längere Zeit zur Auflösung in Anspruch nimmt. Es
wird bis zur Auflösung gerührt.
-
33,00 g des getrockneten PVP K-30 werden abgewogen und der Lösung unter Rühren
bis zur Auflösung zugesetzt.
-
Der pH wird mit 5N NaOH (nach Bedart, ungefähr 3 ml) auf 5,0 ± 0,1 eingestellt.
-
Es wird destilliertes Wasser zugegeben, um das Endvolumen auf 11 zu bringen. Der pH
wird überprüft. Die Lösung wird durch eine Sartorius 0,45 µ-Filterkapsel filtriert.
Enzymlösung:
-
909 ml des Verdünnungsmittels Lösung B werden in einen Behälter eingemessen; man
läßt auf Raumtemperatur kommen.
-
Es werden 90,9 ml destilliertes Wasser in einen Behälter eingemessen. Das destillierte
Wasser wird mit 500 000 U Meerrettichperoxidase und 500 000 U Glucoseoxidase
versetzt; es wird bis zur Auflösung gemischt.
-
Das Verdünnungsmittel Lösung B wird mit 8 g MBTH versetzt; es wird bis zur
Auflösung gerührt.
-
Die Lösung von Enzym/destilliertem Wasser wird in die Lösung aus Verdünnungsmittel
Lösung B/MTBH eingemischt. Die Lösung wird mehrmals von einem Behälter in den
anderen überführt, um sicherzustellen, daß die Enzymlösung aus dem Behälter gespült ist.
Es wird 5-15 Minuten lang leicht gemischt, bis die Lösung homogen ist.
-
Eine asymmetrische Polysulfon-N4embran (BTSTM -Filter, Futrite, San Diego, Californien,
USA) wurde in Lösung A eingetaucht. Die Membran wurde zwischen Rollen leicht
abgedrückt, um überschüssige Lösung zu beseitigen und das Trocknen zu unterstützen, und
bis zur Verdampfting des Lösungsmittels luftgetrocknet. Die getrocknete Membran wurde
dann in Lösung B eingetaucht, zwischen Rollen leicht abgedrückt, um überschüssige
Lösung zu beseitigen und das Trocknen zu unterstützen, und bis zur Verdampfung des
Lösungsmittels luftgetrocknet. Die Trockenzeiten betrugen ungefähr zehn Minuten bei 50
ºC.
BEISPIEL 2
Zusammenbau der Testvorrichtung
-
Ein Band mit Klebstoff4 15 von 3M wurde in Streifen von 1,27 cm (0,5 inch) geschnitten
und an ein absorbierendes Papier angeklebt (Whatman #3 Papier, Whatman, England).
Längs des Bandes wurden in Abständen von 1 inch kreislörmige Öffnungen mit einem
Durchmesser von ungefähr 0,47 cm (0,187 inch) durch die Bandschicht und die
absorbierende
Schicht erzeugt. Eine Reagensmatrixschicht gemäß Beispiel 1, die auf einen
Durchmesser von 0,635 cm (0,250 inch) beschnitten worden war, wurde an der
kreisförmigen Öffnung ausgerichtet und auf die freiliegende Klebefläche aufgebracht. Ein
Kunststoffstreifen von 1,27 cm (0,5 inch) Breite und einer Reihe kreisförmiger Öffnungen mit
einem Durchmesser von ungefähr 0,47 cm (0,187 inch) in Abständen von 2,54 cm (1 inch)
längs des Kunststoffstreifens wurde daran ausgerichtet und über der Reagensmatrixschicht
auf den Klebeband/Membran-Streifen laminiert. Der Streifen wurde dann in Abschnitte
von 2,54 cm (1 inch) geschnitten, wobei jeder Abschnitt eine Probenauftragsöffiiung und
eine Farbstoff-Bestimmungsöffnung in der Mitte gegenüberliegender Seiten aufwies. Das
Sättigungsvolumen der Reagensmatrixschicht beträgt ungefähr 3 µl.
BEISPIEL 3
Prüfüng einer Blutprobe auf Glucose
-
Ein Tropfen Blut aus einer Fingerpunktur wurde auf die Testvorrichtung von Beispiel 2
an der Öffnung durch die Sperrschicht aufgebracht. Die Testvorrichtung wurde
wenigstens eine Sekunde, vorzugsweise eine Minute lang stehengelassen. Die nachweisbare
Spezies wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 610 nm bestimmt. Das
spektrophotometrische Resultat wurde mit einer Standardkurve verglichen, um die Menge
an Glucose in der Blutprobe zu bestimmen.
BEISPIEL 4
Reagensmatrixschicht flir den Alkoholnachweis
-
Mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 1 wird eine Alkoholnachweismembran gebildet,
wobei die Glucoseoxidase von Lösung B durch 30 000 - 50 000 U Alkoholoxidase ersetzt
wird.
-
Unter Verwendung der Alkoholnachweismembran wird eine Testvorrichtung gemäß dem
Verfahren von Beispiel 2 hergestellt, wobei die Membran von Beispiel 1 durch die für den
Alkoholnachweis ersetzt wird. Ein Tropfen Vollblut wird auf die Testvorrichtung an der
Dosiertläche aufgebracht. Die Farbstoffbildung wird unter Verwendung eines
Spektrophotometers bei 610 nm an der Bestimmungsfläche ausgewertet und mit einem Standard
verglichen, um die Menge an Alkohol in der Blutprobe zu ermitteln.
BEISPIEL 5
Reagensmatrixschicht für den Cholesterin-Nachweis
-
Mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 1 wird eine Cholesterin-Nachweismembran
gebildet, wobei die Glucoseoxidase von Lösung B durch 100 - 200 U Cholesterinesterase und
100 - 200 U Cholesterinoxidase ersetzt wird, und die Peroxidase von Lösung B durch
1000 U Peroxidase ersetzt wird.
-
Es wird eine Testvorrichtung gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt, wobei die
Membran von Beispiel 1 durch die für den Cholesterin-Nachweis ersetzt wird. Ein
Tropfen Vollblut wird auf die Testvorrichtung an der freiliegenden Dosierfläche
aufgebracht. Die Farbstoffbildung wird visuell an der Bestimmungsfläche ausgewertet und mit
einem Standard verglichen, um die Menge an Cholesterin in der Blutprobe zu ermitteln.
BEISPIEL 6
Prüfung einer Urinprobe auf Glucose
-
Eine Testvorrichtung gemäß Beispiel 2 wird aufgebaut. Ein Tropfen Urin wird auf die
fleiliegende Dosierfläche der Testvorrichtung aufgebracht. Die Testvorrichtung wird
wenigstens eine Sekunde lang stehengelassen. Die Farbe wird bestimmt und mit einer
Standardkurve verglichen, um die Menge an Glucose in der Urinprobe zu bestimmen.
BEISPIEL 7
Hämatokrit-Effekt
-
Unerwarteterweise wurde entdeckt, daß das Signal/Rausch-Verhältnis maximiert und der
variable Hämatokrit-Effekt minimiert wird, wenn die Remissionsbestimmung unter
Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 610 nm durchgeführt wird.
-
Berechnete Glucose wurde unter Verwendung einer gemäß Beispiel 2 hergestellten
Assay-Vorrichtung bestimmt. Die tatsächlichen Glucose-Werte wurden unter
Verwendung eines YSI-Instruments Modell 21 (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs,
Ohio, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
-
Das Verhältnis von berechneter Glucose zu tatsächlicher Glucose ist in Tabelle A gezeigt.
In Tabelle A gibt "Ber.Glu." die Menge an Glucose an, wie sie mit einer Vorrichtung
dieser Erfindung bestimmt wurde; "Std.Glu." gibt die tatsächliche Menge Glucose nach
der Standardbestimmungsmethode an; und "Ber./Std." gibt das Verhältnis des mit Hilfe
einer erfindungsgemaßen Vorrichtung bestimmten Werts der Glucose-Konzentration im
Vergleich zur Standardbestimmung an. Ein Verhältnis von 1,0 spiegelt die Überein-
Stimmung beider Bestimmungsmethoden wider. Ein Verhältnis von weniger als 1,0
bedeutet, daß der tatsächliche Glucose-Wert durch die erfindungsgemäße Vorrichtung zu
niedrig wiedergegeben wird. Ein Verhältnis von mehr als 1,0 spiegelt eine zu hohe
Wiedergabe des Glucose-Werts wider.
TABELLE A
Niedrige Glucose-Gehalte (50 mg/dl Glucose)
TABELLE A (Fortsetzung)
Hohe Glucose-Gehalte (350 mg/dl Glucose)
-
Wie in der Tabelle gezeigt, wird Glucose bei niedrigen Glucose-Konzentrationen und
niedrigen Hämatokrit-Gehalten eher zu niedrig dargestellt. Bei niedrigen Glucose-
Gehalten und hohen Hämatokrit-Gehalten wird Glucose eher zu hoch dargestellt.
Überraschenderweise wurde diese Schwankung minimiert, wenn die Remission bei etwa
610 nm bestimmt wurde.
-
Bei allen Hämatokrit-Gehalten war die Schwahkungsbreite bei hohen Glucose-Gehalten
erheblich geringer als bei niedrigen Glucose-Gehalten.
-
Durch die Bestimmung der Farbstoff-Spezies bei etwa 610 nm wurde die Schwankung bei
allen Hämatokrit-Gehalten sowohl bei hohen als auch bei niedrigen
Glucose-Konzentrationen minimiert.