JP3516012B2 - 微量の蛋白質を測定するための組成物 - Google Patents
微量の蛋白質を測定するための組成物Info
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
- G01N33/683—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving metal ions
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、低濃度〜微量の蛋
白を含む液体試料（例えば尿）中の蛋白の存在を示した
り、定量するための組成物に関する。
白を含む液体試料（例えば尿）中の蛋白の存在を示した
り、定量するための組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトがアルブミン等に代表される蛋白
を、尿中に過剰に排泄しているかどうかを判定すること
は、臨床的に重要である。健常者、即ち腎臓が正常に機
能している場合においても、ごく僅かな量の蛋白を排泄
しており、その量は一日当たりで５０〜１００ｍｇにも
なる。さらには、運動後や体位によっても排泄量が増え
ることが知られており、一般的に生理的蛋白尿と呼ばれ
ている。電気泳動法による分析では、健常者において尿
中に排泄される蛋白の約６割は血漿由来のものであり、
そのうち分子量約６７０００のアルブミンが約７〜８割
を占めるとされている。
を、尿中に過剰に排泄しているかどうかを判定すること
は、臨床的に重要である。健常者、即ち腎臓が正常に機
能している場合においても、ごく僅かな量の蛋白を排泄
しており、その量は一日当たりで５０〜１００ｍｇにも
なる。さらには、運動後や体位によっても排泄量が増え
ることが知られており、一般的に生理的蛋白尿と呼ばれ
ている。電気泳動法による分析では、健常者において尿
中に排泄される蛋白の約６割は血漿由来のものであり、
そのうち分子量約６７０００のアルブミンが約７〜８割
を占めるとされている。
【０００３】生理的蛋白尿に対して、病的な蛋白尿は腎
前性、腎性、腎後性に分類され、腎性はさらに糸球体由
来、尿細管由来等に細分類される。腎前性蛋白尿は特定
の臓器組織の機能変化や障害により血中に増加した蛋白
が尿中に漏洩したものであり、このような特定成分の検
出は病態診断に直結する。代表的なものに腫瘍マーカー
であるベンスジョーンズ蛋白がある。腎性蛋白尿のうち
アルブミン等に代表される糸球体由来蛋白尿は腎糸球体
基底膜の濾過機能低下、β２−マイクログロブリンやα
１−マイクログロブリンに代表される尿細管由来蛋白は
腎尿細管再吸収能低下にそれぞれ起因するものであり、
共に腎機能低下並びに腎障害の程度を把握する為の優れ
た指標となる。腎後性蛋白尿は腎盂、尿管、膀胱、尿
道、前立腺等における出血、結石、腫瘍等に伴って発現
する蛋白尿であり、上記局所疾患の診断に利用される。
前性、腎性、腎後性に分類され、腎性はさらに糸球体由
来、尿細管由来等に細分類される。腎前性蛋白尿は特定
の臓器組織の機能変化や障害により血中に増加した蛋白
が尿中に漏洩したものであり、このような特定成分の検
出は病態診断に直結する。代表的なものに腫瘍マーカー
であるベンスジョーンズ蛋白がある。腎性蛋白尿のうち
アルブミン等に代表される糸球体由来蛋白尿は腎糸球体
基底膜の濾過機能低下、β２−マイクログロブリンやα
１−マイクログロブリンに代表される尿細管由来蛋白は
腎尿細管再吸収能低下にそれぞれ起因するものであり、
共に腎機能低下並びに腎障害の程度を把握する為の優れ
た指標となる。腎後性蛋白尿は腎盂、尿管、膀胱、尿
道、前立腺等における出血、結石、腫瘍等に伴って発現
する蛋白尿であり、上記局所疾患の診断に利用される。
【０００４】蛋白尿の数ある測定法の中で、歴史も古
く、現在でもスクリーニング検査として確立されている
手法に、ｐＨ指示薬であるテトラブロムフェノールブル
ー（ＴＢＰＢ）を用いた蛋白誤差法がある。ＴＢＰＢは
ｐＨ２〜３の溶液中では黄色を、ｐＨ４以上では青色を
呈色するが、溶液中に蛋白が存在するとｐＨ３において
も青色となる。この現象を利用して、濾紙等の試験紙に
ＴＢＰＢをｐＨ３の緩衝剤と共に含ませておけば、尿中
におけるアルブミン等の蛋白の存在量に応じて青色の色
調が変化するので、この色調から蛋白尿の程度を読みと
る事が出来る。
く、現在でもスクリーニング検査として確立されている
手法に、ｐＨ指示薬であるテトラブロムフェノールブル
ー（ＴＢＰＢ）を用いた蛋白誤差法がある。ＴＢＰＢは
ｐＨ２〜３の溶液中では黄色を、ｐＨ４以上では青色を
呈色するが、溶液中に蛋白が存在するとｐＨ３において
も青色となる。この現象を利用して、濾紙等の試験紙に
ＴＢＰＢをｐＨ３の緩衝剤と共に含ませておけば、尿中
におけるアルブミン等の蛋白の存在量に応じて青色の色
調が変化するので、この色調から蛋白尿の程度を読みと
る事が出来る。
【０００５】しかしながら、この蛋白誤差法では通常１
０〜１５ｍｇ／ｄｌ以下の蛋白を検出する事が出来ず、
試験紙法である以上、その検出は定量的な数値ではなく
−〜±〜＋等、定性的に出力される。また、検出出来る
蛋白は概ねアルブミンのみであり、血漿蛋白の約４割を
占めるグロブリンや、上述したベンスジョーンズ蛋白等
は検出出来ない。
０〜１５ｍｇ／ｄｌ以下の蛋白を検出する事が出来ず、
試験紙法である以上、その検出は定量的な数値ではなく
−〜±〜＋等、定性的に出力される。また、検出出来る
蛋白は概ねアルブミンのみであり、血漿蛋白の約４割を
占めるグロブリンや、上述したベンスジョーンズ蛋白等
は検出出来ない。
【０００６】このような定性的な測定法に対して、蛋白
量そのものを定量的に検出出来る方法も、数多くの方法
が知られている。約２０年前から、Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ
−Ｃｌａｒｋ法に代表される比濁法が主たる日常検査法
として行われてきたが、蛋白誤差法と同様にアルブミン
以外の蛋白には反応しにくく、用手法である為に測定に
手間がかかるという問題点を有していた。
量そのものを定量的に検出出来る方法も、数多くの方法
が知られている。約２０年前から、Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ
−Ｃｌａｒｋ法に代表される比濁法が主たる日常検査法
として行われてきたが、蛋白誤差法と同様にアルブミン
以外の蛋白には反応しにくく、用手法である為に測定に
手間がかかるという問題点を有していた。
【０００７】現在、最も多く用いられている定量法とし
て、ピロガロールレッドに代表される色素とモリブデン
等の金属との錯体を用いた色素結合法があり、用手法の
みならず自動分析装置への搭載によって、高精度な測定
結果が得られるようになった。
て、ピロガロールレッドに代表される色素とモリブデン
等の金属との錯体を用いた色素結合法があり、用手法の
みならず自動分析装置への搭載によって、高精度な測定
結果が得られるようになった。
【０００８】特公平４−５３２６５号には、モリブデン
と錯体を形成し、さらに蛋白の存在で波長がシフトする
色素を使用した微量蛋白比色定量法が示されている。本
発明の基本的原理は公知であるが、試験試料中にモリブ
デンと結合する物質が含まれていると、正常尿では負の
値になり、純水を測定した場合よりも低い吸光度となっ
てしまう。
と錯体を形成し、さらに蛋白の存在で波長がシフトする
色素を使用した微量蛋白比色定量法が示されている。本
発明の基本的原理は公知であるが、試験試料中にモリブ
デンと結合する物質が含まれていると、正常尿では負の
値になり、純水を測定した場合よりも低い吸光度となっ
てしまう。
【０００９】その点特公平４−５３２６５号は、阻害物
質から試薬中のモリブデンをカバーするために試薬組成
中に予めモリブデンと結合するキレート剤を処方した
り、モリブデンと結合してしまうクエン酸等の阻害物質
と結合する金属イオンを処方する等の工夫をしている。
質から試薬中のモリブデンをカバーするために試薬組成
中に予めモリブデンと結合するキレート剤を処方した
り、モリブデンと結合してしまうクエン酸等の阻害物質
と結合する金属イオンを処方する等の工夫をしている。
【００１０】また、特公平６−７０６３２号には、タン
グステンと錯体を形成し、さらに蛋白の存在で波長がシ
フトするポリヒドロキシベンゼンスルホンフタレインタ
イプの色素及び／又はポリヒドロキシベンゼンフタレイ
ンタイプの色素、並びに、組成物を酸性のｐＨに保持す
る緩衝剤を含むことを特徴とする微量蛋白比色定量法が
示されている。
グステンと錯体を形成し、さらに蛋白の存在で波長がシ
フトするポリヒドロキシベンゼンスルホンフタレインタ
イプの色素及び／又はポリヒドロキシベンゼンフタレイ
ンタイプの色素、並びに、組成物を酸性のｐＨに保持す
る緩衝剤を含むことを特徴とする微量蛋白比色定量法が
示されている。
【００１１】また、出版物“Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ
−Ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ（ＶＩ）Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎ
ｄＰｒｏｔｅｉｎ”、Ｙ．フジタ、Ｉ．モリ及びＳ．キ
タノ、分析化学、３２、ｐｐ．Ｅ３７９−Ｅ３８６（１
９８３）には、蛋白誤差現象を利用した微量蛋白測定方
法として使用できる金属と色素のスクリーニング実験の
結果が示されている。色素はポリヒドロキシベンゼンス
ルホンフタレインタイプの色素又はポリヒドロキシベン
ゼンフタレインタイプの色素であるが、金属の種類とし
ては、モリブデン（ＶＩ）、ビスマス（ＩＩＩ）、アル
ミニウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、ウラン（ＶＩ）、
ジルコニウム（ＩＶ）、アンチモン（ＩＩＩ）、タング
ステン（ＶＩ）、セリウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＶ）、
亜鉛（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、水銀（ＩＩ）、銀
（Ｉ）、カドミウム（ＩＩ）がスクリーニングの対象と
して挙げられている。
ｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ
−Ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ（ＶＩ）Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎ
ｄＰｒｏｔｅｉｎ”、Ｙ．フジタ、Ｉ．モリ及びＳ．キ
タノ、分析化学、３２、ｐｐ．Ｅ３７９−Ｅ３８６（１
９８３）には、蛋白誤差現象を利用した微量蛋白測定方
法として使用できる金属と色素のスクリーニング実験の
結果が示されている。色素はポリヒドロキシベンゼンス
ルホンフタレインタイプの色素又はポリヒドロキシベン
ゼンフタレインタイプの色素であるが、金属の種類とし
ては、モリブデン（ＶＩ）、ビスマス（ＩＩＩ）、アル
ミニウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、ウラン（ＶＩ）、
ジルコニウム（ＩＶ）、アンチモン（ＩＩＩ）、タング
ステン（ＶＩ）、セリウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＶ）、
亜鉛（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、水銀（ＩＩ）、銀
（Ｉ）、カドミウム（ＩＩ）がスクリーニングの対象と
して挙げられている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
になかった手段で尿といった液体試料中の微量蛋白を定
量測定することにある。
になかった手段で尿といった液体試料中の微量蛋白を定
量測定することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は、インジウム又はインジウム化合物と、イ
ンジウムと錯体を形成しうるポリヒドロキシベンゼンス
ルホンフタレインタイプの色素及び／又はポリヒドロキ
シベンゼンフタレインタイプの色素と、反応系を酸性の
ｐＨに保持する緩衝剤を含むことを特徴とし、蛋白質含
有液体試料と接触することによって、試料中の蛋白質の
存在及び／又は濃度を示すのに十分な色変化を示しうる
組成物である。
に、本発明は、インジウム又はインジウム化合物と、イ
ンジウムと錯体を形成しうるポリヒドロキシベンゼンス
ルホンフタレインタイプの色素及び／又はポリヒドロキ
シベンゼンフタレインタイプの色素と、反応系を酸性の
ｐＨに保持する緩衝剤を含むことを特徴とし、蛋白質含
有液体試料と接触することによって、試料中の蛋白質の
存在及び／又は濃度を示すのに十分な色変化を示しうる
組成物である。
【００１４】本発明は、ブロモピロガロールレッドやキ
シレノールオレンジといったポリヒドロキシベンゼンス
ルホンフタレインタイプの色素又はポリヒドロキシベン
ゼンフタレインタイプの色素がインジウムと錯体を形成
し、この錯体が蛋白と結合して波長がシフトする現象を
利用するものである。本発明で得られる組成物は、液系
試験試薬としても使用できるし、簡便な乾式試験片にも
加工できる。
シレノールオレンジといったポリヒドロキシベンゼンス
ルホンフタレインタイプの色素又はポリヒドロキシベン
ゼンフタレインタイプの色素がインジウムと錯体を形成
し、この錯体が蛋白と結合して波長がシフトする現象を
利用するものである。本発明で得られる組成物は、液系
試験試薬としても使用できるし、簡便な乾式試験片にも
加工できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明は、新しく改良されたイン
ジウム化合物／色素の錯体を含む指示試薬組成物を用い
ることにより、測定試料液中の低濃度から微量の低い蛋
白レベルを測定するためにその蛋白レベル間の蛋白に対
する十分な感度と、視覚的に十分判定できる色調変化が
可能となる。具体的には、少量から微量の蛋白を測定す
ることができ、尿中の０ｍｇ／ｄｌから約２０００ｍｇ
／ｄｌ、特に０ｍｇ／ｄｌから約３０ｍｇ／ｄｌの間の
蛋白レベルを定量的に測定することができる。さらに本
発明の試薬組成物により、尿中の蛋白濃度が０ｍｇ／ｄ
ｌから約３０ｍｇ／ｄｌの間、また０ｍｇ／ｄｌから約
５ｍｇ／ｄｌの間、約５ｍｇ／ｄｌから約１０ｍｇ／ｄ
ｌの間のような低濃度から微量の蛋白の検出および測定
が可能である。
ジウム化合物／色素の錯体を含む指示試薬組成物を用い
ることにより、測定試料液中の低濃度から微量の低い蛋
白レベルを測定するためにその蛋白レベル間の蛋白に対
する十分な感度と、視覚的に十分判定できる色調変化が
可能となる。具体的には、少量から微量の蛋白を測定す
ることができ、尿中の０ｍｇ／ｄｌから約２０００ｍｇ
／ｄｌ、特に０ｍｇ／ｄｌから約３０ｍｇ／ｄｌの間の
蛋白レベルを定量的に測定することができる。さらに本
発明の試薬組成物により、尿中の蛋白濃度が０ｍｇ／ｄ
ｌから約３０ｍｇ／ｄｌの間、また０ｍｇ／ｄｌから約
５ｍｇ／ｄｌの間、約５ｍｇ／ｄｌから約１０ｍｇ／ｄ
ｌの間のような低濃度から微量の蛋白の検出および測定
が可能である。
【００１６】本発明の試薬組成物により、液体試薬とし
た湿潤状態での測定にも、試薬組成物が担体に均等に取
り込まれている乾燥状態での測定にも適している。乾燥
状態の担体は、濾紙のような吸水性多孔質材料、浸透性
のある重合物質でできている膜のような非吸水性材料、
水溶性ポリマーの練り物から成る。担体に液体試料が入
り込むことができるような概知の濃度で、試薬組成物を
担体全体に均等に保持する。
た湿潤状態での測定にも、試薬組成物が担体に均等に取
り込まれている乾燥状態での測定にも適している。乾燥
状態の担体は、濾紙のような吸水性多孔質材料、浸透性
のある重合物質でできている膜のような非吸水性材料、
水溶性ポリマーの練り物から成る。担体に液体試料が入
り込むことができるような概知の濃度で、試薬組成物を
担体全体に均等に保持する。
【００１７】本発明は特公平４−５３２６５号とは異な
り、インジウムを阻害物質からカバーする目的で試薬組
成中にキレート剤を予め処方する必要もなく、モリブデ
ンと結合してしまうクエン酸等はインジウムに対して阻
害物質とはなり得ないため、金属イオンを処方する必要
もない。
り、インジウムを阻害物質からカバーする目的で試薬組
成中にキレート剤を予め処方する必要もなく、モリブデ
ンと結合してしまうクエン酸等はインジウムに対して阻
害物質とはなり得ないため、金属イオンを処方する必要
もない。
【００１８】インジウム／色素錯体中において用いるイ
ンジウム化合物は、特に制限はされない。しかしなが
ら、インジウム化合物は、ポリヒドロキシベンゼンスル
ホンフタレイン型の色素またはポリヒドロキシベンゼン
フタレイン型の色素と錯体を作るために、十分水に可溶
性でなければならない。さらに、本発明で用いられるイ
ンジウム化合物の陽イオンは着色度の高い陽イオンによ
る測定の妨害を避けるために本質的に着色されいないこ
とが望ましい。ポリヒドロキシベンゼンスルホンフタレ
イン型の色素またはポリヒドロキシベンゼンフタレイン
型の色素と錯体を作るために、十分水に可溶性であるイ
ンジウム化合物は、硫酸インジウム、塩化インジウム、
臭化インジウム、硝酸インジウム、ビス硫酸インジウム
アンモニウム、またはそれらを組み合わせたものがある
が、これらに制限されない。
ンジウム化合物は、特に制限はされない。しかしなが
ら、インジウム化合物は、ポリヒドロキシベンゼンスル
ホンフタレイン型の色素またはポリヒドロキシベンゼン
フタレイン型の色素と錯体を作るために、十分水に可溶
性でなければならない。さらに、本発明で用いられるイ
ンジウム化合物の陽イオンは着色度の高い陽イオンによ
る測定の妨害を避けるために本質的に着色されいないこ
とが望ましい。ポリヒドロキシベンゼンスルホンフタレ
イン型の色素またはポリヒドロキシベンゼンフタレイン
型の色素と錯体を作るために、十分水に可溶性であるイ
ンジウム化合物は、硫酸インジウム、塩化インジウム、
臭化インジウム、硝酸インジウム、ビス硫酸インジウム
アンモニウム、またはそれらを組み合わせたものがある
が、これらに制限されない。
【００１９】本発明で用いられる緩衝剤の種類は、指示
試薬組成として要求される色調変化を起こすために十分
な一定ｐＨに試薬反応系を維持すること、および蛋白含
有測定試料のｐＨの変動が原因の色調変化を本質的に除
去するものであれば、何でも使用できる。しかし用いら
れる緩衝剤の性質は指示試薬組成物に混入したインジウ
ム化合物／色素錯体に依存し、変化する。一方で本発明
で用いられる緩衝剤の量は、測定試料の性質に依存す
る。通常、緩衝剤の量は約１００ｍＭと約５００ｍＭの
間にある。
試薬組成として要求される色調変化を起こすために十分
な一定ｐＨに試薬反応系を維持すること、および蛋白含
有測定試料のｐＨの変動が原因の色調変化を本質的に除
去するものであれば、何でも使用できる。しかし用いら
れる緩衝剤の性質は指示試薬組成物に混入したインジウ
ム化合物／色素錯体に依存し、変化する。一方で本発明
で用いられる緩衝剤の量は、測定試料の性質に依存す
る。通常、緩衝剤の量は約１００ｍＭと約５００ｍＭの
間にある。
【００２０】この試薬組成物に緩衝剤を用いることは好
ましいことではあるが、緩衝剤はすべての場合で必要な
わけではない。例えば、インジウム又はインジウム化合
物と、インジウムと錯体を形成しうる色素のみからなる
組成物を用意し、測定試料とその試薬組成物を接触させ
てから、系を酸性のｐＨに保持する緩衝剤を加えてもよ
い。特許請求の範囲で意味する組成は、それら処方を
「最終的に」含んだ状態と考えればよい。つまり、予め
尿中へ緩衝剤を加えておく場合や、測定試料が適当な種
類の緩衝物質を適量あらかじめ含んでいる場合も含まれ
る。
ましいことではあるが、緩衝剤はすべての場合で必要な
わけではない。例えば、インジウム又はインジウム化合
物と、インジウムと錯体を形成しうる色素のみからなる
組成物を用意し、測定試料とその試薬組成物を接触させ
てから、系を酸性のｐＨに保持する緩衝剤を加えてもよ
い。特許請求の範囲で意味する組成は、それら処方を
「最終的に」含んだ状態と考えればよい。つまり、予め
尿中へ緩衝剤を加えておく場合や、測定試料が適当な種
類の緩衝物質を適量あらかじめ含んでいる場合も含まれ
る。
【００２１】本発明の試薬組成は、インジウム化合物／
色素の錯体および緩衝剤の性質および機能を実質的に変
えず、蛋白測定の妨害をしない界面活性剤のような任意
の成分もまた、試薬組成物中に含むことができる。界面
活性剤を添加することで蛋白質との反応性が高まること
が望める上に、界面活性剤を添加すると（液系試薬溶液
状態に限定されるが）意外なことにも反応を行うセルの
内側が汚れないという効果もあることが判明した。使用
できる界面活性剤の種類としては、ノニオン系界面活性
剤及びアニオン系界面活性剤の両方を好ましく使用でき
る。
色素の錯体および緩衝剤の性質および機能を実質的に変
えず、蛋白測定の妨害をしない界面活性剤のような任意
の成分もまた、試薬組成物中に含むことができる。界面
活性剤を添加することで蛋白質との反応性が高まること
が望める上に、界面活性剤を添加すると（液系試薬溶液
状態に限定されるが）意外なことにも反応を行うセルの
内側が汚れないという効果もあることが判明した。使用
できる界面活性剤の種類としては、ノニオン系界面活性
剤及びアニオン系界面活性剤の両方を好ましく使用でき
る。
【００２２】ノニオン系界面活性剤としては、Ｔｒｉｔ
ｏｎシリーズ、メチルセルロース、ポリアクリル酸、ポ
リビニルアルコール、Ｂｒｉｊシリーズ等が好ましく使
用でき、アニオン系界面活性剤としては、ラウリル硫酸
ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等
が好ましく使用できる。
ｏｎシリーズ、メチルセルロース、ポリアクリル酸、ポ
リビニルアルコール、Ｂｒｉｊシリーズ等が好ましく使
用でき、アニオン系界面活性剤としては、ラウリル硫酸
ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等
が好ましく使用できる。
【００２３】同様に他の重要でない成分には、重合ポリ
マー化合物、可塑剤、および活性のないベースになる染
料がある。
マー化合物、可塑剤、および活性のないベースになる染
料がある。
【００２４】本発明で使用できる酸性緩衝剤の種類とし
ては、グリシン緩衝剤、ラクテート、フタレート、トリ
クロロアセテート、スルホサリチレート、ホスフェート
類、アセテート類、塩化ナトリウム／塩酸、ピペラジン
−Ｎ，Ｎ’−Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）ス
ルホン酸（ＰＯＳＰＯ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−
ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、３−Ｎ−（トリスヒドロキシメチル）メチルアミ
ノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＳＰ
Ｏ）、２−（［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］
−アミノ）エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、あるいは当該
技術において周知な他の好適な、ｐＨを２．０〜４．０
に保持する酸性緩衝剤、さらに好ましくは２．２〜２．
７に保持する酸性緩衝剤が挙げられる。
ては、グリシン緩衝剤、ラクテート、フタレート、トリ
クロロアセテート、スルホサリチレート、ホスフェート
類、アセテート類、塩化ナトリウム／塩酸、ピペラジン
−Ｎ，Ｎ’−Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）ス
ルホン酸（ＰＯＳＰＯ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−
ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、３−Ｎ−（トリスヒドロキシメチル）メチルアミ
ノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＳＰ
Ｏ）、２−（［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］
−アミノ）エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、あるいは当該
技術において周知な他の好適な、ｐＨを２．０〜４．０
に保持する酸性緩衝剤、さらに好ましくは２．２〜２．
７に保持する酸性緩衝剤が挙げられる。
【００２５】更に、特公平６−７０６３２号ではキレー
ト化剤を試薬中に含まない、それどころかキレート化剤
を含むと測定に対して有害である旨が記載されている
が、本発明の他の重要な特徴によれば、本発明に関わる
組成物はキレート化剤を含んでも良好に作動するのであ
る。例えば、グリシン緩衝剤、酒石酸、シュウ酸、クエ
ン酸、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）といったキレート化作用
を有する化合物が試薬中及び尿中に含まれていても、誤
った測定結果とはならない。
ト化剤を試薬中に含まない、それどころかキレート化剤
を含むと測定に対して有害である旨が記載されている
が、本発明の他の重要な特徴によれば、本発明に関わる
組成物はキレート化剤を含んでも良好に作動するのであ
る。例えば、グリシン緩衝剤、酒石酸、シュウ酸、クエ
ン酸、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）といったキレート化作用
を有する化合物が試薬中及び尿中に含まれていても、誤
った測定結果とはならない。
【００２６】本発明は乾式の試験片へも応用できるが、
その際の手法は一般的な乾式試験片の作製方法に準ず
る。例えば、本発明の試薬組成の水溶液を濾紙のような
吸水性多孔質材料に含浸させ、乾燥させ、好みにより取
手となる水非浸透性材質に貼り合わせて作製することが
できる。
その際の手法は一般的な乾式試験片の作製方法に準ず
る。例えば、本発明の試薬組成の水溶液を濾紙のような
吸水性多孔質材料に含浸させ、乾燥させ、好みにより取
手となる水非浸透性材質に貼り合わせて作製することが
できる。
【００２７】
【実施例】（実施例１）精製水に下記の処方で試薬を配
合し、下記の組成からなる試薬溶液を調製した。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．０５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．０５ｍＭ コハク酸緩衝液（コハク酸＋水酸化ナトリウム） ｐＨ２．７ ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク） ０．１％
合し、下記の組成からなる試薬溶液を調製した。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．０５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．０５ｍＭ コハク酸緩衝液（コハク酸＋水酸化ナトリウム） ｐＨ２．７ ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク） ０．１％
【００２８】蛋白標準液として、ヒト血清アルブミンを
用いて２００ｍｇ／ｄｌとなるように調製した。この標
準液を用い、図１の横軸に示す濃度の希釈系列を作製し
た。この試料５μｌに試薬溶液３５０μｌを加え、３７
℃における１０分後の６００ｎｍにおける吸光度を測定
した。結果を図１に示す。図から判断できる様に、非常
に良好な検量線が得られた。
用いて２００ｍｇ／ｄｌとなるように調製した。この標
準液を用い、図１の横軸に示す濃度の希釈系列を作製し
た。この試料５μｌに試薬溶液３５０μｌを加え、３７
℃における１０分後の６００ｎｍにおける吸光度を測定
した。結果を図１に示す。図から判断できる様に、非常
に良好な検量線が得られた。
【００２９】（実施例２）実施例１と同様の操作によ
り、プール尿６０例を測定した。同時に従来法（ピロガ
ロールレッドーモリブデン法；市販試薬）も測定して、
本発明に関わる方法と従来法どの相関を調べた。結果を
図２に示す。相関係数は０．９９４６であり、非常に良
好な相関性を示した。
り、プール尿６０例を測定した。同時に従来法（ピロガ
ロールレッドーモリブデン法；市販試薬）も測定して、
本発明に関わる方法と従来法どの相関を調べた。結果を
図２に示す。相関係数は０．９９４６であり、非常に良
好な相関性を示した。
【００３０】（実施例３）精製水に下記の試薬を配合
し、下記の組成からなる試薬溶液を調製し、この試薬溶
液を濾紙（ワットマン社製：３ＭＭｃｈｒ）に含浸し、
液から引き上げた後、５０℃で１０分間送風乾燥し、得
られた原反を５ｍｍ×８０ｍｍの短冊状に切断し、乾式
試験紙とした。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．２５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．２５ｍＭ コハク酸緩衝液（コハク酸＋水酸化ナトリウム） ｐＨ２．７ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク） ０．５％
し、下記の組成からなる試薬溶液を調製し、この試薬溶
液を濾紙（ワットマン社製：３ＭＭｃｈｒ）に含浸し、
液から引き上げた後、５０℃で１０分間送風乾燥し、得
られた原反を５ｍｍ×８０ｍｍの短冊状に切断し、乾式
試験紙とした。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．２５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．２５ｍＭ コハク酸緩衝液（コハク酸＋水酸化ナトリウム） ｐＨ２．７ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク） ０．５％
【００３１】得られた乾式試験紙へ図３に示す濃度の蛋
白標準液試料１０μｌを滴下し、３０秒後に色調変化部
分を肉眼で観察した。図３に示すように、良好に目視で
判断できた。
白標準液試料１０μｌを滴下し、３０秒後に色調変化部
分を肉眼で観察した。図３に示すように、良好に目視で
判断できた。
【００３２】（実施例４）精製水に下記の処方で試薬を
配合し、下記の組成からなる試薬溶液を調製した。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．０５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．０５ｍＭ グリシン緩衝液（グリシン＋塩酸） ｐＨ２．２ ポリアクリル酸（和光純薬） ０．１％ イミノ二酢酸（同仁試薬）又はクエン酸（ナカライテスク）又は酒石酸（ナ カライテスク） ０．１％
配合し、下記の組成からなる試薬溶液を調製した。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．０５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．０５ｍＭ グリシン緩衝液（グリシン＋塩酸） ｐＨ２．２ ポリアクリル酸（和光純薬） ０．１％ イミノ二酢酸（同仁試薬）又はクエン酸（ナカライテスク）又は酒石酸（ナ カライテスク） ０．１％
【００３３】正常ヒトプール尿へ正常ヒト血清アルブミ
ン１００ｍｇ／ｄｌを添加した実尿試料５μｌに、上記
試薬溶液３５０μｌを加え、３７℃における１０分後の
６００ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図４
に示す。図から判断できるように、キレート剤が試薬中
に存在しても測定値の変動はおこらなかった。
ン１００ｍｇ／ｄｌを添加した実尿試料５μｌに、上記
試薬溶液３５０μｌを加え、３７℃における１０分後の
６００ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図４
に示す。図から判断できるように、キレート剤が試薬中
に存在しても測定値の変動はおこらなかった。
【００３４】（実施例５）精製水に下記の処方で試薬を
配合し、下記の組成からなる試薬溶液を調製した。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．０５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．０５ｍＭ コハク酸緩衝液（コハク酸＋水酸化ナトリウム） ｐＨ２．７ ポリアクリル酸（和光純薬） ０．１％
配合し、下記の組成からなる試薬溶液を調製した。 ブロモピロガロールレッド（同仁化学） ０．０５ｍＭ 硫酸インジウム（ナカライテスク） ０．０５ｍＭ コハク酸緩衝液（コハク酸＋水酸化ナトリウム） ｐＨ２．７ ポリアクリル酸（和光純薬） ０．１％
【００３５】正常ヒトプール尿へ正常ヒト血清アルブミ
ン１００ｍｇ／ｄｌを添加した実尿試料に、キレート剤
としてクエン酸又は酒石酸を、それぞれ０，５０，２０
０ｍｇ／ｄｌを更に添加したものを試料とした。この実
尿試料５μｌに、上記試薬溶液３５０μｌを加え、３７
℃における１０分後の６００ｎｍにおける吸光度を測定
した。同時に従来法（ピロガロールレッド−モリブデン
法）も測定した。結果を図５に示す。従来法ではキレー
ト剤が試料中に存在すると測定値が変動するが、本発明
に関わる組成物を使用すると、測定値の変動はおこらな
かった。
ン１００ｍｇ／ｄｌを添加した実尿試料に、キレート剤
としてクエン酸又は酒石酸を、それぞれ０，５０，２０
０ｍｇ／ｄｌを更に添加したものを試料とした。この実
尿試料５μｌに、上記試薬溶液３５０μｌを加え、３７
℃における１０分後の６００ｎｍにおける吸光度を測定
した。同時に従来法（ピロガロールレッド−モリブデン
法）も測定した。結果を図５に示す。従来法ではキレー
ト剤が試料中に存在すると測定値が変動するが、本発明
に関わる組成物を使用すると、測定値の変動はおこらな
かった。
【００３６】
【発明の効果】以上詳説したように、従来になかった手
段で、試料中の蛋白質の存在及び／又は濃度を示すのに
十分な色変化を示し、液体試料中の微量蛋白を定量測定
することができた。
段で、試料中の蛋白質の存在及び／又は濃度を示すのに
十分な色変化を示し、液体試料中の微量蛋白を定量測定
することができた。
【図１】本発明に関わる組成物を使用して、蛋白標準液
希釈系列を吸光度測定したグラフである。
希釈系列を吸光度測定したグラフである。
【図２】本発明に関わる組成物の、従来法との相関を示
すグラフである。
すグラフである。
【図３】本発明に関わる組成物を、試験片へ加工した際
の結果を示す表である。
の結果を示す表である。
【図４】本発明に関わる組成物へキレート剤を添加した
際に、吸光度測定したグラフである。
際に、吸光度測定したグラフである。
【図５】キレート剤を添加した際の、本発明に関わる組
成物と従来法とを比較したグラフである。
成物と従来法とを比較したグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 蛋白質含有液体試料と接触することによ
って、試料中の蛋白質の存在及び／又は濃度を示すのに
十分な色変化を示しうる組成物であって、 インジウム又はインジウム化合物、 インジウムと錯体を形成しうるポリヒドロキシベンゼン
スルホンフタレインタイプの色素及び／又はポリヒドロ
キシベンゼンフタレインタイプの色素、 反応系を酸性のｐＨに保持する緩衝剤、 を含むことを特徴とする組成物。 - 【請求項２】 ポリヒドロキシベンゼンスルホンフタレ
インタイプの色素又はポリヒドロキシベンゼンフタレイ
ンタイプの色素が、ピロカテコールバイオレット、ピロ
ガロールレッド、ブロモピロガロールレッド、キシレノ
ールオレンジ、ピロガロールフタレイン及びｏ−ヒドロ
キシヒドロキノンフタレイン、あるいはこれらの組み合
わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成
物。 - 【請求項３】 緩衝剤が、ラクテート、フタレート、サ
クシネート、トリクロロアセテート、スルホサリチレー
ト、ホスフェート類、アセテート類、塩化ナトリウム／
塩酸、グリシン／塩酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＳＰ
Ｏ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２
−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−Ｎ−（トリス
ヒドロキシメチル）メチルアミノ−２−ヒドロキシプロ
パンスルホン酸（ＴＡＳＰＯ）、及び２−（［トリス−
（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ）エタンスル
ホン酸（ＴＥＳ）、あるいはこれらの混合物からなる群
より選択される請求項１に記載の組成物。 - 【請求項４】 更に界面活性剤を含む、請求項１に記載
の組成物。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37842698A JP3516012B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | 微量の蛋白質を測定するための組成物 |
| DE69909419T DE69909419T2 (de) | 1998-12-25 | 1999-12-22 | Indium-enthaltende Zusammensetzung zur Messung von Proteinspuren |
| EP99125529A EP1014089B1 (en) | 1998-12-25 | 1999-12-22 | Composition comprising indium for measuring trace amount of protein |
| US09/471,283 US6319721B1 (en) | 1998-12-25 | 1999-12-23 | Method for measuring trace amount of protein |
| CNB991229673A CN1143133C (zh) | 1998-12-25 | 1999-12-24 | 对低浓度至痕量的蛋白质进行检测或定量的组合物和方法 |
| US09/967,975 US6797520B2 (en) | 1998-12-25 | 2001-10-02 | Composition for measuring trace amount of protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37842698A JP3516012B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | 微量の蛋白質を測定するための組成物 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000193668A JP2000193668A (ja) | 2000-07-14 |
| JP3516012B2 true JP3516012B2 (ja) | 2004-04-05 |
Family
ID=18509671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37842698A Expired - Lifetime JP3516012B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | 微量の蛋白質を測定するための組成物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1014089B1 (ja) |
| JP (1) | JP3516012B2 (ja) |
| CN (1) | CN1143133C (ja) |
| DE (1) | DE69909419T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP4214271B2 (ja) * | 2002-10-15 | 2009-01-28 | アークレイ株式会社 | クレアチニン測定用試験片 |
| US7745153B2 (en) * | 2008-02-06 | 2010-06-29 | Pierce Biotechnology, Inc. | Pyrocatechol violet-metal protein assay |
| CN102539692A (zh) * | 2010-12-13 | 2012-07-04 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒 |
| US9804154B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Epinex Diagnostics, Inc. | Rapid test for urine albumin and urine creatinine |
| CN106153947B (zh) * | 2016-04-05 | 2018-08-28 | 广州捷检生物科技开发有限公司 | 一种尿蛋白快速检测试剂及其制备方法和应用 |
| EP3662286A1 (en) * | 2017-08-03 | 2020-06-10 | Fraunhofer Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Means and methods for protein quantification |
| WO2019139980A1 (en) | 2018-01-09 | 2019-07-18 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods for measuring analyte and/or protein in biological samples |
| CN109900887A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-06-18 | 深圳市安帝宝科技有限公司 | 一种尿液样本的前处理液 |
| CN113376150A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-10 | 吉林基蛋生物科技有限公司 | 一种尿液微量白蛋白干化学检测试纸及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS6193448A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-05-12 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| US4960710A (en) * | 1988-06-06 | 1990-10-02 | Miles Inc. | Device and method of assaying for trace mounts of proteins |
| JPH0453265A (ja) | 1990-06-20 | 1992-02-20 | Seiko Epson Corp | 半導体装置 |
| JP3090503B2 (ja) * | 1991-06-07 | 2000-09-25 | 国際試薬株式会社 | 蛋白質の測定法 |
| US5925570A (en) * | 1991-12-25 | 1999-07-20 | Iatron Laboratories, Inc. | Method of measuring metals in samples of living body |
| JPH0670632A (ja) | 1992-08-24 | 1994-03-15 | Hokoku Kogyo Co Ltd | 穀物の乾燥貯留用建家 |
| US5399498A (en) * | 1993-12-17 | 1995-03-21 | Miles Inc. | Reduction of background interferences in the molybdate-dye protein assay |
| US5552547A (en) * | 1995-02-13 | 1996-09-03 | Shi; Song Q. | Organometallic complexes with built-in fluorescent dyes for use in light emitting devices |
-
1998
- 1998-12-25 JP JP37842698A patent/JP3516012B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-12-22 EP EP99125529A patent/EP1014089B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-22 DE DE69909419T patent/DE69909419T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-23 US US09/471,283 patent/US6319721B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-24 CN CNB991229673A patent/CN1143133C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-02 US US09/967,975 patent/US6797520B2/en not_active Expired - Lifetime
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| US20020037591A1 (en) | 2002-03-28 |
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| CN1143133C (zh) | 2004-03-24 |
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