DE69737657T2

DE69737657T2 - Nachweis der alkoholexposition von zellen

Info

Publication number: DE69737657T2
Application number: DE69737657T
Authority: DE
Inventors: Adrienne S. Kensington GORDON; Ivan Berkeley DIAMOND; Doug P. San Francisco DOHRMAN
Original assignee: GALLO CLINIC AND RES CT; Gallo Clinic and Research Center San Francisco
Current assignee: GALLO CLINIC AND RES CT; Gallo Clinic and Research Center San Francisco
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: EP0925505B1; JP3996198B2; EP0925505A1; JP2000515977A; US6255057B1; AU3738297A; EP0925505A4; DE69737657D1; WO1998004921A1

Description

I. FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Fachgebiet biologischer Tests zur Detektion von Ethanolexposition bei Säugetieren und zur Evaluierung von Arzneimitteln, welche die zellulären Auswirkungen von Ethanolkonsum modifizieren.
II. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Missbrauch von Ethanol bleibt ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit in den USA und auf der ganzen Welt. Es ist von Interesse, Verfahren zur Detektion von Ethanolexposition bei Personen bereitzustellen, um die Einhaltung von Behandlungsplänen bei Missbrauch zu überwachen. Es ist auch von Interesse, Tests bereitzustellen, die zur Beurteilung von Arzneimitteln nützlich sind, die verwendet werden können, um eine oder mehrere nachteilige Auswirkungen von chronischem Ethanolüberkonsum zu behandeln. Um solche Verfahren und Tests bereitzustellen, ist es notwendig, ein detailliertes Verständnis der biochemischen Wirkung von Ethanolexposition auf Zellebene zu erlangen. Jüngste Beweise lassen vermuten, dass Ethanol die Funktion bestimmter Proteine und Signalübertragungswege modifiziert, woraus Veränderungen der zweiten Messengerkonzentrationen, von Proteinkinasen und der Genexpression resultieren. Diese Beobachtung stellt keinen spezifischen Test bereit, der es ermöglicht, die Wirkungen von Ethanol einfach zu bestimmen. Kürzlich ist gezeigt worden, dass die Spezifität von Proteinkinasen mit ihrer Lokalisierung innerhalb der Zelle zu korrelieren scheint. Mochly-Rosen, Science 268, 247 (1995).
Hundle et al., The Journal of Biological Chemistry 270 (50), 30134 (1995), haben gezeigt, dass die Überexpression von ε-Proteinkinase-C die von Nervenwachstumsfaktor induzierte Phosphorylierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen und Neuritenauswuchs verstärkt. Roivainen et al., Toward a Molecular Basis of Alcohol Abuse, 29–38 (1994), zeigen, dass chronische Ethanolexposition PKC-vermittelte Phosphorylierung aktiviert, zum Teil durch Erhöhung der Expression von zwei PKC-Isozymen, δ und ε. EP-A-331.361 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Alkoholismus und Alkoholempfindlichkeit durch Messung eines Zellindikators, der für die intrazelluläre cAMP-Konzentration charakteristisch ist.
Chronischer Alkoholismus verursacht in vielen Organen, insbesondere im Gehirn, funktionelle und pathologische Veränderungen; die molekularen Mechanismen, die für diese Wirkungen verantwortlich sind, sind jedoch nicht leicht verständlich. Es kann wünschenswert sein, Verfahren zur Überwachung der Wirkung von chronischer Ethanolexposition auf Säugetierzellen bereitzustellen, und es kann weiters wünschenswert sein, Verfahren zur Bestimmung, ob eine Person über einen längeren Zeitraum aktiv Ethanol zu sich genommen hat, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Detektion der Wirkungen von Ethanol, insbesondere der chronischen Exposition von Ethanol, auf Säugetierzellen, insbesondere menschliche Zellen oder andere Säugetierzellen. Dieser Test kann sowohl in einem diagnostischen Test verwendet werden, um bei einer Person Ethanolkonsum zu bestimmen, oder im Screening auf Arzneimittel oder Behandlungen, welche die Wirkungen von Ethanolkonsum mäßigen, hemmen, umkehren oder verstärken.
III. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil die Entdeckung, dass Exposition gegenüber Ethanol die subzelluläre Lokalisierung der katalytischen Cα-Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) und die δ- und ε-Untereinheiten von Proteinkinase-C (PKC) dramatisch verändert. Beispielsweise scheint die katalytische Cα-Untereinheit von PKA, die normalerweise im Bereich des Golgi-Apparats lokalisiert ist, den Nucleus nach Exposition einer Zelle gegenüber Ethanol zu translozieren. Es wurde auch gezeigt, dass Ethanol in Astrozyten und menschlichen Lymphozyten und in Epidermiskeratinozyten die Translokation von PKC-Aktivität von der zytosolischen Fraktion hin zur Membranfraktion verursacht. Die vorliegende Erfindung betrifft wieters die Entdeckung, dass die detektierbare Menge der regulierenden Untereinheit RI von PKA abnimmt und die Mengen von α-, δ- und ε-Untereinheiten von PKC in bestimmten Zelltypen, einschließlich, wenn auch nicht ausschließlich NG108-15-Zellen (α-, δ-, und ε-Untereinheit) oder PC12-Zellen (δ- und ε-Untereinheit), nach Exposition gegenüber Ethanol steigen. Diese Entdeckungen stellen die Grundlage für Tests bereit, die verwendet werden können, um die Exposition von Zellen gegenüber Ethanol zu detektieren, und weiters für Tests, die zum Screening auf Arzneimittel oder Behandlungen zur Modulierung der Wirkungen von Ethanolkonsum verwendet werden können.
Ein Aspekt der Erfindung ist es, Tests bereitzustellen, die durch Identifizierung zumindest einer Zellkomponente, z.B. eines Proteins, das eine zelluläre Lokalisierung (Verteilung) aufweist, die in Verbindung mit der Exposition der Zelle gegenüber Ethanol variiert, und Bestimmen der Verteilung dieser Zellkomponente innerhalb einer Zelle einer zu testenden Probe einen Hinweis auf die Exposition einer Zelle oder einer Person gegenüber Ethanol bereitstellen. Die Zellkomponente umfasst eine Untereinheit der AMP-abhängigen Proteinkinase PKA, wobei die Cα-Untereinheit besonders bevorzugt ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zellkomponente eine Isozym-Proteinkinase-C, PKC, wobei das δ- oder ε-Isozym von Proteinkinase-C besonders bevorzugt ist.
Es werden Tests bereitgestellt, die durch Messung der Menge des Proteins, dessen Menge in einer Beziehung mit der Exposition der Zelle gegenüber Ethanol variiert einen Hinweis auf die Exposition einer Zelle oder einer Person gegenüber Ethanol bereitstellen. Der Rückgang der detektierbaren Menge der regulierenden Untereinheit RI von PKA als Reaktion auf Ethanolexposition wird bestimmt. Der Anstieg der detektierbaren Mengen von α-PKC, δ-PKC oder ε-PKC als Reaktion auf Ethanolexposition wird gemessen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung von Tests zum Screening auf therapeutische Verbindungen, welche die Wirkungen von Ethanol auf einer Zelle modulieren. Diese Screeningtests messen die Wirkungen einer Verbindung von Interes se, um in eine oder mehrere der hierin beschriebenen Zellwirkungen von Ethanol, d.h. Veränderungen der Lokalisierung von Cα, δPKC oder εPKC, einzugreifen.
IV. KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A–1D zeigen Mikroaufnahmen, welche den Ort der Färbung der katalytischen PKA-Untereinheit in NG108-15-Zellen nach achtundvierzig (48) Stunden der Exposition gegenüber 200 mM Ethanol anzeigen.
2 ist eine Darstellung der Abhängigkeit des Prozentsatzes von Zellen, die im Vergleich zu Golgi-Färbung Kernfärbung zeigen, von der Ethanolkonzentration, der die Zellen ausgesetzt wurden.
3 ist eine Reihe von Mikroaufnahmen, welche die Bewegung der Cα-Untereinheit von PKA in Zellen, die Ethanol ausgesetzt werden, mit den Wirkungen einer Behandlung mit mehreren anderen angegebenen Mitteln vergleichen.
4 zeigt die Schwankung des Prozentsatzes an Zellen mit Golgi-Färbung mit der Zeit für Zellen, die Ethanol ausgesetzt werden, und für Zellen, die mit Forskolin behandelt werden.
5 zeigt eine Western-Blot-Analyse von Cα- und RI-PKA- Untereinheiten in ethanolexponierten NG108-15-Zellen.
6 zeigt die immunhistochemische Färbung von δPKC in NG108-15-Zellen, die in einem definierten Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von EtOH oder von PKC-Aktivierung durch PMA gezüchtet wurden.
7 zeigt die immunhistochemische Färbung von δPKC in NG108-15-Zellen nach vier (4) Tagen Exposition gegenüber 25 mM Ethanol.
8 zeigt die immunhistochemische Färbung von εPKC in NG108-15-Zellen, die in einem definierten Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von EtOH oder von PKC-Aktivierung durch PMA gezüchtet wurden.
9 zeigt die immunhistochemische Färbung von εPKC in NG108-15-Zellen nach vier (4) Tagen Exposition gegenüber 25 mM Ethanol.
V. DEFINITIONEN
Hierin hat der/haben die folgende(n) Begriff(e), unabhänhig davon, ob im Singular oder im Plural gebraucht, die nachstehenden Bedeutungen:
Ethanolanzeigendes Protein. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff ethanolanzeigendes Protein ein Genprodukt, dessen Zelllokalisierung oder detektierbare Menge sich als Reaktion auf Exposition gegenüber Ethanol ändert und das eine Untereinheit von PKA oder ein Isozym von PKC ist.
VI. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Entdeckungen, die sich mit der Einwirkung von Ethanol auf die zelluläre Lokalisierung und mit der Abundanz spezifischer Proteine als Folge von Exposition von Zellen gegenüber Ethanol befassen. Speziell betrifft die Erfindung die Entdeckung, dass die Exposition von Zellen gegenüber Ethanol eine Translokation der katalytischen Cα-Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKA) von der Golgi-Region zum Nucleus induziert. Die Erfindung betrifft weiters die Entdeckung, dass die Exposition von Zellen gegenüber Ethanol eine Translokation der δ-Untereinheit von PKC von der Golgi-Region zum Perinucleus und Nucleus induziert, während eine Translokation der ε-Untereinheit von PKC vom Perinucleus zum Zytoplasma induziert wird. Es ist entdeckt worden, dass die detektierbare Menge der regulierenden Typ-I-(RI-) Untereinheit von PKA, die in Zellen festgestellt wird, als Reaktion auf Ethanolexposition sinkt, während die detektierbaren Mengen von αPKC, δPKC und εPKC als Reaktion auf kurzfristige wie auch langfristige Exposition gegenüber Ethanol steigen. Die Zellveränderungen als Reaktion auf Ethanolexposition haben zahlreiche Folgen, die über die Wirkungen von Ethanol auf die zelluläre Lokalisierung von Cα und δPKC und εPKC hinausgehen. Beispielsweise setzt die Dissoziation der katalytischen Untereinheit Cα aus der regulierenden Untereinheit die Cα-Untereinheit frei, um Proteine zu phosphorylieren. Weiters kann die Cα-Untereinheit von PKA durch Translokation zum Nucleus eine andere Reihe von Proteinen phosphorylieren als jene, die im Golgi-Apparat oder anderswo im Zytoplasma vorliegen. Weiters kann die Translokation der Cα-Untereinheit auch das Ausmaß der Phosphorylierung verschiedener Proteine, die von Cα phosphoryliert werden, wie z.B. CREB, verändern, wie sie auch die CRE-regulierte Genexpression ändern kann. Die Cα-vermittelten Änderungen der Proteinphosphorylierung können auch detektierbare Auswirkungen auf die Genexpression haben; solche PKA-Wirkungen können auch dazu verwendet werden, Ethanolexposition zu überwachen. Es können ähnliche Wirkungen von δPKC und εPKC bestimmt werden. Hierin werden Proteine, deren zelluläre Lokalisierung oder detektierbare Menge durch Ethanolexposition verändert werden, allgemein ethanolanzeigende Proteine genannt.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Ethanolexposition einer Probe, die zumindest eine Zelle enthält, bereit, welches das Applizieren eines Farbstoff, der spezifische Bindungsaffinität für eine Untereinheit von PKA oder ein Isozym von PKC aufweist, und die Bestimmung der Verteilung des Farbstoffs innerhalb der Zelle umfasst, wodurch ein Hinweis auf eine Exposition der Zelle gegenüber Ethanol erhalten wird. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Protein die katalytische Cα-Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKA). In einer anderen spezifischen Ausführungsform ist das Protein das α- oder ε-Isozym von Proteinkinase-C (PKC). Der Schritt zur Bestimmung der Lokalisierung des Proteins umfasst vorzugsweise Abbildung oder Beobachtung der Zelle unter Einsatz herkömmlicher Bildgebungsverfahren, z.B. eines Mikroskops. Vorzugsweise enthält die Probe eine Vielzahl von Zellen, und die Bestimmung wird für mehrere dieser Vielzahl von Zellen durchgeführt. Vorzugsweise stammen die analysierten Zellen aus Blutproben, z.B. Lymphozyten, Granulozyten etc. Eine nukleare Anhäufung des ethanol anzeigenden Proteins, z.B. Cα von PKA, δPKC oder εPKC, kann auch durch Beobachtung von Cα-, δPKC- oder εPKC-induzierten Zellereignissen bestimmt werden. Beispielsweise kann es möglich sein, die chronische Aktivierung von CREB-Transkriptionsfaktor und anderen nuklearen Substraten als Reaktion auf Cα-Aktivierung zu beobachten.
Die Verfahren der Erfindung können dazu eingesetzt werden, den Entzug von Ethanol bei einem Subjekt zu überwachen. Insbesondere, nachdem einem chronischen Alkoholiker Alkohol entzogen wurde, ist zu erwarten, dass Cα und δPKC den Nucleus oder den Nucleus und den Perinucleus verlassen und zum Golgi zurückkehren, während εPKC vom Zytoplasma in die perinukleare Region zurückkehrt. Daher können die beschriebenen Verfahren dazu eingesetzt werden, den Entzug von Ethanol über einen relativ kurzen Zeitraum zu überwachen.
Die Erfindung stellt daher Verfahren zur Bestimmung der Exposition von Zellen gegenüber Ethanol bereit, welche die Schritte des Applizierens eines Farbstoffs unter Einsatz einer spezifischen Affinität für das ethanolanzeigende Protein, z.B. die Cα-Untereinheit von PKA oder das δ- oder ε-Isozym, zur Probe, um eine oder mehrere Regionen der Zelle zu identifizieren, die Cα, δPKC oder εPKC enthalten. Nachdem Regionen der Zelle identifiziert worden sind, die PKA oder PKC enthalten, wird/werden die Zelle(n) bezüglich der Verteilung des Farbstoffs innerhalb der Zellen klassifiziert, wobei die Lokalisierung von Cα-Farbstoff im Zellnucleus, δPKC im Perinucleus und Nucleus und εPKC im Zytoplasma eine vorherige Exposition der Zellen gegenüber Ethanol anzeigt. Zellen, die signifikante (d.h. größere als Kontrollzellen) detektierbare Mengen an Farbstoff für die Cα van PKA im Nucleus, der δ-Untereinheit von PKC im Perinucleus und Nucleus bzw. von εPKC im Zytoplasma enthalten, zeigen jeweils eine Exposition gegenüber Ethanol an.
Vorteilhafterweise umfasst die Bestimmung der Zelllokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins, z.B. Cα, δPKC oder εPKC, die Identifizierung des ersten und des zweiten Bereichs innerhalb jeder Zelle und die Klassifizierung der Zellen als vom ersten Typ, wenn das Protein hauptsächlich in einem ersten Bereich vorliegt, und als vom zweiten Typ, wenn das Protein hauptsächlich im zweiten Bereich vorliegt. Die Anzahl an Zellen vom ersten Typ kann mit der Anzahl an Zellen vom zweiten Typ für eine bestimmte Anzahl an Zellen innerhalb einer Probe verglichen werden. Eine Zahl, die vom Anteil der Zellen des ersten und des zweiten Typs abhängig ist, für gewöhnlich das Verhältnis oder ein Prozentsatz, kann mit einer Kontrolle korreliert werden, die von Referenzdaten herrührt, um eine qualitative Bestimmung anzustellen, ob Exposition der Probe gegenüber Ethanol einen bestimmten Schwellenwert überschritten hat, oder um eine halbquantitative Bestimmung der Exposition gegenüber Ethanol der Probe zu erhalten. Im Fall von Cα ist der erste Bereich bevorzugt der Nucleus der Zelle, und der zweite Bereich ist vorzugsweise der perinukleare Gogli-Apparat. Im Fall von δPKC ist der erste Bereich bevorzugt der Perinucleus und der Nucleus der Zelle, und der zweite Bereich ist vorzugsweise der perinucleare Golgi-Apparat. Im Fall von εPKC ist der erste Bereich vorzugsweise das Zytoplasma der Zelle, und der zweite Bereich ist vorzugsweise der Perinucleus und der Nucleus der Zelle. Die Kontrolle hängt vom Typ der untersuchten Zellen ab und umfasst für gewöhnlich etwa 25–35 %, d.h. wenn mehr als 25–35 % der Zellen eine Lokalisierung im ersten Bereich zeigen, ist die Probe positiv.
Der Klassifikationsschritt umfasst den Schritt der Identifizierung der Lokalisierung des Farbstoffs in der Zelle und daher der Lokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins, z.B. der Cα-Untereinheit von PKA, δPKC oder εPKC oder von beliebigen anderen Proteinen mit vergleichbarem Lokalisierungsverhalten. Die genauen Mittel zur Identifizierung der Lokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins, z.B. Cα, δPKC oder εPKC, in der Zelle varieren mit der im Farbstoff verwendeten Markierung. Allgemein kann eine Vielzahl von Verfahren für jeden Typ von gewählter Markierung angewandt werden. Beispielsweise kann eine Radioisotopenmarkierung durch Film (Auoradiographie), ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCDs) und dergleichen bestimmt werden.
Bei der Analyse der Ergebnisse der vorliegenden Tests, in denen eine Probe, die eine Vielzahl von Zellen enthält, mit einem für das ethanolanzeigende Protein, z.B. für Cα, δPKC oder εPKC, spezifischen Farbstoff gefärbt wird, muss der Prozentsatz an Zellen berücksichtigt werden, die eine andere Lokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins aufweisen. Nicht jede ethanolexponierte Zelle in einer Probe weist eine veränderte Lokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins auf. Jedoch sind signifikant mehr Zellen mit einer veränderten Lokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins in mehrere Zellen enthaltenden Proben zu finden, die im Gegensatz zu Kontrollproben Ethanol ausgesetzt waren. Weiters wird erwartet, dass der Prozentsatz an Zellen, die eine veränderte Lokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins aufwiesen, d.h. Translokation zum Nucleus im Fall von Cα, Translokation zum Perinucleus und Nucleus im Fall von δPKC oder Translokation zum Zytoplasma im Fall von εPKC, mit längerer Dauer der Aussetzung gegenüber Ethanol und mit steigender Ethanolmenge, unter dessen Einfluss die Zellen gebracht werden, zunehmen. Die statistische Analyse kann dazu verwendet werden, quantitative Korrelationen zwischen dem Prozentsatz an Zellen in einer Probe, die eine veränderte Lokalisierung des ethanolanzeigenden Proteins aufweisen, und dem Ausmaß der Exposition zu erstellen. Andere zu berücksichtigende Faktoren bei der Erstellung solcher Korrelationen umfassen das Alter und Leiden der Quelle der Zellprobe, den jeweils analysierten Zelltyp und dergleichen. Die Probe kann einem lebenden Subjekt, z.B. einem Menschen, abgenommen werden, dessen Ethanolkonsum gemessen werden soll. Alternativ dazu können Zellen, die in vitro kultiviert werden, in jenen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, die auf das Monitoring von Ethanol bei Subjekten ausgerichtet sind, z.B. Screening auf therapeutische Mittel. Wenn die Probe einem lebenden Subjekt abgenommen wird, ist die Probe vorzugsweise eine Blutprobe, die kernhaltige Zellen, wie z.B. Granulozyten und Lymphozyten, enthält.
Der Ethanolkonsum eines Subjekts, insbesondere eines Menschen, kann prinzipiell durch Testen der Zellen bestimmt werden, die vom Subjekt erhalten werden. Zellen zur Analyse in den vorliegenden Tests auf Ethanolexposition können aus einer Vielzahl von Stellen innerhalb des Körpers stammen. Zellenthaltende Proben können aus Organen oder nichtorganischem Gewebe stammen. Vorzugsweise werden die zellenthaltenden Proben aus einfach zu entfernendem Gewebe, wie z.B. Blut und Haut, erhalten. Aufgrund der vorübergehenden und umkehrbaren Wirkungen von Ethanol auf ethanolanzeigendes Protein, z.B. Cα, δPKC, εPKC, ist es wichtig, dass Proben mit den Tests der Erfindung möglichst bald analysiert werden, nachdem die Probe zur Analyse einem Subjekt abgenommen wurde. Die Lokalisierung von ethanolanzeigenden Proteinen, wie z.B. der Cα-Untereinheit von PKA, δ-PKC oder εPKC, in Granulozyten und/oder Lymphozyten kann erforscht werden. Beide dieser Zelltypen können einfach aus Blutproben erhalten werden. Zur Bestimmung der Wirkung von Ethanolkonsum bei einer bestimmten Person kann ein Vergleich zwischen dem Anteil jener Zellen, die z.B. hauptsächlich nucleare Lokalisierung von Cα, perinucleare und nucleare Lokalisierung von δPKC oder zytoplasmatische Lokalisierung von εPKC aufweisen, mit jenen angestellt werden, die aus einer Referenzprobe erhalten werden. Zur Überwachung der Fortschritte der Person über einen gewissen Zeitraum kann eine Reihe von Proben abgenommen und die Variationen der Lokalisierung der Färbung überwacht werden. Das Verfahren kann dazu verwendet werden, die Auswirkungen einer Behandlung auf ein lebendes Subjekt durch Überwachung der Veränderungen des Subjekts zu bestimmen, wenn es die Behandlung erfährt.
Die hierin beschriebenen Verfahren können zum Screening von Arzneimitteln bezüglich ihrer Wirksamkeit bei der Mäßigung der Auswirkungen von Ethanol durch Messung der Auswirkungen von Ethanol auf eine Probe, die mit dem Arzneimittel behandelt und Ethanol ausgesetzt wird, und durch Vergleich der Ergebnisse mit Ergebnissen, die von einer Kontrollprobe erhalten wurden, die Ethanol ausgesetzt, aber nicht mit dem Arzneimittel behandelt wurde, verwendet werden. Die Verfahren können auch zur Bereitstellung eines Hinweises auf die Wirkungen von Ethanolkonsum bei einem Subjekt verwendet werden, indem die erhaltenen Ergebnisse mit Referenzergebnissen verglichen werden, z.B. Ergebnissen, die bei einem Kontrollsubjekt, entweder in vitro oder in vivo, erhalten wurden, oder mit anderen Messungen, die über einen gewissen Zeitraum an demselben Subjekt vorgenommen wurden, um den Fortschritt von Alkoholismus oder von Behandlungen zu bestimmen. Zahlreiche andere Anwendungen sind für den Fachmann offensichtlich.
Unter Einsatz von Immunozytochemietechniken wird ein Farbstoff hergestellt, der für das ethanolanzeigende Protein, z.B. die katalytische Untereinheit Cα von PKA, αPKC, δPKC oder εPKC, spezifisch ist. Farbstoffe, die für RI und andere Proteine spezifisch sind, die Lokalisierungen oder Mengen in der Zelle aufweisen, die mit Ethanolexposition korreliert werden können, können auf ähnliche Weise hergestellt werden und zur quantitativen Detektion von z.B. RI verwendet werden. Der Farbstoff umfasst eine spezifische Bindungssubstanz, die sich spezifisch an das ethanolanzeigende Protein bindet, auf das abgezielt wird, z.B. die Cα-Untereinheit von PKA, αPKC, δPKC, εPKC, RI, z.B. ein Antikörper und eine markierende Gruppierung. Unter Einsatz herkömmlicher Antikörperproduktionsverfahren können geeignete Antikörper gebildet werden. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein. Die Antikörper können auch aus gentechnisch präparierten Wirten oder aus herkömmlichen Quellen gebildet werden. Antikörper können als Reaktion auf ethanolanzeigendes Protein, z.B. Cα, αPKC, δPKC, εPKC oder RI, oder immunologisch kreuzreaktive Fragmente davon gebildet werden. Verfahren zur Antikörperproduktion sind Fachleuten bekannt. Beispiele für solche Verfahren können in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988), Birch und Lennox, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, New York (1995), gefunden werden. Die markierende Gruppierung wird in herkömmlichen immunhistochemischen Detektionsverfahren sichtbar zu beobachten sein, z.B. ein Fluoreszenzfarbstoff, wie z.B. Fluorescein, ein Radioisotop, eine kolloidale Markierung, wie z.B. kolloidales Gold oder gefärbte Latexperlen, eine Enzymmarkierung oder ein beliebiger anderer bekannter Markierungskomplex. Solche Farbstoffe können nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, z.B. wie in Mansan, Immunochemical Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 10, Humana Press, Totawa, New Jersey (1992), Besley, Immunocytochemistry: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1993) hergestellt werden, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
In den obigen Ausführungsformen wurden Verfahren zur Untersuchung der Wirkungen von Ethanol und therapeutischen Mitteln, die diese entweder in vivo oder in vitro beeinflussen, beschrieben, und für Fachleute ist offensichtlich, dass diese Verfahren für eine Reihe von Problemen angewendet werden können. Die Bestimmung der Lokalisierung der Cα-Untereinheit von PKA, δPKC, εPKC oder eines beliebigen anderen ethanolanzeigenden Proteins, das untersucht wird und oben beschrieben wurde, ist manuell durch visuelle Beobachtung durchgeführt worden. Dieses Verfahren kann automatisiert werden, z.B. durch computerbasierte Bilderkennung, oder es können Tests entwickelt werden, bei denen die Lokalisierung des Proteins ohne Visualisierung bestimmt wird, beispielsweise unter Verwendung von Reagenzien, die für dieses Protein spezifisch sind, in Kombination mit Reagenzien, die über spezifische Affinität für spezielle Lokalisierungen innerhalb der Zelle verfügen. Weiters soll die Erfindung nicht auf die Detektion der oben genannten Proteine beschränkt sein, sondern ein Fachmann kann auch andere Proteine verwenden, deren Verhalten in Gegenwart von Ethanol jenem der oben beschriebenen ähnlich ist. Dementsprechend soll der Schutzumfang der Erfindung nicht auf die beschriebenen Ausführungsformen beschränkt sein, sondern ist so auszulegen, dass all jene Varianten enthalten sind, die nicht von der Lehre hierin abweichen.
Die Beschreibung offenbart Verfahren zur Detektion der Auswirkungen von Ethanol auf Zellen durch Messung der Phosphorylierung von Proteinen, die unterschiedlich phosphoryliert werden, z.B. Cα in Gegenwart und Abwesenheit von Ethanol. Wie zuvor beschrieben, führt die Exposition von Zellen gegenüber Ethanol zur Translokation von Cα zum Nucleus, wo die katalytische Untereinheit von Cα eine Reihe von Proteinen (mit Serin/Threonin als Ziele) phosphoryliert, die sich von der Reihe von Proteinen unterscheidet, die im Zytoplasma, in der Plasmamembran oder im Golgi für Phosphorylierung verfügbar sind. Die Identität solcher Proteine, die als Reaktion auf Ethanolexposition unterschiedlich phosphoryliert werden, kann unter Einsatz herkömmlicher Testverfahren, die einem gewöhnlichen Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind, einfach bestimmt werden. Beispielsweise kann radioaktiv markiertes Phosphat kultivierten Zellen zugesetzt werden, die sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Ethanol gezüchtet werden. Proteine können dann aus den markierten Zellen extrahiert werden und auf einem ein- oder zweidimensionalem Gelsystem aufgetrennt werden. Isolierte phosphorylierte Proteine können durch Autoradiographie und verwandte Verfahren visualisiert werden. Nach Auftrennung und Visualisierung können Veränderungen des Ausmaßes an Phosphorylierung verschiedener Proteine durch Vergleich der Ergebnisse, die aus Zellen erhalten werden, die Ethanol ausgesetzt werden, mit den Ergebnissen, die aus Zellen erhalten werden, die nicht Ethanol ausgesetzt werden, bestimmt werden. Beispielsweise können Proteine identifiziert werden, die als Reaktion auf Ethanol durch Cα unterschiedlich phosphoryliert werden, z.B. durch Sequenzierung der aminoterminalen Aminosäurereste. Proteine, die als Reaktion auf Ethanolexposition der Zelle durch Cα unterschiedlich phosphoryliert werden, können in Tests auf die Exposition von Zellen gegenüber Ethanol verwendet werden. Weiters können diese unterschiedlich phosphorylierten Proteine als Targets verwendet werden, wenn auf Verbindungen gescreent wird, welche die zellulären Wirkungen von Ethanol modulieren. Solche Tests umfassen Tests, welche die Schritte der Messung der Phosphorylierung von unterschiedlich phosphorylierten Proteinen umfassen. Verbindungen können durch Messung ihrer Wirkungen auf die Phosphorylierung dieser unterschiedlich phosphorylierten Proteine gescreent werden. Zellen zur Verwendung in den vorliegenden Screeningtests auf Verbindungen, welche die Wirkungen von Ethanol modulieren, können primäre Zellen, die direkt von einem Subjekt stammen, oder Zellen aus einer Zelllinie sein. Solche Tests umfassen Tests, in denen die zellulären Lokalisierungen von Cα, δPKC oder εPKC gemessen werden, und Tests, in denen die Mengen an RI, αPKC, δPKC oder εPKC gemessen werden. Vorzugsweise stammen die Zellen, die im Test verwendet werden, aus Zelllinien, noch bevorzugter stammen die Zellen aus einer Neuroblastomzelllinie. Zelllinienzellen werden für die Verwendung in den vorliegenden Screeningtests bevorzugt, weil sie für Übereinstimmung zwischen Tests sorgen. Zellen zur Verwendung in den Tests der Erfindung können aus Zellen erhalten werden, die in vitro kultiviert werden, und umfassen Zellen, die aus dem Gehirn oder aus Nervengewebe stammen, insbesondere NG108-15-Neuroblastom-X-Gliomzellen.
Die Beschreibung offenbart auch Sets zur Durchführung der vorliegenden Verfahren. Sets enthalten im Allgemeinen ein oder mehrere Reagenzien, die zur Durchführung der Verfahren der Erfindung notwendig oder nützlich sind. Reagenzien können in zuvor abgemessenen Einheiten bereitgestellt werden, um für Einheitlichkeit und Präzision bei den Testergebnissen zu sorgen. Sets zur Bestimmung der Exposition von Zellen gegenüber Ethanol durch Bestimmung der intrazellulären Lokalisierung von Cα, δPKC oder εPKC umfassen einen Farbstoff, der für Cα, δPKC oder εPKC spezifisch ist. Solche Sets umfassen weiters einen oder mehrere der folgenden Inhaltsstoffe: weitere Reagenzien, die zur Detektion von Cα, δPKC oder εPKC erforderlich sind, das mit dem Farbstoff einen Komplex gebildet hat, positive Kontrollen, negative Kontrollen, Instrumente zum Erhalt von Gewebeproben und dergleichen. Die Erfindung stellt auch Sets zur Bestimmung der Exposition von Zellen gegenüber Ethanol durch Messung der Menge von RI, αPKC, δPKC oder εPKC bereit. Diese RI-, αPKC-, δPKC- oder εPKC-Messsets umfassen einen Farbstoff, der für RI, αPKC, δPKC oder εPKC spezifisch ist. Die RI-, αPKC-, δPKC- oder εPKC-Messsets können weiters einen oder mehrere der folgenden Bestandteile umfassen: weitere Reagenzien zur Detektion von RI, αPKC, δPKC oder εPKC, das mit dem Farbstoff komplexiert wurde, positive Kontrollen für RI, αPKC, δPKC oder εPKC, negative Kontrollen für RI, αPKC, δPKC oder εPKC; RI-, αPKC-, δPKC- oder εPKC-Lösungen bekannter Konzentration; Instrumente zum Erhalt von Gewebeproben und dergleichen. Die Beschreibung offenbart auch Sets zum Testen von Verbindungen auf ihre Fähigkeit, unter Einsatz der Testverfahren der Erfindung Zellantworten auf Ethanol zu modulieren. Diese Sets sind im Wesentlichen dieselben wie die oben beschriebenen Sets zur Messung von Cα-, δPKC- oder εPKC-Zellpositionen und RI-, αPKC-, δPKC- oder εPKC-Mengen, jedoch können solche Sets weiters eine Zelllinie umfassen, die zur Detektion von Veränderungen der Cα-, δPKC- oder εPKC-Lokalisierung nützlich ist.
Exemplarische Versuchsverfahren zur Detektion der Lokalisierung der katalytischen Cα-Untereinheit von PKA und der δ- und ε-Untereinheiten von PKC werden später beschrieben, diese Verfahren sind jedoch nicht entscheidend, und Fachleuten sind andere Verfahren bekannt. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollen die Erfindung nicht einschränken.
VII. BEISPIELE
A. Beispiel 1: Ethanolinduzierte Translokation der katalytischen Cα-Untereinheit von PKA
NG108-15-Zellen wurden auf Objektträgern mit einer einzigen Kammer in einem definierten Medium in einer Dichte von etwa 40.000 ZellenlObjektträger ausplattiert. Die Verfahren und Medien, die zum Züchten der Zellen eingesetzt werden, sind nicht entscheidend und Fachleuten bekannt. Geeignete Verfahren werden von Gordon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2105 (1986), beschrieben. Die Zellen wurden weitere achtundvierzig (48) Stunden lang in dem definierten Medium oder dem definierten Medium, das verschiedene Konzentrationen an Ethanol enthielt (z.B. 25, 50, 100, 200 mM Ethanol), gehalten. Die Medien wurden täglich durch frisches Medium ersetzt (mit oder ohne Ethanol), und die Objektträger wurden in Parafilm gewickelt, um Ethanolverdampfung zu vermeiden. Die Zellen wurden mit Methanol zwei (2) bis drei (3) Minuten lang auf einer gekühlten Oberfläche fixiert, und die Objektträger wurden dann jeweils zweimal fünf (5) Minuten lang in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf Eis fixiert. Danach wurden die Zellen mit blockierendem Puffer (1 % normales Ziegenserum in PBS, die 0,1 % Triton-X-100 enthielt) bei 4 °C sechs (6) bis zwölf (12) Stunden lang inkubiert und dann mit Primärantikörperlösung achtundvierzig (48) Stunden lang bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Die Primärantikörperlösung wurde aus Primärantikörpern hergestellt, die als Reaktion auf Cα gezüchtet wurden (erhältlich von Transduction Laboratories und anderen Unternehmen und von Susan Taylor an der Universität von Kalifornien in San Diego), verdünnt in PBS, die 0,1 % Trito-X-100 und 2 mg/ml fettsäurefreies Rinderserumalbumin enthielt. Die Objektträger wurden wie zuvor gewaschen und im geeigneten FITC-(Fluoresceinisothiocyanat-) konjugierten Sekundärantikörper inkubiert, der in derselben Lösung auf 1:1000 verdünnt wurde.
Nach vierundzwanzig (24) Stunden wurden die Objektträger gewaschen und unter Einsatz von Vectashield^TM-Einbettungsmittel (Vector Labs) mit Deckgläsern versehen. Die Bilder in 1A und 1B wurden unter Einsatz des konfokalen BIO-RAD^TM-1024-Mikroskops hergestellt. Die Bilder in 1C und Fig. AD wurden unter Einsatz eines Leica^TM-DMBR-Mikroskops aufgenommen, das mit einem Fluoresceinfilter ausgerüstet war.
Zur Bestimmung der Reversibilität der Exposition gegenüber Ethanol (Ergebnisse in 1C dargestellt) wurden die Zellen 48 Stunden lang einem Medium ausgesetzt, das 200 mM Ethanol enthielt, dann dreimal mit frischem Medium gewaschen, das kein Ethanol enthielt, und ohne Ethanol weitere achtundvierzig (48) Stunden lang inkubiert. Zur Bestimmung der Spezifität der Bindung des Farbstoffs (Ergebnisse in 1D dargestellt) wurden zwei (2) Stunden vor Inkubation mit den fixierten Zellen 0,1 mg/ml der gereinigten katalytischen Untereinheit zur Primärantikörperlösung zugesetzt.
Um die in 2 dargestellten numerischen Daten zu erhalten, wurden zufällige Felder auf dem Objektträger ausgewählt und die Zellen innerhalb eines Felds als entweder primäre Golgi-Färbung oder primäre nukleare Färbung für Cα aufweisend klassifiziert. Obwohl die Verwendung von nur zwei Arten der Klassifizierung die Bewertung der Zellen erleichtert, kann es wünschenswert sein, Zellen in eine Vielzahl von Klassifikationsgruppen zu klassifizieren, die vom Grad der Färbung an jeder von mehreren Stellen abhängt. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, eine kontinuierliche variable Klassifizierung jeder Zelle bereitzustellen, beispielsweise, wenn die Bildintensität an einem bestimmten Punkt in einer Zelle gemessen wird. Zumindest fünf (5) Felder wurden für eine Gesamtanzahl von zumindest einhundert (100) Zellen pro Objektträger klassifiziert. Der Beobachter wurde über die Versuchsbedingungen der Objektträger nicht informiert. Datenpunkte sind der Mittelwert +/- SEM (Standardfehler der Mittelwerte) von vier (4) Versuchen, *p < 0,05.
Die erhaltenen Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: NG108-15-Zellen, die eine Kontrolle bilden, die nicht Ethanol ausgesetzt worden ist, wurden mit dem spezifischen Farbstoff gefärbt. Cα wurde bei etwa 80 % der Kontrollzellen im perinuclearen Golgibereich festgestellt, Cα wurde vor allem im Nucleus und Zytoplasma nachgewiesen. Diese Lokalisierung der Cα-Untereinheit im Golgi ist zuvor von Nigg und Mitarbeitern beobachtet worden. Nigg et al., EMBO J. 4, 2801–2806 (1985). Zelluläre Lokalisierung von Cα wurde weiters durch die Co-Lokalisierung mit golgispezifischen Markern, einschließlich Mannosidase-II und Ceramid, nachgewiesen. Nigg et al., siehe oben.
Andere Zellproben wurden für einen Zeitraum von achtundvierzig (48) Stunden variierenden Konzentrationen von Ethanol ausgesetzt (25, 50, 100, 200 mM), und der Test wurde wiederholt. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Wie aus 2 ersichtlich ist, weisen 75 % der Zellen, die mit 200 mM Ethanol behandelt wurden, überwiegende Lokalisierung von Cα im Nucleus auf. Ein Mikrobild dieser Zellen wird in 3B gezeigt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen dienen als Referenz, mit der eine Probe von Zellen, die unter dem Verdacht stehen, Ethanol ausgesetzt worden zu sein, verglichen wird. Zur Bereitstellung eines Screens auf ein Arzneimittel oder therapeutisches Mittel zur Entdeckung, ob es eine Auswirkung auf die zellulären Wirkungen von Ethanol hat, kann das obige Verfahren mit dem Arzneimittel wiederholt werden, das im Wachstumsmedium zusätzlich zu Alkohol vorliegt. Da festgestellt wurde, dass 100 mM Ethanol eine beachtliche Wirkung auf die Lokalisierung von Cα-PKA zeigen, kann ein Screen auf ein Arzneimittel bereitgestellt werden, in dem ein einzelnes Wachstumsmedium verwendet wird, das vorzugsweise eine Ethanolkonzentration in der Größenordnung von zumindest 100 mm aufweist, noch bevorzugter 200 mM oder mehr. Selbstverständlich können wie oben beschrieben verschiedene Wachstumsmedien verwendet werden, die unterschiedliche Mengen an Ethanol enthalten, um die Wirksamkeit des Arzneimittels bei unterschiedlichen Werten der Ethanolkonzentration zu untersuchen. Dies kann besonders zur Untersuchung der Wirkungen eines Arzneimittels auf langfristige, geringgradige Exposition gegenüber Ethanol nützlich sein.
Die Ergebnisse der Kontrollprobe können gespeichert werden, sodass es beim Screenen auf ein bestimmtes Arzneimittel nicht notwendig ist, jedes Mal einen Kontrollversuch durchzuführen. Allerdings ist es oft wünschenswert, jedesmal einen Kontrollversuch durchzuführen, wenn ein Arzneimittel gescreent wird, um Schwankungen anderer Faktoren auszugleichen, welche die Ergebnisse beeinflussen können.
Das obige Verfahren ist ausreichend, um die Grundlage für ein Screening zu bilden. Weitere Faktoren, die Auswirkungen auf die Lokalisierung von PKA-Cα und die Aktivität anderer PKA-Untereinheiten haben, sind identifiziert worden. Die folgende Information kann daher von Nutzen sein, um zu beurteilen, wie das Screeningverfahren durch äußere Faktoren beeinflusst werden kann.
Die Reversibilität der Lokalisierung wird in 1C gezeigt, die ein Mikrobild einer ähnlichen Probe achtundvierzig (48) Stunden nach Abziehen des Ethanols ist. Wie ersichtlich ist, war die Mehrheit von Cα in den Golgi-Apparat zurückgekehrt. In einem Screening auf ein Arzneimittel ist es daher wichtig, die Zellen relativ bald nach Entfernung des Mediums zu klassifizieren, für gewöhnlich innerhalb von achtundvierzig (48) Stunden, vorzugsweise innerhalb von zwölf (12) Stunden. Auf ähnliche Weise sollen Proben, die dem Patienten angenommen werden, bald nach der Abnahme klassifiziert werden.
Zum Testen auf die Spezifität des Farbstoffs wurde der Farbstoff durch gereinigtes Cα vor Färbung präabsorbiert, und wie aus 1D ersichtlich ist, ergab sich nahezu keine Färbung, was zeigt, dass der polyklonale Antikörper-Farbstoff für Cα spezifisch ist.
Die Zeitabhängigkeit der Lokalisierung von Cα und die Wirkung anderer Substanzen wurden wie folgt untersucht (3A–3D): NG108-15-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert. Nach zwei (2) Tagen in definiertem Medium erhielten die Zellen Medien, die entweder 200 mM Ethanol (3B), 1 μM Forskolin (3D) oder 10 μM PGE (Prostaglandin-E1) (3C) enthielten, für unterschiedlich lange Zeiträume. Kontrollzellen erhielten zu denselben Zeitpunkten nur frisches Medium. Alle Objektträger wurden vier (4) Tage nach dem Ausplattieren fixiert und wie oben beschrieben auf Cα gefärbt. Ähnliche Versuche wurden unter Einsatz von 25 mM und 50 mM Ethanol über einen Zeitraum von vier (4) bis fünf (5) Tagen durchgeführt, und es wurden vergleichbare Ergenisse erzielt.
Um die in 4 dargestellten numerischen Ergebnisse zu erhalten, wurden wie oben beschrieben Felder ausgewählt, und die Zellen wurden entweder als Zellen bewertet, die über eine Cα-Färbung verfügen, die primär auf den Golgi-Apparat beschränkt ist, oder als Zellen, die über ausgedehnte Färbung außerhalb des Golgi-Apparats verfügen. Die Datenpunkte sind die Mittelwerte +/- SEM von drei (3) Versuchen.
Die Ergebnisse werden nun unter Verweis auf die 3A–3C und 4 beschrieben. 3A zeigt, dass αa sich in den Kontrollzellen wie zuvor im Golgi-Apparat befand, und 3B zeigt, dass nach 48 Stunden Exposition gegenüber Ethanol Cα-Färbung im Nucleus zu finden war. Dies beweist die zuvor beschriebenen Ergebnisse.
Eine Stimulierung mit 10 μm PGE führte zu einer diffusen Färbung der ganzen Zelle, wie im Bild in 3C zu sehen ist. Ähnliche Ergebnisse wurden wie in 3D dargestellt durch Behandlung mit 1 μM Forskolin erzielt. Maximale Translokation von Cα weg vom Golgi-Apparat ereignet sich, mit Forskolin oder PGE, nach etwa dreißig (30) Minuten, was zu jenem Zeitpunkt war, als die Mikrobilder, die in 3C und 3D zu sehen sind, aufgenommen wurden. Darauf folgte eine Desensibilisierung und Rückkehr der Färbung zum Golgi-Apparat.
Dies steht im klaren Gegensatz zu den Wirkungen der Exposition von Ethanol, wo (siehe 4) nach einer relativ kurzen Exposition gegenüber Ethanol (30–60 Minuten) geringe Veränderungen der Lokalisierung von Cα detektiert wurden, nach sechs (6) Stunden Exposition gegenüber Ethanol war die Translokation von Cα vom Golgi zum Nucleus offensichtlich, und nach zwölf (12) Stunden wiesen die meisten Zellen eine deutliche Kernfärbung mit einem entsprechenden Rückgang der Golgi-Färbung auf. Diese Färbung blieb für achtundvierzig (48) Stunden chronischer Exposition gegenüber Ethanol aufrecht.
Daher werden beim Screening auf die Auswirkung von Arzneimitteln auf die Ethanolaufnahme die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Zellen zumindest etwa zwölf (12) Stunden, noch bevorzugter etwa achtundvierzig (48) Stunden (zwei (2) Tage), lang im Wachstumsmedium belassen werden. Die Wirkungen von Ethanolexposition können von den Wirkungen anderer Substanzen unterschieden werden, die eine relativ temporäre reversible Veränderung der Cα-Lokalisierung ergeben.
Die Bewegung und Aktivität anderer PKA-Untereinheiten, besonders von regulierenden Typ-I-(RI-) und Typ-II-(RII-) Untereinheiten wurden ebenfalls untersucht. Es wurden Farbstoffe unter Einsatz monoklonaler Antikörper, die durch herkömmliche immunozytochemische Verfahren erzeugt wurden, analog zu den für die Cα-Untereinheit beschriebenen verwendet. Weder durch Immunfluoreszenz- noch durch Western-Blot-Analyse wurde in NG108-15-Zellen die RII-Untereinheit detektiert, aber die RI-Untereinheit wurde primär am Golgi-Apparat detektiert. Ethanol zeigte keine signifikante Wirkung auf die Lokalisierung der RI-Untereinheit innerhalb der Zelle. Es wurde jedoch herausgefunden, dass die Menge der RI-Untereinheit durch Exposition gegenüber Ethanol verringert wurde. Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse, die zeigten, dass die Exposition gegenüber 200 mM Ethanol über achtundvierzig (48) Stunden keine Auswirkung auf die Menge der Cα-Untereinheit hatte, aber einen Rückgang von etwa 40 % (43 +/- 3 %) der RI-Untereinheit zeigte, sind in den 5A–5B dargestellt. Daher kann ein alternatives Testverfahren bereitgestellt werden, indem die Menge der PKA-RI gemessen wird.
Mit den obigen Ergebnissen können daher die Wirkungen von Ethanol auf NG108-15-Zellen einfach identifiziert werden. Um ein Screening auf therapeutische Mittel oder Arzneimittel zu produzieren, das die Zellwirkungen von Exposition gegenüber Ethanol modulieren, können diese Zellen in Gegenwart eines Arzneimittels, dessen Aktivität untersucht werden soll, Ethanol ausgesetzt werden, und die Ergebnisse können mit jenen von Zellen verglichen werden, die in Abwesenheit des Arzneimittels Ethanol ausgesetzt wurden.
B. Beispiel 2: Ethanolinduzierte Translokation von δPKC und εPKC
Immunhistochemie von δPKC in NG108-15-Zellen, die in definiertem Medium vermehrt wurden, zeigt überwiegende Golgi-Färbung (6A–6C); etwa 70 % dieser Zellen zeigen Golgi-Färbung (Tabelle I). Nach chronischer Ethanolexposition (48 Stunden, 100 mM EtOH) ist δPKC am Perinucleus und Nucleus lokalisiert und fehlt am Golgi-Apparat (6A–6C und 7A–7C). Mehr als 90 % der Zellen zeigen perinukleare und nukleare Färbung (Tabelle I). Die Spezifität der Fluoreszenzfärbung für δPKC zeigt sich durch das Fehlen von Färbung, wenn der Anti-δ-Antikörper vor Markierung der Zelle mit dem immunisierten Peptid vorabsorbiert wird (7). Diese Ergebnisse legen nahe, dass chronische Ethanolexposition eine Translokation von δPKC vom Golgi zum Perinucleus und Nucleus verursacht, da nach chronischer Ethanolexposition wenig δPKC im Golgi-Bereich übrigbleibt (Tabelle I).
Ethanol verändert auch die Lokalisierung von δPKC. In naiven Zellen ist εPKC in mehr als 90 % der Zellen am Perinucleus lokalisiert (8A–8C, 9A–9C und Tabelle I), bei keiner messbaren zytoplasmatischen Färbung. Nach chronischer Ethanolexposition ist die ε-PKC-Färbung bei mehr als 90 % der Zellen im gesamten Zytoplasma zu beobachten (8A–8C, 9A–9C und Tabelle I); perinukleare Färbung ist immer noch in mehr als 90 % der Fällen gegenwärtig (8A–8C, 9A–9C und Tabelle 1). Die Färbung von εPKC scheint spezifisch zu sein, da keine Färbung zu bebachten ist, wenn der Anti-ε-Antikörper mit immunisierendem Peptid vorabsorbiert wird (9A–9C). Eine ethanolinduzierte veränderte Lokalisierung von δPKC und εPKC ist auch nach Exposition gegenüber 25 mM Ethanol über vier (4) Tage (7A–7C und 9A–9C) zu beobachten.
Die ethanolinduzierte veränderte Lokalisierung von PKC-Isozymen könnte ähnlich jener sein, die durch Phorbolester oder Hormone induziert wird, oder kann Stellen ähnlich sein, die sich von diesen späten Aktivatoren unterscheiden. Naive NG108-15-Zellen wurden deshalb zehn (10) Minuten lang in 100 nm PMA inkubiert, um dann die Lokalisierung von δPKC und εPKC zu bestimmen. Bei Aktivierung durch PMA wird das δ-Isozym hauptsächlich zum Perinucleus (6A–6C) transloziert, was nahe legt, dass eine ethanolinduzierte Translokation von δPKC zu Stellen erfolgt, die ähnlich jenen sind, die nach Aktivierung mit PMA besetzt werden. Im Gegensatz dazu führt die Translokation von εPKC aufgrund von PMA-Aktivierungsergebnissen zu nuklearer und perinuklearer Zytoplasmalokalisierung dieses Isozyms, was sich von ethanolinduzierter Translokation zum Zytoplasma unterscheidet (8A–8C).
Die Auswirkungen von Ethanol auf NG108-15-Zellen können daher einfach durch Bestimmung der Lokalisierung von δPKC und εPKC identifiziert werden. Zur Produktion eines Screenings auf therapeutische Mittel oder Arzneimittel, welche die Zellwirkungen der Exposition gegenüber Ethanol modulieren, können diese Zellen in Gegenwart eines Arzneimittels, dessen Aktivität untersucht werden soll, Ethanol ausgesetzt werden, und die Ergebnisse mit jenen verglichen werden, die von Zellen erhalten werden, die in Abwesenheit des Arzneimittels Ethanol ausgesetzt werden. TABELLE 1
Alle Patente, Patentanmeldungen und Publikationen sind hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen.
Die vorangegangene schriftliche Beschreibung wird als ausreichend angesehen, um einem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung auszuführen. Tatsächlich sollen verschiedene Modifikationen der oben beschriebenen Verfahren zur Durchführung der Erfindung, die Fachleuten im Bereich der Zellbiologie oder auf verwandten Gebieten bekannt sind, innerhalb des Schutzumfangs der folgenden Ansprüche liegen.

Claims

Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe, die zumindest eine Zelle mit mehreren Unterbereichen aufweist, Ethanol ausgesetzt war, umfassend: (a) das Applizieren eines Farbstoffs, der spezifische Bindungsaffinität für eine Untereinheit von PKA oder ein Isozym von PKC aufweist, auf die Probe; (b) das Identifizieren des Farbstoffs in einem oder mehreren Unterbereichen der Zelle, wobei die Unterbereiche den Nucleus, Perinucleus und/oder Golgi-Apparat umfassen; (c) das Klassifizieren der Probe gemäß der Verteilung des Farbstoffs in Bezug auf die Unterbereiche der Zelle im Vergleich zu einer Kontrollzelle, die nicht Ethanol ausgesetzt war, worin eine Änderung der Verteilung des Farbstoffs im Vergleich zur Kontrollzelle anzeigt, dass die Probe früher Ethanol ausgesetzt war.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mehreren Unterbereiche der Zelle einen ersten und einen zweiten vorbestimmten Unterbereich der Zelle umfassen und worin die Zelle als erster Typ klassifiziert wird, wenn der Farbstoff vorwiegend im ersten vorbestimmten Unterbereich der Zelle vorhanden ist, und als zweiter Typ, wenn der Farbstoff vorwiegend im zweiten Unterbereich der Zelle vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Zelle einen Nucleus und einen Golgi-Apparat aufweist und der erste Unterbereich der Zelle den Nucleus und der zweite Unterbereich der Zelle den Golgi-Apparat der Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der erste Typ Zellen entspricht, die wesentlich durch Ethanol beeinflusst sind, und der zweite Typ Kontrollzellen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die PKA-Untereinheit Cα von PKA ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Zelle einen Nucleus, Perinucleus und Golgi-Apparat aufweist und der erste Unterbereich der Zelle den Nucleus und den Perinucleus und der zweite Unterbereich der Zelle den Golgi-Apparat der Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der erste Typ Zellen entspricht, die wesentlich durch Ethanol beeinflusst sind, und der zweite Typ Kontrollzellen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das PKC-Isozym δPKC ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Zelle einen Perinucleus und Zytoplasma aufweist und der erste Unterbereich der Zelle das Zytoplasma umfasst und der zweite Unterbereich der Zelle den Perinucleus der Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der erste Typ Zellen entspricht, die wesentlich durch Ethanol beeinflusst sind, und der zweite Typ Kontrollzellen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das PKC-Isozym εPKC ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Klassifikation eine Abbildung der Zelle mithilfe eines Mikroskops umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Probe mehrere Zellen umfasst, wobei das Verfahren weiters eine Wiederholung der Klassifikation für eine Anzahl der mehreren Zellen und den Erhalt eines numerischen Maßes für den Einfluss von Ethanol auf die Proben in Abhängigkeit von der Anzahl an Zellen jedes Typs und der Gesamtanzahl an klassifizierten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der Farbstoff einen Antikörper mit einer detektierbaren Gruppierung und spezifischer Bindungsaffinität, ausgewählt aus der aus PKA Cα, δPKC und εPKC bestehenden Gruppe, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die detektierbare Gruppierung Fluorescein und einen zweiten Antikörper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Zelle von Nervengewebe stammt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Zelle aus der aus Granulozyten und Lymphozyten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Probe vor der Durchführung von Schritt (a) in Gegenwart eines Therapeutikums Ethanol ausgesetzt wird und worin die Ergebnisse der Klassifizierung aus Schritt (c) mit Ergebnissen der Klassifizierung einer Kontrollprobe verglichen werden, die zwar Ethanol, nicht aber dem Therapeutikum ausgesetzt wurde, was eine Angabe über den Einfluss des Therapeutikums auf ethanolvermittelte Zelleffekte bereitstellt.
Screening-Verfahren zur Bestimmung, ob eine Testsubstanz den Einfluss von Ethanol auf Säugetierzellen verändert, umfassend: (a) das Bereitstellen einer Probe, die mehrere Säugetierzellen umfasst; (b) das Bereitstellen eines Kulturmediums, das Ethanol enthält; (c) das Zugeben der Testsubstanz zum Kulturmedium; (d) das Einwirkenlassen des Kulturmediums auf die Zellen für eine vorbestimmte Dauer; (e) das Färben der Zellen mit einem Farbstoff mit spezifischer Bindungsaffinität für eine Untereinheit von PKA oder ein Isozym von PKC; (f) das Klassifizieren jeder Zelle gemäß der Verteilung des Farbstoffs innerhalb der Zelle; und (g) das Vergleichen der Ergebnisse der Klassifikation mit der Verteilung eines Farbstoffs in einer Kontrolle, die nicht der Testsubstanz ausgesetzt wurde, worin eine Änderung der Verteilung des Farbstoffs im Vergleich zur Kontrolle auf Einflüsse einer Testsubstanz auf die Auswirkungen von Ethanol in Säugetierzellen anzeigt.
Screening-Verfahren nach Anspruch 19, worin die Zellen in eine von zumindest zwei Kategorien klassifiziert werden und worin ein numerisches Ergebnis erhalten wird, das vom Anteil an Zellen abhängt, die in eine vorbestimmte Kategorie klassifiziert wurden, und das numerische Ergebnis mit dem numerischen Ergebnis verglichen wird, das aus der Klassifizierung der Kontrollzellen erhalten wurde.
Screening-Verfahren nach Anspruch 19, worin die Zellen zumindest zwölf (12) Stunden lang Ethanol ausgesetzt werden.
Screening-Verfahren nach Anspruch 19, worin die Zellen etwa zwei (2) Tage lang Ethanol ausgesetzt werden.
Screening-Verfahren nach Anspruch 21, worin die Zellen von Nervengewebe stammen und jeweils einen Nucleus, einen Perinucleus und einen Golgi-Apparat aufweisen und worin Zellen als einen wesentlichen Einfluss von Ethanol aufweisend klassifiziert werden, wenn der Farbstoff vorwiegend im Nucleus oder Perinucleus vorhanden ist.
Screening-Verfahren nach Anspruch 23, worin die PKA-Untereinheit oder das PKC-Isozym Cα von PKA bzw. δPKC ist.
Screening-Verfahren nach Anspruch 24, worin die Zellen NG108-15-Neuroblastom-X-Gliomzellen sind.
Screening-Verfahren nach Anspruch 25, worin das Ethanol in einer Konzentration von zumindest etwa 100 mM bereitgestellt wird.
Screening-Verfahren nach Anspruch 19, worin die Zellen einen Nucleus, einen Perinucleus und ein Zytoplasma aufweisen und worin Zellen als einen wesentlichen Einfluss von Ethanol aufweisend klassifiziert werden, wenn der Farbstoff vorwiegend im Zytoplasma vorhanden ist.
Screening-Verfahren nach Anspruch 27, worin das PKC-Isozym εPKC ist.
Screening-Verfahren nach Anspruch 28, worin das Ethanol in einer Konzentration von zumindest etwa 200 mM bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe eine Blutprobe umfasst, die Granulozyten und Lymphozyten enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe zumindest eine Zelle eines Individuums umfasst und die Kontrollzelle aus der aus einer früheren Probe von demselben Individuum und einer in vitro kultivierte Zellen umfassenden Probe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die PKA-Untereinheit oder das PKC-Isozym in einer Zelle, die Ethanol ausgesetzt war, in einem vorbestimmten Unterbereich der Zelle in einer statistisch signifikant größeren Menge vorhanden ist als in einer Kontrollzelle, die nicht Ethanol ausgesetzt war, und worin die Gegenwart des Farbstoffs im vorbestimmten Zellunterbereich der Testzelle in einer statistisch signifikant größeren Menge als in der Kontrollzelle diesen Einfluss anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus oder das Zytoplasma ist.
Verfahren nach Anspruch 32, worin in der Zelle, die Ethanol ausgesetzt war, der Farbstoff im Nucleus oder im Zytoplasma in einer statistisch signifikant größeren Menge vorhanden ist als in einem zweiten Unterbereich der Zelle.
Verfahren nach Anspruch 34, worin gilt, dass: (i) wenn der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus ist, der zweite Unterbereich der Zelle der Golgi-Apparat ist; und (ii) wenn der vorbestimmte Unterbereich der Zelle das Zytoplasma ist, der zweite Unterbereich der Zelle der Perinucleus ist.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Probe als einen Einfluss von Ethanol aufweisend klassifiziert wird, wenn der Farbstoff im vorbestimmten Zellunterbereich der Testzelle in einer signifikant größeren Menge vorhanden ist als der Farbstoff in einem vorbestimmten Zellunterbereich der Kontrollzelle vorhanden ist, worin gilt, dass: (i) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für PKA Cα aufweist, die Testzelle ein Lymphozyt ist oder von Nervengewebe stammt und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus ist; (ii) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für δPKC aufweist, die Testzelle von Nervengewebe stammt und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus oder Perinucleus ist; und (iii) wenn der Farbstoff spezifischen Bindungsaffinität für εPKC aufweist, die Testzelle von Nervengewebe stammt und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle das Zytoplasma ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die PKA-Untereinheit oder das PKC-Isozym in einer Kontrollzelle, die nicht Ethanol ausgesetzt war, in einem vorbestimmten Unterbereich der Zelle in einer statistisch signifikant größeren Menge vorhanden ist als in einer Zelle, die Ethanol ausgesetzt war, und worin die Gegenwart des Farbstoffs im vorbestimmten Zellunterbereich der Kontrollzelle in einer statistisch signifikant größeren Menge als in der Testzelle anzeigt, dass die Probe früher Ethanol ausgesetzt war.
Verfahren nach Anspruch 37, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Golgi-Apparat oder der Perinucleus ist.
Verfahren nach Anspruch 37, worin gilt, dass: (i) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für PKA Cα oder δPKC aufweist, der vorbestimmte Unterbereich der Zelte der Golgi-Apparat ist; und (ii) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für εPKC aufweist, der zweite Unterbereich der Zelle der Perinucleus ist.
Screening-Verfahren nach Anspruch 19, worin die PKA-Untereinheit oder das PKC-Isozym in einer Zelle, die Ethanol ausgesetzt war, in einem vorbestimmten Unterbereich der Zelle in einer statistisch signifikant größeren Menge vorhanden ist als in einer Zelle, die nicht Ethanol ausgesetzt war, und worin eine Änderung der Farbstoffmenge in diesem vorbestimmten Zellunterbereich der Säugetierzellen im Vergleich zur Kontrolle den Einfluss dieser Substanz anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 40, worin der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus oder das Zytoplasma ist.
Verfahren nach Anspruch 41, worin der Farbstoff in der Zelle, die Ethanol ausgesetzt war, im Nucleus oder im Zytoplasma in einer statistisch signifikant größeren Menge vorhanden ist als in einem zweiten Unterbereich der Zelle.
Verfahren nach Anspruch 42, worin gilt, dass: wenn der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus ist, der zweite Unterbereich der Zelle der Golgi-Apparat ist, und wenn der vorbestimmte Unterbereich der Zelle das Zytoplasma ist, der zweite Unterbereich der Zelle der Perinucleus ist.
Verfahren nach Anspruch 40, worin die Probe als einen Einfluss von Ethanol aufweisend klassifiziert wird, wenn der Farbstoff im vorbestimmten Zellunterbereich der Testzelle in einer signifikant größeren Menge vorhanden ist als der Farbstoff im vorbestimmten Zellunterbereich der Kontrollzelle vorhanden ist, worin gilt, dass: (i) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für PKA Cα aufweist, die Testzelle ein Lymphozyt ist oder von Nervengewebe stammt und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus ist; (ii) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für δPKC aufweist, die Testzelle von Nervengewebe stammt und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Nucleus oder Perinucleus ist; und (iii) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für εPKC aufweist, die Testzelle von Nervengewebe stammt und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle das Zytoplasma ist.
Screening-Verfahren nach Anspruch 19, worin die PKA-Untereinheit oder das PKC-Isozym in einer Zelle, die nicht Ethanol ausgesetzt war, in einem vorbestimmten Unterbereich der Zelle in einer statistisch signifikant größeren Menge vorhanden ist als in einer Zelle, die Ethanol ausgesetzt war, worin eine Änderung der Farbstoffmenge in diesem vorbestimmten Zellunterbereich der Säugetierzellen im Vergleich zur Kontrolle den Einfluss dieser Substanz anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 45, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist und der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Golgi-Apparat oder der Perinucleus ist.
Verfahren nach Anspruch 45, worin gilt, dass: (i) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für PKA Cα oder δPKC aufweist, der vorbestimmte Unterbereich der Zelle der Golgi-Apparat ist; und (ii) wenn der Farbstoff spezifische Bindungsaffinität für εPKC aufweist, der zweite Unterbereich der Zelle der Perinucleus ist.