DE69027982T2 - Quantitative immunocytochemische prüfung - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft die direkte quantitative immuncytochemische Bestimmung von Targetmolekülen in Gewebeproben.
- L. B. Nabors et al, J. of Neuroscience Methods, 26:25-34 (1988) beschreiben Verfahren zum Nachweis der Konzentration der Aminosäure γ-Buttersäure (GABA) aus optischen Dichtemessungen.
- Die US-A-4,816,410 bezieht sich auf Kontroll-Glasträger zur Verwendung in Immunassays mit einem Zellpellet-zurückhaltenden Bereich auf dem Träger.
- Assays zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Target-Molekülen in Gewebeproben bringen typischerweise das Durchführen eines geeigneten biochemischen Tests auf einem Gewebehomogenat mit sich. Assays für den Östrogen-Rezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PR) sind von Wichtigkeit in der Vorhersage einer Tumorantwort und werden routinemäßig in Homogenaten bei Brustkrebs durchgeführt.
- Gewebehomogenate für quanititative biochemische Assays basieren auf einer variablen Zahl von normalen Zellen und Zeilen wie Krebszellen, welche Targetmoleküle exprimieren. Die Immuncytochemie besitzt einen theoretischen Vorteil gegenüber solchen biochemischen Assays, in dem direkt die Gegenwart oder Abwesenheit des Targetmoleküls in relevanten Zellen gemessen wird.
- Bis heute ledoch ist dieser Vorteil nicht realisiert worden, da die gegenwärtige Immuncytochemie auf eine visuelle Bestimmung der Intensität des Immunfärbereaktionsproduktes basiert. Dieses Verfahren hat große Nachteile, welche seine Verwendung als einen prazisen, reproduzierbaren quantitativen Assay ausschließen. Unter anderem sind dies:
- (1) Die verschiedenen Gewebebearbeitungsschriffe (Fixierzeit, Art des Fixativs, Dehydrierung, Einbettung und vergleichbare Verfahren) reagieren auf einige Variationen, insbesondere Verlust des Antigens, welches das Immunfärbesignal modifiziert.
- Diese Variablen sind schwierig zu kontrollieren, da sie von der Fixativkonzentration, Temperatur, Kontaminationen und, sehr wichtig, von der Zeit abhängen.
- (2) Die Dicke des Gewebebereiches ist schwierig zukontrollieren, ein wichtiger Faktor, da die Signastärke als Funktion der Bereichsdicke zunimmt.
- (3) Das Färbeverfahren wird Unterschiede in der Intensität der Immunreaktivität in Abhängigkeit von vielen Variablen, wie Antikörperkonzentration, Timing, Art des verwendeten Chromogens und dergleichen, zeigen.
- Die Erfindung ersetzt das visuelle Bestimmungsverfahren aus dem Stand der Technik durch eine praktische Technik unter Verwendung der Fähigkeit der Immuncytochemie, quantitativ die Gegenwart oder die Abwesenheit eines Tagesmoleküles in den Zellen eines Gewebes oder einer anderen Probe zu messen. Insbesondere stellt die Erfindung eine Kontrolle oder einen internen Standard bereit, der eine bekannte Menge einer mit der Gewebeprobe gleichzeitig zu bearbeitender Menge eines Antigens (oder eines anderen Tagesmoleküles) enthält. Die Kontrolle ist so den gleichen Bedingungen unterworfen, wie die zu bestimmende Gewebeprobe. Z. B. wird eine Abnahme von 30% in der Zugänglichkeit eines zu bestimmenden Antigens gleichzeitig die Kontrolle und die zu überprüfende Probe beeinflussen. Da die Kontrolle Zellen mit einer bekannten Menge eines Antigens oder anderer Targetmoleküle aufweist, kann ein Kompensationsfaktor leicht bestimmt und ein quantitativer Assay der Gewebeprobe erreicht werden.
- Gemäß der Erfindung wird daher ein quantitativer immuncytochernischer Assay bereitgestellt, der
- (i) das Suspendieren von Zellen, die eine bekannte definierte Menge eines Targetmoleküls in einem wäßrigen Agar- oder Gelatinegel bildenden Medium exprimieren,
- (ii) die Bildung eines Agar- oder Gelatinegels mit den darin suspendierten Zellen in der Suspension,,
- (iii) die Bestimmung der optischen Dichte der Zellen in einem Teil des Gels,
- (iv) das Einbringen des Teils des Gels in eine Gewebeschale mit einer Probe des auf das Targetmolekül zu analysierenden Gewebes unter Verwendung von Immunfärbung, so daß der Teil und die Gewebeprobe gleichzeitig fixiert, bearbeitet, eingebettet und gefärbt werden,
- (v) die Bestimmung der optischen Dichte der fixierten, bearbeiteten, eingebetteten und gefärbten Zellen in dem Teil und in der Gewebeprobe,
- (vi) das Messen des Unterschiedes zwischen der optischen Dichte der Zellen, wie sie in Stufe (iii) bestimmt worden sind, mit der optischen Dichte der Zellen, wie sie in der Stufe (v) bestimmt worden sind, und
- (vii) die Nutzung der in Stufe (vi) gemessenen optischen Dichtedifferenz zum Bereitstellen einer quantitativen immunhistochemischen Bestimmung des Targetmolekülgehalts der Gewebeprobe umfaßt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen quantitativen immuncytochemischen Assay für ein Targetmolekül bereit, der
- (i) das gleichzeitige Fixieren, Bearbeiten und Einbeffen eines Teiles eines Agar- oder Geleatinegels der Zellen, die eine bekannte Menge eines Targetmoleküls und einer zu bestimmenden Gewebeprobe zum Exprimieren des Targetmoleküls unter Verwendung von Immunfärbung enthält,
- (ii) das quantitative Bestimmen der Differenz in dem Targetmolekülgeholt des Teils des Gels vor und nach dem Fixieren, Bearbeiten und Einbetten,
- (iii) das quantitative Bestimmen des Targetmolekülgehalts der Gewebeprobe nach dem gleichzeitigen Fixieren, Bearbeiten und Einbetten und
- (iv) das Nutzen der Differenz im Targetmolekülgehalt des Teils, wie sie in Stufe (ii) bestimmt worden ist, um einen quantitativen Assay des Targetmolekülgehalts der zu prüfenden Probe bereitzustellen, umfaßt.
- Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Kontrolle kann ein Bereich oder ein Teil eines Mediums, wie Gelatin, Agar oder jedes andere wäßrige Einbettungsmedium, mit darin eingebetteten Zellen, wie MCF7 (eine bekannte Brustkrebszellinie, welche ER und PR exprimiert) oder BT474 (eine bekannte Zellinie, die ein Brustkrebsonkogen exprimiert) sein, die eine definierte Menge eines Targetmoleküls exprimieren. Insbesondere werden die in der Gewebekultur gewachsenen Zeilen in der Gelatine oder einem anderem Einbettmedium suspendiert, welches anschließend durch Abkühlen oder Polymerisation fest-werden gelassen wird. Das die Zellsuspension enthaltende verfestigte Medium wird in Bereiche oder Scheiben von geeigneter Dicke, e. g. einer Dicke von etwa 2 bis 5 mm geschnitten.
- Die Auswahl des Zelltypes hängt von dem Typ des Antigens oder des anderen zu bestimmenden Moleküls ab. Es gibt eine Fülle von Zellen verschiedener Art, die eine Verschiedenheit von Antigenen oder anderen Molekülen exprimieren. Transfektierte Zellen können verwendet werden. Targetmoleküle, die in einer Probe durch Verwendung der vorliegenden Erfindung quantifiziert werden können, beinhalten z. B. durch Onkogene exprimierte Proteine, Zellwachstumsfaktoren und ledes der verschiedenen Moleküle, die die Zellproliferation steuern.
- Der Pathologe, der z. B. eine Brustbiopsie erhält, die im Verdacht steht, Krebszellen zu enthalten, schließt eine Kontrollscheibe gemäß der Erfindung in die Kassette ein, um sicherzustellen, daß sowohl die Gewebeprobe und die Kontrolle gleichzeitig allen nachfolgenden Verfahren durch das Immunfärben unterworfen werden. Die optische Dichte der gefärbten Krebszellen in der Biopsieprobe wird verglichen mit den Zellen in der Kontrolle, welche als ein interner Standard wirkt. Vorzugsweise wird der Vergleich unter Verwendung eines computergesteuerten Zellanalysesystems, wie eines CAS 200 Bildanalysators (Cell Analysis Systems, Inc., Lombard, Illinois) durchgeführt.
- In Gewebekulturen gewachsene Zellen (MCF7 und BT474), von denen bekannt ist, daß sie eine definierte Menge des zu bestimmenden Antigenes exprimieren, wurden kurz in Formaldehyd fixiert und in einer 3%-igen Agarsung (Difco, Detroit, Michigan) bei 56ºC suspendiert und gelieren gelassen. Gleichförmige Scheiben , 3 mm dick, wurden in Formaldehyd während einer Zeit von 4 bis 72 Stunden fixiert und zusammen in einem einzigen Paraffinblock bearbeitet. Die Querschnittsdimensionen des Blockes waren etwa 2 bis 2,5 cm. 5 µm dicke ge-schnitte Sektionen wurden für einen Östrogenrezeptor (ER-ICA, Abbott, Illinois) und cERB-b2 Onkoprotein (Triton Bios.., Alameda, California) irnmungefärbt. Die Intensität der Immunreaktivität wurde für jede Quantifizierung des immuncytochemischen Gels mit einem CAS 200 Bildanalysator gemessen. Eine progressive Verringerung in der Intensität der Immunreaktivität, welche mit der Länge der Fixierzeit korrelierte, wurde mit beiden Antigenen bestimmt. Signifikanterweise war eine solche Reaktion bei einer herkömmlichen Mikroskopie in den ER-ICA Färbungen nicht feststellbar.
Claims (8)
1. Quantitativer imrnuncytochemischer Assay, der
(i) das Suspendieren von Zellen, die eine bekannte definierte Menge eines
Targetmoleküls in einem wäßriges Agar- oder Gelatinegel bildenden Medium
exprimieren,
(ii) die Bildung eines Agar- oder Gelatinegels mit den darin suspendierten Zellen
in der Suspension,
(iii) die Bestimmung der optischen Dichte der Zellen in einem Teil des Gels,
(iv) das Einbringen des Teils des Gels in eine Gewebeschale mit einer Probe des
auf das Targetmolekül zu analysierenden Gewebes unter Verwendung von
Immunfärbung, so daß der Teil und die Gewebeprobe gleichzeitig fixiert,
bearbeitet, eingebettet und gefärbt werden,
(v) die Bestimmung der optischen Dichte der fixierten, bearbeiteten, eingebetteten
und gefärbten Zellen in dem Teil und in der Gewebeprobe,
(vi) das Messen des Unterschiedes zwischen der optischen Dichte der Zellen, wie
sie in Stufe (iii) bestimmt worden sind, mit der optischen Dichte der Zellen, wie
sie in der Stufe (v) bestimmt worden sind, und
(vii) die Nutzung der in Stufe (vi) gemessenen optischen Dichtedifferenz zum
Bereitstellen einer quantitativen immunhistochemischen Bestimmung des
Targetmolekülgehalts der Gewebeprobe
umfaßt.
2. Assay nach Anspruch 1, in dem das Targetmolekül ein Östrogenrezeptor oder
eine Progesteronrezeptor ist.
3. Quantitativer immuncytochemischer Assay für ein Targetmolekül, der
(i) das gleichzeitige Fixieren, Bearbeiten und Einbetten eines Teiles eines
Agar- oder Geleatinegels der Zellen, die eine bekannte Menge eines Targetmoleküls
und einer zu bestimmenden Gewebeprobe zum Exprimieren des
Targetmoleküls unter Verwendung von Immunfärbung enthält,
(ii) das quantitative Bestimmen der Differenz in dem Targetmolekülgehalt des Teils
des Gels vor und nach dem Fixieren, Bearbeiten und Einbetten,
(iii) das quantitative Bestimmen des Targetmolekülgehalts der Gewebeprobe nach
dem gleichzeitigen Fixieren, Bearbeiten und Einbetten und
(iv) das Nutzen der Differenz im Targetmolekülgehalt des Teils, wie sie in Stufe (ii)
bestimmt worden ist, um einen quantitativen Assay des Targetmolekülgehalts
der zu prüfenden Probe bereitzustellen,
umfaßt.
4. Assay nach Anspruch 3, in dem der Unterschied im Targetmolekülgehalt des in
Stufe (ii) bestimmten Teils durch optische Dichtemessung der Zellen in dem Teil
bestimmt wird.
5. Assay nach Anspruch 3 oder 4, in dem das Targetmolekül ein
Östrogenrezeptor oder ein Progesteronrezeptor ist.
6. Verwendung eines Teils eines Agar- oder Gelatinegels mit darin suspendierten
eine bekannte definierte Menge eines Targetmoleküls exprimierenden Zellen in einem
Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
7. Verwendung eines Teils nach Anspruch 6 in einem Assay nach einem der
Ansprüche 1 bis 5, in dem das Targetmolekül ein durch ein Onkogen, einen
Wachstumsfaktor oder einen Rezeptor exprimiertes Protein ist.
8. Verwendung eines Teils nach Anspruch 6 in einem Assay nach einem der
Ansprüche 1 bis 5, in dem die Zellen MCF7-Zellen oder BT474-Zeilen sind.
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