DE3784465T2

DE3784465T2 - Bestimmung von analyt-konzentration mit zwei etiketten.

Info

Publication number: DE3784465T2
Application number: DE8787306995T
Authority: DE
Inventors: Roger Philip Ekins
Original assignee: Multilyte Ltd
Current assignee: Multilyte Ltd
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1987-08-06
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2007-08-07
Also published as: EP0318491A1; KR960010696B1; EP0271974A1; DE3784465D1; GR3007803T3; KR880701885A; CA1284620C; GB8619206D0; EP0271974B1; ES2039444T3; ZA875825B

Description

Hintergrund der Erfindung

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Analyt-Konzentration in Flüssigkeiten unter Verwendung von zwei verschiedenen Markierungen mittels Immunassayverfahren oder immunometrischer Verfahren, sowie eine Analysevorrichtung und eine Ausrüstung.

Stand der Technik

Es ist bekannt, die Konzentration eines Analyten, wie eines Arzneimittels oder eines Hormons, in einer Flüssigkeit dadurch zu bestimmen, daß die Flüssigkeit einem Bindungsstellen für den Analyten an seinem Molekül enthaltenden Rezeptor ausgesetzt, der gebundenen Analyten enthaltende Rezeptor von der Lösung abgetrennt, ein für den Anteil an verfügbaren, von Analytenmolekülen besetzten Bindungsstellen (teilweise Besetzung) auf dem Rezeptormolekül repräsentativer Wert bestimmt und dieser Wert mit einem entsprechenden, mit einer Lösung bekannter Analyt-Konzentration erhaltenen Meßwert verglichen wird.
Die Messung des betreffenden Werts kann mit einer Rücktitrationstechnik (siehe WO-A-8401031) erfolgen, bei der das gebundenen Analyten enthaltende Rezeptormolekül mit einer markierten Version des Analyten in Berührung gebracht wird. Anstelle von markiertem Analyten kann auch ein anderes markiertes Material verwendet werden, das in der Lage ist, nur diejenigen Analytbindungsstellen auf dem Rezeptormolekül zu besetzen, die nicht von dem Analyten selbst besetzt sind. Diese beiden Systeme werden kompetitive Systeme genannt, weil der markierte Analyt oder das andere markierte Material mit dem zu messenden Analyten um Bindungsstellen auf dem Rezepormolekül konkurriert. In einer weiteren Möglichkeit wird bei der Rücktitrationstechnik das gebundenen Analyten enthaltende Rezeptormolekül mit einem Material, das zur Bindung mit dem gebundenen Analyten oder nur mit den von gebundenem Analyten besetzten Bindungsstellen befähigt ist, in Berührung gebracht, wobei dieses Material selbst markiert ist oder anschließend durch Anbringung einer markierten Markierung markiert wild. Dieses System ist als nicht-kompetitives System bekannt, weil es hier keine Konkurrenz um Bindungsstellen gibt.
Sowohl bei dem kompetitiven als auch bei dem nicht-kompetitiven System wird das Rücktitrations- Reagens (Analyt oder anderes Material) mit einer Markierung markiert. Eine Vielzahl von Markierungen wurden verwendet, beispielsweise Radioisotopen (Radioimmunassay), Enzyme, Chemolumineszenz-Substanzen und fluoreszierende Markierungen (Fluorimmunassay), wobei es sich bei letzteren entweder um ein herkömmliches fluoreszierendes Material wie Fluoreszein oder um ein erst nach Aktivierung und Schätzung durch zeitlich aufgelöste Impuls-Fluoreszein fluoreszierendes Material wie Europium oder ein anderes Lanthanid-Chelat handelt, wobei die durch Abtastung mit einem Lichtstrahl hoher Intensität und entsprechender Wellenlänge aufgezeigte Fluoreszenzstärke ein Maß für die Menge des Materials darstellt, das vom gebundenen Analyten enthaltenden Rezeptormolekül aufgenommen wird.
Die herkömmlichen Testverfahren verließen sich entweder darauf, daß die Gesamtmenge des in jeder Probe vorhandenen Rezeptors genau bekannt war oder auf das Wissen, daß die Rezeptormenge von Probe zu Probe, insbesondere von der unbekannten Probe zu den für Kalibrierungszwecke verwendeten Standardproben, genau gleicht bleibt. Mit Ausnahme des in WO-A-8401031 offenbarten Verfahrens mußte auch das Gesamtvolumen der Probe genau bekannt sein. Diese Erfordernisse beruhen auf der Tatsache, daß das Meßsignal (z.B. Fluoreszenz) in solchen Systemen für die Gesamtmenge an gebundenem, markiertem Material repräsentativ ist und, vorausgesetzt, daß nicht das gesamte markierte Material gebunden wurde (in welchem Fall das System nicht auf Veränderungen in der vorhandenen Analytmenge ansprechen würde), hängt diese Gesamtmenge nicht nur von der teilweisen Besetzung der Bindungsstellen auf dem Rezeptormolekül sondern auch von der vorhandenen Rezeptormolekülmenge ab. Kurz gesagt hing das in den bisher bekannten Fluorimmunoassaytechniken erhaltene Fluoreszenzsignal unweigerlich auf komplexe (und praktisch unbekannte) Weise von der Menge des im System verwendeten Rezeptormoleküls und von der Gesamtmenge an vorhandenem Analyten ab; dies setzt voraus, daß sowohl die Rezeptormenge als auch das verwendete Probenvolumen sorgsam standardisiert werden müssen, um eine korrekte Schätzung der Analyt-Konzentration in der Versuchsprobe zu gewährleisten, wobei eine solche Standardisierung ein charakteristisches und wesentliches Merkmal aller bisher bekannten Fluorimmunassay-Techniken, insbesondere der wie oben definierten, als kompetitiv beschriebenen Techniken darstellt. Es muß besonders hervorgehoben werden, daß bei diesen Techniken die teilweise Besetzung des Antikörpers durch Analyt (und damit das abgegebene Fluoreszenz-Signal) selbst von der vorhandenen Rezeptormenge abhängt; beispielsweise wird durch Erhöhung der Anzahl Rezeptormoleküle um einen gegebenen Faktor auch die Anzahl der von ihm gebundenen Analytmoleküle erhöht, jedoch um einen völlig verschiedenen Faktor, wodurch die teilweise Besetzung des Rezeptors sich wesentlich ändert. Auch die Menge des an den Rezeptor bindenden markierten Materials wird sich erhöhen, aber wiederum auf disproportionale Weise.
WO-A-8401031 offenbart jedoch ein Rücktitrations-Verfahren, bei dem die proportionale Besetzung der Bindungsstellen vom Probenvolumen unabhängig ist.
Die Notwendigkeit einer Standardisierung der verwendeten Rezeptormenge (ein Merkmal, das den bisher bekannten Fluorimmunassay-Techniken und den analogen Verfahren mit anderen Markierungen, wie Radioisotopen, gemeinsam ist) läßt sich nicht nur experimentell nachweisen, sondern ist auch theoretisch unter Berücksichtigung der Massewirkungsgesetze, denen Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Ligand unterliegen, voraussagbar. Dieses Erfordernis wurde darüber hinaus schon lange als schwerer Nachteil dieser Verfahren erkannt, da es große Probleme bei der Qualitätskontrolle von Immunassaysystemen aufwirft, besonders dort, wo der Rezeptor (Antikörper) an einem festen Träger angebracht wird und wo es technisch schwierig sein kann, sicherzustellen, daß genau dieselbe Rezeptormenge an das feste, in jedes Probeninkubationsgemisch eingebrachte Material gekoppelt wird. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß die Fachleute auf diesem Gebiet die an feste Träger gekoppelte Rezeptormenge oft durch Markierung des Rezeptors selbst (beispielsweise mit einem Radioisotop) kontrolliert haben, um die Konstanz der so gekuppelten Menge sicherzustellen. Darüber hinaus haben die Fachleute auf dem Gebiet auch erkannt, daß geringe Schwankungen in der gekoppelten Rezeptormenge teilweise korrigiert werden könnten, wenn durch Verwendung eines solchen Rezeptormarkierungsverfahrens die Abweichung von der Standardrezeptormenge bekannt wäre. Da die teilweise Besetzung von Antikörperbindungsstellen durch den Analyten aber in komplexer und praktisch unbekannter Weise von der vorhandenen Menge sowohl von Rezeptor als auch von Analyt abhängt, sind solche ungefähren Korrekturen nur begrenzt nützlich und werden selten oder überhaupt nicht routinemäßig angewandt.
In der internationalen Patentanmeldung WO 80/02076 wurde beispielsweise vorgeschlagen, die Qualitätskontrolle von Immunassays durch Bereitstellung von zwei verschiedenen Markierungen, vorzugsweise fluoreszierenden Markierungen, im System zu verbessern, wobei eine Markierung an dem konkurrierenden Liganden (wie oben definiert) befestigt wird und eine zweite Markierung an dem Rezeptormolekül angebracht wird. Es wird dort angegeben, daß eine direkte Markierung des Rezeptormoleküls den Vorteil hat, daß das Rezeptormolekül quantitativ bei einem Immunassayverfahren unabhängig von der quantitativen Erfassung des markierten (konkurrierenden) Liganden erfaßt werden kann, so daß das Immunassayverfahren sich selbst kalibriert. Gemäß der bevorzugten Form dieser Erfindung werden eine fluoreszierende Markierung auf dem Rezeptormolekül und eine fluoreszierende Markierung auf dem markierten (konkurrierenden) Liganden quantitativ erfaßt, während die aneinander gebunden sind, und die Menge des in einer unbekannten Probe vorhandenen Analyten wird als Funktion des Verhältnisses der quantitativen Messungen der beiden Markierungen bestimmt.
Aus den Offenbarungen in WO 80/02076 geht hervor, daß mit Ausnahme der Verwendung einer zweiten Markierung die beschriebenen Immunassays auf herkömmliche Weise durchgeführt werden. Bei sogenannten "kompetitiven Immunassays" ist es üblich, genügend Rezeptor zu verwenden, um 30-50% des markierten Liganden und der vorhandenen unmarkierten Analytmoleküle (bei gegen Null gehenden unmarkierten Analyt-Konzentrationen) zu binden. Bei sogenannten "nicht-kompetitiven" Assays werden gewöhnlich noch höhere Rezeptorkonzentrationen verwendet, die fast 100% des vorhandenen Analyten binden. In beiden Fällen ist deutlich, daß das Verhältnis zwischen vom markierten Rezeptor ausgesendeten Signalen und markierter Rücktitrationsmarkierung nicht konstant bleibt, wenn sich die Rezeptormenge ändert. (Bei einem nicht- kompetitiven Assayaufbau erhöht sich beispielsweise durch Verdopplung der Menge an markiertem Rezeptor die Menge an gebundenem Analyt nicht wesentlich; das Verhältnis wird sich deshalb in etwa um die Hälfte verringern. Ähnliche Überlegungen gelten für die in WO 80/02076 diskutierten kompetitiven Systeme.)
Die Offenbarungen in WO 80/02076 erlauben deshalb nur eine grobe ungefähre Korrektur kleinerer Schwankungen der vorhandenen Rezeptormenge in Assaysystemen dieser oben beschriebenen Art und sind bezüglich ihrer Anwendung auf diesen Zweck beschränkt. Kurz gesagt kann sowohl theoretisch wie auch experimentell nachgewiesen werden, daß das Verhältnis der quantitativen Messungen der beiden Markierungen (Markierungsrezeptor bzw. konkurrierender Ligand) nicht allgemein ein Maß für die Analytmenge in einem herkömmlichen Assaysystem auf Rezeptorbasis (beispielsweise ein Immunassay) darstellt und daß die Verwendung dieses Verhältnisses als Reaktionsvariable deshalb im allgemeinen völlig falsche Analytmessungen ergeben wird. Obwohl also die Offenbarungen in WO 80/02076 eine Technik (begrenzter Nützlichkeit) zur gleichzeitigen Überwachung (und ungefähren Korrektur) kleinerer Schwankungen in der vorhandenen Rezeptormenge in individuellen Probeninkubationsröhrchen wie oben beschrieben liefert, wird das Design und die Bedienung von Assaysystemen, in denen das gemessene Verhältnis zweier Markierungen ein genaues und zuverlässiges Maß der Analyt-Konzentration in der Probe darstellt, nicht beschrieben.
Weiter muß betont werden, daß auch wenn es möglich ist - wie gewöhnlich der Fall ist-, die Rezeptormenge sehr genau zu standardisieren (d.h. wo die Rezeptormenge in jedem Inkubationsröhrchen bis auf sehr enge Grenzen konstant gehalten werden kann und eine Korrektur auf die vorhandene Rezeptormenge wie in WO 80/02076 beschrieben weder notwendig noch sinnvoll ist), das erhaltene Immunassaysystem normalerweise "kalibriert" werden muß (d.h. Einbeziehung von Assaystandardsets mit bekannten Analyt-Mengen), was im Stand der Technik gebräuchlich ist. Soweit in WO 80/02076 geltend gemacht wird, daß ein Immunassay durch die Markierung des Rezeptors "selbstkalibrierend" wird, hat das Gültigkeit nur in dem eingeschränkten Sinn, daß kurzfristige Schwankungen in der Effizienz der Signalerfassungsgeräte (z.B. dem Radioisotopenzähler, Fluoreszenzmesser, usw. je nach verwendeter Markierung) ebenfalls korrigiert werden können (da zu erwarten wäre, daß eine Verringerung der Erfassungseffizienz für eine Markierung von einer in etwa proportionalen Verringerung der Erfassungseffizienz für die andere Markierung begleitet würde, wodurch das Verhältnis ungefähr konstant bliebe).
Zusammengefaßt bietet die Offenbarung in WO 80/02076 höchstens die Mittel für eine ungefähre Korrektur für a. kleinere Schwankungen in der verwendeten Rezeptormenge in Assays auf Rezeptorbasis und b. kleinere, kurzfristige Schwankungen in der Signalerfassungseffizienz von Markierungsmeßgeräten. Diese Korrekturen sind von zweifelhafter Gültigkeit und beschränktem Wert und werden aus diesen Gründen nicht routinemäßig für Assays verwendet.

Zusammenfassung der Erfindung

Meine vorliegende Erfindung betrifft Rezeptorbestimmungen, deren Konzept und Design sich völlig von den in WO 80/02076 vorgesehenen oder beschriebenen unterscheidet und bei denen die teilweise Besetzung des Rezeptors ein echtes, genaues und zuverlässiges Maß für die Analyt-Konzentration im Medium darstellt (unabhängig von den vorhandenen Gesamtrezeptor- bzw. Analytmengen). Diese Systeme (in WO 80/02076 weder angesprochen noch vorgesehen) hängen notwendigerweise und spezifisch von der Messung der teilweisen Analytbesetzung des Rezeptors ab, d.h. von der Messung des Verhältnisses unbesetzter (oder besetzter) Rezeptorstellen zu Gesamtrezeptorstellen (oder eines im wesentlichen gleichwertigen Verhältnisses, beispielsweise das Verhältnis unbesetzte Stelle/besetzte Stelle) und erfordern deshalb wünschenswerterweise die getrennte Markierung dieser beiden Stellenklassen. Ich habe unter anderem gefunden, daß es bei diesen Systemen notwendig ist, die relativen Mengen an Rezeptor und Analyt sowie deren Affinität zueinander so zu bemessen, daß die Einleitung des Rezeptors in die Versuchsprobe keinen wesentlichen Einfluß auf die darin enthaltende Analyt-Konzentration hat.
Gemäß vorliegender Erfindung schaffe ich deshalb ein Verfahren zur Bestimmung der Analyt- Konzentration in einer Probe mit unbekannter Flüssigkeit, bei dem die Probe mit einem Bindungsstellen für den Analyten aufweisenden und mit einer ersten Markierung markierten Rezeptormolekül in Berührung gebracht wird, wodurch ein Teil der Bindungsstellen auf dem Rezeptormolekül durch den Analyten besetzt werden, der teilweise besetzte Bindungsstellen aufweisende Rezeptor mittels einer ein System mit einer von der ersten Markierung unterschiedlichen zweiten Markierung einschließenden Rücktitrationstechnik zurücktitriert wird, die relativen Stärken der beiden von den beiden Markierungen erzeugten Signale gemessen werden, um einen für die teilweise Besetzung der Bindungsstellen durch den Analyten auf dem Rezeptormolekül repräsentativen Wert zu liefern, und dieser Wert mit einem oder mehreren entsprechenden, auf dieselbe Weise erhaltenen Werten unter Verwendung von einer oder mehreren Proben mit Standard-Flüssigkeit bekannter Analyt-Konzentration verglichen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben mit unbekannter Flüssigkeit und die Proben mit Standard-Flüssigkeit jeweils mit einer solchen kleinen Rezeptormenge unter Berücksichtigung seiner Affinitätskonstanten mit dem Analyten in Berührung gebracht werden, daß nur ein unbedeutender Teil des Analyten an den Rezeptor gebunden wird.
Wenn ich von einem unbedeutenden Teil des Analyten spreche, so meine ich einen Teil, der so klein ist, daß die durch die erlaubte Änderung der anfänglichen Analyt-Konzentration eingeführten Fehler genauso klein wie bzw. kleiner als die unweigerlich in das Meßverfahren durch Beschränkungen der Probengenauigkeit und Reagensmanipulationen, Signalmessung, Standardisierung, Temperaturschwankungen und dergleichen eingeführten Fehler sind. Allgemein gesagt gibt es üblicherweise (insgesamt) bis zu 10% oder weniger solcher Fehler, so daß es deshalb wahrscheinlich ist, daß die Bindung von 5% oder weniger des Gesamtanalyten in den Versuchproben zu aus dieser besonderen Quelle stammenden Meßfehlern innerhalb der Probe führt und nur in vernachlässigbarer Weise zum Gesamtwert beiträgt. Trotzdem kann diese Grenze manchmal ohne Nachteile überschritten werden. Idealerweise ist es jedoch vorzuziehen, den Meßfehler durch Verringerung der an den Rezeptor gebundenen Analytmenge auf 1-2% (oder weniger) der Gesamtmenge zu minimieren.
Sofern nur ein unbedeutender Teil des Analyten gebunden wird, fand ich, daß die teilweise Besetzung F der Bindungsstellen auf dem Rezeptormolekül mit der Analyt-Konzentration in der Probe nach folgender Gleichung (bei thermodynamischem Gleichgewicht) in Beziehung steht:
wo [A] die Analyt-Konzentration in der Probe und K die Affinitätskonstante des Rezeptors für den Analyten darstellt und eine Konstante bei vorgegebener Temperatur ist.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder beliebige bekannte Markierungstyp verwendet werden, beispielsweise Radioisotopen (beispielsweise radioaktives Jod), Chemolumineszenz-Substanzen, fluoreszierende Markierungen und Enzyme. Diese können auf herkömmliche Weise an dem Rezeptormolekül und dem Rücktitrationsreagens angebracht werden. Die beiden Markierungen sind gewöhnlich vom gleichen Typ, aber voneinander verschieden. Die Markierungen werden auf eine ihrer Art angemessene Weise quantitativ erfaßt, beispielsweise durch Zählung der Radioaktivität einer radioaktiven Markierung oder Abtastung einer fluoreszierenden Markierung mit einem Lichtstrahl, gegebenenfalls nach Aktivierung. Vorzugweise werden fluoreszierende oder potentiell fluoreszierende Markierungen verwendet. Die beiden fluoreszierenden Markierungen können gleichzeitig durch Abtastung mit einem einzigen Lichtstrahl entsprechender Wellenlänge angeregt werden um die relativen Stärken der beiden Fluoreszenzsignale zu messen. Dieses Verhältnis ist direkt repräsentativ für die teilweise Besetzung der Bindungsstellen des Rezeptors und unter den obengenannten Bedingungen unabhängig von der genauen vorhandenen Rezeptormenge und vom den Anteil an der Gesamtmenge, der für die Bestimmung durch Abtastung mit dem Lichtstrahl verbraucht wird. Es ist deshalb nicht mehr notwendig, nicht schwankende oder genau bekannte Rezeptormengen zu verwenden, und die Oberflächendichte des Rezeptors auf seinem Substrat muß auch nicht mehr gleichmäßig sein.
In einem anderen Aspekt umfaßt meine Erfindung die Bildung markierter Produkte als Zwischenstufen in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei jene markierten Produkte mit einer ersten, vorzugsweise fluoreszierenden Markierung markierte und Bindungsstellen, von denen ein Teil von Molekülen eines Analyten besetzt sind, aufweisende Rezeptormoleküle, wobei dieser Anteil völlig repräsentativ ist für die Analyt-Konzentration in einer Probe, mit der die Rezeptormoleküle in Berührung gebracht wurden, weil nur eine Spurenmenge des Rezeptors relativ zum Analyten verwendet wurde, sowie ein entweder direkt oder indirekt an die besetzten Bindungsstellen oder an die unbesetzten Bindungsstellen gebundenes und mit einem zweiten, vorzugsweise fluoreszierenden und von der ersten Markierung unterschiedlichen Markierung markiertes Material enthalten.
Ein weiterer Aspekt meiner Erfindung schafft eine Ausrüstung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Bestimmung der Analyt-Konzentration in einer Flüssigkeitsprobe, wobei jene Ausrüstung ein festes Substrat mit daran gebundenen Molekülen eines mit einer ersten, vorzugsweise fluoreszierenden Markierung markierten Rezeptoren mit Bindungsstellen für einen Analyten umfaßt, wobei die Rezeptormenge auf dem Substrat entsprechend der Größe der Flüssigkeitsprobe ausgewählt wird, so daß nur ein unbedeutender Teil des Analyten in der Probe an den Rezeptor gebunden wird, wobei eine oder mehrere Standard-Lösungen bekannte Konzentrationen des Analyten und ein mit einer zweiten, vorzugsweise fluoreszierenden Markierung, die sich von der ersten unterscheidet und direkt oder indirekt entweder an den gebundenen Analyten oder an die durch den gebundenen Analyten besetzten Bindungsstellen oder an die nicht durch den gebundenen Analyten besetzten Bindungsstellen binden kann, markiertes Rücktitrations- Reagens enthalten.
Die erfindungsgemäße Ausrüstung schließt vorzugweise ein erweitertes festes Substrat, wie eine Platte oder Stange, ein, mit einer Mehrzahl verschiedener, jeweils Bindungsstellen an ihrem Molekül für einen Analyten aufweisender Rezeptoren an einer Mehrzahl von beabstandeten Stellen, wobei der Rezeptor an jeder beliebigen Stelle Bindungsstellen aufweist, die spezifisch sind für einen sich von dem Analyten, für den der Rezeptor an einer oder mehreren anderen Stellen spezifische Bindungsstellen aufweist, unterscheidenden Analyten, wobei jeder der Rezeptoren mit einer Markierung markiert ist.
In der beiliegenden Zeichnung zeigen
Figur 1 schematisch ein kompetitives und ein nicht-kompetitives System gemäß der Erfindung und
Figur 2 eine perspektivische Ansicht eines erfindungsgemäßen analytischen Werkzeugs.
Bezugnehmend auf Figur 1 zeigt das Diagramm markierte Rezeptoren 2, die durch einen ersten mit einem ersten Fluorophor (nicht gezeigt) auf der Oberfläche eines festen Trägers 1 markierten Antianalyt-Antikörper beispielhaft verdeutlicht sind. Der Rezeptor 2 hat auf seinem Molekül Bindungsstellen, die teilweise durch Analyt-Moleküle 3 besetzt sind. Im nicht-kompetitiven System A sind die gebundenen Analyt- Moleküle 3 wiederum an ein markiertes Material gebunden, das durch einen zweiten, mit einem zweiten Fluorophor (nicht gezeigt) markierten Antianalyt- Antikörper 4 beispielhaft verdeutlicht wird. Im kompetitiven System B sind diejenigen Bindungsstellen auf den ersten Antianalyt-Antikörpern 2, die nicht durch den Analyten 3 besetzt sind, von einem markierten Reagens, das durch einen antiidiotypischen Antikörper 5, der ebenfalls mit dem zweiten Fluorophor (nicht gezeigt) markiert ist, beispielhaft verdeutlich wird, besetzt. Das gesamte System wird von einem Laserstrahl 6 abgetastet, und das erste Fluorophor sendet α-Photonen 7 und das zweite Fluorophor β-Photonen 8, die sich von den α-Photonen in irgendeiner Eigenschaft oder Wirkung unterscheiden, aus. Sowohl die α-Photonensignale als auch die β-Photonensignale werden gleichermaßen durch Veränderungen in der Gesamtmenge oder Oberflächendichte des ersten vorhandenen Antianalyt-Antikörpers beeinflußt, vorausgesetzt, daß die teilweise Besetzung von Bindungsstellen unverändert ist, aber nur das α-Photonensignal wird von Änderungen in der teilweisen Besetzung der Bindungsstellen durch den Analyten beeinflußt, indem es sich im nicht- kompetitiven System mit zunehmender Besetzung verstärkt, aber im kompetitiven System mit zunehmender Besetzung verringert. Das Verhältnis der beiden Signale hängt also von der teilweisen Besetzung, aber nicht von der Gesamtmenge des ersten Antianalyt-Antikörpers ab.
Meine Erfindung kann zur Schätzung jedes beliebigen Analyten, für den ein Rezeptor mit entsprechenden Bindungsstellen in seinem Molekül bekannt ist oder hergestellt werden kann, eingesetzt werden. Sie kann besonders für die genaue Schätzung von Konzentrationen im pikomolaren oder nanomolaren Bereich sowie von höheren Konzentrationen im mikromolaren Bereich, beispielsweise 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5;, eingesetzt werden. Zu auf diese Weise schätzbaren Analyten zählen Hormone, wie Schilddrüsenhormone oder Steroidhormone, z.B. Kortisol, Vitamine, Proteine und Proteinhormone wie Insulin und Gonadotropine, Viren, Arzneimittel, Gifte und andere normale oder anomale Bestandteile menschlicher oder tierischer Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Speichel, Urin oder dergleichen. Beispiele solcher Analyten sind in der oben erwähnten WO 80/02076 aufgeführt, und deren Konzentrationen können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden. Spurenverunreinigungen wie Toxine, Fremdproteine und dergleichen in Lebensmitteln und biologische Verunreinigungen in Wasser und anderen flüssigen Medien können ebenso geschätzt werden. Der zu schätzende Analyt in einer Probe kann in Gleichgewicht mit demselben reversibel an ein Bindungsmittel wie ein endogenes Bindungsprotein gebundenen Analyten vorliegen, wobei die Konzentration des freien Analyten mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen wird. Alternativ kann die Probe keinen reversibel gebundenen Analyten enthalten, und die Erfindung kann für solche Messungen von größerer Bedeutung sein, da der reversibel gebundene Analyt nicht zur Dissoziation und damit Pufferung von Veränderungen in der Analyt- Konzentration durch seine Aufnahme vom Rezeptormolekül zur Verfügung steht.
Der verwendete Rezeptor besitzt auf seinem Molekül Bindungsstellen für den zu schätzenden Analyten. Diese Bindungsstellen sollten in im wesentlichen konstanter Anzahl vorliegen und sollten daher lieber chemische Bindungsstellen als nichtspezifische physikalische Adsorptionsstellen sein. Sie sollten darüber hinaus im Vergleich zu einem beliebigen anderen Inhaltsstoff der Schätzprobe zur alleinigen Besetzung durch den Analyten befähigt sein und werden deshalb vorzugsweise für den Analyten spezifisch sein. Antikörper, z.B. monoklonale Antikörper, sind besonders bevorzugte Rezeptormoleküle, aber für individuelle Analyten spezifische Enzyme sind weitere Beispiele verwendbarer Rezeptormoleküle. Antikörper für eine Vielzahl von Analyten sind bekannt oder in der Literatur beschrieben oder sind im Handel erhältlich, und andere, für andere Hormone usw. spezifische Antikörper können mit bekannten Methoden hergestellt werden, die nicht Teil vorliegender Erfindung ausmachen. Um die Meßgenauigkeit zu optimieren, wird vorzugsweise ein Rezeptor mit einer solchen Affinitätskonstante für den Analyten gewählt, daß zwischen 25% und 75% der Bindungsstellen auf dem Rezeptormolekül von dem Analyten in seiner erwarteten Konzentration in der unbekannten Probe besetzt werden, d.h. sie hat eine Affinitätskonstante von einem Drittel bis dem Dreifachen des reziproken Werts der erwarteten Analyt-Konzentration. Affinitätskonstanten für Rezeptoren können mit einer Scatchard-Standardanalyse bestimmt werden (Ann. N.Y. Sci., 51 (1949, 660),.
Die zu markierenden Größen für die fluorometrische immunanalyse oder das Fluroimmunassay, ob es sich dabei um Antikörper (sowohl Antianalyt als auch antiidiotypisch), Enzyme, Analyten oder dergleichen handelt, können entweder mit herkömmlichen fluoreszierenden Materialien wie Fluoreszein oder mit in zeitlich aufgelöster Impulsfluoreszenz verwendbaren Materialien wie Europium und anderen Lanthanid-Chelaten markiert werden, siehe beispielsweise S. Dakubu und andere: "High sensitivity pulsed-light time-resolved fluoroimmunassay" in "Practical Immunassay herausgegeben von W. Butt, Marcel Dekker Inc. (1984) auf Seiten 71-101, und beide Materialtypen werden von dem Begriff "fluoreszierende Markierung" umfaßt. Verfahren zur Markierung von Größen mit fluoreszierenden Markierungen für eine angemessene (ausreichend hohe) spezifische Aktivität (Verhältnis markierter Moleküle zu Molekülen insgesamt oder Bindungsstellen) sind im Stand der Technik bekannt und in der Literatur beschrieben, beispielsweise in "Alternative Immunassays", herausgegeben von W.P. Collins, verlegt von John Wiley & Sons Ltd., 1985, insbesondere Kapitel 13, und in den darin aufgeführten Literaturstellen wie Soini E. und Hemmilaa I., "Fluoroimmunassay: present status and key problems" Clin. Chem., 25, 353-361 (1979). Die europäischen Patentanmeldungen 2963 und 64484, die britische Patentschrift 1560402 und die internationale Patentanmeldung WO 86/01064, die ich mit beantrage, sowie die im Text oder Recherchenbericht genannten Literaturstellen, wie auch die oben erwähnte WO 80/02076 sind weitere Literaturbeispiele zu diesem Thema. Mit solchen Techniken können die in vorliegender Erfindung zu verwendenden Rezeptormoleküle markiert werden. Die Markierung ist auch durch Einarbeitung einer fluoreszierenden Einheit in ein geeignetes Material mit einer rekombinanten DNS-Technik möglich. Wie oben erwähnt liegt auch die Markierung mit radioisotopischen, chemolumineszenten und anderen Markierungen im Bereich der Erfindung.
Zur Verwendung bei der Rücktitrationstechnik geeignete Reagenzien im kompetitiven System, beispielsweise mit einem antiidiotypischen Antikörper oder einem markierten Analyten, oder in einer nichtkompetitiven System, beispielsweise mit einem Antianalyt-Antikörper, sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt oder können auf herkömmlich Weise hergestellt werden. Die Reagenzien können ihrerseits mit einer Markierung versehen sein, vorzugsweise einer fluoreszierenden Markierung, die wiederum von bekanntem oder herkömmlichem Typ ist und wiederum mit einer bekannten oder herkömmlichen Technik angebracht wird, entweder vor Gebrauch, oder sie können in situ mit einem weiteren Reagens, das selbst mit einem solchen Markierungsmittel markiert ist, umgesetzt werden. Sie müssen sich nicht von den in herkömmlichen Immunassay- Techniken mit unmarkierten Rezeptormolekülen verwendeten Rücktitrations-Reagenzien unterscheiden, außer wenn dies notwendig ist, beispielsweise um sicherzustellen, daß bei Verwendung von zwei fluoreszierenden Markierungen Signale ausgesendet werden, die bei gleichzeitiger Abtastung mit einem Lichtstrahl unterschieden werden können, wenn eine solche Technik verwendet wird. Die Rücktitration kann nach der Abtrennung des ungebundenen Analyten von den Rezeptormolekülen erfolgen (zweistufige Analyse) oder, unter der Voraussetzung eines bekannten Probenvolumens, gleichzeitig mit Kontakt zwischen dem ungebundenen Analyten und den Rezeptormolekülen (einstufige Analyse).
Die von den beiden Markierungen ausgesendeten Signale lassen sich auf verschiedene Wege unterscheiden, beispielsweise über die Wellenlänge der ausgesendeten Photonen, über den zeitlichen Verfall der Fluoreszenz bei zeitlich aufgelöster Impulsfluoreszenz (wobei beide oder nur eine der Markierungen ein solchen Verfall zeigt) oder über Polarisation. Die Wellenlängen, Zeitverfallmuster usw. von einer Vielzahl von Markierungssystemen sind in der Literatur bereits bekannt, und andere lassen sich durch bekannte Techniken bestimmen. Die beiden Markierungen sollten Signale erzeugen, die sich ausreichend voneinander unterscheiden, um vom Meßinstrument aufgelöst werden zu können. Die Merkmale der von einer Vielzahl von fluoreszierenden Markierungen unter bestimmten Bedingungen ausgesendeten fluoreszierenden Signale sind bereits bekannt oder in der Literatur beschrieben, und die von anderen können auf herkömmliche Weise bestimmt werden. Die Auswahl eines angemessenen Markierungspaars liegt somit im fachlichen Können des Experten.
Obwohl die Messung des Verhältnisses der Signale grundsätzlich in Lösung vorgenommen werden könnte, würde dies die vollständige Entfernung des gesamten markierten Rücktitrations-Reagenzes, das nicht an das System markiertes Rezeptormolekül/gebundener Analyt gebunden ist, erfordern, beispielsweise mit einem Immunadsorptionsmittel, vor Durchführung der Messung, und ein solcher Entfernungsschritt ist nicht zweckmäßig. Ich ziehe es deshalb vor, wenn die markierten Rezeptormoleküle als Monoschicht an ein festes Substrat gebunden sind und vom restlichen ungebundenen Analyten und dem restlichen ungebundenen markierten Rücktitrations-Reagens, das in der (den) Flüssigkeit(en), in der/denen die Analyse durchgeführt wird, vorliegt, abgetrennt werden, bevor das Signalverhältnis gemessen wird. Geeignete Substrate bestehen aus Glas, Kunststoff oder dergleichen, und die Techniken zur Bindung von Rezeptormolekülen wie Antikörpern an solche Oberflächen sind bekannt und können für die erfindungsgemaßen Zwecke eingesetzt werden, siehe beispielsweise US Patente 4399217, 4381291, 2357311, 4343312 und 4260679.
In einer weiteren Erfindung besteht dabei die Möglichkeit, eine Vielzahl von verschiedenen markierten Rezeptormolekülen an voneinander beabstandeten Stellen auf einem einzigen ausgedehnten, festen Substrat wie einer Platte oder Stange, beispielsweise aus inertem Kunststoffmaterial wie Polystyrol zu binden, wobei jede der verschiedenen Stellen mit Rezeptormolekülen mit Bindungsstellen für einen bestimmten Analyten versehen ist, so daß verschiedene Stellen verschiedene Analyten binden. Eine solche Vorrichtung mit vielen Stellen kann dann zur Schätzung der Konzentrationen einer Vielzahl von Analyten in einer einzigen Flüssigkeitsprobe verwendet werden, wobei getrennte markierte Rücktitrations-Reagenzien für jeden Analyten vorgesehen sind, so daß jedes Markierungspaar unterschieden und das Verhältnis der Signalstärken bestimmt werden kann. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn eine Flüssigkeit wie eine Körperflüssigkeit mehrere verschiedene interessierende Bestandteile enthält oder enthalten kann und von jedem Bestandteil die Konzentration bekannt sein muß. (Obwohl die Verwendung von markierten Rezeptormolekülen die Herstellung einer solchen Vorrichtung mit mehreren Stellen erleichtert, da die Rezeptormolekülmenge nicht an jeder Stelle und in jeder Vorrichtung gleich sein muß, wäre es auch möglich, eine solche Platte durch Verwendung unmarkierter Rezeptormoleküle herzustellen, vorausgesetzt, die Rezeptormolekülmenge auf jeder Stelle könnte durch andere Mittel genau bestimmt werden und/oder könnte genau reguliert werden, damit sie von Vorrichtung zu Vorrichtung konstant ist.).
Ein solches Analysewerkzeug is in Figur 2 der beiliegenden Zeichnung gezeigt. Bezugnehmend auf diese Figur besteht eine Platte 20 von rechteckiger oder anderer geeigneter Gestalt aus Polystyrol oder einem anderen inerten Material. Sie besitzt eine Mehrzahl von Vertiefungen oder Näpfchen 21, deren Größe jeweils zur Aufnahme eines ebenfalls aus Polystyrol oder einem anderen inerten Material bestehenden Mikrokügelchen 22 bemessen ist und die zweckmäßigerweise einen Durchmesser von ungefähr 1 mm oder weniger aufweist. Diese Kügelchen wurden zuvor auf herkömmliche Weise in einen Rezeptor, wie einen Antikörper, enthaltenden Lösungen eingeweicht, um den Rezeptor als Schicht auf der Kügelchenoberfläche abzuscheiden, wobei verschiedene Kügelchen in verschiedenen Lösungen mit verschiedenen Rezeptoren eingeweicht werden und die verschiedenen Rezeptoren entsprechend den zu schätzenden Analyten ausgewählt und gegebenenfalls mit einem entsprechenden Markierungsmittel markiert werden. Die Mikrokügelchen 22 werden in den Näpfchen 21 durch einen angemessenen inerten Klebstoff, beispielsweise einen herkömmlichen handelsüblichen Polystyrol- Klebstoff, zurückgehalten.
Im Gebrauch einer solchen Vorrichtung mit markierten Mikrokügelchen werden die Mikrokügelchen 22 auf der Platte 20 mit der zu schätzenden, Analytenenthaltenden Probe und danach mit geeigneten Rücktitrations-Reagenzien mit entsprechenden Markierungen in Berührung gebracht, wonach die relativen Signal stärken der beiden Markierungen geschätzt werden. Für verschiedene Kügelchen und Rücktitrations-Reagenzien werden verschiedene Markierungen ausgewählt, damit die Ablesung für ein Kügelchen getrennt von der Ablesung für ein anderes Kügelchen vorgenommen werden kann, oder alternativ wird jedes Kügelchen getrennt abgelesen, wobei letztere Möglichkeit durch Verwendung eines fluoreszierenden oder fluorogenen Markierungsmittels erleichtert wird.
Eine solche Vorrichtung kann auf zahlreichen anderen Wegen hergestellt werden. Beispielsweise könnte auf die Kügelchen 22 verzichtet und die Rezeptoren direkt in die Näpfchen 21 als Lösungen eingebracht werden, und die Lösungsmittel könnten gegebenenfalls unter Zurücklassung fester Schichten entfernt werden. Oder es könnte auf die Kügelchen und auf die Näpfchen verzichtet werden, und die Rezeptoren könnten auf geeignete Weise auf die Plattenoberfläche gedruckt werden. Die Platte könnte auch durch eine Stange oder eine andere Basis ersetzt werden. Es könnten nur zwei oder viel mehr, beispielsweise 5, 10 oder mehr, verschiedene Rezeptoren anwesend sein, und die Anzahl der verschiedenen Stellen mit demselben Rezeptor könnte eins oder mehr betragen, wobei durch Verwendung von mehreren Stellen mit demselben Rezeptor die Ergebnisse von einer einzigen Stelle überprüft werden könnten.
Zur Messung von Impulsfluoreszenzsignalen von Materialien auf festen Substraten, beispielsweise Platten, befähigte Instrumente sind bekannt, beispielsweise die Instrumente von CyberFluor Inc., Toronto, Ontario, Kanada, wie auch Instrumente zur Messung von Signalen in Lösung bekannt sind. Wenn keine Instrumente zur direkten Messung des Verhältnisses in einem einzigen Schritt zur Verfügung stehen, ist es möglich, aber weniger bevorzugt, die beiden Signale getrennt zu messen und aus diesen Messungen ein Verhältnis mit entsprechenden Sicherungen aufzubauen. Die obenerwähnte WO 80/02076 beschreibt andere Meßinstrumente, die in vorliegender Erfindung verwendet werden können. Bei dem abtastenden Lichtstrahl handelt es sich vorzugsweise um einen monochromen oder im wesentlichen monochroinen Strahl hoher Intensität, insbesondere einen Laserstrahl. Die Wellenlängen zur Erregung der Fluoreszenz mit dem abtastenden Lichtstrahl sollten entsprechend der Art der fluoreszierenden Markierung gemäß den bekannten Prinzipien gewählt werden, und es ist eindeutig vorzuziehen, daß die beiden Signale von einem Strahl einer einzigen Wellenlänge erregt werden können und tatsächlich erregt werden. Die Impulsfluoreszenz mit zeitlicher Auflösung ist die bevorzugte Methode für mindestens eine der Markierungen, da damit die Hintergrundstörungen leichter ausgesondert werden können, aber sie stellt keinen wesentlichen Teil meiner Erfindung dar. Wenn andere Markierungsarten verwendet werden, werden stattdessen geeignete Standardzähl- oder- schätzvorrichtungen und- verfahren eingesetzt.
Da die Erfindung mit Antikörpern und anderen Rezeptormolekülen in solch kleiner Menge und mit einer solchen Affinitätskonstanten für den zu schätzenden Analyten betrieben wird, daß nur ein unbedeutender Teil (üblicherweise weniger als 5%, vorzugweise weniger als 1%) der Gesamtmenge des vorhandenen Analyten in der Probe an die Rezeptormoleküle gebunden wird, ist es überflüssig, eine Probe mit bekanntem Volumen für die Konzentrationsbestimmung oder Proben mit konstantem Volumen für die Kalibrierungstests zu verwenden, und es ist auch nicht notwendig, ein solches Volumen genau, wenn überhaupt, zu messen, vorausgesetzt, es ist im Verhältnis zur Rezeptormenge ausreichend groß, daß nur ein unbedeutender Teil des Analyten an den Rezeptor gebunden wird. Die Vorrichtung kann deshalb als Sonde zur Überwachung gemischter Analyt-Konzentrationen in großen Flüssigkeitsmengen, wie sie bei industriellen Verfahren vorkommen, verwendet werden.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß bei Verwendung von fluoreszierenden Markierungen und Abtastung mit einem Lichtstrahl der Lichtstrahl nicht die gesamte, die Rezeptormoleküle enthaltende Stelle umfassen muß, sondern nur einen Teil der Stelle abzutasten braucht, da die Gesamtmengen an gebundenem Analyten und Rezeptormolekül nicht untersucht werden müssen.
Bei Verwendung eines kompetitiven Systems für die Rücktitration ist es außerdem unnötig, daß der markierte antiidiotypische Antikörper oder ein anderes markiertes Rücktitrations-Reagens alle durch den Analyten nicht besetzten Bindungsstellen besetzt, vorausgesetzt, er besetzt einen Teil davon, der konstant bleibt, wie zwischen Schätzungen unter Verwendung der Flüssigkeitsprobe unbekannter Analyten- Konzentration und den Standards bekannter Analyten- Konzentration. Im allgemeinen beinhaltet dies die Verwendung konstanter (verhältnismäßig hoher) Konzentrationen antiidiotypischer Antikörper oder anderer markierter Rücktitrations-Reagenzien, die Spurenmengen des Systems Rezeptormolekül/gebundener Analyt ausgesetzt werden, oder die Verwendung konstanter Volumina sowie konstanter Konzentrationen. Das gleiche gilt auch für die Reaktion des gebundenen Analyten und den von Analyten besetzten Bindungsstellen im nicht-kompetitiven Rücktitrationssystem.
Die vorliegende Erfindung kann für den Handelsgebrauch zur Schätzung von Analyten in Krankenhäusern und dergleichen zusammen mit einem geeigneten Fluoreszenzmeßgerät in Form einer aus den markierten Rezeptormolekülen auf einem festen Substrat, Standardlösungen des Analyten und markierten Rücktitrations-Reagenzien bestehenden Ausrüstung verpackt werden. Durch Verwendung einer solchen Ausrüstung können Messungen routinemäßig mit geeigneten Instrumenten durchgeführt werden.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Erläuterung der Grundprinzipien der Methodik in einer Analyse von Thyroxin (T4) mittels radioaktiv markiertem (¹³¹J) Antithyroxin-Antikörper und radioaktiv markierten (¹²&sup5;J) Thyroxin, und der Auswahl von Reagens-Konzentrationen für ein aussagekräftiges Markierungsverhältnisimmunassay-Verfahren.
(Antithyroxin-Antikörper ist weithin im Handel erhältlich und wurde auch in der Abteilung für Molekularendokrinologie des Middlesex Hospital Medical School, Mortimer Street, London, sowohl mittels herkömmlicher (in vivo) Immunisierungstechniken als auch mittels monoklonaler Antikörper- Herstellungsverfahren in vitro hergestellt.) Der in diesem Beispiel verwendete Antithyroxin-Antikörper war ein spezifischer T4 monoklonaler Antikörper, der durch Auswahl aus einer Reihe von durch Immunisierung von Mäusen mit Rinderthyroglobulin als Immunogen erzeugten Antikörpern hergestellt wurde. Er besitzt eine Bindungskonstante in der Größenordnung von 10&sup9; l/M und weist ansonsten keine besonderen Bindungsmerkmale auf. Er wurde mit ¹³¹J mittels der herkömmlichen Chloramin- T-Technik, die üblicherweise für die Herstellung mit Jod markierter Antikörper und anderer Proteine verwendet wird, markiert. Er wurde dann auf handelsübliche mikrokristalline Zellulose (Sigma-Cell Typ 20) mit einer herkömmlichen Technik gekuppelt (Clinica Chimica Acta. Bd. 118, (1982), Seiten 129- 134).
¹²&sup5;J-markiertes Thyroxin hoher spezifischer Aktivität wurde von Amersham International, Amersham, Bucks, bezogen.
In Serum vorliegendes T4 (1 ml) wurde mit einem handelsüblichen Anionenaustauscherharz (BioRad AG1x2 (400-600 mesh) als Säule) extrahiert und mit 70% Essigsäure nach dem Waschen eluiert (siehe Endocrinology, 117 (1985), Seite 1890). Wiederfindungsversuche (mit vernachlässigbar geringen Spurenmengen von ¹²&sup5;J-markiertem T4, das anfänglich dem Versuchsserum zugegeben wurde) zeigten Gesamtwiederfindungsraten um 70%. Die Versuchsserumeluate wurden jeweils in einem Standard-Hepes- Puffer (50 ml) eluiert, wobei Berechnungen zufolge im Konzentrationsbereich von 0.5-1.5 ng/ml liegende T4- Lösungen erhalten wurden (d.h. in der Größenordnung von 10&supmin;&sup9; M/l). Standard-T4-Lösungen wurden durch entsprechende Verdünnung einer Stammlösung von T4 in Hepes-Puffer hergestellt, wodurch eine Reihe von T4- Konzentrationen zwischen 0 und 10 ng/ml erhalten wurden.
In einer anfänglichen Versuchsreihe wurden verschiedene Mengen von Festphasen-¹³¹J-markiertem Antikörper zusammen mit jeweils 1 ml von T4 enthaltenden Standardlösungen zusammen mit Spurenmengen von ¹²&sup5;J-markiertem T4, wobei die T4- Gesamtkonzentration 0.1 ng/ml entsprach, über Inkubationszeiten von 10 Minuten bis 8 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Festphasen- Antikörper durch Zentrifugieren abgetrennt, gewaschen und das adsorbierte ¹²&sup5;J-markierte T4 wurde mit einem Zweikanal-Gammazähler mittels herkömmlicher Berechnungsverfahren berechnet, um die ¹²&sup5;J-Aktivität an sich zu kennzeichnen. Es wurden Kurven gezeichnet, die das Verhältnis zwischen der vom Antikörper aufgenommenen ¹²&sup5;J-Aktivität und der Inkubationszeit und der Menge an markiertem Antikörper zeigen. Auf Grundlage dieser Daten wurden eine solche Antikörpermenge und eine solche Inkubationszeit ausgewählt, daß etwa 5% der Gesamtmenge an vorhandenem T4 im Inkubationsgemisch (d.h. ungefähr 5 pg, mit einer Ausbeute von ungefähr 1000 ¹²&sup5;J cpm) als vom Antikörper adsorbiert errechnet wurde (d.h. eine ungefähr 200 ¹³¹J cpm ergebende Antikörpermenge und eine Inkubationszeit von 4 Stunden). Es wurde bestätigt, daß unter diesen Bedingungen: a. eine Erhöhung oder Verringerung der verwendeten Antikörpermenge um den Faktor 2 das Verhältnis ¹²&sup5;J/¹³¹J nicht signifikant (d.h. innerhalb von 2%) änderte; b. eine Erhöhung des Volumens der verwendeten Standardlösung das Verhältnis ¹²&sup5;J/¹³¹J nicht beeinflußte.
Mit dieser Standardmenge von Antikörper wurde die Analysenkalibrierung wie folgt vorgenommen. Die Standardmenge Antikörper wurde mit Volumen von 1 ml der oben beschriebenen Standard-T4-Konzentrationen 4 Stunden lang inkubiert. Danach wurde der Festphasenantikörper jeweils durch Zentrifugieren isoliert, kurz mit Puffer gewaschen und erneut mit 3 ml einer Standardlösung von ¹²&sup5;J-markiertem T4, die ungefähr 1 ng/ml T4 enthielt, weitere 4 Stunden inkubiert. Der Festphasenantikörper wurde wiederum jeweils durch Zentrifugieren isoliert, sorgsam viermal zur Entfernung der gesamten restlichen ¹²&sup5;J-markierten T4-Lösung gewaschen, und das jeder Standard-T4- Konzentration entsprechende ¹²&sup5;J/¹³¹J-Verhältnis wurde gemessen. Da in dieser Versuchsreihe eine Standardantikörpermenge (mit einer Ausbeute von ungefähr 200 ¹³¹J cpm) verwendet wurde, war der ¹³¹J- Gehalt jeweils im wesentlichen konstant; der ¹²&sup5;J- Gehalt schwankte trotzdem zwischen ungefähr 2000 cpm im Fall des Null-T4-Konzentrationsstandards und ungefähr 200 cpm im Fall des 10 ng/ml T4-Standards (d.h. einem ¹²&sup5;J/¹³¹J-Verhältnis im Bereich von 10:1 bis 1:1). In einer weiteren Versuchsreihe wurde wiederum bestätigt, daß a. fünffache Schwankungen der verwendeten Festphasenantikörper-Menge keinen Einfluß auf die Gestalt und Lage der Dosis-Wirkungs-Kurve hatten und daß b. Volumenerhöhungen der Standard-T4-Lösungen um einen vergleichbaren Faktor die Kurve ebenfalls nicht beeinflußten. Diese Ergebnisse zeigen, daß das System vom Probenvolumen und der Antikörperkonzentration unabhängig ist. Das System wurde anschließend zur Analyse der wie oben beschrieben erhaltenen T4-Extrakte verwendet, wobei die Werte des ¹²&sup5;J/¹³¹J-Verhältnisses für die Unbekannten auf die übliche Weise mit der Standardkurve und die Ergebnisse mit den mit einem herkömmlichen T4-Analyseverfahren erhaltenen Ergebnissen verglichen wurden. Die Ergebnisse waren gut vergleichbar mit einer Übereinstimmung von üblicherweise 5% und selten schlechter als 10%.

Beispiel 2

Festlegung eines Zweifach-Fluoreszenz-T4- Analyseverfahrens.

Beispiel 1 erläutert den zur Festlegung eines aussagekräftigen kompetitiven Immunassayverfahrens mit "Zweifachmarkierungsverhältnis" gewählten Weg. Durch Verwendung einer Fluoreszein-Markierung anstelle von ¹²&sup5;J zur Markierung von T4 und einer Rhodamin- Markierung anstelle von ¹³¹J zur Markierung von Anti- T4-Antikörper konnte ein analoges Immunassayverfahren mit Zweifachfluoreszenzverhältnis festgelegt werden. Die Markierung von Antikörper und T4 mit diesen Fluoreszenzmarkierungen wurde mit herkömmlichen Verfahren "Immunochemistry in Practice", A. Johnston und R. Thorpe, Blackwell Scientific Pub (1982), durchgeführt. Um jedoch die Auswahl der richtigen Reagenzien-Konzentrationen zu erleichtern, wurden bestimmte Versuche mit zweifach markiertem Antikörper (d.h. markiert mit ¹³³J und mit Rhodamin) und zweifach markiertem T4 (d.h. markiert mit ¹²&sup5;J und mit Fluoreszein) durchgeführt. Darüber hinaus wurde Antikörper (durch Adsorption) mit einem zur Beschichtung von Polystyrol wohlbekannten Verfahren als Überzug auf kleine Polystyrolscheiben aufgebracht und nicht wie in Beispiel 1 kovalent an Mikrocellulose gebunden. In diesem Beispiel wurde die in den unbekannten Proben vorhandene T4-Konzentration aus dem Rhodamin/Fluoreszein-Fluoreszenzverhältnis mit einem Lumineszenzspektrometer Typ LF-5 von Perkin Elmer (Fluorimeter) zur sequentiellen Messung der Fluoreszenzsignale bestimmt. Die so erhaltenen Ergebnisse wurde wiederum mit den Ergebnissen von Messungen des Isotopenverhältnisses wie in Beispiel 1 beschrieben und mit den Ergebnissen aus einem herkömmlichen T4-Analyseverfahren verglichen, und es wurde wieder eine zufriedenstellende Übereinstimmung erzielt.

Beispiel 3

Festlegung eines Zweifach-Fluoreszenz-T4- Analyseverfahrens mit zeitlich aufgelöster Impulsfluoreszenz.

Anstelle der Markierung von T4 und Anti-T4- Antikörper mit Fluoreszein und Rhodamin wie in Beispiel 2 wurden diese mit Terbium bzw. Europium-Chelaten mit EDTA (Ethylendiamin-tetraessigsäure), die in bekannter Weise auf den Antikörper gekoppelt war, markiert. Das Signalverhältnis wurde mit bekannten Impulslichtfluoreszenztechniken mittels eines bekannten zeitauflösenden Fluorimeters gemessen, und die mit der unbekannten Probe erhaltenen Ergebnisse wurden mit der mit Standardlösungen erhaltenen Eichkurve verglichen. Die Übereinstimmung mit Ergebnissen aus anderen Verfahren war wiederum zufriedenstellend.

Beispiel 4

Eine Ausrüstung zur Verwendung bei der Schätzung von RSH (Thyrotropin) gemäß der Erfindung besteht aus den folgenden Bestandteilen:
(a) ein monoklonaler Anti-TSH-Antikörper, der von der Abteilung für Endokrinologie der Middlesex Hospital Medical School, Mortimer Street, London, erhältlich ist, wird auf einer festen Platte immobilisiert und mit Fluoreszein markiert.
(b) Standardlösungen enthalten 0,2, 1,0, 5,0, 20,0 und 100 internationale Mikroeinheiten TSH pro Mol.
(c) Das Rücktitrations-Reagens ist ebenfalls ein handelsüblicher Anti-TSH-monoklonaler Antikörper, der in diesem Fall mit einem Europium(III)-Chelat mit Kupfertrifluoracetylaceton und Formaldehyd auf ähnliche Weise wie in der veröffentlichen internationalen Patentanmeldung WO 86/01604 vorgeschlagen markiert ist. Der erste Antikörper ist permanent fluoreszierend, und der zweite Antikörper kann durch zeitlich aufgelöste Impulsfluoreszenz geschätzt werden.
Eine solche Ausrüstung kann zur Schätzung von TSH mit einem den in obigen Beispielen 1-3 beschriebenen Verfahren ähnlichen Verfahren verwendet werden, wobei die Menge des Anti-TSH-Antikörpers und die Größe der TSH enthaltenden Probe in einem solchen Verhältnis zueinander gewählt werden, daß etwa 5% oder weniger TSH in der Probe an den Anti-TSH-Antikörper auf der Platte gebunden wird. Die Rücktitration erfolgt mit einem nicht-kompetitiven System anstelle eines kompetitiven Systems, ist im Prinzip aber gleich.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Analyt- Konzentration in einer Probe mit unbekannter Flüssigkeit, bei dem die Probe mit einem Bindungsstellen für den Analyten aufweisenden und mit einer ersten Markierung markierten Rezeptormolekül in Berührung gebracht wird, wodurch ein Teil der Bindungsstellen auf dem Rezeptormolekül durch den Analyten besetzt werden, der teilweise besetzte Bindungsstellen aufweisende Rezeptor mittels einer ein System mit einer von der ersten Markierung unterschiedlichen zweiten Markierung einschließenden Rücktitrationstechnik zurücktitriert wird, die relativen Stärken der beiden von den beiden Markierungen erzeugten Signale gemessen werden, um einen für die teilweise Besetzung der Bindungsstellen durch den Analyten auf dem Rezeptormolekül repräsentativen Wert zu liefern, und dieser Wert mit einem oder mehreren entsprechenden, auf dieselbe Weise erhaltenen Werten unter Verwendung von einer oder mehreren Proben mit Standard-Flüssigkeit bekannter Analyt-Konzentration verglichen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben mit unbekannter Flüssigkeit und die Proben mit Standard-Flüssigkeit jeweils mit einer solchen kleinen Rezeptormenge unter Berücksichtigung seiner Affinitätskonstanten mit dem Analyten in Berührung gebracht werden, daß nur ein unbedeutender Teil des Analyten an den Rezeptor gebunden wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Markierungen um fluoreszierende Markierungen handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rücktitrationstechnik ein kompetitives System einschließlich eines Rücktitrations-Reagens, ausgewählt aus einem mit einer Markierung markierten Analyten und einem weiteren Material, das in der Lage ist, nur die unbesetzten Analyt-Bindungsstellen auf dem Rezeptormolekül zu besetzen, und das mit einer Markierung markiert ist, umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rücktitrationstechnik ein nicht-kompetitives System einschließlich eines Rücktitrations-Reagens, das in der Lage ist, mit dem gebundenen Analyten oder nur mit den vom gebundenen Analyten besetzten Bindungsstellen auf dem Rezeptormolekül zu binden, und das bereits markiert ist oder nachfolgend mit einer Markierung markiert wird, umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der unbedeutende Teil weniger als 2% der Gesamtmenge des anwesenden Analyten ausmacht.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper für den Analyten handelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Analyten um ein Hormon handelt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die den Analyten enthaltende Probe nicht den reversibel an ein Bindungsmittel gebundenen Analyten enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Markierungen um verschiedene Lanthanid-Chelate handelt, die nur bei Aktivierung fluoreszierend werden, und daß die Fluoreszenz durch zeitlich aufgelöste Impulsfluoreszenz mit Abtastung durch einen Lichtstrahl hoher Intensität geschätzt wird.

10. Ausrüstung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Bestimmung der Analyt-Konzentration in einer Flüssigkeitsprobe, wobei jene Ausrüstung ein festes Substrat mit daran gebundenen Molekülen eines mit einer ersten, vorzugsweise fluoreszierenden Markierung markierten Rezeptoren mit Bindungsstellen für einen Analyten umfaßt, wobei die Rezeptormenge auf dem Substrat entsprechend der Größe der Flüssigkeitsprobe ausgewählt wird, so daß nur ein unbedeutender Teil des Analyten in der Probe an den Rezeptor gebunden wird, wobei eine oder mehrere Standard-Lösungen bekannte Konzentrationen des Analyten und ein mit einer zweiten, vorzugsweise fluoreszierenden Markierung, die sich von der ersten unterscheidet und direkt oder indirekt entweder an den gebundenen Analyten oder an die durch den gebundenen Analyten besetzten Bindungsstellen oder an die nicht durch den gebundenen Analyten besetzten Bindungsstellen binden kann, markiertes Rücktitrations- Reagens enthalten.

11. Ausrüstung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Analysevorrichtung einschließt, umfassend ein erweitertes festes Substrat mit einer Mehrzahl verschiedener, jeweils Bindungsstellen an ihrem Molekül für einen Analyten aufweisender Rezeptoren an einer Mehrzahl von beabstandeten Stellen, wobei der Rezeptor an jeder beliebigen Stelle Bindungsstellen aufweist, die spezifisch sind für einen sich von dem Analyten, für den der Rezeptor an einer oder mehreren anderen Stellen spezifische Bindungsstellen aufweist, unterscheidenden Analyten, wobei jeder der Rezeptoren mit einer Markierung markiert ist.