DE3853254T2 - Ausrüstungssatz und Verfahren für Analysen von biologischen Proben. - Google Patents
Ausrüstungssatz und Verfahren für Analysen von biologischen Proben.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Ausrüstungssatz zum klinischen Testen und Quantifizieren biologischer Proben, z.B. zellularer DNA, durch Bildanalyse der Proben.
- Die Erfindung betrifft einen Ausrüstungssatz und ein Verfahren zum quantitativen Testen, die für einen weiten Bereich diagnostischer Test- und Auswertungsvorgänge verwendet werden können, die an verschiedenen Zellen, Geweben oder anderen dem menschlichen Körper entnommenen Materialien vorgenommen werden. Die Erfindung betrifft einen Ausrüstungssatz und ein Verfahren, die bei der mittels Probenerkennungstechniken durchgeführten Bildanalyse zum Analysieren und Quantifizieren von Zellkernen, die angefärbt sein können, verwendet werden. Dieser Ausrüstungssatz und dieses Verfahren sind besonders zweckmäßig und anpassungsfähig im Zusammenhang mit dem Verfahren und der Vorrichtung, die in der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 (Veröffentlichungsnr. 0245466) des Anmelders beschrieben sind. Das Verfahren und die Vorrichtung können bei der zur Krebsdiagnose und -prognose vorgenommenen Messung von zellularer DNA verwendet werden.
- Wie noch genauer erläutert wird, zielt die Erfindung darauf ab, eine Ausrüstung des benutzerinteraktiven Typs zu schaffen, die nicht nur von Forschern, sondern auch von Laborfachärzten im Labor benutzt werden kann, sowie eine kostengünstige Ausrüstung zu schaffen, die von einem typischen Pathologielabor erworben werden kann.
- Gemäß dem aktuellen Stand der Technik in Laborfacharzt-Betrieben wird der Inhalt von Zellbestandteilen oder -komponenten (im folgenden als "Zellen-Objekte" bezeichnet), etwa die Bestandteile oder Komponenten von DNA, mittels visueller Betrachtung durch den Laborfacharzt bestimmt, der primär Form und Textur der Zellen-Objekte nach der Anfärbung beobachtet. Falls beispielsweise ein Verdacht auf Krebszellen besteht, beobachtet der Laborfacharzt die Form und die Struktur der Zellen-Objekte und ordnet diese dann einer normalen Kathegorie oder einer von mehreren anormalen - d.h. Krebs- - Kathegorien zu. Diese Auswertungen sind jedoch sehr subjektiv und ungeeignet zur Differenzierung und Quantifizierung geringfügiger Veränderungen von DNA innerhalb einzelner Zellen oder in sehr kleinen Populationen anormaler Zellen, wobei diesen Veränderungen, wie noch erläutert wird, eine klinische Bedeutung bei der Diagose und Prognose von Krebs zukommt. Obwohl im Handel Allzweck-Durchflußzytometer erhältlich sind, die sehr kostenaufwendig und zur Untersuchung von flüssigen Blutproben oder Gewebe-Disaggregationen verwendbar sind, sind diese Zytometer ungeeignet zur Untersuchung von Standard-Gewebeabschnitten und zur Verwendung von Mikroskop-Objektträgern, die die bevorzugte Handhabungsform von Proben in Pathologielabors darstellen. US- A-4345027 beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren maligner Zellen in einer Probe durch Anfärben mit einem histologischen Farbstoff, der nur normale Zellen anfärbt und anschließend sämtliche Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff gegenfärbt. Diese Fluoreszenz wird von einem Durchflußzytometer gemessen; das Verfahren jedoch - obwohl es die malignen Zellen identifiziert - wird durch die gleichen Nachteile beeinträchtigt, die oben im Zusammenhang mit der quantitativen Messung beschrieben wurden. Eine Bildanalysetechnik gestattet die Analyse von morphologischen Eigenschaften von Zellen, etwa der Struktur, in Kombination mit Größe und Form von Zellkernen und Änderungen in den Kern-Zytoplasma-Verhältnissen von Zellen, während ein Durchflußzytometer für eine derartige Analyse ungeeignet ist.
- Der derzeitige Entwicklungsstand der technischen Fertigkeiten zum Testen auf den Gebieten der Anatomie, Chirurgie und Histopathologie besteht darin, daß Zellen und Gewebe, die eine verstärkte Anfärbung aufweisen, vornehmlich visuell mit Hilfe des menschlichen Erinnerungsvermögens mit früheren Beispielen verglichen werden. Neue Fortschritte bei der Messung (z.B. gemäß der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3), die eine Quantifizierung vorsehen sowie darauf abzielen, den nach dem Stand der Technik durchgeführten subjektiven Vergleich mit Erinnerungsinhalten zu ersetzen, erfordern eine Kalibrierung der Meßinstrumente. Es sind, z.B. im Vergleich mit der Kalibrierung zur chemischen Analyse (bei der der Stand der Technik zur kalibrierten Messung gut entwickelt ist), neuartige Kalibrierungseinrichtungen erforderlich, da in der Praxis das Material, obwohl es wie bei der chemischen Analyse durch Lichtdurchlässigkeitsmessungen untersucht wird, dem Meßinstrument als auf einem transparenten Substrat angeordnetes, dünnes, festes Material präsentiert wird, bei dem die Zell- und Gewebemorphologie erhalten bleibt. Zur Verwendung für bestimmte Zell- oder Gewebeteile geeignete Verfahren und gemäß dem Stand der Technik ausgebildete Techniken, mit denen nach einer geeigneten quantitativen Anfärbung derartige Lesewerte kalibriert werden können, sind kaum entwickelt worden bzw. existieren überhaupt nicht. Die gemäß der Erfindung beschriebene adäquate Kalibrierung wird die in Labors durchgeführten Tests revolutionieren und einen Wechsel von subjektiven zu objektiven Tests bewirken. Diese Kalibrierung erfolgt vorzugsweise auf einer Test-zu-Test-Basis, d.h. auf Basis des individuellen Mikrospkop-Objektträgers für jede Probe, da die getesteten Objekte so verschwindend klein sind - z.B. bei der Messung von Pikogramm-Mengen von DNA in Zellen, deren Kerne Größen im Bereich von 100 um² aufweisen - , daß bereits kleine Verschiebungen in der Lichtdurchlässigkeit oder geringfügige Schwankungen der Anfärbung den Meßvorgang ohne eine derartige Kalibrierung zu fehleranfällig machen.
- Für die Bildanalyse ist es generell erforderlich, daß die Zellen-Objekte auf einem Mikroskop-Objektträger angefärbt werden. Bei der Verwendung von Bildanalysetechniken und -ausrüstungen und von angefärbten Proben durch Laborfachärzte in einem herkömmlichen Labor müssen mehrere Probleme gelöst werden, etwa Schwankungen der Anfärbung, Schwankungen der optischen Dichte angefärbter Zellen-Objekte und Kalibrierung von Mikroskop-Objektträgern mit darauf angeordneten angefärbten Objekten, die sämtlich durch die Erfindung beseitigt werden. Es stehen mehrere verwendbare Anfärbtechniken zur Verfügung. Die Feulgen-Färbtechnik kann verwendet werden, um in Zellen- Objekten enthaltene DNA mit Farbstoffen anzufärben, z.B. mit Thionin, Azur A, Azur C, Pararosanilin und Methylenblau. Proteine können mit Kongorot, Eosin, einer Eosin-Hematoxylin- Kombination oder Echtgrün angefärbt werden. Enzyme können mit Diaminobenzidin oder 3-Amino-9-Ethylcarbazol oder alkaliner Phosphatase in Kombination mit einem Anfärbemittelsubstrat sichtbar gemacht werden; Zell-Organellen können mit Methylenblau angefärbt werden; und Ribosome können mit Methylenblau, und Mitochondrien mit Giemsa-Farbstoff angefärbt werden. Ferner sind gemäß DE-B-2019778 Thiongruppen enthaltende Farbstoffe verwendet worden, um die RNA-Verteilung in Zellen zu bestimmen. Bei der Brustzellenkrebsanalyse werden einige dieser Anfärbungen in Kombination mit monoklonalen Antikörpern verwendet, die Östrogen- oder Progesteron-Rezeptoren erkennen. Die Antigen-Analyse kann die Schritte des Bindens monoklonaler Antikörper an die Probe und Kontrollzellen-Objekte enthalten. Später kann der monoklonale Antikörper mit einer Enzym-Anfärbung konjugiert werden. Dann kann die fluoreszierende Anfärbung mit einer zur Induzierung der Fluoreszenz geeigneten Wellenlänge erregt werden, und die Anfärbung kann bei einer anderen Wellenlänge beobachtet werden, bei der eine Fluoreszenzabgabe auftritt. Wenn der Antikörper für ein bestimmtes Virus erzeugt worden ist, können die Kontrollzellenproben- Objekte mit einer Nukleinsäureprobe behandelt werden, die spezifisch für das Genom des Virus ist.
- Schwankungen des Grades der Anfärbung von Zellen-Objekten und die Schwankung der optischen Dichte der angefärbten Zelle verursachen ein Problem bei der Quantifizierung der angefärbten Zellen-Objekte durch Bildanalyse. Die Anfärbung von Zellen-Objekten, z.B. das Anfärben von DNA mit Azur A, ist nicht nur von Objektträger zu Objektträger oder Charge zu Charge bei demselben Laborfacharzt, sondern auch zwischen verschiedenen Laborfachärzten und verschiedenen Labors beträchtlichen Schwankungen ausgesetzt. Da die Bildanalyseausrüstung die Graupegel- oder optische Dichte mißt und da man durch Messungen der optischen Dichte aus angefärbten Zellen-Objekten die aktuelle Ist-Menge von DNA pro Zelle in Pikogramm erhalten will, ist es wichtig, das Problem unterschiedlicher Anfärbungsfaktoren bei unterschiedlichen Proben zu beseitigen. Ferner werden bei Bildanalysetechniken Mikroskope und optische Beleuchtungseinrichtungen verwendet, die einstellbar sind, um bei Verwendung durch den Laborfacharzt verschiedene Lichtintensitäten zu erzeugen. Qualifizierte Forscher in Forschungslaboren sind zwar mit derartigen Apparaten ausgerüstet, daß sie die optische Intensität den gewünschten Bedingungen für die durch Bildmustertechniken durchgeführte Bildanalyse anpassen können, jedoch erfolgt dies nicht mit der für die übliche Laborarbeit erforderlichen Genauigkeit. Somit besteht die Notwendigkeit, das genannte Problem der optischen Dichte und der Anfärbungsschwankungen zu beseitigen.
- Bislang steht für den Bereich der Zellanalyse keine kostengünstige und einfache Quantifizierung von Zellen-Objekten zur Verfügung. Beispielsweise können, außer wenn eine verhältnismäßig teure und komplizierte Ausrüstung benutzt wird, relative Vergleiche von Daten, die eine Funktion des Zellenobjekt-Inhalts bilden, nur zur Untersuchung der Vermehrung von Zellen- Objekten durchgeführt werden. Im Fall von DNA ist dies klinisch wichtig für die Diagnose und Prognose von Krebs. Die Analyse des DNA-Inhaltes von Zellen hat sich als wertvoll bei der Feststellung der Proliferation gutartiger und bösartiger Zellen erwiesen. Ein anormaler DNA-Gehalt (Aneuploidie) ist durchgehend bei zahlreichen Krebserkrankungen beobachtet worden , etwa bei Prostata-, Colon-, Zervix-, Brust- und Nierenkrebs. Ferner weisen vorläufige Daten darauf hin, daß die Feststellung von Aneuploidie prognostischen Wert hat; vgl. Atkin, "Cytophotometric DNA Determination Correlated to Karyotype, Particularly Cancer", in: The International Academy of Cytology Analytical and Quantitative Cytology and Histology, 9:96-104 (1987). Zudem hat sich erwiesen, daß das Vorhandensein einer erhöhten Anzahl von Zellen, die DNA synthetisch erzeugen (die sogenannten "S-Phasen"-Zellen) in manchen Fälllen mit der Proliferation von Tumorzellen in Zusammenhang steht.
- Bei Anwendung des Verfahrens und des Ausrüstungssatzes gemäß der Erfindung in Verbindung mit einer beliebigen Vorrichtung, mit der im Anschluß an eine Anfärbung eine Bildanalyse von Zellen-Objekten durch Mustererkennungstechniken durchgeführt werden kann (z.B. der Vorrichtung gemäß der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3), kann der Benutzer problemlos und kostengünstig nicht nur winzige Veränderungen bei Zellen-Objekten einschließlich DNA feststellen, sondern zudem - als Hilfe bei der statistischen Analyse in der Forschung sowie bei der Diagnose und Behandung von Patienten -die Menge der Zellen-Objekte messen und quantifizieren.
- Das Europäische Patent Nr. 0248840 beschreibt einen Ausrüstungssatz und ein Verfahren, die zur Quantifizierung von Probenzellen-Objekten und zur Verwendung mit einem Bildanalyse-Ausrüstungssatz des in der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 beschriebenen Typs vorgesehen sind. Der Ausrüstungssatz enthält Mikroskop-Objektträger mit einem Referenzmaterial, das vorbestimmte physikalische Eigenschaften, die nach dem Anfärben von der Bildanalyseausrüstung detektiert werden können, und einen Bereich aufweist, in dem die zu qualifizierenden Zellen-Proben plaziert werden. Der Ausrüstungssatz enthält einen Anfärbstoff, der zum gleichzeitigen Anfärben des Referenzmaterials und der Probe verwendet und in einer derartigen Konzentration angewandt wird, daß nach dem Anfärben die optische Dichte des Referenzmittels im wesentlichen eine lineare Funktion der Anfärbungskonzentration des Referenzmittels ist.
- Die in EP-0248840 beschriebene Erfindung beseitigt das Kostenproblem, das bisher bei der Verwendung eines computerisierten Ausrüstungssatzes zur Bildanalyse auftrat, und ist zu diesem Zweck als interaktives System ausgebildet, bei dem der Laborfacharzt eine Anzahl von Aufgaben einschließlich der Auswahl, Präparation, Anordnung und Anfärbung von Zellen auf Mikroskop-Objektträgern durchführt. Dem Laborfacharzt wird der erfindungsgemäße Ausrüstungssatz geliefert, der ein Anfärbemittel und Objektträger enthält, die beide speziell vorbereitet und kalibriert sind. Der Objektträger enthält Referenzzellen zur Hilfe bei der Diagnose der Probenzellen-Objekte und zur Unterstützung bei der Überwindung des oben beschriebenen Problems der Anfärbungsdichte. Jene Erfindung ermöglicht ferner die Lokalisierung von Zellen-Objekten zur Untersuchung ihrer Morphologie und bewahrt ihre Position für eine spätere Analyse oder für eine bestätigende Analyse durch einen zweiten Laborfacharzt, falls gewünscht. Hinsichtlich der Zellkerne kann man Messungen sogar bis zu einem Bereich in Mikron, der optischen Gesamtdichte des Zellkerns oder der Zellkernmasse in Pikogramm, der mittleren optischen Zellkerndichte, der Zellkernstruktur und der Abweichung der Zellkernform von einem runden Zellkern erhalten. Eine Reihe solcher Messungen kann auch am Zellzytoplasma vorgenommen werden.
- Bei Verwendung des Ausrüstungssatzs für die Zellanalyse werden Gewebe- und Zellproben auf einen Objektträger aufgebracht, der anschließend mit einem spezifischen Anfärbemittel gefärbt wird, das sich proportional mit den Zellen-Objekten vereinigt, was den Rest der Zelle generell im wesentlichen unsichtbar macht, so daß die Bildanalyse den Gehalt an Zellenobjekt - wie etwa DNA oder Protein - mißt, der in erster Linie am Zellkern konzentriert ist. Das Anfärbemittel assoziiert derart mit dem Zellen-Objekt, daß eine detaillierte Kernstruktur und ein Muster erzeugt werden, das visuell beobachtet und von dem Laborfacharzt mittels einer Vorrichtung zur Bildanalyse interpretiert werden kann. Im Zusammenhang mit DNA-Analysen zur Diagnose und Prognose von Krebs ist der DNA-Gehalt in den malignen Zellen generell erheblich größer als bei normalen Zellen, da sich die malignen Zellen schnell teilen und replizieren oder die malignen Zellen eine abnorme Anzahl von Chromosomen aufweisen oder defekte Chromosomen enthalten.
- Ein gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehener Ausrüstungssatz zur Quantifizierung von Zellkernen weist auf: einen Mikroskop-Objektträger, der einen Referenzbereich und einen Probenzellen-Objektbereich zur Aufnahme von Probenzellen-Objekten aufweist, wobei der Referenzbereich ein Referenzmittel zum Anfärben enthält und das Referenzmittel Rattenleber-Kerne mit vorbestimmten physikalischen Eigenschaften aufweist, die nach dem Anfärben detektierbar sind; und einen oder mehrere Behälter mit Anfärbematerial, das Thionin aufweist, zur gleichzeitigen Aufbringen von Anfärbemittel auf die Probenzellen-Objekte und das Referenzmittel, wobei das Anfärbemittel in den Behältern in einer ausreichenden Menge vorliegt, um nach dem Anfärben eine optische Dichte pro Einheit des Referenzmittels zu erzeugen, die eine im wesentlichen lineare Funktion der Anfärbemittel-Konzentration pro Einheit des angefärbten Referenzmaterials ist, und wobei das Anfärbematerial in den Behältern in einer ausreichenden Menge vorliegt, um eine optische Dichte pro Einheit des angefärbten Referenzmittels zwischen ungefähr 0,1 bis 0,8 zu erzeugen.
- Gemäß der Erfindung ermöglicht diese gleichzeitige Anfärbung des Referenzmittels und der Probenzellen-Objekte mit einem Anfärbemittel von vorbestimmter Konzentration eine Selbstkalibrierung des Objektträgers, wie noch beschrieben wird. Der Ausrüstungssatz enthält ferner einen oder mehrere Behälter mit Anfärbemittel, und er kann einen Behälter eines Spülsulfonierungsmittels zum Hinzufügen zu einem bei der Präparation des Objektträgers für eine mikroskopische Bildanalyse verwendeten Spülmittel enthalten. Die Menge an Anfärbemittel im Ausrüstungssatz beeinflußt die optische Dichte des Referenzmittels und der Probenzellen-Objekte. Dies ist ein bedeutender Aspekt der Erfindung. Nach Anfärbung ist die optische Dichte des Referenzmittels (und der Probenzellen-Objekte, sofern sie das nachzuweisende und zu bestimmende Material wie etwa DNA enthalten) eine lineare Funktion der Konzentration des Anfärbemittels pro Materialeinheit (wie z.B. Konzentration des Anfärbemittels pro Zellen-Objekt, sofern es sich bei dem anzufärbenden Material um Zellen handelt) nur über einen ausgewählten Bereich von Konzentrationen des Anfärbemittels pro angefärbtem Zellen-Objekt, derart, daß eine optische Dichte im Bereich von ungefähr 0,1 bis 0,8 erzeugt wird. Außer diesem linearen Abschnitt ist die Kurve der optischen Dichte über der Konzentration des Anfärbemittels pro Zelle nicht linear und/oder ergibt keine leicht meßbaren oder ersichtlichen Unterschiede in den optischen Dichten bei Veränderungen in den Konzentrationen des Anfärbemittels pro Zellen-Objekt. Dies ist für die Zellanalyse wichtig. Bei der Diagnose und Prognose von Krebs ist die Beobachtung eines variierenden DNA-Gehalts mittels eines unterschiedlichen Gehalts an Anfärbemittel und der resultierenden unterschiedlichen optischen Dichten leichter nachweisbar und ersichtlich, sofern die Variation von optischer Dichte relativ zu der Konzentration des Anfärbemittels pro Zelle linear ist und die optische Dichte im Bereich von ungefähr 0,1 bis 0,8 liegt. Die Analyse eines beliebigen Zellen-Objekts durch optische Dichte wird erleichtert, wenn die optische Dichte des Zellen-Objekts linear ist. Daher ist es wichtig, daß das Thionin im Ausrüstungssatz in einer ausreichend wirksamen Menge an Anfärbemittel vorgesehen ist, um nach Anfärbung für eine vorbestimmte Zeitdauer eine derartige optische Dichte für das Referenzmittel zu erzeugen, daß die optische Dichte des Referenzmittels nach der Anfärbung eine im wesentlichen lineare Funktion der Anfärbemittelkonzentration des Referenzmittels ist und die optische Dichte in dem oben genannten Bereich liegt. Das gleiche gilt für das Probenzellen-Objekt, falls das Objekt DNA enthält.
- Das zur Anfärbung vorgesehene Referenzmittel besteht aus Rattenleber-Kernen. Das Anfärbemittel des Ausrüstungssatzs kann auch ein Anfärbe-Sulfonierungsmittel enthalten. Das Anfärbe-Sulfonierungsmittel und das Spül-Sulfonierungsmittel werden zusammen mit wässerigen sauren Lösungen von Anfärbeund Spülmittel verwendet. Bei der Präparation des Objektträgers wird häufig das Anfärbemittel in eine wässerige saure Lösung gegeben, und anschließend werden das Referenzmittel sowie die Probenzellen-Objekte mit der wässerigen Anfärbelösung angefärbt. Nach dem Anfärben der Materialien auf dem Objektträger werden die Materialien mit einer Lösung gespült, die häufig eine wässerige, saure Lösung ist. In solchen Fällen werden, um konsistente, reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, Anfärbe- und Spülmittel benötigt, deren pH-Wert innerhalb dauerhaft relativ enger Bereiche liegt. Ein Sulfonierungsmittel, das mit dem Anfärbemittel verträglich ist, fördert die Bindung des Thionins an die hydrolysierte DNA.
- Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung weist der mikroskopische Objektträger des Ausrüstungssatzs einen Referenzbereich für die optische Dichte auf, der ein Material enthält, das eine vorbestimmte bekannte optische Dichte besitzt, um den mikroskopischen Objektträger mit dem Instrument zu kalibrieren, das zur Untersuchung der Probenzellen-Objekte verwendet wird. Ohne den Referenzbereich der optischen Dichte ist der Objektträger zusammen mit dem hier beschriebenen Ausrüstungssatz selbstkalibrierend, ohne daß bestimmte andere Variable zu beachten sind, die sich von Analyse zu Analyse ändern können. Zu diesen Variablen zählen Variationen in der Dicke und der Art des in dem Objektträger verwendeten Glases sowie Variationen in den Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen, die bei der Analyse auftreten und die Analyse beeinträchtigen könnten.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Quantifizierung von DNA durch Vergleich der optischen Dichte der angefärbten Probenzellen-Objekte mit der optischen Dichte der angefärbten Rattenleber-Kerne, die eine bekannte Menge an zu quantifizierendem DNA aufweisen. Die Verwendung dieser Zellen als Referenzmaterial ermöglicht die Berechnung des DNA-Gehalts von Probenzellen-Objekten in Form eines absoluten DNA-Gewichts, wenn derartige Probenzellen-Objekte gleichzeitig präpariert und angefärbt werden und die optischen Dichten des angefärbten Referenzmaterials und der Probenzellen-Objekte verglichen werden. Ein zu diesem Zweck verwendbares Berechnungs- und Computerprogramm ist in der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 des Anmelders beschrieben.
- Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Quantifizierung von Zellkernen geschaffen, das die folgenden Schritte aufweist:
- Versehen eines Objektträgers mit einem Referenzbereich und einem Probenzellen-Objektbereich;
- Versehen des Referenzbereiches mit einem Rattenleber-Kerne aufweisenden Referenzmaterial, das physikalische Eigenschaften aufweist, die eine bekannte Menge an DNA umfassen und eine Assoziation des Referenzmaterials mit einem Anfärbemittel erlauben, die einer Assoziation des Anfärbemittels mit DNA proportional ist;
- Plazieren von Probenzellen-Objekten in dem Probenzellen-Objektbereich;
- gleichzeitiges Anfärben des Referenzmaterials und der Probenzellen-Objekte mit einem Thionin aufweisenden Anfärbemittel für eine vorbestimmte Zeitdauer, wobei das Anfärbemittel in einer ausreichenden Menge vorliegt, um nach dem Anfärben eine optische Dichte pro Einheit des Referenzmaterials zu erzeugen, die eine im wesentlichen lineare Funktion der Anfärbemittel- Konzentration pro Einheit des angefärbten Referenzmaterials ist, und um eine optische Dichte pro Einheit des angefärbten Referenzmaterials zwischen ungefähr 0,1 bis 0,8 zu erzeugen;
- Messen der optischen Dichte des Referenzmaterials nach dem Anfärben;
- Messen der optischen Dichte der Probenzellen-Objekte nach dem Anfärben; und
- Bestimmen des Mengenbetrages von DNA in den Probenzellen-Objekten aus den gemessenen optischen Dichten.
- Rattenleber-Zellkerne als Referenzmittel bilden in Verbindung mit Thionin-Färbemittel eine sehr vorteilhafte Kombination. Rattenleber enthält Tetraploid-Zellen mit 13,4 Pikogramm DNA die eine Anzahl von Meßpunkten für DNA-Gehalt bieten, und Diploid-Zellen mit 6,7 Pikogramm DNA. Hinsichtlich der Tetraploid-Zellen ist Rattenlebergewebe im Vergleich mit Forellen-Erythrozyten oder anderen Referenzmaterialen vorteilhaft, die lediglich große Mengen an Diploid-Zellen enthalten und somit weniger Meßpunkte für DNA aufweisen. Nach dem Anfärben ergibt sich aufgrund der größeren Mengen an DNA in den Rattenleber- Kernen und der größeren Bemessung dieser Kerne ein Referenzmaterial mit erhöhter optischer Dichte. Die größere Bemessung, die größere DNA-Menge und die vergrößerte gesamte optische Dichte ermöglichen eine präzisere Kalibrierung und somit eine Reduzierung des Meßfehlers. Ferner weisen Rattenleber-Kerne nicht nur im wesentlichen das gleiche Aussehen wie menschliches Gewebe auf, sondern kombinieren sich mit einem Anfärbemittel in ähnlicher Weise, wie sich menschliches Gewebe mit Anfärbemittel kombiniert. Diese Ähnlichkeit führt zu ähnlichen optischen Dichten für gleichzeitig angefärbtem Menschen- und Rattengewebe. Ferner kann Rattenlebergewebe leicht geschnitten, mikrotomiert und auf Mikroskop-Objektträger aufgebracht werden, um eine Probe mit einer gleichmäßigen Verteilung der Zellen zu erhalten, die derart ausgerichtet sind, daß Anfärben und Beobachtung erleichert werden.
- Thionin ist für die alternative Ausführungsform und die Verwendung von Rattenleber-Zellen als Referenzmaterial wichtig, da es sehr selektiv beim Anfärben von DNA ist. Zahlreiche andere handelsübliche Färbemittel, wie z.B. Azur A, weisen oft Verunreinigungen auf, die andere Materialien in einer Zelle anfärben, z.B. Proteine. Dies ist für den gemäß der Erfindung vorgesehenen Vorgang schädlich, da das Verhältnis zwischen optischer Dichte und der Menge an DNA nicht so präzise wie bei einer reinen Anfärbung ist, die beim Anfärben von DNA exakt selektiv ist.
- Der Ausrüstungssatz und das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglichen einen leichten und preiswerten Nachweis von geringen Änderungen in Zellkernen. Bei Änderungen des DNA-Gehaltes erfolgt dies durch Schaffung einer realen und genauen Messung von DNA in Pikogramm. Die Erfindung ermöglicht auch eine Messung und Quantifizierung der DNA-Menge und setzt diese in Relation zu gespeicherten statistischen Analysen, um die Diagnose zu unterstützen. Insbesondere ermöglicht die Erfindung in Verbindung mit den in der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 des Anmelders offenbarten und beschriebenen Erfindungen im Zusammenhang mit DNA-Analyse eine interaktive Analyse von Probenpopulationszellen und bietet ein Histogramm oder eine Anzeige der Populationsverteilung der Zellen hinsichtlich ihres DNA-Gehalts und hinsichtlich einer Standard-DNA für normale Zellen, so daß geringe Verschiebungen in der Populationsverteilung leicht erkennbar sind. Zu diesem Zweck werden Bilder von Zellkernen nicht nur aufgenommen und gespeichert, sondern die Daten aus den Bildern können mit statistischen Daten integriert werden, um eine Multivarianzanalyse, eine Diskriminierung von Zeilen, Histogramme und Streudiagramme von Zellen oder Zellpopulationen zu ergeben.
- Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen neuen und verbesserten Ausrüstungssatz zu schaffen, der ein Färbemittel (Thionin) und einen für Probenzellen-Objekte vorgesehenen Objektträger oder -halter aufweist, an dem ein Referenzmittel (Rattenleber-Kerne) oder Zellen-Objekte angeordnet sind, wobei das Färbemittel mit dem Objektträger eine Kalibrierung des Objektträgers zur Bildanalyse des Objektträgers mittels einer Bildanalysevorrichtung ermöglicht.
- Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, einen neuen und verbesserten Ausrüstungssatz und ein Verfahren zur Durchführung einer Ploidieanalyse von Zellen unter Verwendung einer Bildmustererkennungsvorrichtung zu schaffen.
- Diese und weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung in Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich,
- Fig. 1 zeigt eine perspektivische Ansicht eines Ausrüstungssatzs gemäß der Erfindung.
- Fig. 2 zeigt eine Ansicht eines gemäß der Erfindung ausgebildeten Proben-Objektträgers oder -halters.
- Fig. 3 zeigt eine Draufsicht auf einen Objektträger mit darauf befindlichen Materialien für Kontrollzellen, Proben-Zellen, Lichtkalibrierung, Referenzlokalisierung und Beständigkeitsprüfung.
- Fig. 4 zeigt eine Querschnittansicht entlang der Linie 3-3 in Fig. 3.
- Fig. 5 zeigt schematisch die optische Dichte nach der Anfärbung über der Anfärbemittelkonzentration pro Zelle.
- Fig. 6 zeigt ein Histogramm einer gemäß der Erfindung durchgeführten Kontrollzellenploidie-Kalibrierung.
- Fig. 7 zeigt ein Histogramm eines Zusammenfassungsberichts der Zellenploidie-Verteilung gemäß der Erfindung.
- Wie in den Zeichnungen zur Veranschaulichung gezeigt, verwendet man den Ausrüstungssatz und das Verfahren gemäß der Erfindung generell in Verbindung mit einer Vorrichtung zur automatischen Analyse von "Zellen-Objekten". Diese Bezeichnung wird hier allgemein für Zellen verwendet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blutzellen oder aus Tumoren entnommenen Zellen oder dgl., die derart präpariert sind, daß ihre Kerne beobachtet werden können. Bei der Quantifizierung von DNA werden die Zellen unter Verwendung einer Feulgen-Färbungsreaktion präpariert, so daß man die DNA in den Zellkernen beobachten kann. Salzsäure hydrolysiert Ribose-Nukleinsäure-Bindungen der DNA und ergibt Aldehydzuckerreste. Ein Anfärbemittel wie etwa Thionin koppelt dann über eine Schiff-Reaktion an die Zuckeraldehyde und ergibt eine blau-violette Farbe. Die vorliegende Erfindung ist geeignet für die Anfärbungsuntersuchung von DNA zur Ploidieanalyse und zur Blutzellenanalyse, sondern sie kann auch zur Analyse von Pap-Zellabstrichen verwendet werden.
- Gemäß Fig. 1 enthält der Ausrüstungssatz 2 einen Behälter 4, der eine oder mehrere Flaschen oder Röhrchen mit Anfärbematerial 6, eine oder mehrere Schachteln 8 mit mikroskopischen Objektträgern 10 und eine oder mehrere Flaschen oder Röhrchen des Spül-Sulfonierungsmittels 12 enthält. Der Behälter hat ein Unterteil 14, einen am Unterteil angelenkten Deckel 16 und einen Riegel, der Riegelelemente 18 und 20 enthält, die durch Reibung und Zuschnappen den Deckel und das Unterteil jeweils in Eingriff bringen, um den Behälter zu schließen. Das Unterteil des Behälters weist ein Kissen 22 aus Schwamm, Schaum oder dgl. mit geformten oder ausgeschnittenen Ausnehmungen 24 auf. Die Ausnehmungen haben die Form der Röhrchen oder der Schachteln der Objektträger und sind derart ausgebildet, daß sie beim Transport des Ausrüstungssatzs die Flaschen und die Schachteln ohne Beschädigung in fester Position halten.
- Gemäß Fig. 2 kann der mikroskopische oder Proben-Objektträger 10 beliebige Größe oder Form aufweisen, aber aufgrund der Vertrautheit von Labortechnikern und Laborfachärzten mit für Mikroskope verwendeten Glasobjektträgern ist der Objektträger 10 vorzugsweise ein echter Mikroskopträger aus Glas, der typischerweise 7,6 cm 2,6 cm (3 Inch 1 Inch) mißt. Der in Fig. 2 gezeigte Objektträger 10 hat eine vorgedruckte Begrenzung 26, die einen Referenzbereich definiert, in dem sich das Referenzmittel zum Anfärben, etwa Referenzzellen-Objekte 28, befindet. Die Referenzmittel sind Rattenleber-Zellen, bei denen Größe, Form und DNA-Gehalt bekannt sind, wobei der DNA-Gehalt ungefähr 6,7 Pikogramm bei Diploid-Zellen und 13,4 Pikogramm bei Tetraploid-Zellen beträgt.
- Der Objektträger weist ferner einen Probenzellen-Objektbereich 30 zur Aufnahme von Probenzellen-Objekten 32 auf, die in diesem Fall Zellen aus einem Gewebeschnitt (wie etwa einem Tumorgewebe) oder ein Nadelaspirat von Tumorgewebe oder eine Monoschicht von Blutzellen oder anderen Zellen im Bereich 30 auf dem Objektträger sind.
- Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der Objektträger auch einen Referenzbereich für die optische Dichte auf, der vorzugsweise eine gedruckte Markierung ist, z.B. ein Kreuz 34 auf dem Objektträger. Dieser Bereich weist ein Material mit einer vorbestimmten, bekannten optischen Dichte auf, die als Referenzwert zur Kalibrierung eines zur Analyse des Objektträgers Instrumentes verwendet werden kann. Wie noch ausführlicher erklärt wird, erhält die Bedienungsperson ein Histogramm und Instruktionen von einer für das Bedienungspersonal vorgesehenen Instruktionskontroll-Logik, wie in der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 des Anmelders beschrieben ist, und die Bedienungsperson stellt die optische Lichtintensität manuell ein, bis die gewünschte Intensität der optische Dichte des Referenzmaterials und des Hintergrundlichts erreicht wird. Die in der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 des Anmelders beschriebene Systemlogik wird mit dem die optische Dichte aufweisenden Referenzmaterial kalibriert, um die korrekte optische Dichte von Objekten abzulesen.
- Der Objektträger kann ferner ein optisches Integritätsmuster 36 zur Gewährleistung der Integrität des Systems enthalten. Dieses Muster sorgt für eine Integritätsprüfung oder -identifizierung auf dem Objektträger 10 durch Analyse eines vorbestimmten und im voraus festgesetzten optischen Musters auf dem Objektträger, das vor Beginn der Analyse etwa auf Grauwerte und physische Dimensionen abgelesen und gemessen wird. Das optische Integritätsmuster kann hier in Form der Initialen CAS ausgebildet sein, die sich über den Kontrollzellen-Objekten befinden, wie Fig. 2 zeigt. Die Integritätsprüfung kann konkret das Kreuz 34 des optischen Endes oder ein beliebiges anderes Material auf dem Objektträger 10 sein.
- Der Ausrüstungssatz und der Objektträger eignen sich zur späteren Analyse der Probenzellen-Objekte 32 auf dem Objektträger 10 und zur Unterstützung bei der Erinnerung an im Gedächtnis gespeicherte Zellbilder, oder um der Bedienungsperson oder einer anderen Person zu ermöglichen, zu einem späteren Zeitpunkt auf zu eine bestimmte Zelle zurückzugreifen, um an dieser eine zweite Betrachtung vorzunehmen. Zu diesem Zweck wird nach Befestigung des Objektträgers 10 auf einer Mikroskopplatte eine bestimmte Stelle auf dem Objektträger, wie etwa der Mittelpunkt 38 des Kreuzes 34, als Null-Null X-Y Referenzpunkt notiert; anschließend werden die Positionsregister für die X- und Y-Abstände an diesem Punkt gleich Null gesetzt, so daß anschließend alle Zellen-Positionen eine spezifische X- und Y-Koordinatenadresse relativ zum Mittelpunkt 38 des Kreuzes aufweisen. Eine weitere, durch die Einstellung mit der Mikroskopplatte leicht zu findende Position ist eine Ecke, etwa die rechte untere Ecke 39 der Kasten-Begrenzung 26, in der sich die Referenzzellen-Objekte 28 befinden. Im vorliegenden Fall ist die Kasten-Begrenzung 26 auf dem Objektträger aufgedruckt und sie kann auch anstelle des speziellen Kreuzes 34 zur Kalibrierung der optischen Dichte verwendet werden. Andererseits kann durch geeignete Logik und Steuerung jeder beliebige Punkt auf dem Objektträger und der Mikroskopplatte, an dem der Klassifizierungsvorgang beginnt, als X und Y Null-Stelle verwendet werden, wobei zu Anfang die Positionsregister für die X und Y-Koordinaten für diese Stelle auf Null gesetzt werden und dann basierend aus dieser auf Null gesetzten Position ein Auslesewert für jede Zellen-Position erzeugt wird.
- Der Objektträger kann ferner Lokalisierungsstreifen auf dem Objektträger aufweisen, um die Lokalisierung spezifischer Zellen-Objekte zu erleichtern. Die jeweilige X und Y-Koordinate für jede Probezelle kann man durch Verwendung konventioneller Schrittmotortechniken erhalten, die weithin bekannt und relativ kostspielig sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Objektträgers werden die X- und Y-Koordinaten für jede gegebene Position problemlos mit einem X-Richtungs-Sensorstreifen 40 bestimmt, der an der Unterseite des Mikroskopobjektträgers 10 zur Bewegung mit dem Objektträger über einen Sensorlesekopf befestigt werden kann, der an einem stationären Teil des Mikroskops befestigt ist, eine Sensorskala auf dem Sensorstreifen abliest und ein digitales Ausgangssignal an eine elektronische Schnittstelle liefert, die die X-Koordinate in digitalen Zahlen an eine Instrumentensteulogik ausgibt, die zur Speicherung im Speicher und zur Ausgabe dient. Ferner wird ein ähnlicher Streifen 42 derart an dem Objektträger befestigt, daß der Streifen mit der Platte in der Y-Richtung über einen Lesekopf bewegt werden kann, welcher an einem stationären Teil des Mikroskops angebracht ist, so daß der Lesekopf die Kennnzeichnungen auf dem Y-Streifen 42 lesen kann, um einen digitalen Auslesewert an die elektronische Schnittstelle auszugeben, die digitale Signale an die Instrumentensteuerlogik übermittelt, um die Y-Koordinate zu speichern und auf dem Videomonitor die der X-Koordinate zugeordnete Y-Koordinate anzuzeigen. Das System kann umgekehrt ausgebildet sein, wobei die Leseköpfe an der Platte befestigt sind und sich mit dieser bewegen, und wobei die Skalenstreifen 40 und 42 stationär befestigt sind, um digitale Auslesewerte zu liefern, wenn sich die Köpfe über die Streifen bewegen. Die gezeigten bevorzugten Streifen und Köpfe werden üblicherweise als Instrumentfühlermeßgeräte oder dgl. verwendet, die unter der Marke "SYLVAC" vertrieben werden und bei denen magnetische Streifen und magnetische Leseköpfe verwendet werden.
- Das in den Flaschen 6 des Ausrüstungssatzs enthaltene Anfärbematerial enthält Thionin und kann ein Sulfonierungsmittel enthalten. Das Thionin ist nicht nur mit den Probenzellen-Objekten und den Referenzzellen-Objekten kompatibel, sondern es ist auch in einer ausreichenden Menge vorhanden, um für die Referenzzellen-Objekte und die Probenzellen-Objekte nach Aufbringen einer wässerigen Lösung des Anfärbemittels für eine vorbestimmte Zeitdauer eine optische Dichte zu erzeugen, die im wesentlichen eine lineare Funktion der Anfärbemittelkonzentration pro angefärbtem Referenzzellen-Objekt ist. Gemäß Fig. 5 ist nach dem Anfärben der Zellen-Objekte mit einer wässerigen Anfärbemittel-Lösung eine Kurve der optischen Dichte über der Anfärbemittelkonzentration pro angefärbtem Zellen-Objekt über einen ausgewählten Bereich von Anfärbemittelkonzentration pro Zelle im wesentlichen linear, wie bei 46 gezeigt. Vor der Verwendung wird das Anfärbemittel generell mit einer wässerigen Lösung von 0,1 N HCl gemischt und dann für eine vorbestimmte Zeitdauer auf die untersuchten Zellen-Objekte ausgebracht. Danach wird der Objektträger gespült und untersucht. Ein bedeutender Aspekt der Erfindung besteht darin, daß die Menge des Anfärbemittels nach dem Vermischen mit dem Wasser derart beibehalten wird, daß die Anfärbelösung für einen gegebenen Anfärbezeitbereich eine Konzentration von mit den Zellen-Objekten assoziiertem Anfärbemittel ergibt, die entlang des im wesentlichen linearen Abschnitts der Kurve von Figur 5 verläuft. Das Beibehalten der Anfärbemittelkonzentration pro angefärbtem Zellen-Objekt als eine im wesentlichen lineare Funktion der optischen Dichte erleichtert die Bestimmung der Anfärbemittelkonzentration pro angefärbtem Zellen-Objekt aus der optischen Dichte und erleichtert generell die Messung der optischen Dichte und der Differenzen der optischen Dichte über relativ geringe Differenzen in der Anfärbemittelkonzentration pro Zellen-Objekt. Diese Faktoren sind bei der Quantifizierung von Zellbestandteilen oder -komponenten aus der Anfärbemittelkonzentration bedeutsam, die ihrerseits anhand der optischen Dichte gemessen wird. Im Falle von Thionin und der Quantifizierung von DNA liegt die Anfärbemittelkonzentration in der wässerigen Färbelösung im Bereich von etwa 1 bis etwa 5 mg/ml für eine Anfärbezeit im Bereich von etwa 60 bis 120 Minuten, wobei die Konzentration des Anfärbemittels vorzugsweise etwa 2 mg/ml für eine Anfärbezeit von etwa 60 Minuten beträgt.
- Die wässerige Lösung des auf den Objektträger aufgebrachten Anfärbemittels Azur A ist sauer. Im Falle der Anfärbung van DNA mit diesem Anfärbemittel hat die wässerige Lösung des Anfärbemittels einen pH-Wert von 2,7, der mit 0,1 N Salzsäure kontrolliert wird. Die wässerige Lösung des Anfärbemittels kann ferner eine Anfärbungssulfonierungsmittel aufweisen, dessen Konzentration im Bereich von ungefähr 2 bis 16 mg/ml liegt und vorzugsweise 8 mg/ml beträgt.
- Nach dem Anfärben der auf dem Objektträger befindlichen Zellen-Objekte, z.B. mit einer sauren, wässerigen Anfärbelösung, wird überschüssiges Anfärbemittel meist mit einer sauren, wässerigen Spüllösung von dem Objektträger abgespült. Bei der Anfärbung von DNA mit Thionin und einer nachfolgenden Spülung wird die wässerige Spüllösung vorzugsweise mit 0,05 N Salzsäure auf einen pH-Wert von ungefähr 2,65 gebracht. Die Spüllösung enthält ferner ein Spülsulfonierungsmittel in einer Menge, die im Bereich von ungefähr 3 bis 6 mg/ml liegt und vorzugsweise 5 mg/ml beträgt.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Objektträgerschachtel 8 ein Unterteil 48 und einen Deckel 50 auf, wobei jede Objektträgerschachtel fünf mikroskopische Objektträger enthält, die in nebeneinander mit seitlichen Abständen zueinander angeordnet sind. An der Längsseite der zwei einander gegenüberliegeden Seiten des Unterteils der Objektträgerschachtel verlaufen Längsrippen, um die Objektträger in ihrer Position innerhalb der Schachtel zu halten. Die Rippen weisen einen ausreichenden Abstand voneinander auf, um zu erlauben, daß die Mikroskop-Objektträger zwischen ihnen gleiten und an den Längsrändern der Objektträger von den Rippen derart gehalten werden, daß die Objektträger nebeneinander liegen. Eine Öffnung im Deckel ermöglicht die Aspiration von Anfärbemittel in eine geschlossene Schachtel mittels eine hypodermische Nadel oder dgl., so daß die Schachtel zum Aufbringen von Anfärbemittel auf die Objektträger anstelle von Coplin-Färbegefäße verwendet werden kann.
- Für die Analyse von DNA mit Thionin enthält ein Ausrüstungssatz sieben Röhrchen, die jeweils 200 mg Thionin (geprüft) mit 0,8 g K&sub2;S&sub2;O&sub2; Anfärbe-Sulfonierungsmittel enthalten. Jedes Röhrchen reicht zur Herstellung von 100 ml einer wässerigen Thionin-Lösung aus, um eine Konzentration von 2 mg/ml Thionin zu ergeben, wie im folgenden beschrieben wird. Der Ausrüstungssatz enthält ferner sieben Röhrchen mit Spül-Sulfoniermittel, das aus 1/5 g K&sub2;S&sub2;O&sub2; besteht (statt Kaliumsalz kann die gleiche molare Menge an Na&sub2;S&sub2;O&sub5; verwendet werden), und fünf Schachteln mit Objektträgern. Jedes Röhrchen mit Spül-Sulfonierungsmittel reicht bei Vermischen des K&sub2;S&sub2;O&sub2; mit Wasser und Salzsäure zur Herstellung von 300 ml Spülreagenzlösung aus. Die fünf Schachteln oder Behälter mit jeweils fünf mikroskopischen Objektträgern enthalten DNA-Referenzzellen-Objekte in Form von Rattenleber-Zellen.
- Der Ausrüstungssatz kann ferner eine Flasche für die wässerige Anfärbelösung, die zur Herstellung der wässerigen, sauren Thionin-Lösung bei einem Volumen von 100 ml markiert ist, und eine Flasche für die Spüllösung enthalten, die zur Herstellung von 300 ml saurer Spüllösung bei einem Volumen von 300 ml markiert ist. Zu den Materialien, die in Verbindung mit dem Ausrüstungssatz und dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet, aber nicht notwendigerweise zusammen mit dem Ausrüstungssatz geliefert werden, zählen 0,05 N HCl, 0,1 N HCl, 5 N HCl und elf 75 ml-Coplin-Färbegefäße.
- Gemäß der Erfindung wird mit dem Ausrüstungssatz die Präparation der Objektträger unter Ausnutzung der Feulgen-Anfärbereaktion wie folgt durchgeführt.
- Zytologische Proben (z.B. Zytospinpräparationen, Tastpräparationen, feine Nadelaspirate, Ausstriche und Ausstrichpräparationen) werden für ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 2 Stunden an der Luft getrocknet und für ungefähr 30 Minuten in 10 %-igem neutral gepuffertem Formalin fixiert. Dann werden die Objektträger für ungefähr 5 Minuten in deionisiertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Die mit Formalin fixierten, luftgetrockneten Objektträger können bis zur Anfärbung bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
- Zur Herstellung der wässerigen Thionin-Lösung mittels des Ausrüstungssatzes wird der gesamte Inhalt eines Färbemittel-Reagenzröhrchens in eine Flasche mit Thionin-Lösung überführt, die bei einem Volumen von 100 ml markiert ist. Die Flasche wird bis zur Linie mit 0,1 N Salzsäure gefüllt, dicht verschlossen und geschüttelt. Die Flasche wird dicht verschlossen gehalten und für eine Stunde beim Raumtemperatur (18 bis 20ºC) stehengelassen. Anschließend wird die Lösung gefiltert, um Färbemittel zu beseitigen, das sich nicht aufgelöst hat.
- Die saure wässerige Spüllösung wird durch Überführen des gesamten Inhalts (1,5 g K&sub2;S&sub2;O&sub2;) eines Spül-Sulfonierungsmittel- Röhrchens in eine Spülflasche hergestellt, die bei einem Volumen von 300 ml markiert ist. Die bei 300 ml markierte Spülflasche wird mit 0,05 N Salzsäure bis zur Markierung aufgefüllt. Der Behälter wird dicht verschlossen, und sein Inhalt wird bis zum vollständigen Auflösen des Spülpuffers vermischt. Sowohl das wässerige Thionin als auch die Spüllösung sind für 4 bis 6 Stunden stabil, wenn sie bei Raumtemperatur (18 bis 28ºC) aufbewahrt werden. Die Thionin- und die Spüllösung können beide zum Anfärben von bis zu 2 Sätzen van Objektträgern oder zehn Objektträgern verwendet werden, vorausgesetzt, daß der zweite Satz innerhalb von 6 Stunden nach Herstellung der Lösungen fertiggestellt ist.
- Ferner wird eine saure Hydrolyselösung (75 ml), bei der es sich um eine 5 N Salzsäurelösung handelt, zur Präparation der Zellen-Objekte mittels einer Hydrolysereaktion der DNA in der oben beschriebenen Weise hergestellt. Diese 5 N Salzsäurelösung hat einen pH-Wert von 0,5.
- Die Objektträger werden gemäß dem folgenden Ablauf angefärbt und präpariert.
- 1. Die Objektträger werden in Formalin, das in einem Volumenanteil von 10% vorliegt und auf einen pH-Wert im Bereich von ungefähr 7,2 bis ungefähr 7,5 eingestellt ist, für 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert.
- 2. Die Objektträger werden für ungefähr 60 bis ungefähr 75 Minuten in einen 5 N Salzsäure enthaltenden Coplin-Färbekasten gelegt.
- 3. Die Objektträger werden aus dem die Salzsäurelösung enthaltenden Coplin-Färbegefäß direkt in einen Thionin-Lösung enthaltenden Coplin-Färbegefäß überführt und für ungefähr eine Stunde angefärbt.
- 4. Drei Coplin-Färbegefäße, die jeweils mit der Spüllösung gefüllt sind, sind zur Verwendung vorbereitet. Die Objektträger werden in den ersten, Spüllösung enthaltenden Coplin-Färbekasten gegeben und für etwa 30 Sekunden mit dem Spülmittel in Kontakt gebracht. Die Objektträger werden dann in den zweiten mit Spüllösung gefüllten Coplin-Färbekasten gegeben und für ungefähr 5 Minuten stehengelassen. Anschließend werden die Objektträger in den dritten mit Spüllösung gefüllten Coplin-Färbekasten gegeben und erneut für ungefähr 10 Minuten stehengelassen.
- 5. Anschließend werden die Objektträger für etwa 5 Minuten in fließendem destilliertem Wasser gewaschen.
- 6. Die Objektträger werden für 5 Minuten in sauren Alkohol (0,37 % Schwefelsäure, 70 % Ethanol) überführt.
- 7. Die Objektträger werden für ungefähr 5 Minuten in absolutem Ethanol dehydriert, um zur Abdeckung mit Deckplättchen geeignete Objektträger herzustellen.
- 8. Die Objektträger werden für ungefähr 5 Minuten in Xylol gereinigt.
- 9. Die Objektträger werden mit einem Kunstharz und einem Deckplättchen montiert.
- Das Vorhandensein einer dunkelblauen Anfärbung in den Kernen der Kontrollzellen im Kalibrierungsbereich des Objektträgers ist der Nachweis eines korrekten Verhaltens der Reagenzien. Die Feulgen-Reaktion erzeugt eine spezifische blaue Anfärbung von Kern-DNA. Nukleoli, sofern vorhanden, und Zytoplasma sollten keine Anfärbung zeigen. Normale menschliche Zellen weisen einen DNA-Gehalt auf, der gleich 93 % der in den Referenzzellen-Objekten im Referenzzellen-Objektbereich auftretenden Menge ist, d.h. 6,7 Pikogramm. Maligne Zellen können normale, erhöhte oder gelegentlich verringerte Mengen an DNA zeigen. Proliferierende (S-Phasen-) Zellen zeigen erhöhte Mengen an DNA, verglichen mit dem Haupt-DNA-Peak für diesen Zelltyp.
- Nachdem die in der mitanhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 des Anmelders beschriebene Vorrichtung mittels des für optische Dichte vorgesehenen Referenzbereiches auf optische Dichte der Bildanalysevorrichtung kalibriert worden ist, fordert eine Kontrollprogrammlogik eine Referenzzellen- Objekt-Kalibrierungsfunktion entsprechend dem Histogramm gemäß Fig. 6 an. Während dieser Kontrollzellenkalibrierung bewegt die Bedienungsperson den Mikroskop-Objektträger, um die Referenzzellen-Objekte 28 in das Blickfeld eines Monitorschirms zu schieben. Wenn sich ein einzelnes gefärbtes Referenzzellen-Objekt 28 innerhalb eines Referenzbereiches befindet, wird die summierte optische Dichte für dieses angefärbte Referenzzellen-Objekt gemessen und gespeichert. Nach Analyse einer ausreichenden Anzahl von angefärbten Referenzzellen-Objekten erhält der Analytiker - etwa auf einem Videomonitor - ein Histogramm gemäß Fig. 7, das dem Analytiker die Kontrollzellen-Objekt- Ploidieverteilung als relative DNA-Menge zeigt. Innerhalb einer Instrumentenkontrollogik wird - wie in der mitanhängigen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 des Anmelders beschrieben - der Modalwert des Histogramms einzelner auf summierter Werte der optischen Dichte, die für die Kontrollzellen-Objekte tatsächlich gemessen wurden, mit einem vorbestimmten Standard oder einer Referenzbetrag an DNA verglichen, von dem bekannt ist, daß ihn die Kontrollzellen besitzen. Die von der Bedienungsperson gefundene tatsächliche aufsummierte optische Dichte wird durch den gespeicherten Referenz-DNA-Wert dividiert, um einen Faktor zu liefern, durch den eine Abweichung der Anfärbung von einer perfekten Anfärbung ausgeglichen werden kann, für welche die interne Referenzkonzentration aufgestellt worden ist.
- Der Analytiker kann nun mit der Erfassung von Zelldaten für die DNA-Ploidieanalyse beginnen. Der Analytiker wählt eine Anzahl von Feldpositionen entlang des Probenzellen-Objektbereichs 30 für die Analyse. Der Analytiker bewegt den Mikroskop-Objektträger derart, daß die auf DNA-Gehalt - sowie, falls gewünscht, auf Zellmorphologie - zu analysierende Probenzellen-Objekte in das Gesichtsfeld gelangen. Der Analytiker klassifiziert die Zelle auf ähnliche Weise wie in der mitanhängigen Patentanmeldung Nr. 86907142.3 des Anmelders beschrieben, um eine aufsummierte optische Dichte für das Probenzellen-Objekt, d.h. einen angefärbten Zellen-Objektkern, sowie seine Fläche, seine Rundheit und andere Klassifizierungsinformation zu erhalten. Dann kann ein Histogramm erzeugt werden, das den DNA-Gehalt ergibt. Generell wählt der Analytiker eine Anzahl von Zellen-Objekten in jedem Feld oder Bereich aus und bewegt dann die Mikroskopplatte derart, daß eine Anzahl unterschiedlicher Felder von Probenzellen-Objekten in das Blickfeld gelangen, und nimmt eine Anzahl dieser Probenzellen- Objekte auf und analysiert sie, bis er annimmt, eine repräsentative Probe zu besitzen. Dies ermöglicht die Erstellung eines Histogramms gemäß Fig. 7, das die Anzahl von Zellen eines bestimmten DNA-Gehaltes und die Mittelwerte des DNA-Gehalts für jeden der Referenzpeaks zeigt. Die Daten können auch intern innerhalb einer Computerlogik zum späteren Aufruf und Vergleich mit Daten einer neuen Probe vom selben Patienten zur Analyse der Progression oder Regression des Patienten gespeichert werden.
- Nach dem Anfärben und der Bildanalyse der angefärbten Objektträger sollten die Kontrollzellen einen einzelnen Hauptpeak ergeben, der auf der Position des DNA-Gehalts normaler menschlicher Zellen liegt. Verschiebungen des DNA-Hauptpeaks bei unbekannten Proben weisen auf einen abnormen DNA-Gehalt hin. Eine Verschiebung des Hauptpeaks nach rechts, insbesondere unter Erzeugung eines zweiten Peaks mit dem doppelten DNA-Gehalt des ersten Peaks, weist auf eine proliferierende Zellpopulation hin. Für eine ausreichende Genauigkeit sollten 50 bis 100 Zellen bei nicht-proliferierenden Populationen und 100 bis 200 Zellen bei proliferierenden Populationen gezählt werden.
Claims (8)
1. Ausrüstungssatz zur Quantifizierung von Zellkernen, mit
einem Mikroskop-Objektträger (10), der einen
Referenzbereich (26) und einen Probenzellen-Objektbereich (30) zur
Aufnahme von Probenzellen-Objekten (32) aufweist, wobei
der Referenzbereich (26) ein Referenzmittel (28) zum
Anfärben enthält und das Referenzmittel (28) Rattenleber-
Kerne mit vorbestimmten physikalischen Eigenschaften
aufweist, die nach dem Anfärben detektierbar sind; und mit
einem oder mehreren Behältern (6) mit Anfärbematerial, das
Thionin aufweist, zur gleichzeitigen Aufbringen von
Anfärbemittel auf die Probenzellen-Objekte (32) und das
Referenzmittel (28), wobei das Anfärbemittel in den Behältern
(6) in einer ausreichenden Menge vorliegt, um nach dem
Anfärben eine optische Dichte pro Einheit des
Referenzmittels (28) zu erzeugen, die eine im wesentlichen lineare
Funktion der Anfärbemittel-Konzentration pro Einheit des
angefärbten Referenzmaterials ist, und wobei das Anf
ärbematerial in den Behältern (6) in einer ausreichenden
Menge vorliegt, um eine optische Dichte pro Einheit des
angefärbten Referenzmittels (28) zwischen ungefähr 0,1 bis
0,8 zu erzeugen.
2. Ausrüstungssatz nach Anspruch 1, wobei das Ausrüstungssatz
ferner ein Spül-Sulfonierungsmittel aufweist.
3. Ausrüstungssatz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem
der Mikroskop-Objektträger ferner einen Referenzbereich
für optische Dichte aufweist, wobei der Referenzbereich
für optische Dichte ein Material mit einer vorbestimmten
bekannten optischen Dichte enthält, um den Objektträger
mit dem zum Untersuchen der Probenzellen benutzten
Instrument zu kalibrieren.
4. Ausrüstungssatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
zur Verwendung bei der Quantifizierung von nuklearem DNA
durch Lichtmikroskopie, wobei die physikalischen
Eigenschaften des Referenzmittels eine Assoziierung des
Referenzmittels mit einem Anfärbemittel erlaubt, die
proportional zu einer Assoziation des Anfärbemittels mit einer
bekannten Menge von DNA erfolgt.
5. Ausrüstungssatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
bei dem das Anfärbematerial eine ausreichende Menge von
Thionin enthält, um bei Mischung mit 0,1 N HCl eine
wässrige Lösung mit einer Konzentration von Thionin im Bereich
von 1 bis 5 mg/ml zu erzeugen.
6. Ausrüstungssatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
bei dem die Rattenleber-Kerne Tetraploid- und Diploid-
Zellen aufweisen.
7. Verfahren zum zur Quantifizierung von Zellkernen,
umfassend:
Versehen eines Objektträgers mit einem Referenzbereich und
einem Probenzellen-Objektbereich;
Versehen des Referenzbereiches mit einem Rattenleber-Kerne
aufweisenden Referenzmaterial, das physikalische
Eigenschaften aufweist, die eine bekannte Menge an DNA umfassen
und eine Assoziation des Referenzmaterials mit einem
Anfärbemittel erlauben, die einer Assoziation des
Anfärbemittels mit DNA proportional ist;
Plazieren von Probenzellen-Objekten in dem Probenzellen-
Objektbereich;
gleichzeitiges Anfärben des Referenzmaterials und der
Probenzellen-Objekte mit einem Thionin aufweisenden
Anfärbemittel für eine vorbestimmte Zeitdauer, wobei das
Anfärbemittel in einer ausreichenden Menge vorliegt, um nach
dem Anfärben eine optische Dichte pro Einheit des
Referenzmaterials zu erzeugen, die eine im wesentlichen
lineare Funktion der Anfärbemittel-Konzentration pro Einheit
des angefärbten Referenzmaterials ist, und um eine
optische Dichte pro Einheit des angefärbten Referenzmaterials
zwischen ungefähr 0,1 bis 0,8 zu erzeugen;
Messen der optischen Dichte des Referenzmaterials nach dem
Anfärben;
Messen der optischen Dichte der Probenzellen-Objekte nach
dem Anfärben; und
Bestimmen des Mengenbetrages von DNA in den Probenzellen-
Objekten aus den gemessenen optischen Dichten.
8. Verfahren nach Anspruch 7, ferner mit einem der Merkmale
aus Anspruch 3, 5 und 6.
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