JPH01127956A - 生物標本の分析用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞のような生物学的標本の像分析による臨床
検査と定量の方法と装置に関する。

（先行技術および発明が解決しようとする課題〕本発明
は人体から採取した種々な細胞１組織またはその材料の
広範囲な診断検査と評価のために使用可能である定食試
験装置と方法に関する。本発明は染色可能な細胞成分す
なわち構成要素を分析し、定量するための、パターン認
識法による像分析に用いる装置（以下ではキットつと方
法に関する。このキットと方法は、ここに全体的に参考
文献として関係する１９８５年１１月４日出願の米国特
許出願第７９４．９３７号に開示されている方法と装置
に、特に有用であり適用可能である。好ましい実施態様
では、この方法とキットを癌の診断と予後のための細胞
ＤＮＡの測定に用いろことができる。

以下でさらに詳細に説明するように１本発明は研究者が
使用するばかりではなく、検査室で病理学者も使用する
。使用者相互作用的性質の装置の提供、ならびに典型的
な病理学者研究室が入手できるような低コスト装置に関
する。

病理学検査室の技術の現状は病理学者の目視観察によっ
て、ＤＮＡの成分すなわち構成要素のような細胞の成分
すなわち構成要素（以下では、「細胞対象」）の含量を
評価することであり、病理学者は主として染色後の細胞
対象の形状と組織を観察する。例えば、病理学者は癌細
胞の疑いに関連して、細胞対象の形状と組織乞観察して
、それらを正常カテゴリーまたは幾つかの異常な癌カテ
ゴリーの１つに分類する。しかし、これらの評価は非常
に主観的であり、個々の細胞内または非常に小さい異常
細胞群内の、下記で検討するような癌の診断と予後に臨
床的意義を有するような小さい変化を識別または計量す
ることができな（・。

液体血液標本または組織離解な扱うことができる。

市販の一般用フローサイトメーターが存在するが、これ
らのサイトメーターは標準的な組織切片に適用すること
ができず、病理学検査室で用いられる好ましい標本形で
ある顕微鏡スライドを用いることもできない。さらに１
画像分析方法は細胞核のサイズと形状と組合せた組織及
び細胞の核対原形質比の変化のような細胞の形態学的特
徴の分析な可能にするが、フローサイトメーターではこ
のような分析は不可能である。

解剖、外科及び組織病理学の分野における熟練を要する
試験方法の発達は現在までに染色した細胞及び組織と先
行例のヒトの記憶との一次目視比較に達している。この
ような技術の現状での過去の記憶との主観的比較を数量
化し、補足するための測定法の新しい進歩（すなわち、
特許出願第７９４．９３７号〕は、測定機器の較正を必
要とする。

例えば化学分析較正（測定の較正の技術レベルが充分に
発達している）に比べて、新規な較正手段が必要である
、化学分析と同様に元の透過率測定によって分析値を読
み取ることができるとしても、透明な基体上で細胞及び
組織の形状を保護するために、薄い固体物質として機器
に物質が実際に供給されるからである。特定細胞または
組織部分の適当な定量的染色後にこのような読取り筐を
較正するための方法と技術の現状の工法は本質的に未開
発であり、存在しな（・。本発明で述べるような、適切
な較正はこのような検査室試験を根本から変え、主観的
から客観的に変化させるものである。

このような較正は各試験、すなわち各標本の個々の顕微
鏡スライドに基づくものであることが好ましい。被検対
象は信じられないほど小さいので、例えば１００平方マ
イクロメータのオーダーのサイズの有核細胞内の数ピコ
グラムのＤＮＡを測定するので、光の透過率のごく小さ
いシフトまたは微妙な染色変化がこのような較正なしに
は測定過程を誤差の多いものにしがちであるからである
。

画像分析の使用は一般に顕微鏡スライド上での細胞対象
の染色を必要とする。通常の病理学検査室で病理学者が
画像分析方法と装置及び着色標本を用いると、染色の変
動、着色細胞対象の光学密度の一定化、染色対象を載せ
た顕微鏡スライドの較正を含めた多くの問題の解決が必
要とをり、これらの問題の全てが本発明によって解決さ
れた。ホイルゲン（Ｆｅｎｌｇｅｎ　）染色方法な用い
℃、細胞対象内のＤＮＡを染料１例えばチオニン、アズ
ール（Ａｚｕｒｅ　）　Ａ、アズレＣ，パラロザニリン
、及びメチレンブルーによって染色する。蛋白質はコン
ゴレッド、エオシン、エオシン／ヘマトキシリンの組合
せ１．またはファーストグリーンによって染色される。

酵素はジアミノベンジジンまたは３−アミノ−９エテル
カルバゾールまたは染料基質と組合せたアルカリホスフ
ァターゼによって町視化され；細胞オルガネラはメチレ
ンブルーによって染色され；リポソームはメチレン・ブ
ルーによって染色され、ミトコンドリアはギームザ染料
によって染色される。この用途のために、「染料（ｓｔ
ａｉｎ　）Ｊなる用語は成るものを町視化するための染
料基質と組合せた酵素〔アルカリホスファターゼのよう
な〕を含む。さらに、ここで用いるかぎり染料なる用語
にはメチルグリーンのようなカウンター・スティンを含
む。胸部細胞癌分析では、これらの染料の幾つかをモノ
クローナル抗体と組合せて用いて、エストロゲンまたは
プロゲステロン・レセプターを検出する。抗原分析はモ
ノクローナル抗体と標本及び対照の細胞対象との結合段
階を含む。この後、モノクローナル抗体は酵素染料と結
合する。モノクローナル抗体は螢光物質または染料と結
合することができる。次に螢光染料は螢光な誘発する波
長で励起し、このことは螢光の発光が生ずるような他の
波長で観察される。抗体が特定のウィルスに対して形成
されろ場合には、対照の細胞対象標本をウィルスのゲノ
ムに対して特異的な核酸プループによって処理する。

細胞対象の染色度の変化及び着色細胞対象の光学密度の
変化は、像分析による着色細胞対象の定量における問題
を表している。アズールＡによるＤＮＡのような細胞対
象の染色は同一病理学者によっても、各スライドによっ
てまたは各バッチによっ℃実質的に異なるのみでなく、
異なる病理学者または異なる検査室によっても実質的に
変化する。像分析装置はグレーレベルまたは光学密度を
測定して、着色細胞対象の光学密度測定値から。

細胞の実際のＤＮＡ量をピコグラムで算出することが望
ましいので、標本の相違による染色要素の相違を克服す
ることが重要である。像分析法は顕微鏡と、病理学者が
用いる場合に種々の光の強さを与えるように調節可能で
ある光学的照明とを用いる。研究検査室に熟練した研究
者を配置して、像パターン方法による像分析に好まし〜
・条件に光の強さを調節することができるが、これは一
般には通常の病理学検査に必要な精度で実施されない。

従って、この光学密度と染色変数の問題を解決する必要
がある。

今までの細胞分析では、細胞対象の費用のかからない単
純な定量が不可能であった。例えば、高価で複雑な装置
を用いる場合以外には、細胞対象含量の関数であるデー
タの相対比較は細胞対象の増殖を研究する研究者が利用
可能であるにすぎなかった。ＤＮＡの場合には、ピコグ
ラムでの細胞核のＤＮＡ含量絶対値は細胞サイクル分析
のような用途に検査室研究者が容易に利用することはで
きなかった。さらに、ＤＮＡに関連して、これに癌の診
断と予後に臨床的意義を有する。細胞のＤＮＡ含量分析
は良性及び悪性細胞の増殖の評価に重要であることが判
っている。例えば前立腺癌。

結腸癌、頚部癌、胸部癌及び膀胱癌のような多くの癌で
は、異常なりＮＡ含量（異数性〕が常に観察されている
。また、初期データは異数性評価が予後値を有すること
を示している。アトキン　（Ａｔｋｉｎ）の［抜型、特
に癌に相関した細胞測光法によるＤＮＡ測定（ｃｙｔｏ
ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｔｃ　ＤＮＡＤｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ　Ｃｏｒｒｒｅｌｓｔｅｄ　ｔｏ　Ｋａｒｙｏｔ
ｙｐｅ。

ＰａｒｔｉＣｕｌａｒｌｙｃａｎｃｅｒ月細胞分析、定
量細胞学と組織学の国際学会（Ｔｈｅ　ｃｌｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｌｏｇ
ｙ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ａｎｄＱｕａｎｔｉ　ｔａ
ｔｉｖｅ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｈｅｓｔｏｌｏ
ｇｙ　）９：９６−１０４（１９８７）参照のこと。さ
らに、ある場合には、ＤＮＡを合成する細胞（云わゆる
「Ｓ相」細胞）数増加の有無が腫瘍細胞増殖度に相関す
ることが判明している。

染色後に細胞対象の像分析を実施する、パターン認識法
な用いる装置（１９８５年１１月４日出願の特許出願第
７９４．３１７号に開示されている装置のような〕と結
合させた、本発明の方法とキットによって、研究者はＤ
ＮＡを含めた細胞対象の微細な変化に容易にかつ費用を
かけずに検出することができるのみでなく、研究及び患
者の診断と治療における統計分析の補助手段として、細
胞対象の量を測定することができる。

本発明は今まで像分析に用いるコンビシータ化装置に付
随した高コストの問題を克服する；このために、本発明
は細胞の選択、調製、顕微鏡スライドへの塗布及び染色
を含めた多（の仕事を病理学者が実施する相互作用系で
ある。病理学者には両方とも特別に調製され較正された
染料とスライドとを含む本発明のキットを供給する。ス
ライドは、標本の細胞対象の診断を助け、上記の染色密
度問題の克服を補助するための基準細胞を含む。

本発明は細胞対象のその形状に関する検査のための位置
選定を可能にし、それらの位置を第２病理学者による必
要に応じた後の分析または実証分析のために保存する。

核に関しては、ミクロンでの面積、総核光学密度または
ピコグラムでの核質量、平均核光学密度、核組織、及び
抜形状の円形核からの逸脱の測定値が得られる。このよ
うな測定の多（は細胞質に対して行われる。

本発明のキットを細胞分析に用いる場合には、スライド
に組織標本及び細胞標本を塗布し、細胞対象と比例結合
して細胞の残りの部分を一般に本質的に隠ぺいする特定
の染料で染色するので、像分析は細胞の核に主として集
中するＤＮＡのような細胞対象の含量を測定することが
できる。染料は細胞対象と結合して、詳細な核構造とパ
ターンを明らかにし、これらを病理学者は像分析の装置
を用いて目視観察して解釈する。癌の診断と予後のため
のＤＮＡ分析に関連して、悪性細胞中のＤＮＡ量は一般
に正常細胞におけるよりも実質的に大きい、これは悪性
細胞が通常迅速に分割し複製される。または悪性細胞は
異常な数の染色体または不完全染色体な有するからであ
る。

本発明のキットは基準部分と標本細胞を受容するための
標本細胞対象部分とを有する顕微鏡スライドを含む。基
準部分は、標本細胞または標本細胞対象をスライドの標
本細胞対象部分に塗布した後に、標本細胞または標本細
胞対象と所定時間に同時に染色される基準手段を含む。

本発明によると、所定−度の染料によって基準手段と標
本細胞対象とが同時に染色されることによって、下記に
述べるようにスライドの自動較正が可能になる。

キットはまた１個以上の染料容器な含み、顕微鏡像分析
用スライドの調製に用いるリンスに加えるリンス・スル
ホン化剤の容器も含む。キット内の染料量は基準手段と
標本細胞対象の光学密度に影響を与える。これは本発明
の重要な態様である。

染色後に、基準手段（及びＤＮＡのような被検・被測定
物質を含む場合には標本細胞対象も〕の光学密度は、約
０，１〜０．８の範囲内の光学密度が形成されろような
着色細胞対象あたりの染料濃度の特定の範囲にわたって
のみ単位物質あたりの染料濃度（被染色物質が細胞であ
る場合に細胞対象あたりの染色濃度のような）の−次間
数である。この線形部分な除いて、光学密度／細胞あた
りの染料濃度のプロツトの曲線は線形ではなく及び／ま
たは細胞対象あたりの染料濃度の変化による光学密度の
容易に測定可能なまたは容易に理解される差異を示さな
い。このことは細胞分析にとって重要である。癌の診断
と予後におい℃、染料含量の変化と生ずる光学密度の変
化によるＤＮＡ含量変動の観察は、光学密度／細胞あた
りの染料綾部の変化が線形であり、光学密度が約０．１
〜約０．８の範囲内である場合には、容易に検出可能で
あり。

理解されやすい。しかし、ＤＮＡの定量は光学密度によ
る細胞対象の分析の１例にすぎず、細胞対象の光学密度
が線形である場合に推測されやすい。

従って、基準手段の光学密度が染色後の基準手段の染料
−度の実質的に一次関数であり、光学密度が前記の範囲
内であるように、染色後または所定時間後に基準手段に
光学密度が生ずるために、キット内の染料が有効量で供
給されることが重要である。対象が基準物質として参照
される物質を含む場合に、同じことが標本細胞対象につ
いてもいえる。

染色の基準手段が染料と被分析細胞対象との結合に比例
して、染料と結合する基準物質を含むまたは構成する。

ＤＮＡ分析に関連して、基準物質はラット肝細胞核、マ
ス赤血球、ニワトリ赤血球、乾燥ＤＮＡ、ＩＪンパ芽球
様細胞のように再生させろ培養細胞ラインでありうる。

蛋白質または酵素に関連して、基準物質は分析の対象と
をる既知量の蛋白質または酵素な含む物質である。

キットの染料は染料・スルホン化剤をも含みうろ。染料
スルホン化剤とリンススルホン化剤は染料とリンスの酸
性水溶液と共に用いる。スライドの調製ではしばしば染
料を酸性水溶液に入れ、染料水溶液によって基準手段な
らびに標本細胞対象を染色する。スライド上の物質が染
色された後、これらの物質をしばしば酸性水溶液である
溶液によってすすぎ洗いする。このような場合に、常に
再現可能な結果を得るためには、一定の比較的狭い範囲
内のｐＨを有する染料とリンスとが必要である。染料と
適合するスルホン化剤はチオニンまたはアズールＡの水
解ＤＮＡとの結合に役立つ。

本発明の他の実施態様では、キットの顕微鏡スライドは
、標本細胞対象の研究に用いる機器によって顕微鏡スラ
イドを較正するために、所定の公知の光学密度を有する
物質な含む光学密度基準部分を有する。ここに説明する
キットに関連するスライドは、光学密度基準部分なしに
、分析毎に変化する他の変数に関係なく自己較正性（５
ｅｌｆ　−ｃａｌ　ｉｂｒａｔｉｎｇ　）である。これ
らの変数は使用ガラススライドの厚さと種類の変化、な
らびに分析中に生じて分析に影響を与える温度と相対湿
度の変化を含む。

本発明の方法は染色標本細胞対象の光学密度を定量すべ
き物質の既知量を含む染色基準物質の光学密度とを比較
することによって、標本細胞対象の定量を可能にする。

例えば、ＤＮＡ定量に関して、マス赤血球は５．６ピロ
グラムのＤＮＡを有することが知られ℃いる。これらの
細胞を基準物質として用いると、この−ような標本細胞
対象を同時に調製して染色し。

染色基準物質と染色標本細胞対象の光学密度な比較した
場合に、標本細胞対象中のＤＮＡ含量の絶対ＤＮＡ重量
としての算出が可能になる。この算出とそれに関係する
コンピュータ・プログラムは１９８６年１１月４日出願
の我々の特許出該第ＰＣＴ／ＵＳ８６１１０２４０９号
に述べられている。この出願は全体的に参考文献として
ここに関係する。

エストロゲン・レセプタの定量に関する胸部細胞分析で
は、培養した胸部癌細胞またｔ工有機物質例えば子宮内
膜の組織切片を基準細胞として及び基準細胞対象発生源
として用いる。

核ＤＮＡの定量に関しては、本発明の方法は基準領域と
標本細胞対象領域とを有するスライドを形成する；基準
領域内に、既知量のＤＮＡを含み。

染料とＤＮＡとの結合に比例した基準物質と染料との結
合を可能にする物理的特徴を有する基準物質な供給する
；標準細胞対象領域内に標本細胞対象を供給する；染色
後に基準物質の染料濃度の実質的に一次関数である光学
密度を基準物質に与えるために有効量である染料の水溶
液によって、基準物質と標本細胞対象の両方を所定の時
間量同時に染色する；染色後に基準物質の光学密度を測
定する；染色後に標本細胞対象の光学密度を測定する；
測定した光学密度から標本細胞対象中のＤＮＡ量を算出
する段階を含む。

本発明の非常に重要な、他の実施態様では、チオニン染
料と共にラット肝細胞核を基準物質として用いる。ラッ
ト肝はＤＮＡ含量の多くの測定点な与える、ＤＮＡ１３
．４ピコグラム含有４倍体細胞とＤＮＡ６．７ピコグラ
ム含有２倍体細胞とを有する。４倍体細胞を有すること
によって、ラット肝組織は多量の２倍体細胞を含みＤ　
Ｎ　Ａ　１ｊｔｌ＋定点の少ないマス赤血球その他の基
準物質よりも有利である。染色後に、ラット肝細胞核中
の多量のＤＮＡとこれらの核の大きいサイズが基準物質
に大きな光学密度を与える。大きいサイズ、多量のＤＮ
Ａ及び総光学密度の増強が正確な較正と小さい測定誤差
を可能にする。さらに、ラット肝細胞はヒトの組織に実
質的に似ているように見えるのみでなく、ヒト組織が染
料と結合する方法と同様に染料と結合する。この類似性
が同時に染色したヒト組織とラット組織に対して同様な
光学密度を与える。

最後に、ラット肝組織は切断、切片化及び顕微鏡スライ
ドへの塗布が容易であり、細胞が均一に分布し、染色及
び観察が容易であるように配向したサンプルを形成する
。

チオニンはこの代替実施態様と基準としてのラット肝細
胞の使用にとって、ＤＮＡ染色に非常に特異的であるの
で重要である。アズールＡのような他の市販染料の多く
はしばしば不純物を含み、これが蛋白質のような細胞内
の他の物質を染色する。従って、光学密度とＤＮＡ量と
の関係がＤＮＡ染色に非常に選択的である純粋な染料は
ど正確ではなくなるので、このことは本発明の方法にと
って不利である。

本発明のキットと方法は標本細胞対象の微細な変化の容
易で、費用を要さな（・検出を可能にする。

ＤＮＡ含量の細胞対象変化に関連して、この方法はＤＮ
Ａをピコグラムで実際に正確に測定することによって実
施される。本発明はまたＤＮＡ量の測定と定量を可能に
し、ＤＮＡ量を記憶された統計分析値と比較することに
よって診断を補助する。

さらに詳しくは、本発明はＤＮＡ分析に関する我々の特
許出願筒７９４．９３７号（１９８５年１１月４日出願
）と特許出願筒ＰＯＴ／ＵＳ８６１０２４０９号（１９
８６年１１月４日出願）に開示され記載されている我々
の発明と共に、標本集団細胞の反復分析な可能にし、Ｄ
ＮＡ含量と正常細胞の標準ＤＮＡ含量に関する。集団分
布内の微妙なシフトが容易に推測されるような５細胞集
団分布のヒストグラムまたは表示を可能にする。このた
めに、細胞核像な入手して保存するばかりではなく、こ
れからのデータを統計データと統合して、多変数分析、
細胞の識別、ヒストグラム、細胞または細胞集団の散乱
図を可能にする。

従って１本発明の一般目的は像分析方法を用い℃細胞ま
たはその他の生物学的物質を分析するための新規で改良
された装置と方法を提供することである。

本発明の他の目的は、染料とスライドまたは標本細胞対
象のサポートを含み、スライドが基準手段または細胞対
象を含み、スライドと染料が像分析装置に結合したスラ
イドの像分析のための較正を可能にするような新規で改
良されたキットを提供することである。

本発明の他の目的は、像パターン認識装置を用いて細胞
の倍数性分析を実施するための新規で改良された装置と
方法を提供することである。

本発明の上記その他の目的と利点は添付図に関連した次
の記載から明らかになるであろう。

（課題な解決するための手段〕 説明のために図面に示すように、本発明のキットと方法
は一般に、「細胞対象」を自動分析する装置と共に用（
・られる。ここで用いる「細胞対象」なる用語は一般的
に細胞を意味し、核が観察されるように調製した血球ま
たは腫瘍から採取した細胞等をこれらに限定することを
（含む。ＤＮＡの定量の場合には、細胞核内のＤＮＡが
観察されろように、フォイルゲンの染色反応を用いて細
胞を調製する。塩酸はＤＮＡに対するリボース−核酸結
合を加水分解して、アルデヒド糖残基を生ずる。

・次にチオニンまたはアズールＡのような染料がシック
反応（５ｃｈｉｆｆ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）を介り、”
ＩＣ糖７／ｌ／デヒドに結合して青紫色を与える。本発
明に用いることのできる他のシック型試薬染料には、チ
オニン、アズールＣ，バラロザニリン、及びアクリフラ
ビンがある。本発明に用いることのできる非シッフ型試
薬の染料には、メチルグリーン、エチルクリーン、メチ
レンブルー、ヘマトキシリン。

アクリジンオレンジ及びギームザがある。さらに、本発
明は倍数性分析と血球分析のためのＤＮＡ染色試験に有
用であるばかりでな（、パップスミア細胞（！’２ａｐ
　Ｓｍｅａｒ　ｃｅｕ　）、染料に結合し細胞マーカー
として用いられるモノクローナル抗体。

及びＤＮＡグループによってウィルスに関して診断され
る他の感染症の分析に用いられる；前述したように１本
発明は相溶性染料とリンスで染色した蛋白質、酵素、細
胞オルガネラ、リポソーム及びミトコンドリアの検査と
定量に用いられる。

第４図に示すように、キット２は染料物質のビンまたは
バイアル６１個以上、顕微鏡スライド１０のボックス８
１個以上及びリンススルホン化剤のビンまたはバイアル
１２１個以上を含む容器４から成る。この容器は底部１
４、底部にヒンジ止めしたフタ１６及びフタと底部にそ
れぞれ摩擦及びスナップ結合して容器を密閉するラッチ
要素１８と２０を含むラッチを有する。容器の底部は成
形インサートまたはカットインサート２４を含む。

スポンジ、フオーム等のクツション２２を゛有ｆる。

インサートはバイアルまたはスライド・ボックスの形状
を有し、キットの運搬中損傷されないように固定状態に
ビンとボックスを保持するために用いられる。

次に第２図では、顕微鏡スライドすなわち標本スライド
１０は如何なるサイズまたは形状をとり得るが、実験室
技術者及び病理学者が顕微鏡で用いるガラススライドに
なれているため、スライド１０が典型的に３インチ×１
インチのサイズである実際のガラス製顕微鏡スライドで
あることが好ましい。第２図に図示したスライド１ｏは
予めプリントした縁２６な有し、これは基準細胞対象２
８のような染色の基準手段を配置する基準領域を限定す
る。本発明のこの実施態様での基準手段はサイズ；形状
及びＤＮＡ含量が既知のラット肝細胞であり、ＤＮＡ含
量は二倍体細胞では６．７ピコグラムであり、四倍体細
胞では１３，４ピコグラムである。基準細胞対象は良好
に染色される暗色中心または核を有する他の種類の細腕
であることができ１例えばＤＮＡ含量５．６ピコグラム
のマス赤血球、ＤＮＡ含量２．５１ピコグラムのニワト
リ赤血球である；また、これらは細胞形状を有するまた
は有さないスライド上に沈積した人工物でもありうる；
細胞対象２８は特定の螢光染料または酵素染料と反応す
る所定サイズの周知のプラスチックビーズでありうる。

基準細胞対象は試験毎に異なり、木発８Ａは特定の試験
またはそのための細胞対象て限定されない。

スライドはまた。この場合には組織（腫瘍組織のような
〕切片からの細胞、腫瘍組織からの針吸引物または単層
の血球その他の細胞である標本細胞対象３２をスライド
上の領域３ｏに受容するための標本細胞対象領域３ｏを
含む。

本発明の好ましい実施態様では、スライドは例えばスラ
イド上の十字３４のよ５なプリントされたマークである
ことが好ましい光学密度基準領域なも含む。この領域は
スライドを分析する機器を較正する基準として用いるこ
とのできる所定の既知光学密度を有する物質を含む。以
下でさらに詳細に説明するように、特許出願筒７９４．
９３７号（１９８５年１１月４日゛出願〕に記載するオ
ペレーターへの命令制御ロジックからオペレータへヒス
トグラムと指示が与えられ、オペレーターは光学密度基
準物質とバックグラウンド光線に対して望ましい光の強
さが得られるまで１元の強さを手動で調節する。我々の
特許出願筒７９４．９３７号で述べるように、システム
−ロジック（Ｓｙｓｔｅｍ　１ｏ−ＺｉＣ）　　を光学
密度基準物質で較正して、対象の正確な光学密度を読取
ることができる。

スライドはまた系の結合性に対する安全ガードとして光
学的結合性パターン（０ｐｔｉｃａｌ　ｉｎｔｅ−ｇｒ
ｉ　ｔｙ　ｐａｔｔｅｒｎ　）　３６　も含むことがで
きる。このパターンは分析を開始する前に灰色レベルと
物理的サイズに関して読取り測定することのできるスラ
イド上の所定の固定光学パターンを分析することによっ
て、スライド１０からの結合性チエツクと確認を可能に
する。この場合に、光学的結合性パターンは第２図に見
られるように、対照細胞対象上にイニシャルＣＡＳとし
て配置される。結合性チエツクはスライド１０の光学的
端部の十字３４または他の物質によって実施する。

このキットとスライドはスライドｌｏ上の標本細胞対象
３２の後の分析のために有用であり、記憶された細胞像
のリコールを助けるすなわちオペレータまたは他の人を
後に特定細胞に戻して再検討させることを可能にする。

このために、スライド１０を顕微鏡台に固定した後に、
スライド上の成る位置例えば十字３４の中心３８を零−
零Ｘ−Ｙ基準点として注目し、次にＸ及びＹ距離の位置
レジスターをこの点で０位置に調整し、続いて全ての細
胞位置が十字中心３８からの特定のＸ座標、Ｘ座標位置
を有するようにする。顕微鏡台にょる調節によって見出
されたさらに容易な位置選択は基準細胞対象２８を配置
したボックス縁４０の右手下方コーナー３９のようなコ
ーナーである。この場合にボックス縁４０をスライド上
にプリントする。これは特定の十字３４よりも光学密度
較正に用いることができる。一方では、適当なロジック
と対照によって、分類操作を開始するスライド及び顕微
鏡台上の点をＸ及びＹの零位置と見なすことができ、Ｘ
及びＸ座標の位置レジスターを最初にこの位置で零位置
に調節し、この零位置から各細胞位置の読取りを行うこ
とができる。

スライドは特定細胞対象の位置確認な容易にするために
、ロケータ−・ストリップをさらに含むことができる。

各標本細胞の特定のＸ座標、Ｘ座標は技術上周知であり
、比較的費用のかかる段階式モータ一方法で求められる
。スライドの好ましい実施態様では、特定の位置のＸ座
標、Ｘ座標をスライドｌＯの下側に固定されて顕微鏡の
固定部分に固定された検出リードへノドを過ぎてスライ
ドと共に移動することができるＸ方向検出ストリップ４
０によって容易に測定することができる、検出リードヘ
ッドは検出ストリップ上の検出スケールを読取！、中間
電子装置（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｅｌｅｃ−ｔｒｏｎｉ
ｃ　）にデジタルアウトプットを与え、中間電子装置は
デジタル数でのＸ座標を機器制御ロジックにメモリーへ
の記憶と表示のために供給する。

これと同様に、同様なストリップ４２を顕微鏡の固定部
分に固定したリードヘッドを過ぎてＹ方向に台と共に移
動するようにスライドに固定して。

リードヘッドがＹストリップ４２上の印を読取って、デ
ジタル読取り値を中間電子装置に与え、これがＸ座標記
憶とＸ座標をビデオモニターにＸ座標と並んで表示する
ためにデジタルシグナルを機器制御ロジックに供給する
。系は台と共に移動するように台に固定したリードヘッ
ドによっ℃逆にすることができる。スケール・ストリッ
プ４ｏと４２は固定して取付けられ、ヘッドがそれを横
切るたびにデジタル読取り値を与える。図示した好まし
−いストリップとヘッドは機器フィーラーゲージ等とし
て一般に用いられ、磁気ストリップと磁気リードヘッド
を用いて商標「５ＹＬＶＡｃＪとして販売されている。

ラットのピン６内に含まれる染料物質は染料を含み、ス
ルホン化剤を含むこともできる。染料は標本細胞対象物
及び基準細胞対象物と相溶性であるのみでなく、染料水
溶液を所定時間塗布した場合に染色基準細胞対象の染料
濃度の実質的−次間数である光学密度を基準細胞対象物
標本細胞対象物に与えるような有効量で存在する。第５
図に示すように、細胞対象物を染料水溶液で染色した後
における。光学密度／染色細胞対象物の染料濃度のプロ
ットは細胞の染料濃度の特定範囲にわたって４６におけ
るように実質的に直線状である。使用前に染料を一般に
Ｏ，ｔＮＨＣｚ水溶液と混合してから、被検細胞対象物
に所定時間量にわたって塗布する。次にスライドをすす
ぎ洗いして検査する。水と混合した後の染料量を一定の
染色時間にわたって細胞対象に結合した染料濃度が第５
図の曲線の実質的に直線の部分に平行とをるように維持
することは１本発明の重要な態様である。染色゛細胞対
象物の染料濃度を光学密度の実質的−次間数であるよう
に維持すると、光学密度からの染色細胞対象物の染料濃
度の測定が容易になり、細胞対象物の染料濃度の比較的
小さい差に比べて光学密度の測定及び光学密度の差の測
定が一般に容易になる。これらの要素は光学密度によっ
て測定される染料濃度から細胞の成分または構成要素の
定量に重要である。チオニンとＤＮＡ定量の場合には染
料水溶液中の染料濃度は約６０〜１２０分間の範囲内の
染色時間にわたって約１〜約５　ｍｌ　／’　ｍｌの範
囲内であり、約６０分間の染色時間では染料濃度は約２
〜／ａｔである。アズールＡとＤＮＡ定量の場合には、
染料水溶液中の染料の濃度は約１１５〜１２０分間の範
囲内の染色時間に対して約４．９〜約５．１１９／ｍｌ
の範囲内であり、約１２０分間の染色時間に対しては、
染料濃度は約５ダ／ｍｔであることが好ましい。

固体に塗布するチオニンまたはアズールＡ染料の水溶液
は酸性である。これらの染料によってＤＮＡを染色する
場合には、染料の水溶液は０，１Ｎ　ＨＣ，ｔによって
調節したｐＨ２，７を有する。染料の水溶液は染料スル
ホン化剤を約２〜１６１Ｗ９／ｍｌの範囲内の濃度、好
ましくは８　ｍｌ　／　ｒｎｌの濃度を有する。

スライド上の細胞対象を酸性染料水溶液で染色した後に
しばしば、過剰な染料を酸性リンス水溶液で洗い流す。

チオニンまたはアズールＡでＤＮＡを染色し５次にそれ
を洗い流す場合には、リンス水溶液を０．０５Ｎ塩酸に
よっ″（ｐＨ約２．６５に調節するのが好ましい。リン
ス溶液も約３〜６ｍ９／ｗｔｌの範囲内、好ましくは５
〜／ｍｌの量でリンススルホン化剤ケ含有する。

本発明の好ましい態様では、スライド・ボックス８は底
部４８とフタ５０を含み、各スライド・ボックスは間隔
なおいて並んだ関係で並列に維持された顕微鏡スライド
５枚を含む。スライドをボンクス内のそれぞれの位置に
維持するために、スライドボックス底部の向い合った２
個面の長さには縦方向リブが走る。リプは充分に分離し
ており、その間に顕微鏡スライドを挿入して、スライド
が並列するようにスライドの長軸方向エツジなリブで支
えることができる。フタの開口５２は、ボックスをコブ
リン・ジャー（ｃｏｐｌｉｎコａｒ）の代りにスライド
への染料塗布に用いることができるように、皮下注射針
等によって染料を密閉ボックス内に吸引することを可能
にする。

チオニンによるＤＮＡ分析に関連して、好ましい実施態
様のキットはに２Ｓ２ｏ５染料スルホン化剤０．８Ｆと
共にチオニン（公認）２００ｍ９をそれぞれ含む７バイ
アルを含む。各バイアルはチオニン水溶液１００ｍＡ！
を調製して、以下で説明するように、２■／ｒｎｌチオ
ニンの濃度を与えるために充分である。このキットはに
２Ｓ２０５（カリウム塩の代りに１等モル量のＮａ２Ｓ
２Ｏ５を用いることができる）１．５Ｐであるリンス・
スルホン化剤のバイアル７本とスライドボックス５個を
も含む。Ｋ２Ｓ２Ｏ５に水と塩酸を混合する場合に、リ
ンススルホン化剤の各バイアルはリンス試薬溶’ｔＬ３
００ｍｌを充分に製造することができる。それぞれ顕微
鏡スライド５枚を含むボックスまたは容器５個はラット
肝細胞であるＤＮＡ基準細胞を含む。

チオニンを含むキットは酸性チオニン水溶液を製造する
ために１００ｍ１量を示すようにマークした染料水溶液
のビン１本、及び酸性リンス溶液３００ｍ１を製造する
ためにａｏｏｍｇ量な示すようにマークしたリンス溶液
のビン１本を含む。本発明のキットと方法に用（・る物
質は、必らずしもキットと共に供給されるとは限らない
が、ｏ、ｏｓｌ’ＪＨＣ６，Ｏ；ＩＮ　ＨＣｔ　、５Ｎ
　ＨＧｔ及び７５ｖＩｌ＝＋プリン・ジャー１１本を含
むアズールＡによるＤＮＡ分析に関連して、好ましい実
施態様のキットはそれぞれかに２Ｓ２０５染料スルホン
化剤（カリウム塩の代りに等モル量のＮａ２Ｓ２Ｏ５も
使用可能〕１．５？と共にアズールＡ（公認９３７５ｍ
９を含む７バイアルを有する。各バイアルは、以下で説
明するように、アズールＡ　５　ｍ９　／ｍｌ　９度を
与えるアズールＡ水溶液７５ｒｒｔを充分に製造可能で
ある。４このキットはに２Ｓ２０５１．５　Ｐであるリ
ンス・スル承ン化剤バイアル７本とスライドボックス５
個も含む。

Ｋ２Ｓ２Ｑ５に水と塩酸を混合すると、各リンススルホ
ン他剤バイアルはリンス試薬溶液３０（ｌｔＡ：を製造
するために充分である。それぞれ顕微鏡スライド５枚を
含むボックスまたは容器５個はマス赤血球であるＤＮＡ
基準細胞対象を含む。

アズールＡキットはさらに酸性アズールＡ水溶液を製造
するための７５Ｍ量を示すようにマークした染料水溶液
のビン１本と、酸性リンス溶液３００ｍｌを製造するた
めに３００ｍ１量を示すようにマークしたリンス溶液ビ
ン１本とを含む。本発明のキットと方法に用いる材料は
、必らずしもキットと共に供給されるとは限らないが、
０．０５ＮＨＣ１、５Ｎ　ＨＣｌ　、　０．１　Ｎ　Ｈ
Ｃｌ及び７５ｍ１コブリンジヤ一１１本とを含む。

本発明では、ホイルゲン染色反応を用いるＤＮＡ定量に
関して、キットを用いるスライド調製は次のように実施
する。

細胞学的標本（例えば、シトスビンプレパレーション、
タッチ・プレバレージョン、微細針吸引物、スミア及び
スミアプレバレージョン）を約３０分間固定２時間風乾
させ、１０％中性緩衝化ホルマリン中に約３０分間固定
する。次にスライドを脱イオン水中で約５分間すすぎ洗
いし、風乾させる。ホルマリン固定し風乾させたスライ
ドを染色するまで室温に保存する。

染料試薬バイアル１本の全内容物をｉｏｏｍｚ量にマー
クしたチオニン溶液ビンに移すことによって、チオニン
水溶液をキットから製造する。このビンをラインまでＱ
、１Ｈｃｔによつ℃満たし、密封し、撹拌する。ビンを
密封して室温（１８〜ｂ 過して、溶解しない染料を除去する。

リンス・スルホン他剤バイアル１本の全内容物（Ｋ２Ｓ
２０５１．５？）を３００ｍ１量にマークしたリンス・
ビンに移すことによって、酸性リンス水溶液を調製する
。３００ｍ１にマークしたリンスビンに、マークまで０
．０５Ｎ塩酸を満たす。容器を密封し、リンス緩衝液が
完全に溶解するまで混合する。チオニン水溶液とリンス
溶液の両方は室温（１８〜ｂ である。チオニン溶液とリンス溶液の両方を用い−て、
２セツトのスライドすなわち１０枚のスライドを染色す
ることができる。但し第２セツト目が溶液製造から６時
間以内に終了する場合にである。

同じ方法をアズールＡキットに対して用いて、染色スラ
イドの製造に用いる染料を調製する。

さらに、５Ｎ塩酸溶液である酸加水分解溶液（７５＋＋
＋ｌ）を、上記のよ２うなりＮＡの加水分解反応による
細胞対象物の調製のために用いる。この５Ｎ塩酸溶液は
ｐＨ０，５を有する。

次の方法によってチオニンキッ）ｋ用いてスライドを染
色し調製するが、これと同じ方法なアズールＡキットに
対しても用いることができる。

１、約７．２〜約７．５の範囲内のｐＨに調節した１０
容量％ホルマリン中に、スライドを室温におい′ｃ３０
分間固定する。

２、スライドを５Ｎ塩酸含有コブリン・ジャー中に約６
０〜約７５分間入れろ。

３、　スライドを塩酸含有コブリン・ジや−からチオニ
ン溶液含有コブリン・ジャーに直接移し、約１時間染色
する。

４．それぞれリンス溶液を満したコブリンジャー３本を
使用する。スライドを最初のリンス溶液含有コブリンジ
ャーに入れ、リンスに約３０分間接触させる。次にスラ
イドを第２のリンス溶液光てんコブリン・ジャーに移し
、約５分間静置させる。次にスライドをリンス溶液光℃
ん第３コブリン・ジャーに移し、再び約１０分間静置さ
せる。

５、次にスライドを流動蒸留水で約５分間洗浄する。

６、　スライドを酸−アルコール（０，３７％塩酸、７
０％エタノール９中に５分凹入れる。

７、　スライドを無水エタノール中で約５分間脱水して
、カバースリッピング用スライドな調製する。

８　スライドをキシレン中で約５分間洗浄する。

９、　スライドに合成樹脂とカバースリップを取り付け
る。

スライド較正領域の対照細胞の核中の暗青色染色の存在
は、この試薬が適切な性能な有する証拠である。ホイル
ゲン反応は核ＤＮＡの特異的な青色染色な生ずる。核小
体（存在する場合には）と細胞質は染色を示さない筈で
ある。正常なヒト細胞は基準細胞対象物領域中の基準細
胞対象物中に存在する量の９３％に等しいＤＮＡ含量す
なわち６．７ピコグラムを有する。悪性細胞＋Ｓ通常は
ＤＮＡ量の増加、時には減少な示す。増殖（Ｓ相）細胞
はその細胞型の主要ＤＮＡピークに比べてＤＮＡ量の増
加を示す。

特許出願第７９４，９３７号に開示された装置を、上記
方法で調製したスライドに関して、像分析装置の光学密
度基準領域によって光学密度に対して較正した後に、対
照プログラムロジックは第６図のヒストグラムに示すよ
うに、基準細胞対象物較正機能を必要とする。この対照
細胞較正中に、オペレーターは顕微鏡スライドを移動さ
せて、基準細胞対象物２８なモニターリング・スクリー
ン上のビーニーに移す。個々の染色基準細胞対象物２８
が基準領域内にある場合には、染色基準細胞対象物の総
元学密度が測定され、記憶されろ。適当な数の染色基準
細胞対象物が分析された後に、分析者は第７図に示すよ
うなヒストグラムを例えば分析者が相対量のＤＮＡを有
するような対照細胞対象物倍数体分布を示すビデオモニ
ター上に与えられる。同一日付で出願した我々の特許出
願第ＰＯＴ／ＵＳ８６１０２４０９号に述べるように、
機器対照ロジック内で内部的に、対照細胞対象物の実際
に測定した光学密度値の個々の合計値のヒストグラムの
モーダル値を所定の標準または対照細胞が有することが
分っている基準ＤＮＡ量と比較する。

オペレータが実測した実際の総光学密度値を記憶される
基準ＤＮＡ値に分割し、内部基準レベルを設定した完全
な染色からの染色の逸脱を調節するためのファクターを
形成する。

次に分析者はＤＮＡ倍数体分析のための細胞データ獲得
を開始する。分析者は標本細胞対象物３０に沿った多く
のフィールド位置を分析のために選択する。分析者は顕
微鏡スライドを移動させて、ＤＮＡ含量ならびに望まし
い場合には細胞形態に関して分析すべき標本細胞対象物
をビューに移す。

分析者は特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４０９号及
び米国特許第４．４５３．２６６号に開示された方法と
同じ方法によって細胞を分類し、標本細胞対象物すなわ
ち染色細胞対象物核の線光学密度ならびにその領域、そ
の円形性、その他の分類情報を得る。

次に、ＤＮＡ含量を示すヒストグラムを形成することが
できる。一般に、分析者は各フィールドまたは領域の多
くの細胞対象物を選択し、顕微鏡台を移動させて、標本
細胞対象物の多くの種々なフィールドをビューに移し１
代表的なサンプルが得られたと感するまで、多くのこの
ような標本細胞対象物を撮影し、分析する。これは特定
ＤＮＡ含量の細胞数を示し、各基準ピークのＤＮＡ含量
平均値を示す第７図に示すようなヒストグラムの製造を
可能にする。データはまた。後のリコールと患者の進行
または退行を分析するための同一患者からの新しい標本
との比較のために記憶させることも−できる。

染色と染色スライドの像分析の後に、対象細胞は正常ヒ
ト細胞のＤＮＡ含量の相対的位置を示唆する単一主要ピ
ークを示す筈である。未知サンプルの主要ＤＮＡピーク
のシフトハ異常なりＮＡ含量を示す。第１ピークの２倍
のＤＮＡ含量を有する第２ピークの出現に特に起因する
主要ピークの右方向へのゆがみは増殖する細胞集団を示
唆する。

非増殖性集団では５０〜ｉｏｏ細胞が計数され。

増殖性集団ではランダムに選択した細胞１００〜２００
が適当な精度で計数される。

本発明は上記実施態様に限定されるわけではなく、ここ
に示さずまた述べない事項も特許請求の範囲に含まれる
。本発明は他の実施態様を包含するように拡大される。

例えば、核を最初に像形成法な用いて特定の光の波長に
よって単離し、次にＤＡＢ結合モノクローナル抗体を像
形成法の第２の光の波長によって示すように、細胞対象
物をジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と交差染色するため
にメチルグリーンで染色することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のキットの斜視図である。 第２図は本発明に従ってつくられた標本スライドまたは
支持体を示す図である。 第３図は基準細胞や標本細胞等用の物質を有するスライ
ドの平面図である。 第４図は第３図の４−４のラインに沿った断面図である
。 第５図は染色後の光学密度と一細胞中の染料濃度との関
係を示す図である。 第６図は本発明による基準細胞の染色体数の較正ヒスト
グラムである。 第７図は本発明の細胞の染色体数の分布をまとめたヒス
トグラムである。 （外４名） 手続補正書 １．事件の表示 昭和６３年特許願第２３７４７８号 ２、発明の名称 生物標本の分析用キット ３゜補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　セル・アナラシス・システムズ・インコーホ
レーテッド ４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号５、補
正の対象 適正な図面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、染色後に検出可能な所定の物理的特徴を有する染色
   基準手段を含む基準領域と、標本細胞対象物を受容する
   ための標本細胞対象物領域とを含む顕微鏡スライド； 染料物質容器１個以上； 及び標本細胞対象物と基準手段とを同時に染色するため
   の染料を含む染料物質； から成る細胞核定量用キット。 ２、さらにリンススルホン化剤を含む請求項１記載のキ
   ット。 ３、染料物質が、０．１ＮＨＣｌ水溶液と混合した場合
   に約４．９〜約５．１■／ｍｌの範囲内の濃度を有する
   アズールＡの水溶液を形成するのに有効な量のアズール
   Ａを含む請求項２記載のキット。 ４、染料物質がさらに染料スルホン化剤を含む請求項３
   記載のキット。 ５、基準手段がマス赤血球、ニワトリ赤血球、乾燥ＤＮ
   Ａ、培養細胞ライン及びこれらの混合物から成る群から
   選択した基準物質を含む請求項３記載のキット。 ６、染料をチオニン、アズールＡ、アズールＣ、パラロ
   ザニリン、アクリフラビン、ジアミノベンジジン、アル
   カリホスファターゼ、エオシン、メチルグリーン、エチ
   ルグリーン、ファーストグリーン、メチレンブルー、ヘ
   マトキシリン、アクリジンオレンジ、ギームザ及びこれ
   らの混合物から本質的には成る群から選択する請求項１
   記載のキット。 ７、キットが光学顕微鏡による核ＤＮＡ定量用であり、
   染料がチオニンであり、基準手段がラット肝細胞核を含
   む請求項１記載のキット。 ８、染料物質が、０．１ＮＨＣｌと混合した場合に約１
   〜約５■／ｍｌの範囲内の濃度を有するチオニン水溶液
   を形成するのに有効な量のチオニンを含む請求項７記載
   のキット。９、染料と核物質との結合に比例して基準手
   段を染料と結合させる物理的特徴を有する基準領域と、
   標本細胞対象物を受容するための標本細胞対象物領域と
   を有する顕微鏡スライド； 標本細胞対象物と基準手段とを同時に染色するための染
   料として、メチレンブルー、メチルグリーン、ヘマトキ
   シリンまたはアクリジンオレンジから成る群から選択し
   た対染料と交差染色するジアミノベンジジンを基準手段
   と標本細胞対象物とを染色する水溶液を形成するのに有
   効な量含有する染料物質の容器１個以上； から成る光学顕微鏡による胸部細胞分析に用いるキット
   。 １０、染料とＤＮＡとの結合に比例して基準手段を染料
   と結合させる物理的特徴を有する基準領域と、標本細胞
   対象物を受容するための標本細胞対象物領域とを有する
   顕微鏡スライド； 標本細胞対象物と基準手段とを同時に染色するための染
   料として、チオニン、アズールＡ、アズールＣ、パラロ
   ザニリン、アクリフラビン及びこれらの混合物からなる
   群から選択した染料を、染色後に基準手段の染料濃度の
   実質的に一次関数であるような光学密度を所定時間の染
   色後に基準手段に与えるのに有効な量で含有する染料物
   質の容器１個以上； から成る光学顕微鏡による核ＤＮＡ定量用キット。 １１、基準手段が、ラット肝細胞核、マス赤血球、ニワ
   トリ赤血球、乾燥ＤＮＡ、培養細胞ライン及びこれらの
   混合物から成る群から選択した基準物質を含む請求項１
   ０記載のキット。 １２、顕微鏡スライド；四倍体細胞と二倍体細胞を含む
   ラット肝組織を含む、スライド上の基準手段； ヒト組織細胞を受容するためのスライド上の標本細胞対
   象物領域； ヒト細胞とラット肝組織の四倍体細胞と二倍体細胞とに
   同時に染料による染色を行ってヒト細胞とラット細胞そ
   れぞれに含まれるＤＮＡの光学密度測定に有効な量の染
   色ＤＮＡを形成するのに用いるチオニン染料物質の容器
   少なくとも１個；からなる光学密度測定装置による染色
   後のヒト組織細胞ＤＮＡ含量分析用キット。