JPH10123027A - 自動決定および測定装置および方法 - Google Patents

自動決定および測定装置および方法

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JPH10123027A JP9137160A JP13716097A JPH10123027A JP H10123027 A JPH10123027 A JP H10123027A JP 9137160 A JP9137160 A JP 9137160A JP 13716097 A JP13716097 A JP 13716097A JP H10123027 A JPH10123027 A JP H10123027A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】異なる対象における分子クラス、分子群または
分子部分（例えば、エピトープ、ドメイン）を決定しま
たは同定しおよびマッピングする自動化方法を提供する
こと。 【解決手段】本発明の方法では、ランダム数の異なる試
薬溶液を、液体または固体対象、特に細胞、細胞類また
は組織検体に同時にまたは順次に適用し、測定する。本
発明の重要な適用分野は、癌研究ならびに免疫系につい
ての研究である。非常に短時間内に、検査下に、量なら
びに質に関して正確な評価結果が、対象における分子種
の配置および相関的分布について得られる。これらの結
果は、例えば、種々の疾患およびそれらの治療について
の知見を与えることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、液体または固体対象における分
子クラス、分子部分または分子群のランダム数Ｘｎ（ｎ
＝１，２，３，．．．．Ｎ）を決定または同定し、およ
び測定する自動装置に関する。本発明は、さらに、液体
または固体対象におけるランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，
３．．．．Ｎ）の分子クラス、分子部分または分子群を
決定しまたは同定しおよびマッピングする方法に関し、
そこでは、ランダム数の試薬を同時または順次に対象に
自動的に適用し測定する。
【０００２】例えば、蛋白質分子またはポリマーの異な
る分子クラスまたは分子群の相関的分布および／または
組合せおよび配置、あるいは、要すれば対象の着色挙動
を検査しおよび決定しまたは同定するために、自然科
学、特に生物学、化学、生化学および医学において、種
々の技術および方法が使用されている。これらの異なる
方法および技術は、各液体または固体対象における分子
群の配置、分布および構造についての知識を得ることを
目的とする。この目的では、検査すべき対象を特異的溶
液で処理して、例えば、形成された複合体（例えば、Ｅ
ＤＴＡ金属錯体または抗原／抗体複合体等）に基づい
て、特異的な分子クラスまたは分子群を検査しおよび決
定しまたは同定する。かかる方法は、問題の対象におけ
るかかる分子種の配置および分布に基づいてある種の疾
患の徴候についての診断的測定データを得るために、ま
たは細胞または細胞系の分子組織についての知見を得る
ために、主として、医学および生物学の分野で使用され
ている。
【０００３】先行技術の手動方法は一定のスキームに従
っている。例えば、生物学および医学においては、検査
すべき対象を特異的試薬を含有する溶液で処理する。か
かる試薬は、ある種の分子群と反応して特に特異的複合
体を形成する着色剤、抗体等であってよい。これは、特
異的試薬が検査すべき対象における特異的な基または部
位を標識することを意味する。ある暴露時間の後、特異
的に標識された対象を、次いで、例えばフルオレセイン
−イソチオシアナートまたはフィコエリトリンを用いた
異なる蛍光シグナルによる細胞の鏡検において、通常は
シグナル分布パターンによって検査する。
【０００４】先行技術によると、単純な有色溶液を用い
る組織切片の染色のごとき手動方法のいくつかは、特別
の自動染色デバイスによって行うこともできる；細胞中
の単純な分子マーキングについては、自動標識デバイス
が存在する。
【０００５】いずれの場合も、すなわち、対象、特に細
胞または組織切片の試薬での手動および自動処理におい
ても、対象を手でかかるデバイス（例えば顕微鏡）に入
れた後に、この目的に供される特別に設計された異なっ
た別々のデバイスにより、結果を目視的にコントロール
し評価する必要がある。
【０００６】先行技術によると、試薬で対象を処理する
更に複雑な方法（これはプロセスの間にある時点で評価
され記録される必要がある）、例えば、種々の溶液の細
胞への順次の適用は、手動方法に完全に限定されていて
非常に誤差が出易い。すなわち、該方法は量に関して評
価できず、また統計学では使用できない。かかる方法が
長時間（例えば３４時間）にわたって、例えば各々正確
に２０分間の間隔で個々の中間工程の非常に正確な時間
チェックを要する場合、検査者が実行可能であるために
課せられる限界は今日まで過剰なものであった。
【０００７】多数の分子クラスの相互の相関分布を決定
しまたは同定するために、生物医学は、しばしば、突き
止めるべき分子クラスに（直接的にまたは間接的に）各
々カップリングする種々の異なる蛍光色素を使用する。
この場合、これらの異なる蛍光色素から発せられる蛍光
シグナルは別々に検出される。これらのシグナルを相互
に関連付けると、結局、種々の分子クラスの相関的布に
ついての情報が得られる。
【０００８】しかしながら、組み合わせ分子分別プロセ
スを調べるのにとりわけ重要なこれらの方法は、所与の
試料における最大４ないし５の異なる蛍光シグナルの検
査に限られる。というのは、非常に多数の異なる蛍光シ
グナルを相互に分離するのは不可能だからである。従っ
て、これまでに存在する方法は、一つの同一試料に存在
する分子クラスを決定しまたは同定しおよび突き止める
ということになると、非常に限定的である。かくして、
従来、高次の組み合わせ形態を検出するのは不可能であ
った。
【０００９】この制限は、ある種の分子クラスまたは分
子群を前記したごとくに標識した後の第１工程におい
て、紫外線照射による脱色によってこの標識部位に結合
した蛍光色素を破壊することによって克服できる。
【００１０】引き続いて、さらなる分子クラスを標識す
るための１の最大５種までの異なる蛍光色素を含有する
対象に第２のまたはさらなる溶液を適用する。所要の暴
露時間の後、今度は、新しい特異的シグナル分布パター
ンが特異的に標識された分子から得られる。蛍光色素を
脱色した後、このプロセスを多数回反復する。かくし
て、シグナル分布パターンの数は使用する試薬溶液の数
に従って増加する。これらの異なるシグナル分布パター
ンは、対象における分子群の配置および分布についての
知見を与え得る。
【００１１】しかしながら、分子クラスまたは分子群を
決定しまたは同定するこれらの公知の方法はかなりの欠
点を示す。というのは、個々の方法工程は手で行われる
からである。これらの工程を手で行うのは非常に時間を
消費し、これは、量に関して正確な評価としなければな
らない現代的方法に対し、誤差を生じやすくし、また標
準化が十分でなくする。１つの例は、試薬溶液を手で対
象にピペッティングし、次いで、該対象を手で顕微鏡載
物に載せて適切に位置決めすることである。次いで、全
てのさらなるピペッティング操作は、対象を顕微鏡載物
台上で変化させることなく手で対象に対して行われる。
手動ピペッティング操作において、試薬溶液の正確な量
が常に正確に付着する訳ではない。反復ピペッティング
動作の場合には、ピペットを対象の同一スポット上に常
に正確に位置させるのは不可能のようである。さらに、
検査すべき対象にピペットが接触することが容易に起こ
る可能性があり、従って、対象の各スポットが変化し得
る。この結果、評価結果が歪められてしまう。
【００１２】各々３０分内に手動で使い果たされる、２
０を超える異なるマーカーを具備したテストシリーズは
完了するのに数日間を要する。シグナルまたはイメージ
の引き続いての評価、すなわち、相関的分子分布パター
ンの決定または同定は、数週間を要しかねない。という
のは、異なるシグナル分布パターンを組み合わせて全体
としてのイメージが得られる前にまず該パターンを個々
に評価しなければならないからである。この評価方法も
非常に時間を消費する。従って、評価結果が最終的に得
られるまでに数週間を要しかねない。
【００１３】これらの理由で、公知の方法を用いると、
対象において、せいぜい４〜５と少ない分子のクラスし
か突き止め、決定または同定できない。すなわち、検査
しおよび決定しまたは同定できる分子クラスまたは分子
群の数はこれまで非常に制限されてきた。
【００１４】上記の理由で、個々の試料のより複雑な分
子的組合せパターンの正確な定量的鏡検を行うことは現
在不可能である。
【００１５】本発明の目的は、異なる対象における分子
クラス、分子群または分子部分（例えば、エピトープ、
ドメイン）を決定しまたは同定する従来の方法の欠点ま
たは制限を克服することにある。
【００１６】かくして、本発明は、液体または固体対象
におけるランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，３．．．．．
ｎ）の分子クラス、分子群および分子部分を決定しまた
は同定しおよび測定するための自動装置に関する。この
装置を用いると、一つの同一の対象のランダム数の個々
の標識パターンを記録し、コンピューターの助けを借り
た画像重ね合わせにより高度に複雑な分子組合せパター
ンに変換することができる。
【００１７】本発明のさらなる主題は、液体または固体
対象におけるランダム数Ｘ（Ｘ＝１，２，３．．．Ｎ）
の異なる分子クラスまたは分子群を自動的に決定しまた
は同定できる自動化方法である。
【００１８】この自動化方法においては、反復的蛍光脱
色操作に基づいて、かつランダム数の蛍光標識および蛍
光脱色操作を順次行うことによって、一つの同一の（好
ましくは生物学的）構造における異なる分子種および分
子クラスのランダムで複雑な組合せを決定しまたは同定
できる。このように、系における、好ましくは生物学的
系におけるより高次の組み合わせ形態を決定しまたは同
定できる。
【００１９】本発明による装置は、ピペッティング系、
３Ｄハンドリング系ならびに光学測定系よりなる。特に
好ましいのは、倒立または直立の顕微鏡載物台の使用で
ある。３Ｄハンドリング系はロボットまたは直線状ガイ
ド系を具備した。直線状ガイド系、およびかくして試薬
ラックの全直線状アレイは、技術的見地より非常に複雑
ではなく、よって非常に経済的である。さらに、イメー
ジングデバイスが該装置に連結され、特に顕微鏡ユニッ
トに連結されている。該装置は自動である。すなわち、
その構成要素の機能的操作は、個々におよび組み合わせ
て、コンピューターで制御されモニターされる。
【００２０】図面は本発明の操作の具体例の模式的構造
を示す。
【００２１】自動ピペッティング装置は先行技術で十分
に知られている。しかしながら、これらは、本発明の装
置には適しない。異なる分子クラスを正確に検出しマッ
ピングするには、ピペットチップを液体または固体対象
の正確に同一個所に反復して置くことが可能でなければ
ならない。さらに、チップが先に使用した微量の溶液を
決して含有しないように保護するために、新しい溶液を
採取する前にピペットチップを自動的に交換するのが必
要でありまたは望ましい。ピペッティング系は溶液用の
容器、使用した溶液およびピペットチップ用の収集容
器、洗浄溶液用の容器、使用可能なピペットチップ用の
容器、使用し捨てたピペットチップ用の容器および暴露
時間後の洗浄溶液用の容器を具備した。加えて、ピペッ
ティングユニットには、そこに貯蔵された試薬用の温度
制御手段を設けることができる。
【００２２】本発明によるピペッティング系は、ピペッ
トを対象の一定のスポットまでランダム数の回数だけ移
動させることができるように、対象試料におけるピペッ
ト反復位置決定において適切な精度を示す。好ましく
は、ピペットの反復位置決定における精度は少なくとも
±０. １ｍｍであるべきである。さらに、ピペッティン
グ系は、使用する各溶液の採取および分注が自動的に起
こるように制御される。ピペッティング系は高度な移動
性および融通性を有する。
【００２３】３Ｄハンドリング系は今日ほとんど全ての
産業分野で使用される。ピペットを溶液に導入し、充填
されたピペットを対象まで移動させ、溶液を分注した後
に出発位置に戻る本発明における３Ｄハンドリング系
は、対象に適合するピペットの反復位置決定において正
確性を有しなければならない。特異的分子クラスを検査
するために、特にテストシリーズの間に異なる溶液で処
理される対象における一定のスポットまたは個所を特定
するために、ピペットの反復位置決定における３Ｄハン
ドリング系の正確性が必要とされる。偏りは歪められた
評価結果となるので、３Ｄハンドリング系は、この全体
の方法のために、ランダム数の回数だけ予め特定された
対象のスポットにアプローチするような位置になければ
ならない。この理由で、それは、同様に好ましくは少な
くとも±０. １ｍｍであるピペットの反復位置決定にお
ける正確性を示す。３Ｄハンドリング系は３Ｄワーキン
グ領域内を移動し、ピペッティングデバイスを正確に位
置決定するための回転軸を有する。ピペッティング系お
よび３Ｄハンドリング系の個々の機能ならびに両系の技
術的共働はコンピューター制御される。
【００２４】本発明の自動装置のさらなる必須構成要素
は、光学測定系、特に顕微鏡である。特に好ましいの
は、倒立または直立の顕微鏡載物台の使用である。要す
れば、特に長期間実験において、生細胞のために正確な
生理学的条件を維持する気候ボックスを顕微鏡に装備す
ることができる。顕微鏡載物台は自動フィルターおよび
レンズ変更手段を有する。
【００２５】顕微鏡載物台はイメージングデバイスに連
結される。このイメージングデバイスは、各実行の後に
顕微鏡を介して光学的に伝達される各シグナル分布パタ
ーンのイメージを採取するので、コンピューター制御イ
メージ評価を可能とする。
【００２６】本発明の全体の自動装置は以下の技術的パ
ラーメーターを有する。
【００２７】１．それは中央コンピューターを介して制
御できる。
【００２８】２．ピペットチップは自動的に交換され
る。
【００２９】３．３Ｄハンドリング系およびピペッティ
ング系は、好ましくは少なくとも±０. １ｍｍであるピ
ペット反復位置決定における正確性を示す。
【００３０】４．個々の系は振動、発光、場によって損
傷されず、使用者はノイズによって乱されない。
【００３１】５．要すれば、サーモスタットを備えるこ
とができる。
【００３２】６．ピペッティングデバイスを正確に位置
決定するための３Ｄワーキング領域および回転軸を備え
なければならない。
【００３３】本発明の自動装置は、自然科学、特に生物
学および医学における種々の適用分野で使用できる。適
用の特に重要な分野は癌および免疫系の研究および診断
である。
【００３４】固体または液体対象における分子クラスま
たは分子群を決定または同定するための本発明の方法
は、液体または固体対象において、ランダム数Ｘｎ（ｎ
＝１，２，３．．．．Ｎ）の異なる分子クラスまたは分
子群を、特異的試薬溶液Ｙｎ（ｎ＝１，２，３，．．．
Ｎ）によって、ランダムな回数だけ、自動的に決定しま
たは同定しおよびマッピングできることを特徴とする。
【００３５】この方法は以下の自動工程を具備してい
る： Ｉ．ピペッティング系によって、試薬溶液Ｙ１が、溶液
Ｙ１を含有する容器から自動的に採取される。
【００３６】ＩＩ．ステージまたは対象保持体上に載置
した対象（固体または液体）に溶液ＶＩを自動的に適用
する。
【００３７】ＩＩＩ．自動的に特定された時間だけ、溶
液Ｙ１を対象と反応させる。
【００３８】ＩＶ．かかる暴露の直後または、要すれば
実際の暴露の間も、溶液Ｙ１で処理された対象の画像
を、顕微鏡のイメージング系を自動的に作動させること
によって採取してもよい。別法として、工程ＶＩに先行
して工程Ｖを行ってもよい。
【００３９】Ｖ．溶液Ｙ１を自動的に特定したある時間
だけ対象と反応させた後に、溶液Ｙ１をピペッティング
系によって除去する（吸引除去する）。
【００４０】対象および行うべき特別の決定または同定
に応じて、工程ＶＩにおいて異なる別法が可能である。
【００４１】ＶＩａ．ピペッティング系によって、第２
の溶液Ｙ１または溶液Ｙ２あるいはＹ１およびＹ２の混
合液を適用する。
【００４２】ＶＩｂ．溶液Ｙ１、溶液Ｙ２、または溶液
Ｙ１およびＹ２の混合液を除去した後、洗浄溶液Ｚ１を
自動的に対象に適用し、特定できる間だけ対象と反応さ
せる。
【００４３】ＶＩｃ．溶液Ｙ１の除去後直ちに、洗浄溶
液Ｚ２またはＺ３またはＺｎ（ｎ＝１，２，３．．．
Ｎ）をピペッティング系を介して自動的に適用する。
【００４４】ＶＩｄ．溶液Ｙ１の除去の直後、洗浄溶液
Ｚ１ないしＺｎを、変更し得る特定の順序で対象に適用
する。
【００４５】ＶＩｅ．溶液Ｙ１への暴露およびその除去
に続いて可変な自動的に特定された時間の後、洗浄溶液
を対象に適用する。
【００４６】ＶＩｆ．変更し得る一定の特定された時間
が経過した後にのみ、洗浄溶液Ｚ１ないしＺｎをある順
序である暴露時間の間、対象に対して自動的に適用す
る。
【００４７】ＶＩＩ．一つの溶液Ｙ３、あるいはランダ
ムな数の異なった溶液Ｙｎまたは該異なる溶液Ｙｎの混
合液を用いて、工程Ｉ−ＶＩｆをランダムな回数だけ反
復してもよい。
【００４８】少なくとも検査すべき対象に関して可能な
限り、工程Ｉ−ＶＩＩをいずれかの時点で且つ工程のラ
ンダムな段階で中断してもよく、またランダム数の回数
だけ反復してもよい。個々のサイクルは非常に速く、好
ましくは各々５分ないし３０分内に行うことができる。
【００４９】本発明のこの方法は、すべてコンピュータ
ーによって自動的に制御される、３Ｄハンドリング系、
ピペッティング系、光学測定系、特に顕微鏡載物台、お
よびイメージングデバイスを具備した本発明の自動装置
で行うことができる。
【００５０】本発明の方法は、ある時間内に、量および
質に関する評価結果を正確とするであろう。さらに、対
象におけるランダム数の分子クラス、分子種または分子
部分を検査、決定および同定することができる。該方法
を手で行う場合に生じる誤差源は大いに排除された。そ
の結果、本発明の自動化方法は、異なる分子群を検査お
よび決定し、または同定することに関して、先行技術方
法よりもかなり優れた利点を示す。
【００５１】本発明の好ましい態様において、該方法
は、種々の疾患およびそれらの治療に対する知見を得る
ために、分子群の配置および相関的分布についての知識
を得ることを目的として、細胞もしくは組織検体におけ
るランダム数の分子種またはエピトープを自動的に検出
しマップするために行う。この目的では、細胞または組
織検体を、例えば、蛍光抗体またはリガンドを含有する
第１の試薬溶液Ｙ１で処理する。あるインキュベーショ
ンの後、特異的に標識された組織検体または細胞の標識
の特別の分布パターンを写真に取り、記録する。
【００５２】標識の分布パターンを記録するには、例え
ば、自動コンピューター制御下に、蛍光色素を自動的に
励起させ、ビデオカメラのシャッターを所定の時間開口
させる。かくして、蛍光シグナルを、好ましくはデジタ
ルシグナル、すなわちデジタル化イメージの形態で記録
する。自動蛍光励起用のシャッターと同様に、シャッタ
ーの所定の開口時間の後、シャッターを自動的に再度閉
じる。適当な蛍光フィルターおよびシャッターの作動を
用い、試料中に同時に存在する、すなわち試料に結合し
た異なる蛍光色素について同一操作を自動的に反復す
る。
【００５３】引き続いて、特異的に標識された試料を脱
色し、洗浄し、次いで、第２の試薬溶液Ｙ２またはラン
ダム数の試薬溶液Ｙｎまたはその混合液で処理する。ラ
ンダム数のかかる標識−イメージング−脱色サイクルに
よって行うことができる自動化方法は医学および生物学
における用途に特に適している。検査すべき固体または
液体対象について可能な限り、個々の工程をランダムな
回数だけ反復することができる。第１工程および／また
は引き続いての工程またはこれらの反復サイクルは、透
過光顕微鏡と組み合わされた蛍光顕微鏡のごとき光学的
方法によって行う。該方法の第１の試行は、透過光技術
によって、標識した組織検体または細胞のイメージ、す
なわち、相コントラストイメージまたは微分干渉コント
ラストイメージを記録することによって終了する。各サ
イクルは、特異的に標識された組織検体または特異的に
標識された細胞のイメージのこの記録で終了する。
【００５４】このように、反復する標識−イメージング
−脱色のサイクルを経る検査下で各試料、細胞または組
織検体におけるランダム数の個々の標識パターンのイメ
ージを得たり、個々のまたは多数な分子分布の得られた
複雑な組合せパターンを決定したり、あたかも（例え
ば、細胞の）生物学的構造に対する順列的パターンであ
るかのごとくそれらをランダムに投影することが可能で
ある。画像重ね合わせおよびイメージ解析は特別のコン
ピューターによって自動的に行うことができる。単一ま
たは多数の細胞のイメージのコンピューターの助けを借
りた画像重ね合わせは、原理的には構造−結合パターン
として可視的には決して検出できない細胞におけるかか
る複雑な分子組織形態の、合理的方法にての、例えば一
晩にわたる、検出または同定および評価を容易とする。
これは、個々のイメージの冗長な評価プロセス、例えば
パターンの手動コピーを排除する。さらに、相関的分子
濃度およびトポロジー学的関係に関する必須の定量的結
論は特別のアルゴリズムによってのみ得ることができ
る。さらに、これまで目視的に行われてきた評価のた
め、個々のイメージを組み合わせてトータルなイメージ
を得たり、あるいは全細胞系における高度に複雑な順列
的挙動を解析するのは同様にほとんど不可能であった。
【００５５】本発明の方法によって、今や、ランダム数
の異なる試薬溶液を用いて、ランダムな回数だけ、試
料、細胞または組織検体を特異的に標識するのが可能と
なった。かくして、各ランダム試料における試薬の順序
を変更することによって示すこができるように、本質的
立体的障害は排除される。というのは、各標識結果は実
質的に一定のままだからである。本発明のこの態様で使
用する試薬は、抗体、レクチン、核酸、バイオトキシ
ン、（蛋白質のごとき）免疫グロブリン結合性分子、蛍
光色素または酵素のごとき他の特異的リガンドを具備し
た。特に好ましいものは蛍光抗体もしくはリガンド、特
に蛍光色素−結合抗体もしくはリガンドである。この態
様で使用する対象は、ある種のステージまたは担体上に
置かれた、あるいは（ゲルのごとき）ある種の媒体に含
有された単一細胞、複数細胞、組織切片または分子であ
り得る。
【００５６】以下に示すのは、細胞または組織検体中の
分子クラスを標識し測定する個々の自動工程の一般的記
載である。しかしながら、本発明による方法は断じてこ
れらの工程に限定する意図のものではない。個々の工程
は必要であれば相互に交換しまたは省くことができる。
【００５７】細胞（例えば、固定した細胞、例えばアセ
トン固定細胞、アジ化ナトリウム処理細胞または生細
胞）のごとき対象を顕微鏡載物台に載せる。試料を手で
調製し、装置のステージに載せた後、以下の自動工程を
行う： １．第１のインキュベーション溶液Ｙ１（１または数種
の蛍光色素が結合した試薬）を採取する。
【００５８】２．該溶液Ｙ１を対象にピペッティングす
る。
【００５９】３．ある温度、例えば室温で、該溶液Ｙ１
と共に対象をインキュベートする。
【００６０】４．該インキュベーション溶液Ｙ１を除去
する。
【００６１】５．洗浄溶液Ｚ１、例えば緩衝液を対象上
に１回または数回落とす。
【００６２】６．該洗浄溶液Ｚ１を除去する。
【００６３】７．蛍光分布パターンを記録する（イメー
ジング）（数種の蛍光色素の場合、選択的蛍光記録フィ
ルターをイメージング操作で使用する）。
【００６４】８．洗浄溶液Ｚ２を対象にピペッティング
する。
【００６５】９．蛍光励起によって試料を励起させる。
【００６６】１０．蛍光が存在しなければ、脱色プロセ
スを終了する。この時点は、従前のテストに基づいて特
定され、イメージング系によって確認または決定され
る。
【００６７】１１．該洗浄溶液Ｚ２を除去する。
【００６８】１２．（１種または数種の蛍光色素−結合
試薬を含有する）第２のインキュベーション溶液Ｙ２を
採取する。
【００６９】１３．（前記したごとく、それに触れるこ
となく、またはその位置をシフトさせることなく）該溶
液を同一細胞試料上に落とす。
【００７０】１４．前記第４−１１項を継続する。引き
続いて、第３、第４、第５、．．．第Ｎインキュベーシ
ョン溶液を用いて同方法を反復する。
【００７１】各サイクルは、対応する相コントラストイ
メージまたは微分干渉コントラストイメージの記録で終
了する。工程１−１４は全て自動で行う。コンピュータ
ーの助けを借りた画像重ね合わせによって、個々のイメ
ージを組み合わせて全体イメージが得られ、次いで、評
価する。個々の細胞または組織検体のこの全体分子イメ
ージは、２18の異なる組合せの結果、前記した例のよう
になるので、もしそれらの数が高い、例えば１８の異な
る登録分子クラスであれば、基本的には目視的には決定
または同定または評価できない細胞における組織の複雑
な分子形態についての知見を与えるであろう。この分別
解像はさらに容易に増強させることができる。系、特に
細胞系の順列的解析についての公知の方法は、せいぜい
２3 および２5 の間のそれらの順列的分別能力に鑑みる
と、厳格に制限される。組合せから得られる分子組織の
高次の構造は、公知方法によっては検出できない。
【００７２】系、特に細胞系の順列的解析についての全
ての公知の方法とは対照的に、本発明の方法は組み合わ
せた分子を分別するかなり改良された能力（解像能力）
を示す。
【００７３】本発明の方法は、単一血液検体単独からの
免疫系において、特異的順列的分別スペクトルの検出を
可能とする。
【００７４】その結果、本発明の方法は、特に生物学お
よび医学において、個々の分子群の分子配置または分子
分布に対する知見ならびに特異的疾患の徴候およびそれ
らの可能な治療に対する知見を得るのを可能とする。
【００７５】順列的分子分別（すなわち、分別解像）に
ついての実質的に限定されない「解像」のため、異常な
分子組合せが免疫系の細胞の細胞表面に存在するとい
う、当該方法の現実的使用は既に示されている。これら
は、例えば、ある種の神経変性疾患の場合に、細胞侵入
についての異常表面暗号に対する完全に新しい知見、お
よびかくして診断および療法の新しい方法についての知
見も与える。
【００７６】本発明の方法についてのさらなる適用分野
は、例えば遺伝子チップについての複雑な遺伝パターン
のマッピングであり得るが、これは、多重薬物テストま
たは複雑な突然変異パターンの検出で将来大いに有意義
であろう。
【００７７】しかしながら、本発明のプロセスは、細胞
または組織試料における分子組織形態を決定しまたは同
定しおよび検査するのに特に適するが、それらに限定さ
れるものではない。
【００７８】一般に、液体または固体形態のいずれの対
象も、その分子構造または配置あるいはその中の分子部
分の存在につき検査できる。その例は、半導体、合金ま
たはプラスチックにおける分子の配置および組合せの検
査および決定または同定である。
【００７９】以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説
明することを意図するが、本発明を限定するものではな
い。
【００８０】＜実施例＞個々の細胞の蓄積（単離した単
核血液白血球、対物スライドに適用）、すなわち一つの
同一試料中の１８の異なる分子クラスは、自動的に制御
された反復するインキュベーション−イメージング−脱
色サイクル（ＲＩＩＢＣ）によって標識される。
【００８１】調製： １．カバーグラスを単離した細胞で被覆する。
【００８２】２．室温（ＲＴ）で約１０分間細胞を風乾
する。
【００８３】３．（ＲＴにて）アセトン中で１０秒間、
それを短時間固定する。
【００８４】４．それを短時間風乾する。
【００８５】５．液体窒素中で予め冷却したイソペンタ
ン上でカバーガラスを瞬時ショック凍結する。
【００８６】６．（マイナス８０度で長時間貯蔵する）
あるいは ７．マイナス２０度で２０分間アセトン中で脱水する。
【００８７】８．ＲＴで風乾する。
【００８８】９．ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ
７. ４）中で再水和させる。
【００８９】１０．１：３０正常ヤギ血清でプレインキ
ュベートする。
【００９０】１１．ＰＢＳ中で洗浄する。
【００９１】１２．倒立顕微鏡の載物台上の特別の担体
上にカバーガラスを瞬時に載せる。
【００９２】１３．相コントラストレンズを用いて所望
の細胞に焦点を合わせ、同時に、接眼レンズを介して細
胞を目視的にモニターする。
【００９３】１４．顕微鏡載物台の湿潤チャンバーを閉
じる。
【００９４】１５．ピペッティングロボットにスイッチ
を入れる。
【００９５】１６．ピペッティング−イメージング−脱
色工程についての順序および時間間隔をコンピューター
に入力する。
【００９６】１７．自動機械のラック中の所与の容器
（例えば、エッペンドルフ反応容器）に試薬（抗体溶
液、緩衝液）を充填する。
【００９７】自動機械によってＲＩＩＢＣを行う： サイクル１： １．溶液Ａ（８０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ
７. ４、＋１０ｍｌのフルオレセイン−イソチオシアナ
ート（ＦＩＴＣ）が結合したモノクローナル抗体−１、
＋１０ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）が結合したモノ
クローナル抗体−２を具備した溶液１００ｍｌ）を、ピ
ペッティングロボットによって、該溶液Ａを含有する容
器から採取する。該容器はプラスチック反応容器であ
る。
【００９８】２．ピペッティングロボットが、顕微鏡の
対象載置台上にある対象（カバーガラス上の細胞）に溶
液Ａを適用する。
【００９９】３．溶液Ａをある時間（例えば、室温で２
０分間）対象に作用させる。
【０１００】４．工程３の直後、ピペッティングロボッ
トはこのインキュベーション溶液を吸い上げ、それを捨
てるか、あるいは所望によりそれを自動機械のラック中
の特別の排液容器（反応容器）にピペットで入れてもよ
い。
【０１０１】５．これに続き、緩衝液での１０回連続の
洗浄工程を行い、緩衝液は、ラック中の反応容器からピ
ペッティングロボットによって順次に採取され、細胞試
料に適用され、引き続いて再度吸い上げられ、捨てられ
る。個々の洗浄工程の持続：ほぼ２分６．１０回の洗浄
工程が終了すると、緩衝液を再度試料に適用する。
【０１０２】７．工程６の直後、ある時間にわたって、
イメージングデバイス（例えば、ＣＣＤカメラ）によっ
てある時間相コントラスト様式でイメージを自動的に採
取し、保存する。調製の間を通じてイメージングがいく
つかのＺ面で起こって、アルゴリズムによって最適焦点
面を決定される。
【０１０３】８．工程７の直後、蛍光シャッターを開
け、蛍光色素フィコエリトリンから発せられる蛍光シグ
ナルを記録する。顕微鏡における適当な蛍光フィルター
データは、ＰＥおよびＦＩＴＣの実質的全分離が可能な
ように選択される必要がある（例えば、ＰＥ用（ＤＥＰ
ＩＬ ５７５±７ｎｍ）およびＦＩＴＣ用（ＢＰ ５１
５−５４５ｎｍ）発光フィルター）。イメージングは、
（細胞試料に応じて）ランダムにプログラム可能な時間
で２の蛍光シグナルの各々につき別々に、あるいは所望
により二色性フィルターによって同時に起こる。規定し
たイメージ記録時間の後、蛍光シャッターを再度閉じ
る。
【０１０４】９．工程８の後、蛍光シャッターを開けた
ままにし、励起波長によって試料を励起することによっ
て試料を脱色する（この種の温和な脱色は結合した蛍光
色素を破壊するが、免疫原性ドメインの特性は保存する
であろう）。
【０１０５】１０．いったん脱色時間が経過すると、蛍
光シャッターを再度自動的に開け、前記したのと同時点
で各個々の蛍光色素につきイメージングデバイスによっ
てシグナルを記録する（このシグナル記録により、脱色
時間が発光シグナルを完全に排除するのに十分であった
か否かに関しての指標が供される：これは、自動機械の
ソフトウェアによって決定されるか、あるいは各固定時
点はこの方法のために予めプログラムされる）。
【０１０６】サイクル２： １１．工程１０の後、ピペッティングロボットによって
緩衝液を吸い上げ、（８０ｍｌの緩衝液＋１０ｍｌのＦ
ＩＴＣ−結合モノクローナル抗体−３＋１０ｍｌのＰＥ
−結合抗体−４を具備した）溶液Ｂを対象に適用する。
【０１０７】１２．工程１１に続いて、前記したのと同
一の工程（２ないし１０：サイクル２）を行う。
【０１０８】サイクル３： １３．理論的には、サイクル２の終了に続き、新しい溶
液Ｃ（各々ＦＩＴＣおよびＰＥに結合した、特異性５お
よび６のさらなる２種の抗体用）でサイクル３を行う。
【０１０９】サイクル３に続き、標識の特異性を損なう
ことなく、実質的にランダムな数の異なる抗体用のさら
なるＮサイクルを自動的に行うことができる。
【０１１０】この原理は、対応する特異的結合部位にて
新しい蛍光色素−結合抗体を何度も細胞に負荷しつつ、
結合した蛍光色素は脱色によって破壊され、抗体を細胞
に結合したままにするであろう。これらの結合では立体
障害は起こらない：これは、各ランダムアプローチにお
いて抗体反応の順序を変更することによって示すことが
できる。
【０１１１】かくして、実質的にランダムな大きな数の
分子クラスをこのようにして個々の細胞において検出す
ることができる。これにより、細胞における分子組合せ
を系統的に検査する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の操作の具体例の模式的構造を
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｚ 33/48 33/48 Ｐ 35/10 35/06 Ａ

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 液体または固体対象上の、あるいは液体
    または固体対象中の、ランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，
    ３．．．Ｎ）の分子クラス、分子群および分子部分を決
    定しまたは同定しおよび測定する自動装置であって、 ピペッティング系、３Ｄハンドリング系および光学測定
    系の組合せからなり；該ピペッティング系、該３Ｄハン
    ドリング系および該光学測定系はコンピューターによっ
    て制御およびモニターされ；該ピペッティング系は液体
    を採取し分注する自動ピペッティング、自動ピペット交
    換を与え；かつピペットの反復位置決定において、好ま
    しくは少なくとも±０. １ｍｍの適当な精度を示すこと
    を特徴とする装置。
  2. 【請求項２】 前記装置にイメージングデバイス、特に
    カメラを装備した請求項１記載の自動装置。
  3. 【請求項３】 前記３Ｄハンドリング系が、ピペットの
    反復位置決定の所定の精度をもって前記ピペッティング
    系を往復させることができる請求項１または２記載の自
    動装置。
  4. 【請求項４】 前記光学測定系が倒立または直立顕微鏡
    載物台を具備した請求項１、２または３記載の自動装
    置。
  5. 【請求項５】 前記顕微鏡載物台が天候ボックスを含む
    請求項４記載の自動装置。
  6. 【請求項６】 前記３Ｄハンドリング系がロボットまた
    は直線状ガイド系を具備した請求項１ないし５いずれか
    １項記載の自動装置。
  7. 【請求項７】 前記装置が検査下に一つの同一の対象の
    ランダム数の個々の標識パターンのイメージを記録し、
    コンピューターの助けを借りた画像重ね合わせによって
    それらを高度に複雑な分子組合せパターンに変換する請
    求項１ないし６いずれか１項記載の自動装置。
  8. 【請求項８】 固体または液体対象における分子クラ
    ス、分子群または分子部分を決定しまたは同定する自動
    化された方法であって、 ランダム数の試薬溶液Ｙｎ（ｎ＝１，２，３．．．．
    Ｎ）の同時または順次の適用により、対象におけるラン
    ダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，３．．．Ｎ）の分子クラス、
    分子群または分子部分を検査し測定することを特徴とす
    る自動化方法。
  9. 【請求項９】 ランダム数の回数だけ反復できるインキ
    ュベーションならびにイメージングおよび脱色のサイク
    ルを具備した請求項８記載の自動化方法。
  10. 【請求項１０】 各サイクルに続き、検査すべき対象の
    シグナル分布パターンを記録する請求項８または９記載
    の自動化方法。
  11. 【請求項１１】 各サイクルで得られたシグナル分布パ
    ターンが、コンピューターの助けを借りた画像重ね合わ
    せによって、検査すべき対象の複雑な全体イメージに変
    換される請求項８ないし１０いずれか１項記載の自動化
    方法。
  12. 【請求項１２】 請求項８ないし１１いずれか１項記載
    の自動化方法であって、以下の自動的工程、即ち、 Ｉ．第１の溶液Ｙ１を、該溶液を含有する容器から採取
    し、 ＩＩ．対象担体手段上に設置した該対象に該溶液を適用
    する工程と、 ＩＩＩ．自動的に調整された時間の間、該溶液を対象に
    作用させる工程と、 ＩＶ．第１の溶液Ｙ１で予め処理した対象のイメージま
    たは測定値を記録し、または工程ＩＶに先立って工程Ｖ
    を行う工程と、 Ｖ．溶液Ｙ１を除去する工程と、 ＶＩ．第１の溶液Ｙ１または第２の溶液Ｙ２あるいは第
    １および第２溶液の混合液を対象に反復して適用するこ
    とによって工程Ｉ−Ｖを反復する工程と、 ＶＩＩＩ．ランダム数の溶液Ｙｎ（ｎ＝１，２，
    ３．．．Ｎ）またはその混合液で工程ＩないしＶＩを反
    復するこうていとを具備した方法。：
  13. 【請求項１３】 請求項１２記載の工程Ｖにおける第１
    もしくは第２溶液または溶液Ｙｎあるいはその混合液の
    除去に続いて、所定の時間の直後またはその後に（これ
    は変更可能）、洗浄溶液Ｚ１またはＺ２またはＺｎ（ｎ
    ＝１，２，３．．．．Ｎ）を対象に適用する請求項８な
    いし１２いずれか１項記載の自動化方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１２記載の工程Ｖにおける第１
    溶液Ｙ１もしくは第２溶液Ｙ２または溶液Ｙｎあるいは
    その混合液の除去に続いて、所定の時間の直後またはそ
    の後に（これは変更可能）、変更可能な特定の順序で、
    洗浄溶液Ｚ１ないしＺｎ（ｎ＝１，２，３．．．．Ｎ）
    を対象に適用する請求項８ないし１３いずれか１項記載
    の自動化方法。
  15. 【請求項１５】 前記溶液が着色剤、錯化剤、抗体等を
    含有する請求項８ないし１４のいずれか１項記載の自動
    化方法。
  16. 【請求項１６】 前記対象が試料、組織検体、または１
    もしくは複数の細胞である請求項８ないし１５いずれか
    １項記載の自動化方法。
  17. 【請求項１７】 前記試料、前記組織検体、または前記
    １もしくは複数の細胞において、ランダム数Ｘｎの分子
    クラス、分子群または分子部分を試薬溶液によって検査
    しおよび決定しまたは同定する請求項８ないし１６いず
    れか１項記載の自動化方法。
  18. 【請求項１８】 前記試料、組織検体、または前記１も
    しくは複数の細胞において、ランダム数Ｘｎの分子クラ
    スまたは分子群を、変更し得る特定の順序で異なる試薬
    溶液Ｙｎによって検査しおよび決定しまたは同定する請
    求項８ないし１７いずれか１項記載の自動化方法。
  19. 【請求項１９】 前記試薬溶液が、抗体またはリガン
    ド、特に蛍光色素−結合抗体またはリガンドを具備した
    請求項８ないし１８いずれか１項記載の自動化方法。
  20. 【請求項２０】 請求項８ないし１９いずれか１項記載
    の自動化方法であって、以下の自動工程、即ち、 Ｉ．第１試薬溶液Ｙ１、特に蛍光色素−含有溶液を容器
    から採取し、該溶液を試料、組織検体、または１もしく
    は複数の細胞にピペッティングする工程と、 ＩＩ．該試料、該組織検体、または該１または複数の細
    胞をある時間にわたってインキュベートする工程と、 ＩＩＩ．該試薬溶液Ｙ１を除去し、洗浄溶液Ｚ１ないし
    Ｚｎを対象に１回または数回ピペッティングする工程
    と、 ＩＶ．標識の分布パターンを記録する工程と、 Ｖ．蛍光が検出されなくなるまで対象を脱色する工程
    と、 ＶＩ．第２の試薬溶液を採取する工程と、 ＶＩＩ．ランダム数の試薬溶液Ｙｎまたはその混合液で
    工程ＩないしＶＩを反復する（反復する標識−イメージ
    ング−脱色のサイクル）工程とを具備した自動化方
    法。；
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