JP2002228654A

JP2002228654A - 組織マッピング方法及び組織マップ分析装置

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Publication number: JP2002228654A
Application number: JP2001021699A
Authority: JP
Inventors: Nobuyoshi Sudo; 伝悦須藤; Yoshiyo Akiyama; 佳代秋山; Kazunori Yabe; 一徳矢部
Original assignee: Yamato Scientific Co Ltd
Current assignee: Yamato Scientific Co Ltd
Priority date: 2001-01-30
Filing date: 2001-01-30
Publication date: 2002-08-14
Also published as: US20020102213A1

Abstract

(57)【要約】【課題】脳標本における同一標本上の複数の蛍光免疫
組織化学反応を相関的に細胞レベルで解析し画像化す
る。【解決手段】組織試料９を載置したステージ５を２次
元的に移動させながら上記試料９上の多数点の情報をフ
ォトメータ７により測定し、この測定信号を入力しメモ
リ２９に蓄積させて上記試料９の２次元情報を得て組織
マップを作成する。このとき、上記試料９に試薬Ａ’を
反応させた後に、２次元方向に走査して上記試薬Ａ’の
反応部の分布状態図を作成し、次に上記の同一試料９に
試薬Ｂ’を反応させた後に、２次元方向に走査して上記
試薬Ｂ’の反応部の分布状態図を作成し、上記の工程を
必要回数繰り返して上記の同一試料９に対する異なる試
薬の反応部の分布状態図を作成する。同一試料９上の複
数の物質の分布状態の差や比などの値から定量的に分析
し解析することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組織マッピング方
法及び組織マップ分析装置に関し、特に同一標本上で起
こっている複数の化学反応を同時にしかも相関的に細胞
レベルで解析し画像化する組織マッピング方法及び組織
マップ分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】人間の脳には、数千万以上の神経細胞が
分布しており、それぞれの細胞内で起こっている化学反
応の結果として、喜怒哀楽をはじめあらゆる感情や行動
が支配されている。したがって、脳のどの領域でどのよ
うな化学反応が起こっているかを細胞レベルで調べるこ
とは、脳研究の中心的なテーマである。

【０００３】こうした研究のため動物の脳を実験材料と
し、従来においては、脳の同一標本中での複数の物質の
分布を調べるために、各物質をそれぞれ異なる蛍光物質
で標識された抗体（例えば、Ａ物質に対してはフルオレ
セインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）を結合した抗
体、Ｂ物質に対してはローダミン等を結合した抗体な
ど）でラベルし、その標本を写真撮影するという組織化
学的方法が一般的に行われてきた。

【０００４】また、従来においては生化学的方法も行わ
れてきた。これは、標本を生化学的に分析する場合、標
本を各部位ごとにメス等で切り分けるか、細い部位だけ
をパイプによってパンチし、試料を採集し、分析すると
いうものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】脳研究のテーマとして
は、同一標本上で起こっている複数の化学反応を同時に
しかも相関的に細胞レベルで解析することが課題となっ
ている。この課題が解決されることは、多くの神経疾患
を解析し、予防と治療法を開発する上で極めて有効な手
段になると期待されるものである。

【０００６】ところが、従来においては、前者のような
組織化学的方法では、例えば写真上でＡ物質は緑色、Ｂ
物質は赤色等で示され、その分布を視覚的に観察するこ
とはできるが、物質の定量性を求めることはできないと
いう問題点があった。また、顕微鏡内のフィルタを交換
することにより、同一標本中の各蛍光物質由来の蛍光を
分離する方法も検討されているが、フィルタによって完
全に蛍光を分離することは不可能であり、その定量性に
問題があった。

【０００７】また、後者のような生化学的方法では、標
本を各部位ごとに切り取って採集する操作は複雑で非能
率的であるとともに、極微細領域からの試料の採取は不
可能である。さらに、分析までの煩雑な操作の過程で、
不安定な化学物質の分析には誤差も大きくなるという問
題点があった。

【０００８】従って、前者の組織化学的方法並びに後者
の生化学的方法においても、同一標本上の複数の化学反
応を相関的に細胞レベルで解析することは不可能である
という問題点があった。

【０００９】また、稀な疾患を有していた患者の組織試
料は貴重なものであり、その試料の量も少ないことか
ら、同一の試料を用いて種々の異なる物質に対して分布
状態を調べることが望まれている。また、これらの試料
は長期間保存され、その疾患に関する新たな知見が得ら
れたとき、再度保存されている試料を用いて検討する必
要も生じる。すなわち、同一の試料標本を用いて複数の
物質に対する存在状態を定量的に評価する方法が求めら
れている。

【００１０】本発明は上述の課題を解決するためになさ
れたもので、その目的は、脳標本のような組織試料を測
定すべき物質に特異的な試薬、例えば抗体で蛍光免疫組
織化学的に染色し、標本上に分布する蛍光物質の強度の
分布を光学的に分析し、同一標本上の複数の物質の分布
や複数の化学反応を相関的に細胞レベルで解析し画像化
し得る組織マッピング方法及び組織マップ分析装置を提
供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に請求項１によるこの発明の組織マッピング方法は、組
織試料をステージに載置し、このステージを２次元的に
移動させながら上記試料上の多数点の情報を測定装置に
より測定し、この測定した測定信号を入力しメモリに蓄
積させることにより、上記試料の２次元情報を得て組織
マップを作成する組織マッピング方法において、マップ
を作成すべき組織試料に物質Ａに特異的な試薬Ａ’を反
応させた後に、上記試料を２次元方向に走査して上記試
薬Ａ’反応部の分布状態図を作成し、次に上記の同一試
料に物質Ｂに特異的な試薬Ｂ’を反応させた後に、上記
試料を２次元方向に走査して上記試薬Ｂ’反応部の分布
状態図を作成し、上記の工程を必要回数繰り返して上記
の同一試料に対する異なる試薬の反応部の分布状態図を
作成することを特徴とするものである。

【００１２】したがって、脳標本などの組織試料は試薬
Ａ’にて特異的に染色され、この試料がステージにより
２次元方向に移動されて上記の試料上に分布する試薬
Ａ’の光学特性（反射光、透過光、蛍光など）に基づく
試薬Ａ’のフォトメトリーのシグナル強度の分布状態図
が画像化されて作成される。上記の同一試料は試薬Ｂ’
にて同様に特異的に再度染色され、この同一試料が同様
の工程を経て同一試料上に分布する試薬Ｂ’のフォトメ
トリーのシグナル強度の分布状態図が作成される。試薬
Ａ’や試薬Ｂ’のフォトメトリーのシグナル強度の分布
状態は、脳標本などに存在する物質Ａや物質Ｂの分布状
態に１対１に対応するものであり、同一試料上の複数の
化学物質の分布状態が同一位置における互いのシグナル
値の差や比などの値に計算されて細胞レベルで画像化さ
れ、定量的に解析し分析することができ、脳内で起こっ
ている複数の化学反応を相関的に細胞レベルで解析する
ことが可能となる。

【００１３】以上の物質Ａに特異的な試薬Ａ’や物質Ｂ
に特異的な試薬Ｂ’などとしては、抗体や蛍光物質でラ
ベルされた抗体が好ましく、このような抗体を一次抗体
あるいは二次抗体として用いて脳標本などを染色する
と、脳試料は蛍光免疫組織化学的に染色され、この試料
はステージにより２次元方向に移動されて上記の試料上
に分布する物質Ａと特異的に結合する抗体にラベルされ
た蛍光物質の強度の分布状態図が画像化されて作成され
る。上記の同一試料は物質Ｂに特異的抗体あるいは蛍光
物質でラベルされた抗体にて、再度蛍光免疫組織化学的
に染色され、この同一試料が同様の工程を経て同一試料
上に分布する物質Ｂと特異的に結合する抗体にラベルさ
れた蛍光物質の強度の分布状態図が作成され、このよう
にして同一試料上の複数の化学物質の分布状態が同一位
置にある互いの蛍光強度のシグナル強度の差や比などの
値に計算されて細胞レベルで画像化され、定量的に解析
・分析されるとともに、脳内で起こっている複数の化学
反応を相関的に細胞レベルで解析することが可能とな
る。

【００１４】請求項２によるこの発明の組織マップ分析
装置は、組織試料上の一点の情報を測定する測定装置を
設け、上記試料を載置して２次元的に移動するステージ
を設け、このステージを移動させながら前記測定装置か
らの測定信号を入力して上記試料上の多数点からなる２
次元情報を蓄積させるメモリを設け、このメモリ内に、
上記の同一組織試料を各試薬毎に反応せしめて２次元方
向に走査して前記測定装置により得た各試薬反応部の分
布状態の各データをそれぞれ各試薬毎に記憶せしめる複
数の各分割メモリを備え、前記複数の各分割メモリのデ
ータのうちから２つの異なる分割メモリのデータの分析
値を演算する演算装置を設け、前記メモリ内の各分割メ
モリのデータに基づいて各試薬毎の分布状態図を作成す
ると共に前記演算装置により演算された分析値に基づい
て分布状態図を作成する画像処理装置を設けてなること
を特徴とするものである。

【００１５】したがって、請求項１記載の作用と同様で
あり、脳標本などの組織試料は物質Ａに特異的な試薬
Ａ’にて特異的に染色され、この試料がステージにより
２次元方向に移動されて上記の試料上に分布する試薬
Ａ’のフォトメトリーのシグナル強度の分布状態図が画
像化して作成される。上記の同一試料は物質Ｂに特異的
な試薬Ｂ’にて特異的に染色され、この同一試料が同様
の工程を経て同一試料上に分布する試薬Ｂ’のフォトメ
トリーのシグナル強度の分布状態図が作成される。この
ような同一試料上の複数の化学物質の分布状態が、演算
装置により同一位置にある互いのフォトメトリーのシグ
ナル強度の差や比などの値に計算されて細胞レベルで画
像化されるので、容易に且つ確実に定量的に分析し、解
析することができる。

【００１６】請求項３によるこの発明の組織マップ分析
装置は、請求項２記載の組織マップ分析装置において、
前記複数の各分割メモリが、物質Ａに特異的な試薬Ａ’
を反応させた組織試料を２次元方向に走査して前記測定
装置により得た上記試薬Ａ’反応部の分布状態のデータ
を記憶する第１メモリと、物質Ｂに特異的な試薬Ｂ’を
反応させた同一の上記組織試料を２次元方向に走査して
前記測定装置により得た上記試薬Ｂ’反応部の分布状態
のデータを記憶する第２メモリと、物質Ｃに特異的な試
薬Ｃ’を反応させた同一の上記組織試料を２次元方向に
走査して前記測定装置により得た上記試薬Ｃ’反応部の
分布状態のデータを記憶する第３メモリと、から構成し
てなることを特徴とするものである。

【００１７】したがって、試薬Ａ’を反応させた組織試
料の試薬Ａ’反応部の分布状態のデータは第１メモリに
格納され、試薬Ｂ’の場合は第２メモリに格納され、試
薬Ｃ’の場合は第３メモリに格納されるので、各試薬
Ａ’、Ｂ’、Ｃ’に対応する反応部の画像処理や異なる
試薬に対応する反応部のデータ間の差や比などの値の計
算が容易となる。

【００１８】請求項４によるこの発明の組織マップ分析
装置は、請求項２又は３記載の組織マップ分析装置にお
いて、前記ステージに、同一組織試料を前記ステージの
所定位置に試料位置決め手段を設けてなることを特徴と
するものである。

【００１９】したがって、複数の試薬により反応した同
一組織試料の反応部が確実に重ね合わさって画像化さ
れ、２つの異なる分割メモリのデータの差や比などの値
も確実に画像化され、解析できる。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て図面を参照して詳細に説明する。

【００２１】図１及び図２を参照するに、本実施の形態
に係わる組織マップ分析装置（MapAnalyzer）１は、落
射型蛍光顕微鏡３を用いて試料の測光データの２次元分
布を求めるものである。顕微鏡３はオートスキャンニン
グステージ５（以下、「スキャンニングステージ」とい
う）、測定装置としての例えばフォトメータ７を有す
る。

【００２２】フォトメータ７には、検出器に感度や定量
性の上で最も信頼性のあるフォトマル（光電子増倍管、
Photomultiplier）が用いられており、干渉フィルタと
測光絞りが検出器の受光前面に挿入されている。励起ビ
ームは、視野絞りと開口絞りによって任意に絞ることが
でき（標本９面での最小スポット：１００倍の対物レン
ズ使用時０．８μｍφ、２０倍の対物レンズ使用時６μ
ｍφ）、目的とする試料としての例えば標本９の微少領
域からの光だけを選択して測光することが可能である。

【００２３】図３を参照するに、スキャンニングステー
ジ５には、同一組織試料としての同一標本９をスキャン
ニングステージ５の所定位置に設置するための試料位置
決め手段としての例えば位置決めピン１１が少なくとも
２箇所設けられており、標本９を貼り付けたスライドガ
ラス１３にも上記の位置決めピン１１を挿脱可能な位置
決め穴１５が同数設けられている。

【００２４】また、試料位置決め手段の他の例として
は、図４に示されているようにスライドガラス１３の隣
り合う２側縁を突当てるための突当て部材１７がスキャ
ンニングステージ５に設けられており、残りの２側縁に
設けられたスライドガラスおさえ１８でスライドガラス
を所定位置に固定する。なお、上記の突当て部材１７は
少なくとも３箇所の突当てピンであっても構わない。い
ずれにしても、スライドガラス１３をスキャンニングス
テージ５の所定位置に着脱可能であれば特に限定される
ものではない。また、スキャンステージ５上に位置決め
用のマーカを付与せしめて、スライドガラス１３をこの
マーカにその都度位置決めするようにしても構わない。

【００２５】測光コントローラ１９は、上記のスキャン
ニングステージ５をＸＹ方向に移動制御するステージ制
御装置２１、フォトメータ７を制御する測光制御装置２
３を有する。

【００２６】システムコントローラ２５は、ステージ制
御装置２１及び測光制御装置２３に指令信号を出力する
主制御系ＭＣＳ２７と測光データを記憶するためのメモ
リ２９を有する。

【００２７】このメモリ２９内には複数の分割メモリ３
１が備えられており、複数の各分割メモリ３１は、測定
すべき同一組織試料としての同一標本９を各試薬Ａ’、
Ｂ’Ｃ’、…毎に反応せしめてからスキャンニングステ
ージ５を介してＸＹ方向の２次元方向に走査してフォト
メータ７により測定して得た各試薬反応部の分布状態の
各データ（透過光、反射光、蛍光などの強度データ）を
それぞれ各試薬Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、…毎に記憶せしめる
ものである。

【００２８】複数の各分割メモリ３１としては、例え
ば、試薬Ａ’を反応させた組織標本９をＸＹ方向に走査
してフォトメータ７により得た上記試薬Ａ’反応部の分
布状態のデータを記憶する第１メモリ３１Ａと、試薬
Ｂ’を反応させた同一の上記組織標本９をＸＹ方向に走
査してフォトメータ７により得た上記試薬Ｂ’反応部の
分布状態のデータを記憶する第２メモリ３１Ｂと、試薬
Ｃ’を反応させた同一の上記組織標本９をＸＹ方向に走
査してフォトメータ７により得た上記試薬Ｃ’反応部の
分布状態のデータを記憶する第３メモリ３１Ｃと、いう
具合に各試薬Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、…毎に設けられる。

【００２９】また、システムコントローラ２５には、デ
ータや指令を入力するためのキーボードの如き入力装置
３３と、ＣＲＴの如き表示装置３５が設けられている。
さらに、上記の複数の各分割メモリ３１Ａ、３１Ｂ、３
１Ｃ、…のデータのうちから２つの異なる分割メモリ３
１のデータ間の差や比などの分析値を演算する演算装置
３７が設けられている。また、上記のメモリ２９内の各
分割メモリ３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、…毎のデータに基
づいて各試薬Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、…毎の分布状態図（組
織マップ）を作成する画像処理装置３９が設けられてい
る。なお、この画像処理装置３９は上記の演算装置３７
により演算された分析値に基づいて分布状態図（組織マ
ップ）を作成することもできる。

【００３０】スキャンニングステージ５は、測光コント
ローラ１９からの指令により、Ｘ、Ｙ方向に０．２５μ
ｍ以上のステップ幅で自由に走査する。走査速度は１０
０測光ポイント／秒であり、走査範囲は１４０×１４０
ｍｍ以内で任意に選択することができる。標本９を一定
の速度で移動させながら、各測光ポイントの透過光、反
射光、蛍光などの強度が測定され、システムコントロー
ラ２５に取り込まれる。蛍光を用いる場合であっても、
各ポイントは励起ビームによって０．０１秒しか照射さ
れないため、照射による蛍光の退色はほとんどみられな
い。

【００３１】より詳しくは、スキャンニングステージ５
上に配置された標本９が発する光は顕微鏡３を介してフ
ォトメータ７によって検出される。検出した測光信号
は、測光制御装置２３を介してシステムコントローラ２
５内の主制御系ＭＣＳ２７に出力され、メモリ２９内に
蓄積される。システムコントローラ２５と測光制御装置
２３とは測光データ転送専用回線によって接続されてい
る。

【００３２】主制御系ＭＣＳ２７はステージ制御装置２
１に対して指令信号を出力し、スキャンニングステージ
５を任意の測定位置に移動させる。ステージ制御装置２
１からスキャンニングステージ５へ出力されるパルス信
号は、主制御系ＭＣＳ２７にも出力される。主制御系Ｍ
ＣＳ２７はステージ制御装置２１からのパルス信号に基
づいてデータの蓄積を繰り返し行うことにより、標本９
の測光の２次元分布が得られる。

【００３３】本発明の装置は試料からの反射光あるいは
蛍光または試料を透過する透過光を測定するものであ
る。本装置に用いられる光学系の例を図５に示す。図５
のＡは反射光あるいは蛍光を測定する場合であり、図５
のＢは透過光を測定する場合の光学系を例示したもので
ある。

【００３４】図５のＡにおいて、ハロゲンランプ４１か
ら出た光は、集光レンズ４２、熱遮断フィルタ４３、シ
ャッター４４、開口絞り４５、視野絞り４６を介して光
束が絞られ、ダイクロイックミラー４７により反射さ
れ、対物レンズ４８を介して標本（組織試料）９に集光
される。試料により反射された光、または照射された光
により励起された蛍光は、対物レンズ４８を介しダイク
ロイックミラー４７を通過し、測定系にはいる。測定系
では、投影レンズ４９、シャッター４４、赤外線カット
フィルタ５０、バンドパスフィルタ（干渉フィルタ）５
１、測光絞り５２を介しフォトマル（光電子増倍管）５
３に入り、光量が測定される。なお、参照符号５はスキ
ャンニングステージであり、これはＸＹ方向に移動さ
れ、試料表面が走査される。

【００３５】図５のＢは透過光で測定する場合であり、
ハロゲンランプ４１から出た光は、集光レンズ４２、熱
遮断フィルタ４３、シャッター４４、開口絞り４５、視
野絞り４６を介して光束が絞られ、バンドパスフィルタ
（干渉フィルタ）５１を介しミラー５５により反射され
標本（組織試料）９に照射され、試料を透過する透過光
が、Ａの場合と同様な測定系（図示せず）に導かれ光量
が測定される。なお、参照符号５６は標本９上の測定部
位に光を集めるための集光器である。

【００３６】上記の測光操作を蛍光の場合を例に簡単に
まとめると以下のようになる。

【００３７】（１）蛍光免疫組織化学染色した標本９の
微小領域（測光ポイント）が、絞りこんだ励起ビームで
照射される。

【００３８】（２）この領域で発せられた蛍光は、対物
レンズ４８と測光絞り５２を通してフォトマル５３に集
積され、その強度が測定される。

【００３９】（３）標本９がオートスキャンニングステ
ージ５によって次の測光ポイントヘ移動され、蛍光強度
が測定される。

【００４０】（４）各微小領域の蛍光強度のデータがシ
ステムコントローラ２５のメモリ２９に記憶されて蓄積
され、スキャンした全体領域の画像が構築され、カラー
やモノクロの図で表示装置３５に表示される。

【００４１】次に、本発明の実施の形態の組織マッピン
グ方法について説明する。

【００４２】本発明のマッピング法は組織試料内に存在
する物質に特異的な試薬を結合させ、結合した部分に生
ずる光学的な変化あるいは特性を、透過光、反射光ある
いは蛍光などを用いて測光（フォトメトリー）するもの
である。従って、結合する試薬自体が蛍光を発すると
か、特有の吸収波長を有するというような光学的な特徴
あるいは特性を有する場合は、これを光学的マーカーと
して測光することができるばかりか、試薬自体に光学的
マーカーがない場合であっても、試薬が特定の物質と結
合することにより吸収波長が変化するなどの光学的特性
が変化する場合は、これを光学的マーカーとして測光す
ることができる。

【００４３】本発明で用いる物質に特異的な試薬とは、
この物質に特異的に結合する物質や特異的に反応する物
質を意味するものである。特定の物質に特異的に結合あ
るいは反応する物質は、すなわち特異的な試薬は測定し
ようとする物質の種類に応じて選択されるが、例えば、
その物質に対する抗体、特定のレセプターに結合するリ
ガンド、特定の酵素に対する基質などが挙げられ、測定
しようとする物質によっては、ビオチン−アビジン系の
ように特定の物質に結合することが知られている物質を
応用することも可能である。

【００４４】これらの、抗体やリガンドなどには結合し
た抗体やリガンド自体が蛍光を生じるようにそれら自体
に蛍光物質を結合させて、生じる蛍光を光学的マーカー
として測光することもできるが、抗体の場合は、まず、
測定しようとする物質に特異的な抗体を結合させた後、
この抗体に対する蛍光物質を結合した抗体（蛍光標識抗
−抗体）を用いて染色する、いわゆる二抗体法により蛍
光免疫組織化学染色を施すことができる。

【００４５】測定しようとする物質に対する抗体は、公
知の方法に従い、マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギなどの
動物を免疫することにより得られるが、測定しようとす
る物質によってはすでに市販されているものもあり、こ
れらを利用することができる。

【００４６】また、蛍光標識抗−抗体としては、蛍光物
質で標識された抗−ウサギＩｇＧ抗体（血清）、抗−ヒ
ツジＩｇＧ抗体（血清）、抗−マウスＩｇＧ抗体（血
清）など多くのものが市販されており、これらのものを
利用することができる。

【００４７】従って、測定しようとする物質に対する抗
体自体に蛍光物質を公知の方法に従い結合させ、この抗
体を用いて免疫組織化学染色することはもちろん可能で
あるが、上記のような蛍光物質で標識した抗−抗体が市
販されていることから、これらの蛍光標識抗−抗体（血
清）を用いる二抗体法による免疫組織化学染色が容易で
あり、より汎用性があることから好ましいものである。

【００４８】標識する蛍光物質としては、フルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、励起波長；４９６ｎ
ｍ、蛍光波長；５１８ｎｍ）、テトラメチロールイソチ
オシアナート（ＴＲＩＴＣ、励起波長；５５４ｎｍ、蛍
光波長；５６５ｎｍ）、ライサミンローダミンスルホニ
ルクロリド（ＬＲＳＣ、励起波長；５７２ｎｍ、蛍光波
長；５９０ｎｍ）やスルホローダミン１０１酸クロリド
（テキサスレッド、励起波長；５９２ｎｍ、蛍光波長；
６１０ｎｍ）などのローダミン類など多数のものが知ら
れており、いずれのものも使用できるが、一連のマッピ
ングにおいて使用する蛍光物質としては同一のものであ
ることが定量性の見地から好ましいものである。しかし
ながら、異なる蛍光物質であってもこれらの物質が発す
る蛍光強度と濃度との関係を補正することによって使用
することができる。

【００４９】組織標本は、スライドガラス上に固定した
組織試料を測定しようとする物質に特異的に結合する試
薬を用いて処理し、洗浄して未結合の試薬を除去するこ
とにより作製される。また、前記した二抗体法を用いる
場合には、上記の操作に続けて、蛍光物質を結合した抗
−抗体などで標本を処理し、未結合の蛍光標識化抗−抗
体を洗浄除去し、測定しようとする物質が蛍光物質でラ
ベルされた組織標本を得る。そしてこのようにして調製
された組織標本はスキャニングステージ上に載置され、
走査されることにより、それぞれの位置における光量が
測光される。

【００５０】この測光に際し、組織試料標本が前もって
蛍光をもつ色素（エオジンやメチルグリーンなど）で染
色されている場合や組織自体が自ら蛍光の発生を有する
ような場合など、組織標本自体が蛍光を有する場合に
は、抗体が結合する前の試料標本を予め測光しておき、
この測定値をもとに、抗体が結合したときの状態を求め
ることもできる。

【００５１】測定する物質がレセプターとリガンドとの
場合や酵素と基質などのように、特異的に結合する物質
が知られている場合には、リガンドや基質自体あるい
は、蛍光物質を結合したリガンドや基質の誘導体を上記
の「特異的な試薬」として用いることができる。また、
測定しようとする物質が酵素のようなタンパク質のよう
なもので、このタンパク質に対する抗体産生が可能なも
のであれば、このタンパク質を抗原として、免疫するこ
とにより抗体が容易に得られ、この抗体は上記の「特異
的な試薬」として用いることができる。

【００５２】一方、測定する物質が、アミノ酸、ポリペ
プチドや脳内アミンのように低分子であって、そのもの
自体では抗体を産生し得ないものであるときは、以下の
ようにして、蛍光免疫組織化学染色を行い、これらの物
質に対してマッピングを行うことができる（Geffard,
M. ら、Brain Res. 294:161-165; 1984およびGeffard,
M. ら、J. Neurochem. 42:1593-1599; 1984）。

【００５３】脳内アミンのマウスの脳におけるマッピン
グの場合を例に挙げて説明する。まず、インビトロで、
脳内アミンとグルタルアルデヒドとを反応させ、脳内ア
ミンにグルタルアルデヒドが縮合した高分子量のアミン
−グルタルアルデヒド縮合体を得、このものを抗原とし
てウサギを免疫し、血清から抗体を得る。

【００５４】一方で、マウスを用いて、心臓からグルタ
ルアルデヒドを灌流すると、生体内でも同様の縮合反応
が生じ、マウスの脳内で、脳内アミンと灌流されたグル
タルアルデヒドとが縮合し、アミン−グルタルアルデヒ
ド縮合物が生成し、脳内アミンが存在していた位置で固
定される。次に、この脳をスライスし、スライドガラス
上に固定した標本を得、別途調製したウサギの抗−アミ
ン−グルタルアルデヒド縮合物抗体で処理し、マウス脳
内アミン−グルタルアルデヒド縮合体に、抗−脳内アミ
ン−グルタルアルデヒド縮合体ウサギ抗体を結合させ
る。次いで、蛍光標識した抗−ウサギＩｇＧ抗体（血
清）を用いて処理することにより、試料標本が調製され
る。

【００５５】以上のように、本発明では、脳内に存在す
るタンパク質のみならず、脳内アミンのような低分子の
物質に対しても蛍光免疫組織化学染色を施すことがで
き、本発明のマップ分析装置（MapAnalyzer）により蛍
光を測光することによりマッピングすることが可能とな
る。

【００５６】

【実施例】次に、上述したマップ分析装置（MapAnalyze
r）を用いてラット脳の同一標本における複数の物質に
対する多重マッピング法について、実施例として、タイ
ロシン水酸化酵素、カルモジュリンおよびカルモジュリ
ン依存性プロテインキナーゼIIを例として具体的に説明
する。

【００５７】特異的な試薬として、それぞれ、抗−タイ
ロシン水酸化酵素抗体（ＴＨ抗体、試薬Ａ’）、抗−カ
ルモジュリン抗体（ＣａＭ抗体、試薬Ｂ’）、および抗
−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII抗体（Ｃ
ａＭキナーゼII抗体、試薬Ｃ’）を用い、二次抗体とし
て、蛍光物質（ＦＩＴＣ）で標識された、これらの抗体
に対する抗−ＩｇＧ抗体（血清）を用いた二抗体法によ
り蛍光免疫組織化学染色を行った。

【００５８】用いた上記の各抗体について詳しく説明す
ると、ＴＨ抗体は、Chemicon International, Inc.社か
ら購入したものであり（Catalog No. AB151）、ラット
副腎髄質の腫瘍組織から精製したＴＨを抗原とし、ウサ
ギから抗体を作製したものである。

【００５９】ＣａＭ抗体は、Transformation Research,
Inc.社から購入したものであり（Catalog No. 501
6）、牛精巣から精製したＣａＭを用い、ヒツジから抗
体を作製したものである。

【００６０】さらに、ＣａＭキナーゼII抗体は、Chemic
on International, Inc.社から購入したものであり（Ca
talog No. MAB8699）、マウスを精製したＣａＭキナー
ゼIIで免疫し、脾臓のリンパ球をマウス骨髄腫細胞（Ｎ
Ｓ１／ＳＰ２）と融合して、６Ｇ９ハイブリドーマクロ
ーンを作り、抗体を腹水内で作製し、プロテインＡ分別
で精製されたものである。

【００６１】また、ＦＩＴＣで標識化されたＦＩＴＣ標
識化抗−ウサギＩｇＧヤギ血清は、Zymed Lab., Inc.社
から購入したものである（Catalog No. 65-6111）。

【００６２】また、ＦＩＴＣ標識化抗−ヒツジＩｇＧウ
サギ血清は、Vector Lab., Inc.社から購入したもので
ある（Catalog No. FI-6000）。

【００６３】そして、ＦＩＴＣ標識化抗−マウスＩｇＧ
ヤギ血清は、American Qualex International, Inc.社
から購入したものである（Catalog No. A106FU）。

【００６４】組織試料標本を次のようにして調製した。

【００６５】まず、ラットをペントバルビタールで麻酔
し、心臓より４％のパラホルムアルデヒドと０．２％の
グルタルアルデヒドとの混合液で灌流固定する。ラット
脳を摘出し、液体窒素あるいはドライアイスで凍結した
後、クリオスタットを用いて２０μｍの厚さにスライス
し、ゼラチンでコーティングされたスライドガラスに貼
り付け、試料標本を作製した。

【００６６】次に、このラット脳の標本に対して、上記
の抗体を用いて蛍光免疫組織化学染色を行うが、まず二
抗体法によるＦＩＴＣを用いたＴＨに対する蛍光免疫組
織化学染色を行った。操作手順は以下のとおりである。

【００６７】（１）上記の標本をＰＢＳ（phosphte-buf
fered saline）で２０分間洗浄する。

【００６８】（２）正常ヤギ血清で２時間、４℃で前処
理し、抗−ウサギＩｇＧヤギ血清の非特異的結合をブロ
ックする。

【００６９】（３）ＰＢＳで６０分間洗浄する。

【００７０】（４）２００倍に希釈したＴＨ抗体を標本
にのせ、４℃で１２時間反応させる。

【００７１】（５）ＰＢＳで２０分間×３回洗浄する。

【００７２】（６）ＦＩＴＣ標識化抗−ウサギＩｇＧヤ
ギ血清を１００倍に希釈して、標本にのせ、室温で３時
間反応させる。

【００７３】（７）ＰＢＳで２０分間×３回洗浄する。

【００７４】（８）１０％グリセリンで封入し、直ちに
マップ分析装置（MapAnalyzer）で測定する。

【００７５】次に、以上のようにＴＨ分布の測光を行っ
た同一標本に対して、２００倍に希釈したＣａＭ抗体と
２００倍に希釈したＦＩＴＣ標識化抗−ヒツジＩｇＧウ
サギ血清を用いてＴＨ抗体の場合と同様にして、ＣａＭ
の免疫組織化学染色を行い、マップ分析装置（MapAnaly
zer）で測定した。染色に先立ち標本上のグリセリンを
ＰＢＳで洗浄し、除去した。

【００７６】なお、ＣａＭの免疫組織化学的蛍光強度
は、脳標本の各微小領域におけるＣａＭ染色前後の蛍光
強度の差から求めた。

【００７７】次に、以上のようにＣａＭ分布の測定を行
った同一標本に対して、１００倍に希釈したＣａＭキナ
ーゼII抗体と４０倍に希釈したＦＩＴＣ標識化抗−マウ
スＩｇＧヤギ血清を用いて、ＣａＭ抗体の場合と同様に
してＣａＭキナーゼIIの蛍光免疫組織化学染色を行い、
マップ分析装置（MapAnalyzer）で測定した。

【００７８】なお、ＣａＭキナーゼIIの免疫組織化学的
蛍光強度は、脳標本の各微小領域におけるＣａＭキナー
ゼII染色前後の蛍光強度の差から求めた。

【００７９】次に、以上のようにして得られた同一標本
からの各物質の分布分析（マッピング）方法について説
明する。

【００８０】標本の全領域を２０μｍ間隔で測光し、各
標本から約４０万点のデータを得た。最初に染色した物
質（ＴＨ）の免疫組織化学的蛍光強度の分布は、染色し
た標本を測定することにより直接得られる。なお、必要
に応じ、染色前に試料標本のバックグランドを測定し、
この値を差し引いてＴＨの免疫組織化学的蛍光強度の分
布を求めることもできる。そして、２番目以降に染色し
た物質（ＣａＭおよびＣａＭキナーゼII）の免疫組織化
学的蛍光強度分布は、各物質の染色前後の蛍光強度の差
から得られる。

【００８１】すなわち、まず脳標本をＴＨ抗体で染色
し、その標本の全領域における蛍光強度を測定する。こ
のデータ（１回目のデータ）は、ＴＨの分布を示すもの
であり、得られた蛍光強度を８〜２５６段階に層別化
し、標本上の各点における蛍光強度を明度差（白黒）も
しくはカラー化して表示すると、図６Ａに示すような画
像が得られる。この画像（図面においては白黒表示であ
る）において、より黒い部分がＴＨの量が多い部分、す
なわちＴＨが局在する部分である。なお、作製した脳標
本はラットの脳を冠状面でスライスしたものであり、画
像の上方向がラットの頭頂部に相当する。また、図中、
参照符号６１は大脳皮質運動野、６２は線条体、６３は
嗅結節、６４は前交連、６５は側坐核、６６は外側中隔
核、６７は対角帯、６８は梨状皮質、６９は島皮質をそ
れぞれ示し、得られた画像より、ＴＨは線条体６２、側
坐核６５、嗅結節６３、大脳皮質運動野６１に多く局在
していることがわかる。

【００８２】得られたデータ（１回目のデータ）はシス
テムコントローラ２５のメモリ２９内の第１メモリ３１
Ａに保存される。

【００８３】次に、上記の同一標本をＣａＭ抗体で染色
する。この染色した標本をスキャンニングステージのま
ったく同じ位置にセットし、同一条件下で再び測光す
る。この蛍光強度のデータ（２回目のデータ）はシステ
ムコントローラ２５に送られ、システムコントローラ２
５のメモリ２９内の第２メモリ３１Ｂに保存される。そ
して、演算装置３７により各測光点において、２回目の
値から１回目の値を差し引くことにより、ＣａＭの分布
を示すデータが得られ、このデータを層別化して表示す
ると、図６のＢに示すような画像が得られる。

【００８４】さらに、上記の同一標本をＣａＭキナーゼ
II抗体で染色し、同様に測光する。この蛍光強度のデー
タ（３回目のデータ）はシステムコントローラ２５に送
られ、システムコントローラ２５のメモリ２９内の第３
メモリ３１Ｃに保存される。そして、演算装置３７によ
り各測光点において、３回目の値から２回目の値を差し
引くことにより、ＣａＭキナーゼIIの分布を示すデータ
が得られ、このデータを層別化して表示すると、図６の
Ｃに示すような画像が得られる。

【００８５】以上のようにして、マップ分析装置（MapA
nalyzer）を用い、ＴＨ、ＣａＭやＣａＭキナーゼIIの
それぞれに対して定量的画像が得られる。なお、これら
の定量的画像、図６のＡ〜Ｃとそれらの生データはそれ
ぞれメモリ２９に格納される。

【００８６】次に、以上のようにして得られた同一標本
からの各物質の分布の比較について説明する。

【００８７】以上のようにＴＨ、ＣａＭ、ＣａＭキナー
ゼIIの各定量的画像をメモリ２９に記憶できるので、マ
ップ分析装置（MapAnalyzer）を用いて、各領域におけ
る物質間の免疫組織化学的蛍光強度を定量的に比較し、
解析することができる。

【００８８】例えば、標本の各微小領域における純粋な
ＣａＭキナーゼIIの免疫組織化学的蛍光強度（図６の
Ｃ）からＣａＭの免疫組織化学的蛍光強度（図６のＢ）
を差し引き、この差を画像化すると、図７のＡのような
画像が得られる。この図７のＡの画像において黒い部分
はＣａＭよりもＣａＭキナーゼIIが多く分布する領域を
示している。

【００８９】逆に、図７のＢの画像は、ＣａＭの蛍光強
度（図６のＢ）からＣａＭキナーゼIIの蛍光強度（図６
のＣ）を差し引き、この差を画像化したものであり、黒
い部分はＣａＭキナーゼIIよりもＣａＭが多く分布する
領域を示している。

【００９０】さらに、ＣａＭキナーゼIIの蛍光強度（図
６のＣ）をＣａＭの蛍光強度（図６のＢ）で割り、この
比（ＣａＭキナーゼII／ＣａＭ）を画像化すると、図７
のＣで示されるような画像を得ることもできる。黒い部
分は、ＣａＭキナーゼIIがＣａＭに比べ相対的に多い部
分を示している。

【００９１】得られた画像より、ＴＨ、ＣａＭおよびＣ
ａＭキナーゼIIは、線条体６２の外側部、側坐核６５、
嗅結節６３、大脳皮質運動野６１で共に高く、これらの
領域が脳内で重要な役割をはたしていることが考えられ
る。さらに、ＣａＭキナーゼIIはＣａＭよりも外側中隔
核６６、線条体６２の内側部、大脳皮質の梨状皮質６８
と島皮質６９で高く、逆にＣａＭはＣａＭキナーゼIIよ
りも対角帯６７で高く分布することがわかる。

【００９２】以上のように、本発明の組織マップ分析装
置（MapAnalyzer）は、視野絞りと開口絞りによって励
起ビームが絞り込まれ、各測光ポイントは励起ビームに
よって０．０１秒しか照射されないため、一回の測光で
蛍光の退色はほとんどみられない。ちなみに、実験で
は、５０回の分析を繰り返しても同じデータが得られた
ので、実施例のように、染色→測光→染色→測光の繰り
返し操作を行っても、誤差のない値を得ることができ
る。しかも、マップ分析装置（MapAnalyzer）は、検出
器にフォトマル（光電子増倍管）を用いているので、Ｔ
Ｖカメラを用いた画像解析装置と比較して２桁以上、定
量性が優れている。

【００９３】なお、この発明は前述した実施の形態に限
定されることなく、適宜な変更を行うことによりその他
の態様で実施し得るものである。

【００９４】本実施形態においては測光コントローラ１
９とシステムコントローラ２５とが別々になっている
が、測光コントローラ１９がシステムコントローラ２５
の内部に組み込まれていても、逆に測光コントローラ１
９の内部に主制御系ＭＣＳ２７とメモリ２９とが組み込
まれていても構わない。

【００９５】

【発明の効果】以上のごとき発明の実施の形態の説明か
ら理解されるように、請求項１の発明によれば、脳標本
などの組織試料は特異的な試薬Ａ’にて特異的に染色さ
れ（特異的な試薬Ａ’として抗体を用いるときは蛍光免
疫組織化学的に染色され）、この試料をスキャンニング
ステージにより２次元方向に移動してマップ分析装置に
より測光し、上記の試料上に分布する試薬Ａ’の光学的
特性（例えば、蛍光強度など）に基づき試薬Ａ’の分布
状態図を画像化できる。上記の同一試料は特異的な試薬
Ｂ’にて蛍光免疫組織化学的に染色され、この同一試料
を同様の工程を経て測光することにより同一試料上に分
布する試薬Ｂの蛍光物質の強度の分布状態図を画像化で
きる。したがって、同一試料上の複数の化学反応の分布
状態を互いの差や比などの値に計算して相関的に細胞レ
ベルで画像化でき、容易に且つ確実に定量的に分析でき
る。また、本発明の方法は非破壊的であり、しかも測定
前の試料の状態に影響を受けないものであるから、同一
の試料標本に対して異なる物質の分布状態をくり返して
何度でも調べることができる。

【００９６】請求項２の発明によれば、請求項１記載の
効果と同様であり、脳標本などの組織試料は試薬Ａ’に
て特異的に（試薬Ａ’として抗体を用いれば蛍光免疫組
織化学的に）染色され、この試料をスキャンニングステ
ージにより２次元方向に移動してマップ分析装置により
測光し、上記の試料上に分布する試薬Ａ’の光学的特性
（例えば、蛍光強度など）に基づき試薬Ａ’の分布状態
図を画像化できる。上記の同一試料は特異的な試薬Ｂ’
にて同様に染色され、この同一試料を同様の工程を経て
測光することにより同一試料上に分布する試薬Ｂ’の分
布状態図を画像化できる。したがって、同一試料上の複
数の物質の分布状態を互いの差や比などの値に計算し
て、相関的に細胞レベルで画像化でき、容易に且つ確実
に定量的に分析し、解析することができる。

【００９７】請求項３の発明によれば、特異的な試薬
Ａ’を反応させた組織試料の試薬Ａ’反応部の分布状態
のデータを第１メモリに格納でき、特異的な試薬Ｂ’の
場合は第２メモリに格納でき、特異的な試薬Ｃ’の場合
は第３メモリに格納できるので、各試薬Ａ’、Ｂ’、
Ｃ’に対応する反応部の画像処理や異なる試薬に対応す
る反応部のデータ間の差や比などの分析値の計算を容易
にできる。

【００９８】請求項４の発明によれば、複数の試薬によ
り反応した同一組織試料の位置を確実に重ね合わせるこ
とができるので、測定操作が容易となるとともに得られ
る画像の正確性が向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態を示すもので、組織マップ
分析装置の斜視図である。

【図２】本発明の実施の形態に係わる組織マップ分析装
置の構成ブロック図である。

【図３】本発明の実施の形態のスキャンニングステージ
の部分的な斜視図である。

【図４】本発明の実施の形態の他のスキャンニングステ
ージの部分的な斜視図である。

【図５】本発明の実施の形態に係わる組織マップ分析装
置の光学系の一例を示す図である。

【図６】ラットの脳組織における各物質の存在状態を示
すマップ図であり、図中、Ａはタイロシン水酸化酵素
（ＴＨ）の、Ｂはカルモジュリン（ＣａＭ）の、Ｃはカ
ルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（ＣａＭキナ
ーゼII）の分布状態をそれぞれ示す画像である

【図７】図６に示す、ＣａＭとＣａＭキナーゼIIの存在
状態のデータに基づき演算した結果を示すマップ図であ
り、図中、Ａは、ＣａＭキナーゼIIのデータ（図６の
Ｃ）からＣａＭのデータ（図６のＢ）を差し引いたもの
で、ＣａＭキナーゼIIがＣａＭよりも多く存在する領域
を示し、Ｂは逆にＣａＭのデータ（図６のＢ）からＣａ
ＭキナーゼIIのデータ（図６のＣ）を差し引いたもの
で、ＣａＭがＣａＭキナーゼIIよりも多く存在する領域
を示し、さらに、ＣはＣａＭキナーゼIIとＣａＭとの比
をとったもので、ＣａＭキナーゼIIがＣａＭに比べて相
対的に多く存在する領域を示している画像である。

【符号の説明】

１組織マップ分析装置３落射型蛍光顕微鏡５スキャンニングステージ（ステージ）７フォトメータ（測定装置）９標本（組織試料）１１位置決めピン（試料位置決め手段）１３スライドガラス１５位置決め穴１７突当て部材（試料位置決め手段）１８スライドガラスおさえ１９測光コントローラ２１ステージ制御装置２３測光制御装置２５システムコントローラ２７主制御系ＭＣＳ２９メモリ３１Ａ第１メモリ（分割メモリＡ）３１Ｂ第２メモリ（分割メモリＢ）３１Ｃ第３メモリ（分割メモリＣ）３３入力装置３５表示装置３７演算装置３９画像処理装置６１大脳皮質運動野６２線条体６３嗅結節６４前交連６５側坐核６６外側中隔核６７対角帯６８梨状皮質６９島皮質

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組織試料をステージに載置し、このステ
ージを２次元的に移動させながら上記試料上の多数点の
情報を測定装置により測定し、この測定した測定信号を
入力しメモリに蓄積させることにより、上記試料の２次
元情報を得て組織マップを作成する組織マッピング方法
において、マップを作成すべき組織試料に物質Ａに特異的な試薬
Ａ’を反応させた後に、上記試料を２次元方向に走査し
て上記試薬Ａ’反応部の分布状態図を作成し、次に上記
の同一試料に物質Ｂに特異的な試薬Ｂ’を反応させた後
に、上記試料を２次元方向に走査して上記試薬Ｂ’反応
部の分布状態図を作成し、上記の工程を必要回数繰り返
して上記の同一試料に対する異なる試薬の反応部の分布
状態図を作成することを特徴とする組織マッピング方
法。
【請求項２】組織試料上の一点の情報を測定する測定
装置を設け、上記試料を載置して２次元的に移動するス
テージを設け、このステージを移動させながら前記測定
装置からの測定信号を入力して上記試料上の多数点から
なる２次元情報を蓄積させるメモリを設け、このメモリ内に、上記の同一組織試料を各試薬毎に反応
せしめて２次元方向に走査して前記測定装置により得た
各試薬反応部の分布状態の各データをそれぞれ各試薬毎
に記憶せしめる複数の各分割メモリを備え、前記複数の各分割メモリのデータのうちから２つの異な
る分割メモリのデータの分析値を演算する演算装置を設
け、前記メモリ内の各分割メモリのデータに基づいて各試薬
毎の分布状態図を作成すると共に前記演算装置により演
算された分析値に基づいて分布状態図を作成する画像処
理装置を設けてなることを特徴とする組織マップ分析装
置。
【請求項３】前記複数の各分割メモリが、物質Ａに特
異的な試薬Ａ’を反応させた組織試料を２次元方向に走
査して前記測定装置により得た上記試薬Ａ’反応部の分
布状態のデータを記憶する第１メモリと、物質Ｂに特異
的な試薬Ｂ’を反応させた同一の上記組織試料を２次元
方向に走査して前記測定装置により得た上記試薬Ｂ’反
応部の分布状態のデータを記憶する第２メモリと、物質
Ｃに特異的な試薬Ｃ’を反応させた同一の上記組織試料
を２次元方向に走査して前記測定装置により得た上記試
薬Ｃ’反応部の分布状態のデータを記憶する第３メモリ
と、から構成してなることを特徴とする請求項２記載の
組織マップ分析装置。
【請求項４】前記ステージに、同一組織試料を前記ス
テージの所定位置に試料位置決め手段を設けてなること
を特徴とする請求項２又は３記載の組織マップ分析装
置。