JP2005265717A

JP2005265717A - 組織試料分析装置

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Publication number: JP2005265717A
Application number: JP2004081169A
Authority: JP
Inventors: Denetsu Sudo; 伝悦須藤; Jiyuujin Yoda; 充仁依田
Original assignee: Yamato Scientific Co Ltd
Current assignee: Yamato Scientific Co Ltd
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: JP4405837B2

Abstract

【課題】２回目以降のステージ設定位置の位置合せに時間がかからず測定作業が迅速に始められるようにする。
【解決手段】組織試料分析装置１の画像表示装置２７に、少くとも、検査試薬を用いない１回目と検査試薬を用いた２回目の同一組織試料上を、点の状態で測定装置７によって測定した１点、１点の測定情報と位置情報の外に、１回目に測定したスキャニングステージ５のステージ位置を特定するステージ設定位置を記憶し、その位置情報を画面表示する一方、原点復帰させた前記スキャニングステージ５をステージ設定位置に位置決めした時に、１回目の位置情報に対して２回目に得られるステージ設定位置の位置情報の差を読みとり、１回目のステージ設定位置の位置情報として画面表示させる位置表示制御部２５を備えるようにする。
【選択図】図１

Description

本発明は、例えば、脳内神経伝達物質や脳内神経調節物質等を細胞レベルで定量化・画像化する組織試料分析装置に関する。

人間の脳には、数千万以上の神経細胞が分布しており、それぞれの細胞内で起こっている化学反応の結果として、喜怒哀楽をはじめあらゆる感情や行動が支配されている。したがって、脳のどの領域でどのような化学反応が起こっているかを細胞レベルで調べることは、脳研究の中心的なテーマとなっている。

脳細胞の化学反応を調べるには、例えば、動物等のスライスした脳細胞に、化学反応を見るため検査試薬を落して反応させ、その反応部の状態を見ることで行なわれる。
特開２００２−２２８６５４号公報

反応部の測定は、検査試薬を用いない状態でステージを移動させながら反応領域を１点、１点測定し、測定が完了した後、ステージを元の位置に復帰させる。次に検査試薬を用いてステージを移動させながら１回目に測定した同一箇所を１点、１点測定し、その測定値の比較検討を行なうものである。

その測定にあたって１点、１点の測定位置は、１回目と２回目が必ず同一箇所であることが、絶対条件となるが、実際には１回目に対する２回目の位置合せに多大の時間を費やし作業効率の改善が求められていたものである。

この点について具体的に説明すると、例えば、１回目の測定が完了した時点で、２回目の測定に備え、組織試料を保持したスライドガラスの位置を設定するために、例えば、スライドガラスにマジック等で印をつけて位置合せ用の印とし、その印の位置をステージを移動させながら、例えば、測定装置の接眼レンズに設けられた位置合せマークに目視によって一致させる。この時のステージ設定位置はＸ座標，Ｙ座標の位置座標として画面表示されるから、そのステージ設定位置のＸ軸とＹ軸の数値をメモしておく。そして、２回目の測定に入る時に、メモしたＸ軸とＹ軸の位置座標となる数値と一致するよう原点復帰させたステージを再び画面表示を見ながら移動させていき数値を一致させることで、２回目測定時の前記ステージ設定位置の位置合せが完了しプログラムされ、そのプログラムに基づく測定が可能となる。

しかしながら、前記したように画面表示を見ながらステージを移動させ、１回目のステージ設定位置のＸ軸，Ｙ軸の位置座標となる数値に一致させた時、実際の測定位置となる測定装置の位置合せマークと組織試料側の位置合せ用の印も同時に一致し位置合せ完了となる筈であるが、実際にはマイクロメートルオーダの高い位置精度が求められるため、測定装置側の各機能部品の加工精度や組立精度の誤差に加え、組織試料をセットするスライドガラスをステージにセットする際のズレによって位置合せマークとステージ側の位置合せ用の印の位置が不一致となってしまうのが現状となっている。

このために、今までは、ステージを原点復帰させた後、再びステージを移動させてステージ設定位置へ向けて位置合せするようになるが、ソフト側となる制御部に記憶された位置情報（画面表示の数値）に対して、ハード側となる実際の測定位置となる位置合せマークと位置合せ用の印は前記理由によってわずかな狂いが発生し２つの条件が同時に一致するには至らず、原点復帰、ステージ設定位置の位置合せを何回も繰返すようになる。その内、偶然に画面表示の数値と位置合せマークと印がそれぞれ一致するようになる。この２つの条件は１回で一致する時もあれば、３０分以上かかってしまう時もある。

これは、ステージを原点復帰させた時に、必ず同一精度で復帰するわけではなく、復帰精度にバラツキがあるため、何回か繰返す内、一致するものと考えられる。

この場合、ソフト側となる制御部の位置情報、即ち、画面表示の数値が一致した時に、位置ずれが起きているハード側となるステージを移動させて測定装置の位置合せマークと組織試料をセットしたスライドガラスの位置合せ用の印を一致させることが考えられるが、今度はソフト側となる制御部側の位置情報となるＸ軸，Ｙ軸の位置座標となる数値が変化し、ステージを移動させた分、１回目に設定されたプログラムの位置情報が変わってしまう問題があった。

そこで、本発明は、装置そのものの加工精度や組立精度、あるいはステージにスライドガラスをセットする際の位置精度に左右されることなく迅速に測定作業に入れるようにした組織試料分析装置を提供することを目的としている。

前記目的を達成するために、本発明は、組織試料を載せるためのスキャニングステージと、そのスキャニングステージを前後・左右に移動させるステージ駆動コントロール装置と、前記スキャニングステージを移動させながら、少くとも検査試薬を用いない１回目と検査試薬を用いた２回目の同一組織試料とを、点の状態で１点、１点測定する測定装置と、その測定装置の測定時の１点、１点の測定情報とその場所の位置情報を記憶し、検査試薬を用いない状態の測定値と検査試薬を用いた測定値を分析しその分析値に基づき１点、１点からなる分布状態マップ図を表示する画像表示装置とを有し、前記画像表示装置は、前記１点、１点の位置情報とその場所の測定情報の外に、１回目の測定時の前記スキャニングステージの位置を特定するステージ設定位置を記憶しその位置情報を画面表示する一方、前記スキャニングステージの原点復帰後、再びスキャニングステージを移動しステージ設定位置に位置決めした時に、１回目のステージ設定位置の位置情報に対して２回目に得られるステージ設定位置の位置情報の差の有無を判定し、差がないと判定した時は２回目のステージ設定位置座標を１回目のステージ設定位置座標とみなして１回目のステージ設定位置の位置情報の画面表示をそのまま保持し、差があると判定した時は、１回目のステージ設定位置の位置情報を画面表示させる位置表示制御部を備えていることを特徴とする。

本発明によれば、１回目の測定が終って２回目の測定に入る時に原点復帰させたスキャニングステージを移動させステージ設定位置に位置決めした時に、位置表示制御部によって１回目のステージ設定位置の位置情報に対して２回目に得られるステージ設定位置の位置情報を判定し、差がないと判定した時は、２回目のステージ設定位置座標を１回目のステージ設定位置座標とみなして１回目のステージ設定位置の位置情報の画面情報をそのまま保持することができる。この結果、測定が可能となる。

また、位置情報の判定に、差がありと判定した時は、１回目のステージ設定位置の位置情報を画面表示させることができるため、いずれの条件下でも測定作業を迅速に開始することができる。

本発明は、前記スキャニングステージの位置を特定するステージ設定位置を、組織試料を載せる透明な試料セット板に設けられた位置合せマークと測定装置側に設けられた位置合せマークとを目視によって正確に一致させることができるようにする。

［実施例１］
以下、図１乃至図９の図面を参照しながらこの発明の実施形態について具体的に説明する。

図１及び図２を参照するに、本実施の形態に係わる組織試料分析装置（MapAnalyzer）１は、落射型蛍光顕微鏡３を用いて試料の測光データの２次元分布を求めるものである。顕微鏡３はオートスキャンニングステージ５（以下、「スキャニングステージ」という）、測定装置としての例えばフォトメータ７を有する。

フォトメータ７には、検出器に感度や定量性の上で最も信頼性のあるフォトマルが用いられており、干渉フィルタと測光絞りが検出器の受光前面に挿入されている。励起ビームは、視野絞りと開口絞りによって任意に絞ることができ（測定面での最小スポット：１００倍の対物レンズ使用時０．８μｍφ、２０倍の対物レンズ使用時６μｍφ）、目的とする組織試料としての例えば標本９の微少領域からの光だけを選択して測光することが可能である。スキャニングステージ５には、同一組織試料としての同一標本９をスキャニングステージ５の所定位置に設置するための試料位置決め手段として、例えば図３に示されているように透明な試料セット板１５の隣り合う２側縁を突当てる突当て部材１７がスキャニングステージ５に設けられており、残りの２側縁に設けられたバネ付勢によるおさえ部材１９で試料セット板１５を所定位置に固定するようになっている。

試料セット板１５は、必ずガラスである必要はなく透明板あればよい。試料セット板１５の四隅には＋字状の位置合せマークＰが設けられ、その位置合せマークＰを、後述する測定装置側の十字状の位置合せマークＰ−１に目視によって一致させることで前記スキャニングステージ５の位置を特定するステージ設定位置が得られるようになっている。

スキャニングステージ５は、ステージ駆動コントロール装置２１の操作レバー２３を前後・左右に操作する操作信号と位置表示制御部２５からの位置情報に基づいてＸ軸モータＭＸとＹ軸モータＭＹが駆動しＸ，Ｙ方向への移動制御が可能となっている。ステージ駆動コントロール装置２１の操作信号は位置表示制御部２５が組込まれたインターフェース２６を介してシステムコントローラとなる画像表示装置２７に入力される。

位置表示制御部２５は、例えば、１回目の測定が完了した時点で２回目の測定に備え、前記スキャニングステージ５の位置を特定するステージ設定位置のＸ軸，Ｙ軸の位置座標が位置情報として入力されると、その位置情報を記憶しておき、その位置情報を、例えば、スタート釦２５ａをオンとすることで前記ステージコントロール装置２１へ送る機能に加え、２回目に入力されるステージ設定位置の位置情報と比較検討し、差がありと判定した時は、１回目のステージ設定位置の位置情報として画像表示装置２７に入力するものである。また、位置情報の比較検討時に差なしと判定した時は、２回目のステージ設定位置座標を１回目のステージ設定位置座標とみなして１回目のステージ設定位置の位置情報としてそのまま保持するよう画像表示装置２７に入力するものである。

なお、ステージ設定位置の位置情報は必ずしも測定完了後でなくてもよく、測定前に入力しておくことも可能である。

画像表示装置２７は、例えば、図４に示すように主制御系ＭＣＳ２９と測光データを記憶するためのメモリ３１を有する。

このメモリ３１内には複数の分割メモリ３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃが備えられており、複数の各分割メモリ３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃは、測定すべき同一組織試料としての同一標本９を１回目は検査試薬なし、２回目以降は検査試薬を用いて反応させ、その反応部をスキャニングステージ５を介してＸＹ方向の２次元方向に走査してフォトメータ７により測定して得た各試薬反応部の分布状態の各データ（測定位置座標データ、蛍光強度データ）を試薬なしと、試薬ありの状態でそれぞれ記憶させるものである。

複数の各分割メモリ３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃとしては、例えば、試薬なしの組織標本９をＸＹ方向に走査してフォトメータ７により得た反応部の分布状態のデータを記憶する第１メモリ３１Ａと、試薬を用いて反応させた同一の上記組織標本９をＸＹ方向に走査してフォトメータ７により得た反応部の分布状態のデータを記憶する第２メモリ３１Ｂとの外に、さらに試薬を重ねて使用する場合には、第３メモリ３１Ｃというように複数設けられるようになる。

また、画像表示装置２７には、データや指令を入力するためのキーボード等の入力装置３３と、ＣＲＴ等の表示部３５が設けられている。表示部３５には、前記試料セット板１５の位置合せマークＰと画面を見ながら測定スタート位置の位置合せができるよう十字状の位置合せマークＰ−１が設けられている。この場合、顕微鏡３の接眼レンズ３ａ側に設けることも可能である。さらに、前記の複数の各分割メモリ３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ、…のデータのうちから２つの異なる分割メモリ３１のデータ間の差や比などの分析値を演算する演算装置３７が設けられ、その演算装置３７により演算された分析値に基づいて点で表わされた分布状態図、組織マップ図が作成され、図９に示すように表示部３５に表示されるようになっている。

なお、前記スキャニングステージ５は、ステージ駆動コントロール装置２１からの指令により、Ｘ，Ｙ方向に０．２５μｍ以上のステップ幅で自由に走査する。走査速度は１００測光ポイント／秒であり、走査範囲は１４０ｍｍ×１４０ｍｍ以内で任意に選択することができる。標本９を一定の速度で移動させながら、各測光ポイントの蛍光強度の測定が可能となる。

図５は、測定装置となるフォトメータ７の測定原理を示したもので、ハロゲンランプ４１から出た光は、集光レンズ４２、熱遮断フィルタ４３、シャッター４４、開口絞り４５、視野絞り４６を介して光束が絞られ、ダイクロイックミラー４７により反射され、対物レンズ４８を介して標本（組織試料）９に集光される。試料により反射された光、または照射された光により励起された蛍光は、対物レンズ４８を介しダイクロイックミラー４７を通過し、測定系にはいる。測定系では、投影レンズ４９、シャッター４４、赤外線カットフィルタ５０、バンドパスフィルタ（干渉フィルタ）５１、測光絞り５２を介しフォトマル（光電子増倍管）５３に入り、光量が測定される。

このように構成された分析装置１によれば、まず、検査試薬が用いられていない標本９がセットされた試料セット板１５をスキャニングステージ５にセットした後、そのスキャニングステージ５を例えば、左右方向となるＸ方向へマイクロ単位で間欠的に移動させながら１点、１点測定していき、最終端になった位置で前後方向となるＹ方向へ１段移動させた後、再びＸ方向へ間欠的に移動させながら１点、１点測定する走査を繰返すことで、測定領域の１点、１点の位置情報と測定情報が記憶される。

ここで、例えば、１回目の測定が完了し、検査試薬を用いた２回目の測定に入る前に、標本９（組織試料）の位置決めを行なう。

まず、試料セット板１５に設けられた４つの位置合せマークＰの内、１つを選択し、表示部３５の画面表示を見ながらその表示部３５に設けられた十字の位置合せマークＰ−１にスキャニングステージ５を移動させながら試料セット板１５の位置合せマークＰを近づけていき、目視によって各マークＰ，Ｐ−１を正しく一致させる（図６（ｂ））。この時、画面表示されるＸ軸とＹ軸の位置座標は、例えば、図６（ａ）に示すようにＸ軸：０００１２４，Ｙ軸：０００１２３として表示される。と同時にそのステージ設定位置の位置座標は位置情報として記憶され、そのステージ設定位置を基準として測定情報と位置情報が記憶された１つ目の測定箇所ｎ１，２つ目の測定箇所ｎ２，３つ目の測定箇所ｎ３…というようにプログラムに基づく測定が可能となる。

次にスキャニングステージ５を原点に復帰させる。この時、ＸとＹの位置座標はＸ軸００００００，Ｙ軸００００００となる一方、スキャニングステージ５上の試料セット板１５を取り外し、その標本９に検査試薬を用いて反応させた後、その試料セット板１５を再びスキャニングステージ５上にセットする。続いてスタート釦２５ａをオンとすることで、スキャニングステージ５は記憶された位置座標の情報に基づき移動し、ＸとＹの座標位置の数値と一致した所で停止する。この時、偶然に表示部３５の位置合せマークＰ−１と試料セット板１５の位置合せマークＰが一致した時は位置表示装置２５が働いて、ソフト側及びハード側いずれも位置合せ条件がクリアされたとして、２回目のステージ設定位置座標を１回目のステージ設定位置座標とみなし１回目の位置情報が保持され測定が可能となる。

次に、図７（ａ）に示すようにソフト側となる画面表示の位置座標の数値が一致した時に、図７（ｂ）に示すようにハード側となる表示部３５側の位置合せマークＰ−１と試料セット板１５の位置合せマークＰとに位置ずれが起きた時には、その位置からさらに図８（ｂ）に示すように目視によってスキャニングステージ５を移動させて、各位置合せマークＰ，Ｐ−１を正しく一致させる。この位置合せ操作時に、図８（ａ）に示すようにステージ設定位置となる一方のＸ軸は０００１２４から例えば、０００１２６に、Ｙ軸は０００１２３から例えば、０００１１９として画面表示されるようになるが、この時、位置表示制御部２５が働いて位置情報に差がありと判定し、ＸとＹの位置座標を図６（ａ）に示すように１回目のステージ設定位置となるＸ軸の座標を０００１２４に、Ｙ軸の座標を０００１２３にそれぞれ画面表示する。

この結果、ソフト側となるＸ軸とＹ軸の位置座標と実際の測定位置となるハード側の試料セット板１５の位置合せマークＰと測定装置側となる表示部３５の位置合せマークＰ−１がそれぞれ一致する２つの条件がクリアされるため、迅速に速度作業に入れるようになる。

なお、この実施形態では、試料セット板１５の位置合せマークＰは四つある内、１つを選択してステージ設定位置の位置決めを設定する説明となっているが、３点を選択して設定することで、良り正確なステージ設定位置の位置精度が得られるようになる。

本発明にかかる組織試料分析装置全体の概要説明図。本発明にかかる組織試料分析装置全体の概要斜視図。スキャニングステージの概要平面図。本発明にかかる組織試料分析装置の構成ブロック図。本発明にかかる組織試料分析装置の光学系の一例を示す説明図。１回目測定時のＸ軸，Ｙ軸と位置合せマークとの関係を示した説明図。２回目測定時のＸ軸，Ｙ軸が１回目の測定完了時と一致した時の位置合せマークとの関係を示した説明図。２回目測定時の位置合せマークが１回目の測定完了時と一致した時のＸ軸，Ｙ軸との関係を示した説明図。２回目の測定によって得られたマウスの分布状態のマップ図。

符号の説明

１組織試料分析装置
５スキャニングステージ
７フォトメータ（測定装置）
９標本（組織試料）
２５位置表示制御部
２７画像表示装置
Ｐ位置合せマーク
Ｐ−１位置合せマーク

Claims

組織試料を載せるためのスキャニングステージと、そのスキャニングステージを前後・左右に移動させるステージ駆動コントロール装置と、前記スキャニングステージを移動させながら、少くとも検査試薬を用いない１回目と検査試薬を用いた２回目の同一組織試料とを、点の状態で１点、１点測定する測定装置と、その測定装置の測定時の１点、１点の測定情報とその場所の位置情報を記憶し、検査試薬を用いない状態の測定値と検査試薬を用いた測定値を分析しその分析値に基づき１点、１点からなる分布状態マップ図を表示する画像表示装置とを有し、前記画像表示装置は、前記１点、１点の位置情報とその場所の測定情報の外に、１回目の測定時の前記スキャニングステージの位置を特定するステージ設定位置を記憶しその位置情報を画面表示する一方、前記スキャニングステージの原点復帰後、再びスキャニングステージを移動しステージ設定位置に位置決めした時に、１回目のステージ設定位置の位置情報に対して２回目に得られるステージ設定位置の位置情報の差の有無を判定し、差がないと判定した時は２回目のステージ設定位置座標を１回目のステージ設定位置座標とみなして１回目のステージ設定位置の位置情報の画面表示をそのまま保持し、差があると判定した時は、１回目のステージ設定位置の位置情報を画面表示させる位置表示制御部を備えていることを特徴とする組織試料分析装置。
前記スキャニングステージの位置を特定するステージ設定位置は、組織試料を載せる透明な試料セット板に設けられた位置合せマークと測定装置側に設けられた位置合せマークとを一致させて行なうことを特徴とする請求項１記載の組織試料分析装置。