JPWO2012029342A1 - 組織染色方法、組織評価方法および生体物質検出方法 - Google Patents

Abstract

蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する。染色された組織の蛍光輝点の数又は輝度を計測し、当該計測された蛍光輝点の数又は輝度に基づいて、当該組織における生体物質認識部位に対応する生体物質の発現レベルを評価する。

Description

本発明は、組織染色方法、組織評価方法および生体物質検出方法に関する。

病理診断では、まず採取した組織を固定するために脱水し、パラフィンによるブロック化といった処理を行った後、２〜８μｍの厚さの薄片に切り、パラフィンを取り除き、染色して顕微鏡観察を行う。病理医は、この顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化等の形態学的な情報、染色情報をもとに診断を行っている。画像のデジタル化技術の発達に伴い、病理診断の分野においても、顕微鏡やデジタルカメラ等を用いてデジタルカラー画像として入力された病理画像から、病理医が病理診断を行う際に必要となる情報を抽出・計測して表示する自動化された病理診断支援装置が普及してきている。

例えば、特許文献１には、病理画像から細胞核領域及び細胞質領域をそれぞれ特定する核・細胞質分布推定手段と、病理画像から腺腔領域（細胞組織を殆ど含まない領域）を特定する腺腔分布抽出手段と、癌細胞が存在するか否かを判定する癌部位推定手段と、癌の進行度を判定する進行度判定手段と、癌細胞の分布図や進行度等を表示する画像表示手段と、を有する病理診断支援装置が開示されている。

また、特許文献２には、正常部位と癌部位をそれぞれ選択的に染色するような２種類の染料で病理標本を染色し、更にスペクトル画像からランベルト・ベールの法則を用いて染色濃度を評価し、癌細胞の有無を判定する癌細胞の検出方法が開示されている。

しかし、いずれの評価法を用いた場合でも、組織染色方法は従来の色素染色法（例えばヘマトキシリン−エオジン染色）、酵素を用いた色素染色法（例えばＤＡＢ染色）であり、その染色濃度は温度、時間等の環境条件により大きく左右され、病理診断支援装置の正確な定量測定性能を生かし切れていない。

また、色素に代わる標識試薬として感度性能が高い蛍光色素が組織染色の研究に用いられているが（非特許文献１参照）、発明者らが、特許文献３に開示されている細胞識別・定量方法により、有機蛍光色素であるＦＩＴＣを用い作製した病理切片を蛍光顕微鏡下で観察したところ、その発光輝度は極めて弱く、極微量のバイオマーカーを発光レベルによって自動判別することはできず、更なる改善が必要であることがわかった。

特開２００４−２８６６６６号公報 特表２００１−５２５５８０号公報 特開昭６３−６６４６５号公報

「病理と臨床 Ｖｏｌ．２５ ２００７年臨時増刊号 診断に役立つ免疫組織化学」文光堂 ２００７年

これに対し、近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効率的に使用するため、正確な診断法の必要性が高まってきている。病理診断においても、より正確に疾病の診断を行うため、極微量のバイオマーカーを組織切片上で定量的に検出することが求められている。しかし、従来の病理組織染色方法では、安定した定量性能、微量検出性能を得ることは困難であった。

本発明は、上記の従来技術における問題に鑑みてなされたものであり、微量の生体物質（バイオマーカー）を定量的に検出することを課題とする。

上記課題を解決するために、
本発明の第１の態様によれば、
蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法が提供される。

本発明の第２の態様によれば、
蛍光物質を複数集積した蛍光物質集積粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織切片を染色し、
当該染色された組織切片の蛍光輝点の数を計測し、
当該計測された蛍光輝点の数に基づいて、前記染色された組織切片における前記生体物質認識部位に対応する生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法が提供される。

本発明の第３の態様によれば、
病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、
染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、
染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、
前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第１の生体物質認識部位が結合し、かつ、第１の蛍光物質を複数集積した第１の粒子と、前記第１の生体物質認識部位とは異なる第２の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第１の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する第２の蛍光物質を複数集積した第２の粒子とを、用いることを特徴とする生体物質検出方法が提供される。

本発明の第１の態様によれば、蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いることにより、蛍光観察時の１粒子当たりの輝度が高くなるため、微量の生体物質を感度良く、定量的に検出することができる。
本発明の第２の態様によれば、微量の生体物質を定量的に検出することができるのに加え、組織切片から計測された蛍光輝点の数に基づいて、生体物質の発現レベルを評価するので、生体物質の定量評価において、安定した評価結果を得ることができる。
本発明の第３の態様によれば、微量の生体物質を定量的に検出することができるのに加え、互いに異なる生体物質認識部位が結合され、蛍光波長が互いに異なる蛍光物質が複数集積された粒子を用いるから、１つの病理切片から複数の生体物質を検出することができる。

１細胞当たりの粒子数と１細胞当たりの輝度の経時変化を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。

本実施形態では、組織染色方法と、これを利用した組織評価方法および生体物質検出方法とを、提供する。
本実施形態にかかる組織染色方法では、生体物質認識部位が結合した蛍光物質を集積したナノ粒子を用いる。

本実施形態にかかる組織評価方法では、生体物質認識部位が結合された蛍光物質又は蛍光物質集積粒子を用い、その輝点の数に基づいて組織切片上に存在するバイオマーカーと結合した蛍光物質又は蛍光物質集積粒子の数を求める。

本実施形態にかかる生体物質検出方法は、病理切片から生体物質を特異的に検出する方法であり、基本的には、（１）染色試薬を用いて病理切片を染色する工程と、（２）染色後の病理切片から生体物質を検出する工程とを、有している。
特に、（２）の工程では、染色試薬として２種類のナノ粒子を使用する。
一方のナノ粒子には、一定の生体物質認識部位が結合され、かつ、一定の蛍光物質が内包されている。他方のナノ粒子には、一方のナノ粒子の生体物質認識部位とは異なる生体物質認識部位が結合され、かつ、一方のナノ粒子の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する蛍光物質が内包されている。すなわち、各ナノ粒子には、互いに異なる生体物質認識部位が結合され、蛍光波長が互いに異なる蛍光物質が内包されている。そのため、蛍光物質に起因する蛍光波長の違いから、生体物質認識部位に応じた２種の生体物質を検出することができるし、生体物質認識部位の選定から、将来的には現在未確認の抗原を特定することもできると考えられる。
なお、本発明の好ましい実施形態では、２種類のナノ粒子を用いた例を示すが、生体物質認識部位と蛍光物質（蛍光波長）とが互いに異なれば、３種類以上のナノ粒子を用いて３種類以上の生体物質を検出するものとしてもよい。
蛍光物質などの種類や特性、生体物質検出方法の詳細は下記のとおりである。

〔蛍光物質〕
本発明で用いられる蛍光物質としては、有機蛍光色素、量子ドット（半導体粒子）、希土類粒子を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。

有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。

具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。

量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。

具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。

上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ₂、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ₂、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。

希土類粒子としては、例えば、酸化ネオジム、塩化ネオジム、硝酸ネオジム、酸化イッテルビウム、塩化イッテルビウム、硝酸イッテルビウム、酸化ランタン、塩化ランタン、硝酸ランタン、酸化イットリウム、塩化イットリウム、硝酸イットリウム、塩化プラジオセム、塩化エルビウム、オルトリン酸、リン酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム等を用いることができる。

〔蛍光物質を複数集積した粒子〕
本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの（蛍光物質を複数内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子））、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。

本発明で用いられる蛍光物質を複数集積した粒子は、公知の方法により作製することが可能である。
例えば、有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア ８巻 ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の有機蛍光色素を用いることで種々の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。

量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー ３３巻 ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。

量子ドットを外包したシリカナノ粒子は、ケミカル・コミュニケーション ２６７０ページ（２００９）に記載されているＣｄＳｅ／ＺｎＳを５−ａｍｉｎｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌとＡＰＳでキャッピングした粒子を表面に集積したシリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。

有機蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への有機蛍光色素の含浸法を用いて作製することができる。

量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー バイオテクノロジー １９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。

本発明で用いられる蛍光物質を複数集積した粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０〜８００ｎｍ程度のものを用いることができる。平均粒径が３０ｎｍ未満の場合には、集積粒子に含まれる蛍光物質が少なく、目的とする生体物質の定量評価が困難となり、８００ｎｍを超える場合には、病理組織での生体物質との結合が困難となるためである。なお、平均粒径は、４０〜５００ｎｍの範囲内であることがより好ましい。ここで、平均粒径を４０〜５００ｎｍとしたのは、４０ｎｍ未満の場合には、高価な検出系が必要となり、５００ｎｍを超える場合には、物理的な大きさから定量範囲が狭まるためである。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％のものを用いることができる。平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。

〔緩衝液〕
緩衝液とは、抗原−抗体反応に適した環境を安定して維持するための溶媒である。例えば、リン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液等である。

〔生体物質認識部位と蛍光物質を集積したナノ粒子との結合〕
本発明に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光物質集積ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。

生体物質認識部位と蛍光物質集積ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。

また、生体物質認識部位と蛍光物質集積ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。

蛍光物質集積シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が有機蛍光色素の場合でも、量子ドットの場合でも、希土類粒子の場合でも同様の手順を適用することができる。
例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。
具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。

有機蛍光色素集積シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。
例えば、得られた有機蛍光色素集積シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された有機蛍光色素集積シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を有機蛍光色素集積シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。

必要により、有機分子で修飾された有機蛍光色素集積シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。
具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した有機蛍光色素集積シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した有機蛍光色素集積シリカナノ粒子ができる。

蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が有機蛍光色素の場合でも、量子ドットの場合でも、希土類粒子の場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ有機蛍光色素、量子ドット又は希土類粒子を含浸することにより、官能基もつ蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣ又はｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体結合した蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子ができる。

〔染色方法（生体物質検出方法）〕
以下、本発明の染色方法（生体物質検出方法）について述べる。
本発明の染色方法は病理切片組織に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
本発明の染色方法が適用できる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。

１）脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に、病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に、病理切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。

２）賦活化処理
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。
賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０−１３０℃、時間は５−３０分で行うことができる。
次いで、水、ＰＢＳを入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。

３）生体物質認識部位が結合された蛍光物質集積ナノ粒子を用いた染色
生体物質認識部位が結合された蛍光物質集積ナノ粒子のＰＢＳ分散液を病理切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質集積ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。
複数（２種以上）の生体物質を検出しようとする場合は、生体物質認識部位が異なる蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液をそれぞれ調製し、病理切片に載せ、目的とする生体物質との反応を行う。病理切片に載せる際に、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液をあらかじめ混合してもよいし、別々に順次載せてもよい。混合比は特に限定されるものではないが、本発明の効果が表れるには両者の比は１：１〜５：１でよい。
蛍光物質集積ナノ粒子のＰＢＳ分散液には、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含有させてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光物質集積ナノ粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質集積ナノ粒子の除去を行う。ＰＢＳ溶液にはＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含有させてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
組織の形態観察のため、ヘマトキシリン−エオジン染色を行ってもよい。
カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。

４）蛍光顕微鏡下の観察
染色した病理切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、目的とする生体物質の発現レベルを輝点数又は発光輝度に基づいて評価する。
輝点数又は発光輝度の計測では、用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源は及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
輝点数又は発光輝度の計測は、画像解析ソフト、例えば、公開解析ソフトＩｍａｇｅＪ、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトＧ−Ｃｏｕｎｔを用いて行うことができる。

次に、本発明を上記実施形態に基づいて具体的に実施した実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されない。

［手順１：蛍光物質内包粒子の合成］
テトラメチルローダミン（インビトロジェン社製ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）６．６ｍｇと３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬをＤＭＦ中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍｌを４８ｍｌのエタノール、０．６ｍｌのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍｌの水、２ｍｌの２８％アンモニア水と３時間混合した。

上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行った。
得られたテトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行い、２００粒子の粒子径を測定したところ、平均粒径１０４ｎｍ、変動係数は１２％であった。

同様の方法で、Ｃｙ５−ＳＥ（ロシュ社製）を用いて平均粒子径２０、４２、１０３、２０４、４９８ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を得た。

また、同様の方法で、ＦＩＴＣ−ＳＥ（インビトロジェン社製）を用いて平均粒子径１０６ｎｍのＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子を得た。

［手順２：蛍光物質内包粒子への抗体の結合］
手順１で得られた蛍光物質内包シリカナノ粒子（テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子）のそれぞれを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度が１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗体結合用シリカナノ粒子を得た。

一方、抗ヒトＥＲ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去することにより、シリカ粒子に結合可能な還元化抗体溶液を得た。

上記で得られた抗体結合用シリカナノ粒子と還元化抗体溶液とを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。

［手順３：蛍光物質内包粒子を用いた組織染色］
手順２で作製した抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片は、コスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、組織アレイスライドを浸漬する液体をキシレン、エタノール、水の順に置換して洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドは、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。

ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈した各抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を組織切片と３時間反応させた。抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子と反応させた後、組織アレイスライドをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを用いて封入した。

［手順４：蛍光物質内包粒子を用いて染色した組織の輝点計測］
手順３で染色した組織切片についてオリンパス社製ＤＳＵ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフトウェア、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点の計測を行った。
Ｃｙ５の観察は、励起フィルター（６４０／３０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（６６０ｎｍ）、蛍光フィルター（６９０／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
テトラメチルローダミンの観察は、励起フィルター（５５０／２５ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（５７０ｎｍ）、蛍光フィルター（６０５／７０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
ＦＩＴＣの観察は、励起フィルター（４７０／４０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（４９５ｎｍ）、蛍光フィルター（５２５／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
組織アレイスライド中の予めＤＡＢ染色で染色濃度が異なることが予測された８スポットについて、各３０細胞の輝点の数を計測し、１細胞当たりの輝点の数（平均値）を求めた。また、同様に、８スポットについて、各３０細胞の発光輝度を計測し、１細胞当たりの発光輝度（平均値）を求めた。

［比較例：蛍光色素単体を用いた組織染色］
比較例として、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣ蛍光色素単体に抗ヒトＥＲ抗体を結合させたものを用い、手順３と同様の方法で組織アレイスライドを染色し、手順４と同様の方法で組織の輝点を計測した。
具体的には、組織アレイスライド中の８スポットについて、各３０細胞の輝点の数及び発光輝度を計測し、１細胞当たりの輝点の数及び１細胞当たりの発光輝度を求めた。

［実験結果Ａ］
まず、標識体に含まれる蛍光色素の違い（すなわち、発光波長の違い）によるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度の差について検討した。
表１に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０３ｎｍ）、テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０４ｎｍ）、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０６ｎｍ）のそれぞれを用いた場合に計測された１細胞当たりの輝点数を示す。表１において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、「＋」は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。

表１に示すように、いずれの蛍光物質内包粒子を用いた場合でも、輝点数の差によりバイオマーカーの定量評価が可能となっている。ただし、スポット番号２の組織切片について、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子及びテトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、輝点数を計測可能であったのに対し、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、バックグラウンドレベル以上の輝点は計測されなかった。すなわち、励起波長が長いＣｙ５（励起波長６５０ｎｍ、発光波長６７０ｎｍ）、テトラメチルローダミン（励起波長５５０ｎｍ、発光波長５７０ｎｍ）の内包粒子の方が、ＦＩＴＣ（励起波長４９５ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）の内包粒子と比べて、より微量のバイオマーカーを検出できることがわかる。

［実験結果Ｂ］
次に、標識体の粒子径の違いによるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度の差について検討した。
表２に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径２０、４２、１０３、２０４、４９８ｎｍ）のそれぞれと、Ｃｙ５色素単体（比較例）とを用いた場合に計測された１細胞当たりの輝点数を示す。表２において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、「＋」は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。

表２に示すように、平均粒子径が４２、１０３、２０４、４９８ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、輝点数を計測可能な各スポットにおいて、輝点数の差によりバイオマーカーの定量評価が可能となっている。しかし、平均粒子径が４９８ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、スポット番号６の組織切片において輝点の区別がつかなくなっており、バイオマーカーが高頻度に発現している場合の定量範囲が狭まることがわかる。

また、Ｃｙ５色素単体を用いた場合、平均粒子径２０ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、スポット番号１〜４の組織切片では、バックグラウンドレベル以上の輝点がなく、スポット番号５〜８の組織切片では、周囲の輝点と区別がつかないため、微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価が不可能なことがわかる。

［実験結果Ｃ］
次に、蛍光色素内包粒子と蛍光色素単体とによるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度を輝点数で比較した。
表３に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０３ｎｍ）、テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０４ｎｍ）、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０６ｎｍ）、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣのそれぞれを用いた場合に計測された１細胞当たりの輝点数を示す。表３において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、「＋」は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。

表３から、蛍光色素単体を用いて組織染色を行った場合には、スポット番号１〜４の組織切片では、バックグラウンドレベル以上の輝点がなく、スポット番号５〜８の組織切片では、周囲の輝点と区別がつかないため、微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価が不可能なことがわかる。
一方、標識体として蛍光物質内包粒子を用いた場合には、微量のバイオマーカーに対しても、精度良く定量的に検出することができる。

［実験結果Ｄ］
次に、蛍光色素内包粒子と蛍光色素単体とによるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度を発光輝度で比較した。
表４に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０３ｎｍ）、テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０４ｎｍ）、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０６ｎｍ）、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣのそれぞれを用いた場合に、ＤＳＵ共焦点顕微鏡により取得された画像データに基づいて計測された１細胞当たりの発光輝度を示す。発光輝度の単位はａ．ｕ．（任意単位）である。表４において、「０」は、バックグラウンドレベル以下の発光であることを示している。

表４から、蛍光色素単体を用いた場合と比較して、蛍光物質内包粒子を用いた場合には、より微量なバイオマーカーを検出可能なことがわかる。

以上説明したように、蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いることにより、組織切片を蛍光観察する際の１粒子当たりの輝度が高くなるため、微量のバイオマーカー（生体物質認識部位に対応する生体物質）を感度良く、定量的に検出することができる。

また、蛍光物質を複数内包した粒子を用いる場合には、蛍光物質が粒子に内包されることにより、蛍光物質の耐久性が高まる。

［手順１：蛍光物質集積粒子の合成］
テトラメチルローダミン（インビトロジェン社製ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）（励起波長５５０ｎｍ、発光波長５７０ｎｍ）６．６ｍｇと３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬをＤＭＦ中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍｌを４８ｍｌのエタノール、０．６ｍｌのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍｌの水、２ｍｌの２８％アンモニア水と３時間混合した。

上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行った。
得られたテトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行い、２００粒子の粒子径を測定したところ、平均粒径１０４ｎｍ、変動係数は１２％であった。

同様の方法で、Ｃｙ５−ＳＥ（ロシュ社製）（励起波長６５０ｎｍ、発光波長６７０ｎｍ）を用いて平均粒子径１０３ｎｍのＣｙ５集積・シリカナノ粒子を得た。

［手順２：蛍光物質集積粒子と量子ドットへの抗体の結合］
手順１で得られた蛍光物質集積シリカナノ粒子（テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子）のそれぞれを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度が１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗体結合用シリカナノ粒子を得た。

一方、抗ヒトＥＲ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去することにより、シリカ粒子に結合可能な還元化抗体溶液を得た。

上記で得られた抗体結合用シリカナノ粒子と還元化抗体溶液とを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質集積シリカナノ粒子を得た。

インビトロジェン社製ＱＤ６５５抗体標識キット（Ｑ２２０２１ＭＰ）を用いて量子ドットに抗ヒトＥＲ抗体を結合させた。抗体の結合はキットの処方にしたがい、ＳＭＣＣによる量子ドットの活性化、ＤＴＴによる抗体の還元工程を経て、量子ドットと抗体の結合反応を行うことで行った。

［手順３：蛍光物質集積粒子と量子ドットを用いた組織染色］
手順２で作製した抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質集積シリカナノ粒子と抗ヒトＥＲ抗体結合・量子ドットを用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片は、コスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、組織アレイスライドを浸漬する液体をキシレン、エタノール、水の順に置換して洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドは、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。

ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈した各抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質集積シリカナノ粒子又は抗ヒトＥＲ抗体結合・量子ドットを組織切片と３時間反応させた。その後、組織アレイスライドをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを用いて封入した。

［手順４：染色した組織の輝点、輝度、粒子数計測］
手順３で染色した組織切片についてオリンパス社製ＤＳＵ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフトウェア、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点の計測を行った。
Ｃｙ５の観察は、励起フィルター（６４０／３０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（６６０ｎｍ）、蛍光フィルター（６９０／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
テトラメチルローダミンの観察は、励起フィルター（５５０／２５ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（５７０ｎｍ）、蛍光フィルター（６０５／７０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
ＱＤ６５５の観察は、励起フィルター（３５０／５０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（４００ｎｍ）、蛍光フィルター（５９０ｎｍのロングパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
組織アレイスライド中の予めＤＡＢ染色で染色濃度が異なることが予測された８スポットについて、各６０細胞の輝点の数と各輝点の輝度を計測した。

［実験結果Ａ］
まず、蛍光物質集積粒子や量子ドットを用いた場合に得られた各輝点の輝度分布（輝度毎の輝点数）に基づいて、１粒子当たりの輝度を求めた。具体的には、輝度分布から、最も頻度の高い輝度を１粒子当たりの輝度とする。
Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用い、８スポット（各スポットにつき各６０細胞）から輝点を計測した。その結果、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子を用いた測定では輝度８２の輝点数が最も多く、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子を用いた測定では輝度６９の輝点数が最も多く、ＱＤ６５５を用いた測定では輝度６４の輝点数が最も多かった。

表５に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用いた場合の、８スポット全体（６０細胞×８スポット）から計測された各輝点の輝度分布を示す。輝度の単位はａ．ｕ．（任意単位）である。表５は、輝度が０−３０、３１−６０、６１−９０、９１−１２０、１２１−１５０、１５１−１８０、１８１−２１０、２１１−２５５の範囲の輝点数を示している。

表５から、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子では、輝度が６１−９０、１５１−１８０、２１１−２５５の範囲にピークが存在していることがわかる。Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子では、輝度８２の輝点数が最も多いため、輝度１５１−１８０に含まれる輝点は２粒子分の合計輝度であり、輝度２１１−２５５に含まれる輝点は３粒子分の合計輝度であることがわかる。このように、輝度分布に基づいて、蛍光物質集積粒子や量子ドット１粒子当たりの輝度を求めることができる。

［実験結果Ｂ］
次に、実験結果Ａの結果に基づいて、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子では１粒子当たりの輝度を８２、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子では１粒子当たりの輝度を６９、ＱＤ６５５では１粒子当たりの輝度を６４と仮定して、各スポットでの「１細胞当たりの輝度の和」を「１粒子当たりの輝度」で割ることで、各スポットでの「１細胞当たりの粒子数」を求めた。
表６に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用いた場合の、各スポットでの１細胞当たりの粒子数を示す。表６において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示している。

表６に示すように、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれについて、１細胞当たりの粒子数の差によりバイオマーカーの発現レベルを定量的に評価することができる。しかし、より微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価（スポット番号２、３）においては、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子を用いた場合の方が、ＱＤ６５５を用いた場合よりも、検出感度が優れていることがわかる。

［実験結果Ｃ］
次に、蛍光物質集積粒子又は量子ドットを用いて染色した組織における輝点の経時変化について検討した。
手順３で染色した組織切片を作製してから０日、３日、３０日、９０日後に、手順４に従って組織アレイスライド中のスポット番号６の組織切片の６０細胞に含まれる輝点の数と各輝点の輝度を計測した。次いで、実験結果Ｂと同様の方法で、１細胞当たりの粒子数を算出した。また、各輝点の輝度の和を細胞数で割ることにより、１細胞当たりの輝度を算出した。
図１に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用いた場合の、スポット番号６の組織切片について算出された１細胞当たりの粒子数と１細胞当たりの輝度の経時変化を示す。
図１から、１細胞当たりの輝度は、組織切片の作製から時間が経過するにつれて次第に減少しているが、１細胞当たりの粒子数は、組織切片作製後９０日後も安定した数値を示すことがわかる。すなわち、各粒子が発する蛍光輝度は次第に減少するが、組織切片に存在するバイオマーカーと結合した粒子の数は変化しない。したがって、１細胞当たりの粒子数の差に基づいてバイオマーカーの発現レベルを定量的に評価することで、より安定した評価結果を得ることができる。

［実験結果Ｄ］
次に、蛍光物質集積粒子や量子ドットを用いて染色した場合と蛍光色素単体を用いた場合とを比較した。
蛍光色素単体を用いた場合の例として、Ｃｙ５、テトラメチルローダミンに抗ヒトＥＲ抗体を結合させたものを用い、手順３と同様の方法で組織アレイスライドを染色し、手順４と同様の方法で組織アレイスライド中の８スポットについて、各６０細胞に含まれる輝点の数と各輝点の輝度を計測した。次いで、実験結果Ｂと同様の方法で、１細胞当たりの粒子数を算出した。

表７に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５、Ｃｙ５、テトラメチルローダミンのそれぞれを用いた場合の、各スポットでの１細胞当たりの粒子数を示す。表７において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の発光がないことを示し、「＋」は、バックグラウンドレベル以上の発光はあるが、輝点の判定はできないことを示している。

表７から、蛍光色素単体での組織染色では、バイオマーカーに対する輝点レベルでの定量評価が不可能であることがわかる。

以上説明したように、組織切片から計測された蛍光輝点の数に基づいて、生体物質の発現レベルを評価するので、生体物質の定量評価において、安定した評価結果を得ることができる。

また、蛍光物質を複数集積した蛍光物質集積粒子を用いることにより、蛍光観察時の１粒子当たりの輝度が高くなるため、微量の生体物質を感度良く、定量的に検出することができる。

［蛍光物質内包ナノ粒子ａ〜ｆの合成］
［合成例１：蛍光有機色素内包シリカ：Ｃｙ５内包シリカナノ粒子の合成］
下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ａ」を作製した。
工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）とテトラエトキシシラン ４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）とを混合した。
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
得られたシリカナノ粒子ａの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径は１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。

［合成例２：蛍光有機色素内包シリカ：ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の合成］
下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ｂ」を作製した。
工程（１）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）２ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）とテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）とを混合した。
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
得られたシリカナノ粒子ｂの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径は１００ｎｍ、変動係数は１５％であった。

［合成例３：量子ドット内包シリカ：発光波長６５５ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子の合成］
下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ｃ」を作製した。
工程（１）：ＣｄＳｅ/ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ６５５）１０μＬとテトラエトキシシラン４０μＬとを混合した。
工程（２）：エタノール４ｍＬ、１４％アンモニア水１ｍＬを混合した。
工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたシリカナノ粒子ｃのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１３０ｎｍ、変動係数は１３％であった。

［合成例４：量子ドット内包シリカ：発光波長５８５ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子の合成］
下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ｄ」を作製した。
工程（１）：ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ５８５）１０μＬとテトラエトキシシラン４０μＬとを混合した。
工程（２）：エタノール４ｍＬ、１４％アンモニア水１ｍＬを混合した。
工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたシリカナノ粒子ｄのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１２０ｎｍ、変動係数は１２％であった。

［合成例５：蛍光有機内包ポリスチレンナノ粒子：Ｃｙ５内包ポリスチレンナノ粒子の合成］
下記工程（１）〜（３）の方法により、「ナノ粒子ｅ」を作製した。
工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン６０μＬ、エタノール１２０μＬに溶解させた。
工程（２）：表面官能基アミノ基で粒径１００ｎｍポリスチレンナノ粒子水分散液（micromod社製）１．５ｍＬを激しく撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（３）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたポリスチレンナノ粒子ｅのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１００ｎｍ、変動係数は５％であった。

［合成例６：蛍光有機内包ポリスチレンナノ粒子：ＴＡＭＲＡ内包ポリスチレンナノ粒子の合成］
下記工程（１）〜（３）の方法により、「ナノ粒子ｆ」を作製した。
工程（１）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）２ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン６０μＬ、エタノール１２０μＬに溶解させた。
工程（２）：表面官能基アミノ基で粒径１００ｎｍポリスチレンナノ粒子水分散液（micromod社製）１．５ｍＬを激しく撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（３）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたポリスチレンナノ粒子ｆのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１００ｎｍ、変動係数は６％であった。

［蛍光物質内包シリカナノ粒子への抗体の結合］
蛍光物質内包シリカナノ粒子ａ〜ｄに対し、以下の手順により抗体結合を行った。
詳しくは、ナノ粒子ａ，ｃに対して工程（１）〜（７），工程（８）〜（９），工程（１２）〜（１４）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ａ，Ｃ」を形成し、ナノ粒子ｂ，ｄに対して工程（１）〜（７），工程（１０）〜（１１），工程（１５）〜（１７）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ｂ，Ｄ」を形成した。

工程（１）：１ｍｇのナノ粒子ａ〜ｄを純水５ｍＬに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
工程（２）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（３）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ａ〜ｄのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
工程（４）：工程（３）で得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ａ〜ｄを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整した。
工程（５）：工程（４）で調整した溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。
工程（６）：反応混合液を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（７）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬＰＢＳを用い再分散させた。

工程（８）：１００μｇの抗ヒトＥＲ抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（９）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液を得た。

工程（１０）：１００μｇの抗ＨＥＲ２抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（１１）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。

工程（１２）：粒子ａまたは粒子ｃを出発原料にして、工程（７）で得られた粒子分散液と工程（９）で得られた還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（１３）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光物質内包シリカナノ粒子Ａおよび粒子Ｃを得た。

工程（１５）：粒子ｂまたは粒子ｄを出発原料にして、工程（７）で得られた粒子分散液と工程（１１）で得られた還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（１６）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１７）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光物質内包シリカナノ粒子Ｂおよび粒子Ｄを得た。

［蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子への抗体の結合］
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ｅ，ｆに対し、以下の手順により抗体結合を行った。
詳しくは、ナノ粒子ｅに対して工程（１）〜（２），工程（５）〜（７）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ｅ」を形成し、ナノ粒子ｆに対して工程（３）〜（４），工程（８）〜（１０）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ｆ」を形成した。

工程（１）：１００μｇの抗ヒトＥＲ抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（２）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液を得た。

工程（３）：１００μｇの抗ＨＥＲ２抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（４）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。

工程（５）：粒子ｅの分散液と工程（２）で得られた還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（６）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（７）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子Ｅを得た。

工程（８）：粒子ｆの分散液と工程（４）で得られた還元化抗ヒトＨＥＲ２抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（９）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１０）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子Ｆを得た。

［蛍光物質への抗体結合］
比較として、抗ヒトＥＲ抗体をＣｙ５に結合させた「色素Ｇ」と、抗ＨＥＲ２抗体をＴＡＭＲＡに結合させた「色素Ｈ」とを、以下の手順により作製した。
詳しくは、工程（１）〜（２），工程（５）〜（６），工程（９）〜（１１）の操作をおこなって色素Ｇを形成し、工程（３）〜（４），工程（７）〜（８），工程（１２）〜（１４）の操作をおこなって色素Ｈを形成した。

工程（１）：１００μｇの抗ヒトＥＲ抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（２）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液を得た。

工程（３）：１００μｇの抗ＨＥＲ２抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（４）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。

工程（５）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整した。
工程（６）：工程（５）で調整した溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。

工程（７）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）２ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整した。
工程（８）：工程（７）で調整した溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。

工程（９）：工程（６）で得られた反応混合物に、工程（２）で得られた還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液をＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（１０）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１１）：ゲルろ過カラムにより過剰のメルカプトエタノールを除去し、Ｃｙ５結合した還元化抗ＥＲ２抗体溶液（色素Ｇ）を得た。

工程（１２）：工程（６）で得られた反応混合物に工程（４）で得られた還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液をＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（１３）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１４）：ゲルろ過カラムにより過剰のメルカプトエタノールを除去し、ＴＡＭＲＡ結合した還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液（色素Ｈ）を得た。

以上の処理により形成した粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈの特性を表８に示す。

［評価実験：（１）粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈを用いた組織染色］
作製した粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈを用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。
染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライド（CB-A712）を用いた。あらかじめＤＡＢ染色によりＥＲおよびＨＥＲ２染色濃度を観察し、（１）ＥＲ発現量が高くてＨＥＲ２発現量も高い、（２）ＥＲ発現量が高くてＨＥＲ２発現量が低い、（３）ＥＲ発現量が低くてＨＥＲ２発現量も低い異なる３種のロットを用意し、それぞれ染色を行った。

（１）：キシレンを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
（２）：エタノールを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
（３）：水を入れた容器に、病理切片を３０分浸漬させた。途中３回水を交換した。
（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（pH6.0）に病理切片を３０分浸漬させた。
（５）：１２１℃で１０分オートクレーブ処理を行った。
（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を３０分浸漬させた。
（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織に載せて、１時間放置した。

（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ａ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｂ１０μＬとを混合し、組織に載せて３時間放置した。
（９）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｃ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｄ１０μＬとを混合し、（８）とは別なスライドの組織に載せて３時間放置した。
（１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｅ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｆ１０μＬとを混合し、（８）および（９）とは別なスライドの組織に載せて３時間放置した。
（１１）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した色素Ｇ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した色素Ｈ１０μＬとを混合し、（８）〜（１０）とは別なスライドの組織に載せて３時間放置した。

（１２）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ３０分浸漬させた。
（１３）：Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。

［評価実験：（２）粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈを用いて染色した組織の輝点計測］
染色した組織切片に励起光を照射して蛍光発光させ、その組織切片からオリンパス社製ＤＳＵ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオンオングストロング社製輝点計測ソフト、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点数および発光輝度を計測した。
Ｃｙ５およびＱｄｏｔ６５５については、励起波長６３３ｎｍ、検出波長６６０ｎｍとした。ＴＡＭＲＡおよびＱｄｏｔ５８５については、励起波長５４３ｎｍ、検出波長５８０ｎｍとして観察を行った。
輝点数は、組織アレイスライド中の８スポットについて各３０細胞の輝点を計測し、その平均値を求めた。発光輝度は、８スポットそれぞれについて視野全体の蛍光強度を合算し、その平均値を求めた。

表９，表１０に、３種のロットと粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈの組合せとに応じた「実験例１〜７」における輝点数および発光輝度の計測結果を示す。

表９から、蛍光有機色素を単独で抗体に結合した実験例４では、蛍光強度が弱くバックグランド光と区別がつかず、標的とする生体物質が検出できなかった。これに対し、蛍光物質内包粒子を用いた実験例１〜３では、蛍光強度が高く、標的とする生体物質の検出が容易に可能となった。
表１０から、ＥＲ２およびＨＥＲ２の発現量の異なる切片を用いた実験例５〜７では、それぞれの発現量に応じて輝点数および蛍光強度が変化しており、蛍光物質，生体物質認識部位が互いに異なる粒子を染色試薬として使用すれば、複数の生体物質の発現レベルを同一切片で計測できることがわかった。

本発明は、微量の生体物質を定量的に検出するのに好適に利用することができる。

Claims (11)

1. 蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法。
2. 請求項１に記載の組織染色方法において、
   前記蛍光物質を複数集積した粒子は、前記蛍光物質を複数内包した粒子である組織染色方法。
3. 請求項１または２に記載の組織染色方法において、
   前記蛍光物質は、蛍光色素、半導体粒子又は希土類粒子である組織染色方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の組織染色方法において、
   前記蛍光物質を複数集積した粒子の粒子径は、４０ｎｍ〜５００ｎｍである組織染色方法。
5. 蛍光物質を複数集積した蛍光物質集積粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織切片を染色し、
   当該染色された組織切片の蛍光輝点の数を計測し、
   当該計測された蛍光輝点の数に基づいて、前記染色された組織切片における前記生体物質認識部位に対応する生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法。
6. 請求項５に記載の組織評価方法において、
   前記染色された組織切片の各蛍光輝点の輝度を計測し、
   前記計測された蛍光輝点の数及び各蛍光輝点の輝度から輝度分布を求め、
   当該輝度分布に基づいて前記蛍光物質集積粒子１粒子当たりの輝度を算出し、
   前記計測された各蛍光輝点の輝度の和及び前記算出された蛍光物質集積粒子１粒子当たりの輝度に基づいて、前記染色された組織切片に結合している蛍光物質集積粒子の粒子数を算出し、
   当該算出された蛍光物質集積粒子の粒子数に基づいて、前記染色された組織切片における前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法。
7. 病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、
   染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、
   染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、
   前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第１の生体物質認識部位が結合し、かつ、第１の蛍光物質を複数集積した第１の粒子と、前記第１の生体物質認識部位とは異なる第２の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第１の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する第２の蛍光物質を複数集積した第２の粒子とを、用いることを特徴とする生体物質検出方法。
8. 請求項７に記載の生体物質検出方法において、
   前記第１の生体物質認識部位が抗ヒトＥＲ抗体であり、
   前記第２の生体物質認識部位が抗ＨＥＲ２抗体であることを特徴とする生体物質検出方法。
9. 請求項７または８に記載の生体物質検出方法において、
   前記第１の蛍光物質および前記第２の蛍光物質が、蛍光有機色素または量子ドットから選択されることを特徴とする生体物質検出方法。
10. 請求項７〜９のいずれか一項に記載の生体物質検出方法において、
    前記生体物質を検出する工程では、前記生体物質の発現レベルを輝点数の計測によりおこなうことを特徴とする生体物質検出方法。
11. 請求項７〜９のいずれか一項に記載の生体物質検出方法において、
    前記生体物質を検出する工程では、前記生体物質の発現レベルを発光輝度の計測によりおこなうことを特徴とする生体物質検出方法。

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