JP2006519376A - 免疫組織化学、免疫細胞化学および分子細胞遺伝学のための標準 - Google Patents

Abstract

本発明者らは、(a)(i)支持媒体；および(ii)支持媒体により支持される量の検出可能実体を含有する参照標準またはその平面切片を提供する工程；ここで検出可能実体は細長い経路を有し、所定の量の検出可能実体が参照標準の横断面の規定された領域に存在する；(b)参照標準、その平面切片、または規定された領域における検出可能実体の存在または量を示す第１の参照シグナルを得る工程；(c)生物学的試料を提供し、生物学的試料、その平面切片、または規定された領域中の検出可能実体の存在または量を示す第２のシグナルを得る工程；および(d)(c)で得られた第２のシグナルに対して(b)で得られた参照シグナルを比較する工程を含む方法を記載する。好ましくは、上記方法は、生物学的試料中の検出可能実体の存在、量または濃度を示すために使用される。

Description

発明の詳細な説明

技術分野
本発明は、細胞学および組織学の分野に関する。詳細には、本発明は、免疫組織化学および分子細胞遺伝学の分野に、詳細には細胞、組織および器官における検出可能実体(entity)の存在または量を測定するための標準物の供給に関連する。

背景
組織学的および細胞学的技術が用いられて、医学的診断の補助として、生検および他の組織試料が分析されている。細胞学は、細胞の全ての正常な成分および異常な成分の構造、ならびにこのような成分の変化、動きおよび変換の研究である。細胞を生存している状態で直接研究するか、または殺傷して（固定して）、例えば包埋、切片化または染色によって、明視野または電子顕微鏡における調査のために調製する。

周知の細胞学的手順の1つは、子宮頸部のガンを検出するために用いられるパパニコロー検査の医学的手順である。擦過、ブラッシングまたはスメアを、膣または子宮頸部の表面から採取し、スライド上に調製して、顕微鏡検査および細胞学的分析のために染色する。細胞の外観によって、それらが正常であるか、疑わしいか、または癌性であるかが決定される。

組織学は、ほとんどの多細胞の植物および動物に見出される、組織と呼ばれる専門的な細胞の群の研究である。組織学的調査とは、組織の死亡および再生ならびに器官の損傷または浸潤に対する組織の反応の研究を包含する。正常な組織は、特徴的な外観を有するので、しばしば組織学的検査を利用して、疾病の組織を同定する。免疫組織化学IHC、およびインサイチュハイブリダイゼーションISHによる分析は、組織学的診断および組織形態学の研究において有用なツールである。

免疫組織化学（IHC）およびインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）の両方とも、検出可能実体に対して結合し得る特定の結合因子を用いることによって試料中の検出可能実体を検出しようとしている。免疫組織化学（IHC）では、特異的な結合因子は抗体を含み、そして検出可能実体は、その中に含まれるポリペプチド、タンパク質またはエピトープを含む。インサイチュハイブリダイゼーション（ISH）では、検出可能実体は、試料中に核酸（DNAおよびRNAを含む）を含み、そして特異的な結合因子は、核酸プローブのようなプローブを含む。このような抗体およびプローブの利用可能性の増大によって、疾病状態の組織および正常な組織の示差的な診断が補助され得る。インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織学的方法は、HarlowおよびLaneに詳細に記載されている（Antibodies：A Laboratory Manual）。

IHCおよびISH技術では、ガラススライドまたは他の平面支持体上に装着された組織切片に対して一連の処理工程を行なって、疾患状態の特定の形態学的指標を選択的に染色することによって強調する必要がある。

従って、例えばIHCでは、試料を個体から採取して、固定して、目的の抗原に対する抗体に対して曝露する。さらなる処理工程、例えば、抗原回復、二次抗体（通常適切な酵素に結合されている）に対する曝露、洗浄、および色素生産性酵素基質に対する曝露などが、抗原結合のパターンを明らかにするために必要であるかもしれない。組織学的物質には一般に以下の2つのカテゴリーが存在する：（a）アルデヒドベースの固定剤で一般に固定されていない、新鮮な組織および／または細胞を含む、調製物、ならびに（b）固定および包埋された組織標本、しばしば保存用物質。

ISHでは、試料を個体から採取して、固定して、目的の核酸に対するプローブに対して曝露する。検出可能実体は代表的には、検出可能な核酸、例えばDNAおよびメッセンジャーRNAを含むRNAを含む。DNA／RNAレベルの検出は、特定の遺伝子の発現のレベルを示し、従ってこれを用いて、細胞、組織、器官または生物体の状態（例えば、疾患状態）を検出してもよい。検出可能実体は核酸であり、代表的には、これが変性されて結合部位が露出する。プローブは代表的には二本鎖または一本鎖核酸、例えば、DNAまたはRNAであり、放射性標識、例えば、³¹P、³³Pもしくは³²Sを用いて標識されるか、または非放射線的に、その非常に多くが当該分野で公知である、ジゴキシゲニンまたは蛍光標識のような標識を用いて標識される。

組織標本を固定および包埋する多くの方法、例えば、アルコール固定が公知である。しかし、最も広範に用いられる固定／包埋の技術は、ホルマリン固定および引き続くパラフィン包埋（formalin−fixation and subsequent paraffin embedding）FFPEを使用する。「典型的な」FFPE IHC染色手順は、以下の工程を包含し得る：組織の切断およびトリミング、固定、脱水、パラフィン浸潤、薄切片への切断、ガラススライドへの装填、焼付け、脱パラフィン、再水和、抗原回復、ブロッキング工程、一次抗体の適用、洗浄、二次抗体の適用−酵素結合、洗浄、酵素色素体基質の適用、洗浄、対比染色、カバーガラスおよび顕微鏡検査。ISHでは同様の工程を行なう。関連の抗原または他の検出可能実体、例えば、このような技術によって検出された核酸の量を次に評価して、これが特定の以前に決定した最小閾値を超え、従って診断的に関連するか否かを決定する。次いで、必要に応じて、個体に対して適切な処置を計画してもよい。

診断のための免疫組織学的染色の例は、図1に示しており、ここでは乳癌抗原HER2について組織を染色する。抗原を発現しない組織は、実質的に抗HER2抗体によっては染色されない（図1A）が、タンパク質を発現する組織は抗HER2抗体によって実質的な程度まで染色される（図1D）。

しかし、このようなIHCおよびISHの技術における主な問題は、試験されている組織中の細胞が抗原を発現するか、または核酸のような検出可能実体が診断的に有意なレベルであるか否か（すなわち、細胞が抗原の発現について「陽性」であるかまたは「陰性」であるか）という正確な決定を行う必要性が生じることである。実験技術の標準化は一般に欠けており、結果の主観的な判定の必要性が生じる。手順のわずかな相違でさえ、最終の染色の結果に影響し得、小さい細胞集団の染色の最終的な解釈は、実験室間で正確に同じではないかもしれない。内部コントロール（陽性もしくは陰性のコントロール、またはその両方を含む）が手順中に含まれる場合でさえ、種々の研究者の間の事前処理および染色のプロトコールの変動によって内部コントロールの変動が生じる。誤差の他の分析上の起源としては、試薬の質および量、抗原回復の有効性、ならびに装置の相違が挙げられる。

これらの問題によって、新規な、別の、予後因子の評価が妨げられ、それらの予後の値に関係する予後因子のほとんどについて矛盾する結果が生じる。

類別および標準化の必要性は、先行技術において多くの方法で取り組まれている。例えば、診断キットは、異なるセットの細胞の顕微鏡写真を種々のレベルの染色で含んでもよい。このキットは、特定のセットの細胞がカットオフまたは閾値ポイントを示す指標を含み、ここでは、細胞が「陽性」の染色に適合するかまたは陽性を超えるか、より低い染色の細胞は「陰性」である。さらに洗練されたキットでは、コントロールのスライド上で既に染色されている、組織または細胞の実際の試料を含んでもよい。例えば、あるキットは、異なるレベルの乳房特異的タンパク質発現を示すFFPE乳癌細胞株の切片を用いたいくつかの参照スライドを備えてもよい。HER2抗原のためのこのような類別システムの例を図1に示しているが、ここでは0または1＋の参照染色レベルが陰性であるとみなされ（それぞれ、図1Aおよび1B）、一方2＋または3＋のレベルはその抗原について陽性であるとみなされる（それぞれ、図1Cおよび図1D）。

染色のパターンまたは分布に関する書面の説明が、分析を補助するために含まれてもよい。例えば、スコア0（陰性）：染色は観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の10％未満で観察される。スコア1＋（陰性）：10％を超える腫瘍細胞において、かすかなまたはわずかな認知可能な膜染色が検出される。細胞は、膜の一部でのみ染色される。スコア2＋（弱い陽性）：弱〜中程度の完全な膜染色が10％を超える腫瘍細胞で観察される。スコア3＋（強度に陽性）：強力な完全な膜染色が10％を超える腫瘍細胞で観察される。

しかし、参照レベルの染色を確立することはこのようなキットで可能であるが、試料自体において一定の質の染色を達成することはかなり困難である。これは、不均一な組織物質、手順の困難かつ複雑な性質、試薬の質のバラツキ（抗体／プローブの親和性および特異性を含む）、および実施者が行なう解釈の主観的性質を含む、種々の異なる要因から生じる。さらに、試料染色における他のバラツキの原因としては、組織試料が収集、処理および貯蔵される条件、エピトープ回復手順の変動、ならびに酵素触媒性色素原沈殿(enzyme catalyzed chromogen precipitation)が挙げられる。

これらの問題を解決する試みとしては、先行技術では、診断キットと共に、種々のレベルの関連抗原（または核酸）の発現を有する無染色の組織または細胞の参照セットが包含されることが公知である。参照を構成する細胞は、公知の疾患のおよび疾患でない個体由来、または抗原もしくは関連の検出可能な核酸を正常レベルよりも高いレベルで発現するが臨床上は疾患ではない個体由来の生検試料（すなわち、組織試料）を含んでもよい。さらに、組織培養細胞を、発現ベクターでトランスフェクトして、抗原または検出可能な核酸を種々のレベルで発現可能であるようにしてもよく、これを参照標準としても用いることができる。参照セットは、固定されホルマリン包埋されるが、そうでなければ未染色であり、パラフィンに包埋されている細胞を含むスライドを備える。次いで、このスライドは、抗原（または検出可能な核酸）の染色のレベルおよびパターンを明らかにするために試料と平行して処理される。最終的に試料を参照セットに比較して、タンパク質または核酸の発現−レベルが診断上有意であるか否かを決定する。

細胞化学において参照細胞として現在用いられている細胞株の例としては、HER2陽性細胞株SK-BR-3、エストロゲンレセプターER陽性およびプロゲステロンレセプターPR陰性およびp53陽性HCC70細胞株、PR陽性およびER陰性HCC2218細胞株、上皮増殖因子レセプター（EGFR）陽性NCI-H23細胞株、前立腺特異的抗原（PSA）およびアンドロゲンレセプター陽性MDA PCA 2b細胞株、ならびにサイトケラチン19およびp53陽性HCC38細胞株が挙げられる。多くのヒトおよび非ヒト細胞株は、種々の生物体を通じて入手可能である。

しかし、抗原または検出可能な核酸を種々の段階的なレベルで発現する組織および細胞を特異的に同定して、使用のためにそれを得る必要があるという点で、このような参照標準にともなう問題が存在する。組織培養細胞を用いる場合、該当の遺伝子を最初にクローニングし、次に適切な発現ベクターを設計して構築する必要がある。次いでこれらのベクターを、細胞中にトランスフェクトして、遺伝子の発現を正しいレベルに調節する必要がある。細胞株は継続的に、そして多くの研究室で成長するので、タンパク質発現のレベルは経時的に変化し得、研究室の間で同じタンパク質またはmRNAの発現は有さないかもしれない。一過性にトランスフェクトされた細胞株も安定なトランスフェクトされた細胞株も両方とも増殖中に変化し易く、標的の発現の変化を生じ、結果として染色のレベルおよびパターンが変化する。

さらに、診断キットには潜在的に有害な生物学的物質を含む必要があるという問題がある。規制上および倫理上の問題は、ヒト由来の物質の使用に伴う；このようなヒトの物質は単一の供給源から大量に得ることは困難であり、プールする必要があるかもしれず、それによってさらにバラツキが生じる。

公知の他の技術としては、ガラススライドに結合されている、ポリマーゲルから構成される参照ドットの使用が挙げられる。ポリマー物質は染色されるべき関連のエピトープを含む。WO 00／62064およびSompuramら、Clin．Chem．，48（3）、p410，2002に記載される品質管理デバイスは、合成ペプチドを含む、代用の分析標的を使用するが、この合成ペプチドは、ガラススライドの表面上に適用され結合される抗体が結合するエピトープの3D高次構造に似ている。

欧州特許1158047は、固定された核酸との高密度の平坦な二次元のアラインメントを含むDNAマイクロアレイまたはDNAチップを記載している。欧州特許1158047は、繊維上に核酸を固定すること、繊維のアラインメントを作製すること、およびこの繊維アラインメントから「スライス（slice）」を作製することによる、このようなマイクロアレイの作製の方法を記載している。このマイクロアレイは、試料中の物質を検出するためのハイブリダイゼーションのために、特にゲノム分析のために用いられ得る。言い換えれば、繊維上に固定された核酸は、プローブとして用いられ、そして欧州特許1158047は、繊維上に固定された核酸の質とは関係しない。詳細には、欧州特許1158047は、類別もしくは標準化の目的のために、マイクロアレイを用いて繊維上に固定された核酸の固定された量もしくは予め決定された量、またはこれに由来するシグナルのレベルを確立することが可能であることを開示も示唆もしない。

要旨
本発明の第１の局面によれば、本発明者らは、：（a）参照標準またはその平面切片(planar section)を提供する工程であって、この参照標準は、（i）支持媒体；およびこの支持媒体によって支持される量の検出可能実体を含み、この検出可能実体は細長い通路を有し；この検出可能実体の所定の量がこの参照標準の横断面の規定の領域に存在する工程；（b）参照標準、その平面切片、または所定の領域における検出可能実体の存在または量の指標である第一の参照シグナルを得る工程；（c）生物学的試料を提供して、この生物学的試料またはその成分中の検出可能実体の存在または量の指標である第２のシグナルを得る工程；（d）（c）において得られた第２のシグナルに対して（b）において得られた参照シグナルを比較する工程：を包含する方法を提供する。

本発明の第２の局面によれば、本発明の第１の局面に従って生物学的試料における検出可能実体の存在、量または濃度の指標を得る方法であって、参照シグナルを第２のシグナルと比較してこの試料中の検出可能実体の存在、量または濃度を決定する方法が提供される。

好ましくは、参照標準またはその平面切片を、この生物学的試料と同じ1つ以上の工程または条件、好ましくは実質的に全てに供する。

好ましくは、参照標準またはその平面切片は以下の工程の1つ以上、好ましくは全てを通じて処理される：スライド上に装填する工程、焼付け、脱パラフィン処理、再水和、抗原回復、ブロッキング工程、抗体への暴露、一次抗体への曝露、核酸プローブへの曝露、洗浄、二次抗体−酵素結合体への暴露、酵素基質への曝露、色素体基質への暴露および対比染色。

好ましくは、検出可能実体は、ハプテン、生物学的に活性な分子、抗原、エピトープ、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ヘテロ二重鎖、ナノ粒子、ヌクレオチドの合成アナログ、リボヌクレオチドの合成アナログ、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸アナログ、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸アナログ、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、炭水化物、色素、診断上関連する標的：からなる群より選択され、好ましくは、抗原、エピトープ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸もしくは上記のうち2つ以上の複数の任意のもの、または上記の1つ以上の混合物、融合物、組み合わせもしくは結合体：からなる群より選択される。

好ましくは、検出可能実体は、HER2、ER、PR、p16、Ki−67およびEGFRタンパク質のいずれか1つ以上、ならびにこれらをコードする核酸を含む。

好ましくは、この方法はさらに、第二の参照標準またはその平面切片を提供する工程と、この第二の参照標準、その平面切片または規定の部分における検出可能実体の量の指標である第二の参照シグナルを得る工程と；第一の参照シグナルおよび第二の参照シグナルに対して（c）で得られた第二のシグナルを比較する工程とを包含する。

好ましくは、検出可能実体の存在および／または量は、結合因子、好ましくは標識された結合因子、好ましくは抗体、好ましくは検出可能実体に特異的に結合し得る抗体、DNAまたはRNAのような核酸、好ましくは検出可能実体に特異的に結合し得る核酸、タンパク質核酸（PNA）、色素、特別な染色液、ヘマトキシリン-エオシン（Haematoxylin−Eosin）（H＆E）、Gomoriメテナミン銀染料（GMS）、過ヨウ素酸−シッフ(Schiff)（PAS）染色液、トリクロムブルー（Trichrome Blue）、マッソントリクローム（Masson's Trichrome）、プルシアンブルー（Prussian Blue）、ギムザ、Diff−Quik、Reticulum、コンゴーレッド（Congo Red）、アルシアンブルー（Alcian Blue）、シュタイナー(Steiner)、AFB、PAP、グラム（Gram）、ムチカルミン（Mucicarmine）、Verhoeff−van Gieson、エラスチカ（Elastic）、カルボールフクシン（Carbol Fuchsin）およびゴルジ染色：からなる群より選択される結合因子によって明らかにできる。

好ましくは、検出可能シグナルは、放射線、光学密度、反射率、放射能、蛍光、酵素活性：からなる群より選択される。

好ましくは、（a）参照標準は、長方形の形状であり、検出可能実体は、参照標準の長軸に沿うかもしくは実質的に平行して配置される実質的に直線状のロッドの形態であるか；または（b）規定の領域は、好ましくは同様の量の検出可能実体を含む参照標準の少なくとも1つの他の横断面に存在するか；または（c）検出可能実体は、細長い通路に沿って実質的に均一の分布を有するか；または（d）検出可能実体は、参照標準の全ての横断する平面切片において実質的に同じ面積、量または濃度で存在するか；または上記の任意の組み合せである。

好ましくは、支持媒体は、包埋媒体を含み、ここでは、検出可能実体が包埋され、この包埋媒体は好ましくは、氷、ワックス、パラフィン、アクリル樹脂、メタクリル酸樹脂、エポキシ、Epon，Araldite、Lowicryl、K4MおよびLR WhiteおよびDurcupan：からなる群より選択される。

好ましくは、検出可能実体は、ポリアミド繊維、セルロース繊維、ポリカルバメート繊維、絹繊維、ポリエステル繊維、ナイロン（Nylon）繊維、レーヨン（Rayon）繊維およびそれらの混紡(blend)からなる群より好ましくは選択される、細長い繊維に対して結合、好ましくは化学結合される。

好ましくは、検出可能実体は、繊維のコアおよび表面部分の両方で実質的に均一である。あるいは、またはさらに、この検出可能実体は、繊維の表面部分では、コア部分よりも大きい量で存在し、好ましくは繊維のコア部分は実質的に検出可能実体を含まない。

好ましくは、検出可能実体は、包埋媒体の細長いチャネルにおいて形成される。好ましくは、繊維またはチャネルは、実質的にその全長にまたがる均一な横断面を有し、好ましくはここでこの繊維またはチャネルは、約0．5μm〜25μm、好ましくは1．5μm〜15μmの直径を有する。

好ましくは、参照標準は、（a）2つ以上の直線繊維もしくはチャネルを実質的に平行な方向で、好ましくは一束として；または（b）2つ以上の異なる検出可能実体であってその各々が個々の繊維またはチャネル中にまたはその上に配置される検出可能実体；または（c）2つ以上の繊維もしくはチャネルであって、各々が同じ検出可能実体を含み、好ましくは各々の上に種々の量の検出可能実体を含む繊維もしくはチャネル；または上記の任意の組み合わせ：を含む。

好ましくは、参照標準の平面切片は、複数の領域を含み、その上に種々の濃度で検出可能実体が存在する。

好ましくは、参照標準の平面切片は、第一の領域を含み、これは検出可能実体を実質的に診断上有意な密度で含み、好ましくはさらに実質的に検出可能実体を含まない繊維またはチャネルを含むコントロールを含む。

本発明者らは、本発明の第３の局面に従って、個体における疾患または状態の確率の指標を得るための本発明の第一または第二の局面による方法を提供する。ここで、生物学的試料中の検出可能実体の存在または検出可能実体の所定の量の存在は、この生物学的試料または試料が採取された個体における疾患または状態の可能性の指標である。

好ましくは、生物学的試料は、細胞、組織または器官を、好ましくはある疾患または状態に罹患していることが疑われる生物体の細胞、組織または器官を含む。

本発明の第４の局面としては、個体におけるある疾患または状態の診断の方法が提供されるが、この方法は（a）その個体から生物学的試料を得る工程；および（b）本明細書に記載のような方法において、生物学的試料またはその成分における検出可能実体の量を参照標準と比較する工程であって；ここでこの個体が生物学的試料または成分における検出可能実体の量がこの参照標準における量と同様であるかそれ以上である場合、この疾患または状態に罹患しているかまたはそれが疑われると診断される工程：という工程を包含する。

本発明者らは、本発明の第５の局面に従って、個体における疾患または状態の処置の方法を提供するが、この方法は、本発明の第四の局面に従う方法で個体における疾患または状態を診断する工程と、この個体に治療剤、好ましくは検出可能実体に結合可能な抗体を含む治療剤を投与する工程とを包含する。

本発明は、第６の局面では、ある手順(procedure)の有効性または首尾(success)を評価する方法を提供するが、この方法は、以下の工程：（a）参照標準またはその平面切片を提供する工程であって、この参照標準が、（i）支持媒体；および(ii)支持媒体によって支持される量の検出可能実体を含み、この検出可能実体が細長い通路を有し；この検出可能実体の所定の量がこの参照標準の横断面の規定の領域に存在し；この検出可能実体の検出可能特性はこの手順の結果として変化する工程と；（b）参照標準上でこの手順を行なう工程と；（c）この検出可能実体の検出可能特性における変化を検出する工程と、を包含する。

好ましくは、このような方法は、試料において行なわれる手順の有効性または首尾を評価するためであり、この手順はこの参照標準または平面切片上でこの試料と実質的に並行して(in parallel)行なわれる。

好ましくは、検出可能実体の検出可能特性は、首尾よい手順の結果として変化し、この検出可能実体の検出可能特性における変化を検出して、この手順が首尾よいことを確認する。

あるいは、またはさらに、検出可能実体の検出可能特性は、不首尾な手順の結果として変化し、この検出可能実体の検出可能特性における変化を検出して、この手順が成功でないことが確認される。

好ましくは、この手順は、インサイチュハイブリダイゼーション手順、免疫組織化学手順、脱パラフィン、抗原回復、ブロッキング、内因性ビオチンブロッキング、内因性酵素ブロッキング、洗浄工程、一次抗体などの顕在化因子とのインキュベーション、二次可視化成分とのインキュベーション、色素体染色、染色情報取得および分析：からなる群より選択される。

この手順は、抗原回復手順であってもよく、そして検出可能実体の検出可能特性は、1つ以上のエピトープのマスキング工程またはアンマスキング工程を包含する。好ましくは、参照標準における検出可能実体が修飾されて、1つ以上のエピトープがマスクされ、そのいくつかまたは全てが首尾よい抗原回復手順ではアンマスキングされる。

この手順は、脱パラフィン手順であってもよく、この検出可能実体の検出可能特性は、脱パラフィン手順後の参照標準における検出可能実体の存在または量を含む。好ましくは、参照標準における検出可能実体は、脱パラフィン媒体において可溶性であり、ここではこの検出可能実体の少なくとも一部、好ましくは全てが、首尾よい脱パラフィン手順後に除去される。

好ましい実施形態では、2つ以上の手順の有効性または首尾は、好ましくは並行して評価される。

本発明の第７の局面では、手順を確証するための参照標準の使用が提供され、ここではこの参照標準は、（i）支持媒体；および（ii）この支持媒体によって支持される量の検出可能実体を含み；この検出可能実体は細長い通路を有し；この検出可能実体の所定の量がこの参照標準の横断面の規定の領域に存在し、そしてこの検出可能実体の検出可能特性はこの手順の結果として変化される。

好ましくは、参照標準を抗原回復の確証標準として、脱パラフィン標準として、ブロッキングの確証標準として、洗浄の確証標準として、一次抗体の確証標準として、二次抗体の確証標準として、較正標準としてまたは診断標準として用いる。

本発明の第８の局面によれば、本発明者らは、本明細書に記載のような方法における使用のための装置と組み合わせて参照標準またはその平面切片を備えるキットを提供するが、ここではこの参照標準は、（i）支持媒体；および（ii）この支持媒体によって支持される量の検出可能実体を含み；この検出可能実体は細長い通路を有し；この検出可能実体の所定の量がこの参照標準の横断面の規定の領域に存在する。

好ましくは、このキットはさらに、検出可能実体に特異的に結合し得る結合因子を備え、この結合因子が参照標準、その平面切片または規定の領域におけるこの検出可能実体の存在または量を示すシグナルを生成する。

本発明者らは、本発明の第９の局面に従って、生物学的試料における検出可能実体の診断上関連する存在または量を決定するための診断キット、本発明の第八の局面によるキットを含む診断キットを提供する。

好ましくは、このキットまたは診断キットは、個体における疾患または状態の症状の少なくとも1つを処置または緩和し得る、好ましくは検出可能実体に対する抗体を含む治療剤を備える。

本発明の第10の局面によれば、各々が参照標準に由来する1セットの2つ以上の平面切片が提供され、この参照標準は、（i）支持媒体；および（ii）この支持媒体によって支持される量の検出可能実体を含み；この検出可能実体は細長い通路を有し；この検出可能実体の所定の量がこの参照標準の横断面の規定の領域に存在し、このセットにおける少なくとも2つの平面切片が種々の量の検出可能実体を含む。

本発明の第11の局面としては、本発明者らは、各々が検出可能実体を含む規定領域を含む、1セットの2つ以上の平面切片を提供するが、この規定領域における検出可能実体の量は、このセットにおける少なくとも2つの平面切片の間で異なり、各々の平面切片は（i）支持媒体と；（ii）この支持媒体によって支持される量の検出可能実体とを含む参照標準に由来し；この検出可能実体は細長い通路を有する。

本明細書に記載される参照標準は、簡便のために「HistoFiber」と呼ばれてもよい。

本発明の実施形態は、一例として添付の図面を参照してここに詳細に記載している。

詳細説明
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の能力内である、化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNAおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に例示されている。例えば、J．Sambrook，E．F．FritschおよびT．Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版、Books 1〜3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F．M．ら（1995および定期補遺；Current Protocols in Molecular Biology，第9、13および16章、John Wiley＆Sons，New York，N．Y．）；B．Roe，J．Crabtree，およびA．Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley＆Sons；J．M．PolakおよびJames O'D．McGee，1990，In situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M．J．Gait（編），1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D．M．J．LilleyおよびJ．E．Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Acdemic Press；Using Antidodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO．I、Edward Harlow、David Lane編、Harlow（1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0−87969−544−7）；Antibodies：A Laboratory Manual Ed Harrow（編集）、David Lane（編集）（1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0−87969−314−2）、1855．Handbook of Drug Screening、Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B．Fernandes編（2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0−8247−0562−9）；ならびにLab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents、and Other Reference Tools for Use at the Bench，Jane RoskamsおよびLinda Rodgers編集，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0−87969−630−3を参照のこと。これらの一般的なテキストの各々が本明細書において参考として援用される。

参照標準
本発明者らは、免疫組織学（IHC）またはインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）の手順を含む、任意の染色手順において試料を標準化および類別するために用いることができる新規な参照標準、ならびに本明細書に記載される参照標準を用いる方法および作製する方法を記載する。本発明者らの参照システムは好ましくは、本質的に「無細胞（cell−free）」であり、そして比較的簡易な手順を用いて製造され得る。

本明細書に記載されるような参照標準は、「標準（standard）」を確立するための簡易な手段、言い換えれば、測定可能な特性の確立された値を提供し、これによって試料または試験項目が判定され得る。それらは、色標準、位置標準、量の標準、質の標準として、または診断標準として用いることができる。

詳細には、本明細書に記載される参照標準によって、試料の状況または状態、またはその試料の任意の成分を決定することが可能になる。いくつかの好ましい態様では、それらによって、ある試料が診断的に関連のレベル、量または濃度の特定の関連抗原を含むか否かを検出することが可能になる。好ましくは、本明細書に記載される参照標準を用いて、組織中、または好ましくは生物学的試料に含まれる細胞中の検出可能実体のレベルまたは量を測定する。

従って、好ましい態様では、参照標準またはその平面切片中の検出可能実体の量は、診断上関連する量または濃度に相当するように予め決定される。

「診断上関連する（diagnostically relevant）」とは、生物学的試料に存在する場合、その試料またはその試料が由来する個体に存在する可能性のある状態または疾患または症状の指標である、検出可能実体のレベルまたは量を、本発明者らは意味する。さらに、これは疾患または状態などに対する感受性を示し得る。「診断上関連する」レベルまたは量の検出とは、その疾患が存在する可能性が高いことを示すのに十分であり得るが、その人がその疾患に罹患していることを医学的に結論付けるためには他の評価が必要であり得る。従って、本発明者らの方法は一般に、試料中の検出可能実体の存在または量の指標を提供することが可能であるが、そしてそれ自体で診断の方法としては扱われなくてもよい。

参照標準中の検出可能実体の正確な量または濃度は、検討されている状況または疾患に依存して変化し得ることが理解される。一般には、参照標準中の検出可能実体の量または濃度は、疾患が生じることが予想されるレベルに対して実質的に相当する。あるいは、またはさらに、参照標準に存在するのはさらに少ない量または濃度の検出可能実体であってもよく、使用者は、実質的な（または量的にこのレベルを上回る）、生物学的試料において検出された任意の量または濃度が、疾患の指標ととられるべきであることなどが分かる。

試料中の検出可能実体のレベル、量などは、好ましい態様では、その中に含まれる細胞または組織の「状態（condition）」または状況の指標であり得る。従って、このようなレベル、量などは好ましくは、細胞または組織が由来する生物体の状態の指標である。この状態は、その検出が所望され得る細胞、組織、器官または生物体の任意の状態であってもよい。細胞などが発達または分化のプログラムの一部のような、正常な生物学的プロセスの一部として取り入れ得る状態が含まれる。「状態」という用語は、生理学的に正常なまたは平穏な状態を包含するが、好ましくは、非生理学的に標準の状態をいう。

好ましい非生理学的に標準の状態としては、疾患状態、または疾患をもたらす任意の状態が挙げられる。好ましくは、「診断上関連するレベル（diagnostically relevant level）」、「診断上関連する量（diagnostically relevant quantiry）」、および「診断上関連する量（diagnostically relevant amount）」という用語は、試料中の検出可能実体のレベル、量（quantity）または量（amount）であって、その試料が採取される個体における状態または疾患の指標であるものを意味すると解釈されるべきである。

診断上関連する量の検出可能実体は、該当の特定の疾患または状態に依存し、標準として確立され得る。当業者は、このような標準を承知しており、疾患また状態に依存してその関連する診断上関連する量を決定することができるということが理解される

本明細書に記載されるような参照標準は、少なくとも2つの成分を含む：（i）関連する検出可能実体の量、および（ii）この検出可能実体を支持する支持媒体。検出可能実体は細長い通路を有し、好ましくは、包埋する媒体において一般に細長い通路を採用する。本明細書において記載されるような参照標準は好ましくは、ブロックの形態である。

好ましい態様では、参照標準は検出可能実体の検出可能量が、参照標準の横断面において、規定の領域、好ましくは参照領域に存在するようになっている。

非常に好ましい態様において、参照標準の横断面に存在する参照領域は、細胞、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞、好ましくは動物細胞、そして最も好ましくはヒト細胞と同様の寸法を有する。すなわち、このような態様における参照領域は、ほぼ同じサイズまたは形状の細胞、またはその両方である細胞を有し、その結果、この参照領域は試料中の現実の細胞を模倣する形状を有する。これによって、試料中の細胞とこのスライスまたは横断面に存在する参照領域との間で容易に直接比較を行うことが可能になる。次いで、使用者は、例えば、細胞の染色のレベルおよび横断面プロフィールの染色のレベルを容易に比較（肉眼で）して細胞が「陽性（positive）」であるか否かを判定することができる。

好ましくは、参照領域は約0．5μm〜25μm、より好ましくは1μm〜20μm、さらに好ましくは1．5μm〜15μmの直径（または最大（greatest）寸法もしくは最大（maximum）寸法）を有する。この寸法は30μmまでであってもよく、ただし好ましくは30μm未満、さらに好ましくは29μm以下、さらに好ましくは28μm以下、さらにより好ましくは27μm以下、さらに好ましくは26μm以下、またはさらに好ましくは25μm以下であってもよい。特に好ましい態様は、0．5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μmの直径もしくは最大寸法、または実質的にそのような直径もしくは最大寸法であるものである。

非常に好ましい態様では、検出可能実体は、参照標準に対して縦方向である細長い通路を有する。「縦方向」という用語は、その長さの方向であるか、その方向に対して沿っているかまたはその方向に関連していることを意味することが理解される。従ってこの細長い通路は好ましくは、参照標準の長さの方向にそって続くかまたは伸長する。

検出可能実体が参照標準に対して縦の方向に配置される好ましい配置を図2Aに示す。他の配置が可能であり、以下にさらに詳細に記載される。

検出可能実体は、その存在および好ましくは量が明らかであり、すなわちその存在は証明可能であり、またはその量は直接または間接的に測定可能であるものである。これは、裸眼で可視であるか、または顕微鏡の使用のような拡大の補助によって可視であるかもしれない。検出可能実体は色素を用いて染色した場合にのみ可視であり得る。包埋されるかまたは支持される検出可能実体は、以下にさらに詳細に記載されるように、種々の形態をとってもよい。検出可能実体は好ましくは、検出可能実体に結合し得、そしてその存在を明らかにし得る結合剤の使用によって検出可能であるものである。この検出可能実体は、詳細には、タンパク質、ペプチドもしくはポリペプチド、またはヌクレオチド、核酸、詳細にはDNAおよびRNAを含み得る。

本明細書に記載される参照標準における使用に適切な検出可能実体に関するさらなる詳細は、本明細書の以降に示す。

好ましくは、参照標準とは、その横断面が、既知のまたは所定の量の検出可能実体を含む規定の領域を含むようになっている。参照標準における検出可能実体の量が既知である場合、その量をその試料中の量と比較して、その試料中のその検出可能実体または好ましくはその試料中に含まれる細胞の量または質を確認することができる。

非常に好ましい態様では、参照標準の薄片または切片をとる。これらの薄片または切片は、本明細書に記載される本発明の一部として取り扱われるべきである。

このような薄片または切片は、図2Cに示されるように、検出可能実体を含む規定の領域を含む。複数の薄片または切片は、参照標準から作製できる。この薄片または切片を、FFPE材料由来の任意の切片同様に処理して検出可能実体を明らかにすることができる。試料と一緒（好ましくは平行して）の参照標準の薄片または切片の処理によって、均質性を確立して、本明細書の前の方で考察したような、プロトコール、材料などの相違に起因する変動を減少または排除する。

好ましい態様では、切片または薄片は、これらの工程のうち1つ以上、好ましくは全てを通じて、好ましくは関連のFFPE切片と平行してとられる。これは図3に図示している。

薄片または切片は、均一な厚みのものである必要はないが、そうであってもよい。染色強度は、薄片の厚みによって変化され得ることも明らかである。例えば、種々の染色強度は、異なる厚みの薄片を用いることによって得ることができる。従って、染色レベルは、切片の厚み、従って、単位面積あたりの繊維物質の量を変化させることによって変化され得る。繊維の長さが均等であるので、これは染色強度を制御する極めて簡易な方法である。

参照標準の用途
上記のように、本明細書において記載される参照標準は、「標準」、言い換えれば、検出可能実体の測定可能な特性の確立された値を確立するための簡易な方法を提供する。試料または試験項目中の同じ、類似または異なる実体の同じかまたは別の特性も測定することが可能であり、その値は比較され得る。

最も一般的な意味では、参照標準によって、検出可能実体の存在を明らかにすることが可能になる。従って、ある目的のためには、参照標準における検出可能実体の存在に関する情報を簡単に得るのに、多くの場合十分である。しかし、他の目的のためには、この検出可能実体の1つ以上の特徴に関する情報が所望され得る。従って、例えば、寸法、量、質、色、方向、位置、反応性（またはこれらのうち任意の2つ以上の任意の組み合わせ）などのような特徴が決定され得る。参照標準はまた、ある方法の1つ以上の手順を確証するためにも用いることができる。

色度標準
ある態様では、検出可能実体の色が検出されるかまたは決定される。従って、例えば、一連の染色実験において色度標準を有することが所望され得る。この場合、本明細書に記載される参照標準は、予め決定された色を有するかまたはそのような色を提供するように染色されている検出可能実体を含むことによって、「標準」色を提供するように用いられ得る。

このような「色度標準」の使用によって、操作者は、染色され得るある試料が「標準」色と同様であるかまたは異なるかを判定することが可能になる。例えば、染色された試料は、陽性の場合、特定の青色を生じることが予想され得、従って、参照標準はこのような青色を有するかまたは青色を生じるように染色され得る検出可能実体を含んでもよい。従って、試料中の色を、参照標準によって提供される青色に対して比較して、この試料が陽性であるとみなされるべきか否かを確認することができる。

さらに、「色度標準」はまた、例えば、光学機械の較正のためにも用いることができる。従って、光学機械の使用の間に生じる色検出における色の偏移（drift）または間違いは必要に応じて、標準色および適切な調節に対するその機械の応答を比較することによって防止または調節され得る。例えば、異なる波長の2つ以上の「標準」色が、さらに正確な較正のための参照標準に含まれてもよい。

位置標準
参照標準内の検出可能実体の位置は、検出または決定され得る。従って、予想される色を含む領域を、操作者によってまたは機械によって検出して、例えば、試料中のグリッド位置の参照ポイントを確認することができる。このような参照ポイントと試料中のポイントとの間の距離を、容易に測定して、参照標準または試料内の距離、面積または体積についての情報を得ることが可能である。参照標準または位置標準は、2つ以上のこのような位置標準、好ましくは3つ以上の位置標準を含んでもよい。同じ色または異なる色の複数の色位置の使用によって、三角形分割を通じてより精度の高い寸法規定、位置決めおよびナビゲーションが可能になる。

量／質の標準
他の態様では、検出可能実体の量が検出されるかまたは決定される。これは、結合剤との反応によって最も容易に達成可能であり、そして結合剤は、この目的のために標識されてもよい。好ましくは、結合剤は、化学量論的な様式で検出可能実体に結合する。次いで、この結合剤による染色の強度によって、検出可能実体の量（quantity）または量（amount）に関する情報が得られる。しかし、単に強度だけでなく、染色の他の特徴が同時に重要であるかまたは有用であることが理解される。

確証標準
本明細書の他の部分に記載される他の用途に加えて、本明細書に記載される参照標準は、ある方法において1つ以上の手順上の工程を確証または検証するために用いられ得る。確証および検証とは、ある手順上の工程の首尾、有効性または効率が測定されるプロセスのことを特に本発明者らは指す。

一般に、本発明者らは、ある手順の確証の方法を開示するが、この方法は、本明細書に開示されるような検出可能実体の参照標準を提供する工程と、この手順をその参照標準またはその一部（詳細にはその薄片または切片）に適用する工程と、その手順の結果として検出可能実体の特性の変化を検出する工程とを包含する。変化される検出可能実体の特性は好ましくは、手順の成功または失敗（または相対的な成功もしくは失敗）の指標であるものである。詳細には、この検出可能実体は、この手順が改変を首尾よく除くような方法で改変され得る。あるいは、またはさらに、この検出可能実体は、この手順によって改変されてもよい。各々の場合に、この改変は、手順の成功または失敗を検出するための手段として容易に検出可能であるものである。

従って、本発明者らは、ある手順の有効性または成功を評価する方法を開示しているが、この方法は以下の工程：（a）本明細書に記載される参照標準を提供する工程であって、この検出可能実体の検出可能な特性がこの手順の結果として変化される工程；（b）この参照標準に基づいてこの手順を行なう工程；および（c）この検出可能実体の検出可能な特性における変化を検出する工程とを包含する。

ある態様では、この検出可能実体の検出可能な特性は、首尾よい手順の結果として変化され、この検出可能実体の検出可能な特性の変化を検出して、手順が成功であることを確認する。あるいは、またはさらに、この検出可能実体の検出可能な特性は、不首尾な手順の結果として変化され、この検出可能実体の検出可能な特性の変化を検出して、この手順が成功でないことを確認する。

本発明者らはまた、本明細書において記載されるような参照標準の用途を、抗原回復確証標準、脱パラフィン標準、ブロッキング確証標準、洗浄確証標準、一次抗体確証標準、二次抗体確証標準、較正標準または診断標準として開示する。この検出可能実体は好ましくは、検出可能であり、この手順の結果、すなわちこの手順が成功かまたは不成功かという結果として変化される特性を含む。

詳細には、本明細書に記載される参照標準は、伝統的なIHC染色手順において使用される任意の1つ以上の工程を確証するために用いられ得る。このような工程としては、パラフィンの除去、抗原回復（AR）、ブロッキング、内因性ビオチンブロッキング（例えば、ビオチンベースの可視化システムが用いられる）、内因性酵素ブロッキング（例えば、ホスファターゼまたはペルオキシダーゼ活性）、1つ以上の洗浄工程、一次抗体のような曝露剤とのインキュベーション、二次可視化成分とのインキュベーション、色原体染色（例えば、酵素触媒化）、染色情報の取得および分析：を挙げることができる。

詳細には、参照標準を用いて、i）特定の染色手順において可視化システムが細胞集団を染色する能力または機能性を確証する工程、ii）特定の染色手順において一次抗体が細胞集団を染色する能力または機能性を確証する工程、iii）陽性に染色された細胞をカウントするための染色閾値強度を規定する工程、iv）2つ以上の染色集団の間の診断閾値強度比を規定する工程、v）または染色プロトコール、例えば、抗原回復、洗浄効率、ペルオキシダーゼ活性のブロッキングおよび二次可視化試薬において個々の試薬の機能を確証する工程：を確証することができる。

非常に好ましい態様では、参照標準は、一次抗体の添加の工程、抗原回復工程、二次可視化試薬の添加、ならびに染色情報の取得および分析のための確証標準として用いることができる。

一般的手順の確証標準
ある特定の態様では、検出可能実体は、ストレプトアビジンまたはアビジンを含んでもよい。ストレプトアビジンまたはビオチンは、細長い通路、例えば繊維に結合されてもよい。次いで、得られた参照標準は特定の試薬の正確な添加、例えば、適当な一次抗体とのインキュベーションのための簡便な指標として用いられ得る。例えば、少量のビオチン化マウス抗体を別に非標識の一次抗体溶液に添加することによって、可視化システムは、適当な一次抗体を特定のスライド上で用いる場合、参照標準陽性を染色する。

別の特定の態様では、検出可能実体は免疫グロブリン、例えばウサギまたはマウスの免疫グロブリンまたは抗体を含んでもよい。免疫グロブリンは、例えば、これらを使用する態様において繊維に結合され得る。二次可視化システムがウサギまたはマウスの抗体を認識および染色する能力はこれによって確証され得る。

さらに別の特定の態様において、検出可能実体は、ハプテン、例えば、DNP（2，4−ジニトロフェニル（DNP）ハプテン）を含んでもよい。適切である他のハプテンとしては：ホスホリルコリン、デキストラン、NIP（4−ヒドロキシ−3−ヨード−5−ニトロフェニルアセチル）、NP（4−ヒドロキシ−3−ニトロフェニルアセチル）、PC（ホスホリルコリン）およびTNP（2，4，6−トリニトロフェニル）が挙げられる。

ハプテンは例えば、これらを使用する態様において繊維に結合し得る。このような手順上の確証標準は、検出システムにおける一次抗体の添加を確証するために用いられ得る。この場合、ある量の抗ハプテン抗体を、一次抗体組成物を「スパイク」するために用いる。一次抗体（抗ハプテン抗体を含む）の添加によって、抗ハプテン抗体が、繊維に結合体化されたハプテンに結合してこれを明らかにすることが可能になる。ハプテンが明らかになれば、一次抗体が試験物に対して適切に添加されていると結論することができる。従って、可視化のシステムは、適当な一次抗体が特定のスライド上で用いられる場合、参照標準を陽性に染色する。

「ハプテン」という用語は、本明細書において用いられる場合、通常それ自体では抗原性ではなく、適切な特異性の抗体と反応し得、より大きい抗原性分子、キャリアまたはスクレッパー（schlepper）に結合体化された場合、このような抗体の形成を誘発し得る低分子を指していることが理解されるべきである。抗ハプテン抗体を用いて一次抗体をスパイクする場合、抗ハプテン抗体は好ましくは、一次抗体と同じ動物の供給源に由来すべきであり、例えば、ウサギ抗抗原抗体の添加を確証するためには、好ましくはウサギ抗ハプテン抗体が用いられるべきである。

切断厚みの標準
参照標準は、パラフィンブロック由来の薄片の正確な厚みを確証する標準として用いられ得る。例えば、正確な厚みのパラフィン薄片がミクロトームによって切断されることが重要であることは、公知である。しかし、温度の変化、用いられるミクロトームまたはブレードの種々のタイプまたは型、実験室にまたがるこのような装置の異なる較正のせいで、ある試料を含むパラフィン薄片の厚みはしばしば、標準化するには困難または不可能であり得る。

この説明による参照標準は、ある試料を含む当該スライドと同じ厚みにスライスされることによって、この手順を確証するために用いられ得る。言い換えれば、試料を含むパラフィンブロックをスライスして、ブロックの形で参照標準と平行して、特定の厚みの薄片を形成する。参照標準の薄片の厚みに依存して、参照標準における検出可能実体は、異なる検出可能な特性、例えば、より高い光学密度、暗さなどを有する。参照標準の厚みと検出可能な特性の値との間の相関が既知であるので、最適の薄片深さに関する検出可能な特性の期待値の目安を使用者に提供することができる。従って、使用者は、スライスされた参照標準における検出可能な特性の値を測定すること、およびそれを期待値と比較することによって、正確な厚みが達成されているか否かを確認する。

抗原回復確証標準
参照標準は、抗原回復確証標準として用いられ得る。この目的のために、本発明者らは、抗原回復手順の有効性または成功を評価する方法を開示するが、この方法は、（a）本明細書に記載される参照標準を提供する工程であって、この検出可能実体の検出可能な特性がこの抗原回復手順の結果として変化され、この検出可能実体の検出可能な特性が1つ以上のエピトープのマスキングまたは脱マスキング工程を含む工程；（b）この参照標準に基づいてこの抗原回復手順を行なう工程；および（c）この検出可能実体の検出可能な特性における変化を検出する工程：という工程を包含する。

非常に好ましい態様では、この参照標準における検出可能実体は、そのいくつかまたは全てが首尾よい抗原回復手順で脱マスクされる1つ以上のエピトープをマスクするように修飾される。

抗原回復（「AR」）手順は、正常には染色され得ないか、または染色レベルが抗原回復プロセスに強力に依存する検出可能実体を含む、参照標準を使用することによって標準化またはモニターされ得る。

検出可能実体は、その抗原性を完全にまたは部分的に失うように修飾され得る。言い換えれば、検出可能実体における1つ以上のエピトープは、人工的にマスクされても天然にマスクされてもよい。正確な抗原回復によってエピトープまたは抗原が脱マスキングされ、引き続く手順における検出可能実体の正確な染色によって明らかになる。

抗原性のマスキングまたは損失（1つ以上のエピトープに影響し得る）は、化学的に影響され得る。例えば、上記と同じ免疫グロブリン修飾繊維は、例えばホルムアルデヒドで固定され得る。詳細には、検出可能実体は、ホルムアルデヒドでの過剰な固定によって「マスクされ」得、その結果、エピトープのほとんどまたは全ての損失、および参照物質における低い拡散が生じる。

当該分野で公知のようなパラホルムアルデヒドまたは任意の他の固定剤も用いることができる。アセチル化、アルキル化、そうでなければ他のマスキングの試薬との誘導体もこの目的のために使用され得る。有機化学の文献からは多くの方法、例えば、シッフ塩基、エステル、エーテルまたはヘミアセタール誘導体を用いるマスキングが公知である。

マスキングはまた、例えば、適切なマスキング抗体または他の結合剤の使用によって免疫学的に影響され得る。従って、参照物質は一次抗体または二次可視化システムのいずれかのために化学的に、および／または免疫学的にマスクされた標的を含んでもよい。

脱マスキングまたは脱保護は、化学選択的抗原回復またはランダム抗原回復のいずれかによって達成され得る。過剰な抗原回復手順を用いる場合にのみ染色される、マスクされた標的も使用することができる。

このような参照手順は、正確な抗原回復の指標として用いられ得る。正確な抗原回復手順は、免疫グロブリンを脱マスキングし、この参照標準のこの態様を染色する。他のタンパク質またはペプチドを有する繊維は、例えば、ホルムアルデヒドで固定され得、これによってその抗原性を完全に失う。このような参照標準は、正確な抗原回復の指標である。正確な抗原回復手順は、免疫グロブリンを脱マスキングし、この参照標準のこの態様を染色する。

脱パラフィン標準
参照標準は、脱パラフィンのための確証標準として、すなわち、パラフィンの除去の工程のために用いられ得る。

この目的のために、本発明者らは、脱パラフィン手順の有効性または成功を評価する方法を開示するが、この方法は、（a）本明細書に記載される参照標準を提供する工程であって、この検出可能実体の検出可能な特性がこの脱パラフィン手順の結果として変化され、この検出可能実体の検出可能な特性が脱パラフィン手順後の参照標準における検出可能実体の存在または量を含む工程；（b）この参照標準に基づいてこの抗原回復手順を行なう工程；および（c）この検出可能実体の検出可能な特性における変化を検出する工程：という工程を包含する。

非常に好ましい態様では、参照標準における検出可能実体は、脱パラフィン媒体に可溶性であり、その検出可能実体の少なくとも一部、好ましくは全てが首尾よい脱パラフィン手順の後に除去される。

従って、例えば二次可視化システムによって検出される、非共有結合され水不溶性の標的を有する参照物質は、それらが染色される場合、脱パラフィンが不十分であることを示し得る。

例えば、伝統的なIHC手順では、トルエンまたは例えばかんきつ油もしくはココナッツ油を用いた洗浄、続いてアルコール／水溶液における再水和によって、脱パラフィンを行なう。従って、このような目的のために用いられる参照標準は、支持媒体内のその位置から容易に離脱または除去または取り除かれる検出可能実体を含み得る。例えば、それらは例えば非共有的手段によって、特定の態様において繊維に対して緩く結合され得る。このような目的のために、検出可能実体は水不溶性であることが望ましい。脱パラフィン工程が適切に行われるならば、この検出可能実体は、二次可視化システムのような試薬によっては明らかにならないはずである。

さらに、色素のようなマーカーがパラフィンに添加されてもよい。このような色素は好ましくは検出可能実体またはその上に検出可能実体が付着している繊維を染色する。不十分な脱パラフィンが行なわれた場合、色素の存在はヒトの眼で容易に見ることができる（または画像解析システムのような機械によって容易に検出される）。これによって、行なわれた脱パラフィンが不十分であることが示される。

ブロッキングの確証標準
本明細書に記載される参照標準はまた、任意のブロッキング工程、例えば、内因性ビオチン活性または酵素活性のような内因性の活性のブロッキングを確証するために使用され得る。

従って、例えば、組織中に天然に沈着しているビオチンまたは他のハプテンは、ブロックされる必要があり、その後にビオチンまたは他のハプテンを用いる可視化システムを使用することができる。内因性ビオチンの存在のために、二次（例えば、ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ）可視化システムが「バックグラウンド」ノイズを生じることがより少ないので好ましい。ブロッキングを確証するために、参照物質は、存在すれば繊維に結合し得る、可視化システムにおいて用いられるビオチン（または他のハプテン、例えば、ジゴキシゲニンもしくはDNP）を含み得る。この参照物質の陽性の染色によって、例えば非反応性の試薬、スライド上での非効率的な混合／拡散、または短すぎるインキュベーション時間に起因して、不十分なビオチンブロッキングが示される。

参照物質はまた、検出可能実体として酵素触媒染色システムにおいて用いられる共有結合された酵素を含んでもよい。用いられる代表的な酵素はペルオキシダーゼまたはホスファターゼである。例えば、検出可能実体は、西洋ワサビペルオキシダーゼを含んでもよい。あるいは、またはさらに、参照標準が繊維を含む場合、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼで修飾されたこのような繊維は、正確かつ有効な内因性ペルオキシダーゼブロッキングを確証するために用いられ得る。参照標準が、最後のペルオキシダーゼ色原体工程後に未染色のままである場合、ブロッキングは効率的であると確認される。

従って、この参照物質の陽性染色は、例えば、非反応性の試薬、可逆性のブロッキング、スライド上での非効率的な混合／拡散、または短すぎるインキュベーション時間に起因して、不十分な潜在性酵素ブロッキングを示す。この物質は、抗原回復参照物質と組合され得る。

洗浄確証標準
参照標準はまた、任意の回数の洗浄工程、例えば、緩衝液を用いる洗浄工程の効率を確証するためにも用いられ得る。参照物質は、有機溶媒に不溶性であり（例えば、トルエン不溶性）、そして一次または二次可視化システムのいずれかについて部分的に水不溶性である検出可能実体を含み得る。標的は、参照物質において共有結合されてはならない。これはイオン対形成もしくは金属錯体結合によって、または単純な吸着作用によって結合され得る。

標的は、洗浄緩衝液が物質に拡散して標的を除去する能力を試験するために高い分子量を有し得る。参照物質（例えば、セルロース繊維）の分子量カットオフ（「MwCO」）は、例えば、孔サイズの選択または固定の程度によって標的のMwと適合されるべきである。

この参照物質の陽性染色は、例えば、洗浄工程の数、用いられる緩衝液のタイプ、スライド上での非効率的な混合、または低すぎる温度もしくは拡散時間のいずれかに起因して、不十分な洗浄を示す。この目的のために、装填された試料組織切片および参照物質は、好ましくは同じ厚みを有するべきである。

あるいは、標的は、参照物質にトラップされた検出可能な高分子量色素と置き換えられてもよい。色素は、効率的な洗浄によって除去され、そして洗浄が不十分または非効率的である場合にのみ存在する。あるいは、部分的に水溶性の物質から構成される繊維（検出可能実体として）を含む参照標準が、用いられ得る。繊維が消失する場合、洗浄は効率的であった。

一次抗体確証標準
参照標準は、任意のインキュベーション工程、例えば、適当な一次抗体を用いたインキュベーションの工程についての標準として用いられ得る。IHC染色における最も重要なヒトによる間違いの1つは、不適切な抗体とのインキュベーションである。

従って、適当な一次抗体の添加またはインキュベーションの確証における使用のための参照標準は、結合パートナーに対して結合（好ましくは特異的に結合）し得る検出可能実体を含み得る。結合パートナーは、検出可能実体に対して結合するかまたは特異的に付着し、従って適当な一次抗体が用いられたことを示す「マーカー」として一次抗体溶液に添加される。一次抗体は、この「マーカー」を含む形態で販売され得ることが理解される。

特定の例では、検出可能実体は、ストレプトアビジンを含んでもよいし、またはストレプトアビジンからなってもよく、そしてこの「マーカー」は、ビオチンを含んでもよいし、またはビオチンからなってもよい。例えば、一次抗体は、参照標準中における検出可能実体、例えば、ビオチンを含むかまたはビオチンからなる検出可能実体に特異的に付着する、ビオチン化された無関係のマウス抗体で補充されてもよい。参照標準の薄片または切片をとれば（好ましい場合）、適当な抗体が用いられた場合、この参照ドットは可視化システムによって陽性に染色される。一次抗体自体がビオチンで修飾され得、「マーカー」として機能することによって、さらなる「マーカー」が厳密には必要ないということが理解される。

二次抗体確証標準
二次抗体添加の確証における使用のために、参照物質は、共有結合したマウスもしくはウサギの抗体、またはその画分を種々の密度で含んでもよい。この参照物質の陽性および段階的な染色によって、二次可視化システムの機能性を確証する。同じ参照物質は、抗原回復工程を確証するために有用な参照物質と組合され得る。

較正標準
段階的な一次または二次の染色のための種々の参照物質の分析以外に、参照システムは、カメラ、光学およびソフトウェアのアルゴリズムの較正に適した持続的な色および物理的形状からなるか、またはそれらを含んでもよい。

従って、さらに別の局面では、参照標準は、任意の装置、例えば、デジタル画像処理装置または任意の自動画像解析システムのためのキャリブレータ（標準物質）として機能し得る。これは、例えば、特定の色、強度または特定の数の事象を規定することによって達成され得る。これは、自動のスキャナーおよび顕微鏡において特に有用である。染色された物質を免疫学的または特別な染色と組み合わせることによって、スライド顕微鏡での方向付けおよびナビゲーションは容易になり得る。

このような参照物質は、染色された領域、対比染色レベルとバックグラウンドとの間のサイズ、色、色スペクトル、境界を規定することを補助し得る。

1つより多い手順上の工程を確証するために用いられ得る参照標準を構築することが可能であることは上記から明らかである。例えば、本発明者らは、任意の方法において1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上の手順上の工程を確証し得る参照標準を開示する。このような参照標準は、上記のような、同じであっても異なってもよい、複数の（または1つより多い）検出可能実体を適切に含み得る。参照標準における検出可能実体の配置は好ましくは、参照標準から得られた薄片または切片が、一列に適切に配置された、1つより多い「ドット」または参照領域を含むようになっている。

このような参照標準は、例えば、9つの異なる参照物質の「スポットアレイ（spot array）」を含む薄片または切片を生じ得る。例えば、それらは、（段階的な染色レベルを生じる）一次抗体についての標的を種々の密度で有するスポット；二次可視化システムのための軽度にかつ段階的に固定された標的を有するスポット（抗原回復工程の一般的確証）；一次抗体のための軽度にかつ段階的に固定された標的を有するスポット（特異的な標的抗原回復工程または染色に必要な「閾値」抗原回復の確証）；二次可視化システムのための「過剰固定された（over fixed）」標的を有するスポット（抗原回復工程の一般的確証）；二次可視化システム（例えば、マウスまたはウサギのAb）のための標的を種々の密度で有するスポット（二次可視化システムの一般的確証）；ペルオキシダーゼ活性および／またはホスファターゼ活性を有するスポット（内因性（endogen）酵素ブロッキング工程の確証）；結合されたビオチンを有するスポット（内因性（endogen）ビオチンブロッキング工程の確証）（例えば、LSABタイプの可視化システムを用いる場合；二次可視化システムのための非共有結合したそしていくらか高分子量の標的を有するスポット（洗浄工程の一般的確証）；別個の、相同な、そして永続的な形状、サイズおよび色を有するスポット（自動化画像解析システムの較正）；を含んでもよい。

非常に好ましい態様では、参照標準は一列の参照「スポット」を患者の試料組織と同じスライド上に含む。このような態様では、確証は画像解析ソフトウェアによって自動的に行なわれることが可能である。

診断標準
非常に好ましい態様では、参照標準は診断標準であるかまたは診断標準として用いられてもよい。これで本発明者らが意味するのは、この検出可能実体は、細胞の状態、好ましくは細胞の生理学的または医学的状態を明らかにする目的で検出されるということである。しかし、ある場合またはより多くの場合には、この検出可能実体の特性の単なる検出は、医学的診断を得るにはそれ自体では不十分であり得ることが理解される。従って、ある場合には、診断を確立するために他の試験を行なうことが所望され得るということが理解される。

参照標準が診断標準として使用される態様では、この検出可能実体は適切には、細胞の健康状態または疾患状態の指標、例えば疾患マーカーのような、細胞の状態の指標を含む。従って、検出可能実体は、関連の試料におけるその存在または量によって、その試料が採取された生物体の状態（例えば、その健康状態または疾患状態）を示し得る。疾患マーカー、詳細には癌マーカーは、以下にさらに詳細に考察される。

好ましくは、参照標準は、その横断面が、ある量の検出可能実体を含む規定の領域を含むようになっている。これは、図2Bの図に示される。参照標準または横断面における検出可能実体の量を、試料中の量と比較して、試料中の量が標準中の量と同一もしくは類似の量で存在するか、または標準中の量よりも少ない量で、または多い量で存在するかを確認することができる。しかし、本明細書に記載される参照標準は、試料中の検出可能実体の存在および／または量を検出するのに最も有用であるが、これは、試料中の検出可能実体が参照標準の検出可能実体と同じであるか、またはそれとは異なるかを示すのにはさらに簡単に用いられ得ると理解される。

参照標準または横断面における検出可能実体の量（quantityまたはamount）は好ましくは、既知であるか予め決定された量である。この量は、以下に詳細に記載されるように、細長い通路に結合されるかまたはそこに保持される量を制御することによって変化され得る。参照標準のスライスまたは切片をとる場合、量の変動はまた、切片またはスライスの厚み（従って、捕獲された検出可能実体の量）を変化させることによっても達成され得る。

非常に好ましい実施形態では、参照標準中の検出可能実体の量は、診断上関連する量を含む。

先行技術と対照的に、正確かつ既知の量の検出可能実体を、記載されるような参照標準に組み込んでもよい。さらに、先行技術に存在するような試料間の変動は克服され得る。その結果が、さらに正確な類別システムである。

ある実施形態では、種々の量の検出可能実体が参照標準に存在する。好ましい実施形態では、参照標準は、別個の細長い通路に、同じ検出可能実体の2つ以上の量を含む。好ましくは、検出可能実体のある範囲の漸増量が、好ましくは算術的な、さらに好ましくは対数的な範囲で提供される。好ましくは、この範囲は、診断上または臨床上関連する量の検出可能実体、すなわち、ほぼその量またはその量を超えて試料中に存在する場合、疾患のまたは疾患になる傾向のある細胞または組織を、その試料が含むかまたは含む可能性が高いことを示す量の検出可能実体を含む。

細胞または組織または他の生物学的な試料中に存在する量と、本実施形態による参照標準との比較によって、特定の試料が特定の検出可能実体に対して「陽性」であるか、または「陰性」であるかの指標が得られる。検出可能実体が疾患抗原、例えばガン抗原を含む（またはガン遺伝子由来の、メッセンジャーRNAを含む、DNA／RNAを発現する）場合、その存在または量は、関連する疾患の診断因子として用いられ得る。従って、本発明者らは、個体における疾患の診断の方法を提供するが、この方法は、この個体由来の生物学的試料における検出可能実体の存在または量（またはその両方）と、本明細書に記載されるような参照標準における量とを比較する工程を包含する。好ましくは、この比較は、参照標準中の臨床上関連する量（すなわち、その量またはそれを上回る量で疾患の存在が示されるか、疑われるか、または診断される、試料中の量）の検出可能実体に対して行なわれる。

特定の実施形態において、検出可能実体は、HER2抗原を含み、細胞または組織は乳房組織を含み、そして診断される疾患または示されるその存在とは、乳癌を含む。この検出可能実体はまた、HER2の代わりに、またはHER2に加えて他の抗原、好ましくは、ER、PR、p16、Ki−67またはEGFR：からなる群より選択される抗原を含んでもよい（また、「検出可能実体（detectable entity）」の節も参照のこと）。これらの任意の2つ以上の混合物が用いられ得る。検出可能実体は、上記のいずれかをコードする核酸、または「検出可能実体」の節で特定されるような任意の検出可能実体を含んでもよい；詳細には、核酸を含むこのような参照標準は、インサイチュハイブリダイゼーションを標準化するために有用である。詳細には、参照標準は、核酸ガンマーカー、例えばDNA／RNAガンマーカー（例えば、ガンmRNAマーカー）を含んでもよい。

好ましくは、参照標準は、臨床上または診断上関連する量の検出可能実体に加えて、陰性コントロール、すなわち、検出可能実体を含まない規定の領域もしくは容積もしくは通路、または検出可能実体を検出不能な量で含む。

診断された疾患は、適切な治療剤の投与によって必要に応じて処置され得る。このような因子または薬物は、このような疾患を処置するために有効であることが公知であるものであってもよい。詳細には、治療剤は、抗体、好ましくはこの検出可能実体に対する抗体を含んでもよい。このような抗体は、参照標準および／または生物学的試料において検出可能実体を染色および決定するために用いられたのと同じ抗体を含んでもよく、またはこれは、その改変体、例えばヒト化抗体、もしくはScFvのような単鎖抗体であってもよい。

詳細には、検出可能実体はHER2を含んでもよく、結合因子は任意の抗HER2抗体を含んでもよく、そして治療剤は、Herceptin（Trastuzumab，Genentech）のようなヒト化抗HER2抗体を含んでもよい。検出可能実体は、HER2核酸、例えば、HER2 RNA、HER2 mRNAまたはHER2 DNAを含んでもよい。検出可能実体は、HER2核酸に結合し得る核酸のような任意の分子を含んでもよく、そして詳細には、HER2核酸の少なくとも一部に相補的な配列を含んでもよい。

HER2およびハーセプチンは、Pegram M，Hsu S、Lewis Gら、Inhibitory effects of combinations of HER−2／neu antibody and chemotherapeutic agents used for treatment of human breast cancers、Oncogene．1999：18：2241〜2251；Argiris A，DiGiovanna M．Synergistic interactions between tamoxifen and Herceptinu．Proc Am Assoc Cancer Res．2000；41：718．Abstract 4565；Pietras RJ，Fendly BM，Chazin VRら、Antibody to HER−2／neu receptor blocks DNA rapair after cisplatin in human breast and ovarian cancer cells．Oncogene．1994；9：1829〜1838；Baselga J，Norton L，Albanell Jら、Recombinant humanized anti−HER2 antibody（Herceptinu）enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2／neu overexpressing human breast cancer xenografts．Cancer Res．1998；58：2825〜2831；Sliwkowski MX，Lofgren JA，Lewis GDら、Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab（Herceptin）．Semin Oncol．1999；26（補遺12）：60〜70；Lewis GD，Figari I，Fendly Bら、Differential responses of human tumor cell lines to anti−p185^HER2 monoclonal antibodies．Cancer Immunol Immunother．1993；37：255〜263およびPegram MD，Baly D，Wirth Cら．Antibody dependent cell−mediated cytotoxicity in breast cancer patients in Phase III clinical trials of a humanized anti−HER2 antibody．Proc Am Assoc Cancer Res．1997；38：602．Abstract 4044．を含む多数の刊行物に記載されている。

他の実施形態では、１つより多い検出可能実体が参照標準中に存在する。詳細には、本発明者らは、単一の参照標準における複数の異なるタイプの検出可能実体を想定している。2つ以上の検出可能実体が参照標準に存在する場合、これらの各々は、同じ1つの細長い通路に存在してもよく、または１つより多い細長い通路が存在してもよい。後者の場合には、この細長い通路または各々の細長い通路は、1つ以上の異なる検出可能実体を含んでもよい。この検出可能実体は、この細長い通路または各々の細長い通路に、同じ量で存在しても、または異なる量で存在してもよい。

従って、2つ以上の異なる検出可能実体は、支持媒体中に支持され得、好ましくは包埋媒体中に包埋され得、その少なくとも1つが一般的に細長い通路にある。好ましくは、種々の検出可能実体の全てが一般に細長い通路にある。この参照標準は、単一または１つより多い量の第一の検出要素、および単一または１つより多い量の第二の検出可能実体を含んでもよい。複数の検出可能実体は、同じまたは異なる量で、参照標準に存在し得る。１つより多い検出可能実体が存在する場合、この参照媒体は好ましくは、少なくとも1つの検出可能実体を診断上または臨床上有意な量（quantityまたはamount）で含む。

従って、この参照標準は、細長い通路中に、ある量の第一の検出可能実体を含んでもよい。この参照標準はさらに、この細長い通路、または第二の細長い通路にある量の第二の検出可能実体を含んでもよい。さらに、この参照標準は、この細長い通路に、または第二のもしくはさらなる細長い通路に、第二の異なる量のこの検出可能実体または各々の検出可能実体を含んでもよい。複数の同じまたは異なる検出可能実体および／またはこのような量は、混合されてもよいし、または空間および／もしくは時間で分離されてもよい。

例えば、検出可能実体は、別のガン抗原、例えばras、または詳細には乳癌抗原、例えば、BRCA1もしくはBRCA2タンパク質と一緒にHER2を含んでもよい。あるいは、またはさらに、この参照標準は、網膜芽細胞腫（Rb）タンパク質のような腫瘍抑制タンパク質のある量を含む。この検出可能実体はまた、核酸、例えば、HER2核酸、および他のガン抗原核酸を含んでもよい。この検出可能実体は、1つ以上のポリペプチド検出可能実体を、1つ以上の核酸検出可能実体と一緒に含んでもよい。

複数の検出可能実体を含む参照標準のこのような実施形態は、試料の試験が１つより多い結合因子を用いて行なわれる適用において有用である。従って、本発明者らは、例えば、抗体／プローブの「バンク（banks）」または「パネル（panels）」を用いる試験における、このような参照標準の使用を想定する。このような試験を用いて、その各々が診断上関連し得る、試料中の種々の検出可能実体の存在もしくは不在、または相対的もしくは絶対的なレベルを検出してもよい。このような相対的または比較の情報は代表的には、単一の存在／不在の試験よりも有用である。この方法での複数の試験を用いて、該当の患者または個体の「プロフィール（profile）」を生成することができる。

ある疾患または状態に罹患している（または罹患が疑われる）個体から生成されたプロフィールを、「正常な（normal）」個体または罹患していない個体の適合するプロフィールに対して比較してもよい。このプロフィール、またはプロフィールを比較することによって得られる情報を用いて、できる最高の治療（「個人に合わせた治療（individualized therapy）」）を選択するという目的でその個体での疾患または状態を診断する（またはその診断を補助する）ことができる。

１つより多い細長い通路が存在する実施形態では、その細長い通路を一束、または１つより多い束に配列することが有利であり得る。細長い通路は、異なる参照ドットおよびクラスターを見出すことを容易にするような方式で配列され得る。例えば、繊維の束の非対称的なパターンは、使用者がスライドを正確に配向することを補助し得る。

単一の検出可能実体を種々の量で、または１つより多い種々の検出可能実体を含む複数の細長い通路の実施形態を図2Cに示す。

いうまでも無く、１つより多い検出可能実体が参照標準に存在する場合、2つ以上の検出可能実体が異なる細長い通路に存在し得る。あるいは、１つより多い検出可能実体が、単一の通路に存在し得る。例えば、その通路が、以下に記載のように、繊維の使用によって規定される場合、１つより多い検出可能実体が繊維に結合体化されても結合されてもよい。各々が単一、2つ以上の検出可能実体を含む複数の繊維を用いてもよい。

この検出可能実体または各々の検出可能実体は、参照標準の細長い通路に存在する；これは、以下にさらに詳細に記載されるような種々の手段によって達成され得る。この細長い通路または各々の細長い通路は、参照標準の少なくとも一部を横切って、好ましくは一端からもう一方へ延びてもよい。例えば、参照標準が上端および下端を含む場合、この検出可能実体または各々の検出可能実体は、その上端から下端に延びる細長い通路に配置されてもよい（または逆も同様である）。

キットおよび診断キット
参照標準、またはそのスライスもしくは切片は、診断キットにパッケージされてもよい。従って、診断標準として用いられる場合の参照標準は、キットとして都合よくパッケージングされ得、このキットは、参照標準またはその平面切片を1つ以上の成分とともに、そして必要に応じて使用説明書とともに備える。この説明書は、詳細には、本明細書に記載されるような、検出可能実体の存在を検出するため、またはその量もしくは濃度を確認するための任意の方法の説明を含む。

キットは、本明細書のいずれかに記載されるように、同じまたは異なる検出可能実体を、同じまたは好ましくは異なる量で含む、2つ以上のスライスまたは切片を含んでもよい。

このキットは、検出可能実体に特異的に結合し得る、抗体のような結合因子を含んでもよい。このキットは、参照標準を備えるミクロトームブロック、その上に装着されたスライスまたは切片を備え得る。このキットはさらに他の試薬、例えば、検出、洗浄または処理の試薬、ならびに使用説明書を含んでもよい。

このキットはさらに、使用の説明書、他の証拠（indicia）、例えば、スコア付け補助、例えば、疾患組織および／または正常な組織のチャートまたは写真を含んでもよい。この証拠は、一般に、生物学的試料中の検出可能実体から期待されるはずのシグナルのレベルを示し、そのレベルが関連する、例えば、診断上関連するレベルになり得る。これは、検出の方法に依存して、写真、顕微鏡写真または光学密度に関連するデータなどを含み得る。陰性の結果を示す証拠も含まれ得る。この証拠はまた、参照シグナルと生物学的試料から検出されたシグナルとの間の分散の量を示し得、これは陽性または陰性の結果について受容可能であるとみなすことができる。複数の参照標準またはその切片がキットに含まれる場合、そのキットに１つより多い証拠が含まれてもよい。

このキットはまた、疾患の少なくとも1つの症状を処置または少なくとも緩和し得る治療剤を含んでもよい。本発明者らはまた、本明細書に記載のような参照標準、またはその切片もしくはスライスを、治療剤と一緒に組み合わせて提供する、

特定の実施形態では、疾患とは、生物学的試料が診断的に関連する量の検出可能実体を含む場合に、個体におけるその疾患の存在が示されるかまたは疑われるものである。詳細には、治療剤は、検出可能実体に対する抗体、またはその検出可能実体に結合し得る核酸、その疾患を処置または予防するのに有効であることが公知である任意の他の治療剤を含んでもよい。例えば、乳癌を検出するためのキットまたは組み合わせは、検出可能実体がHER2抗原またはHER2核酸を含む、参照標準を含んでもよい。このキットはさらにその抗原の検出のための抗HER2抗体を含んでもよく、そしてまた任意の乳癌の薬物、例えばハーセプチン（転移性乳癌患者においてHER2タンパク質を標的するヒト化モノクローナル抗体）をさらに含んでもよい。キットの他の実施形態は、ER、PR、p16、Ki−67またはEGFR：からなる群より選択される任意の抗原を含んでもよい（また、「検出可能実体（detectable entity）」の節も参照のこと）。

好ましい実施形態では、検出可能実体は天然には分子であり（以下の説明を参照のこと）、従って参照標準は実質的に細胞物質を含まない。しかし、ある実施形態では、細胞成分、例えば、細胞の一部（例えば、任意の細胞下の成分または核、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などのような細胞内小器官）または細胞自体の全体が参照標準に組み込まれてもよい。

検出可能実体
検出可能実体とは、その存在および好ましくは量が明らかになり得る、すなわちその存在が、直接または間接的に、実証可能であるか、またはその量が測定可能であるものである。一般には、この検出可能実体は、検出可能なシグナルまたは解明され得るシグナルを、それ自体によって天然に生成できるか、または生成するように刺激された場合に生成できる任意の物質であってもよい。

検出可能実体は、シグナルを単独で、または2つ以上の他の要素と組み合わせて、例えば、顕在化因子、例えば、抗体および／または二次抗体と接触された場合に、生成し得る。この検出可能実体は、いずれかに考察されるように、任意の種々の標識、例えば、当該分野で公知のような放射性標識および非放射性標識を用いて、それ自体が標識されてもよい。この局面のさらなる考察は、以下の「検出および可視化（Detection and Visualisation）」の節に含まれる。

参照標準は好ましくは、検出可能実体を比較的純粋な状態で、すなわち他の分子または化合物から実質的に単離された状態で含む。検出可能実体は好ましくは、検出可能実体が正常には関連し得る細胞成分を含まないか実質的に含まない。例えば、検出可能実体は、単離型で存在してもよい。

検出可能実体は好ましくは、天然には非細胞性であるが、非細胞性の起源である必要はない。このことは、検出可能実体が細胞に由来し得るが、少なくとも1つの他の細胞成分から検出可能実体を単離するために、いくつかの処理、例えば精製または濃縮を好ましくは受けているものであるということを本発明者らは意味する。詳細には、検出可能実体は、例えば、生の細胞物質も細胞全体も含まない。好ましくは、検出可能実体は、実質的な量の細胞構築物、例えば細胞壁、細胞膜、細胞小器官、細胞骨格などは含まない。好ましくはこのような実施形態では、検出可能実体は、「分子（molecular）」成分を、細胞内のそれらの環境に比較して、比較的純粋な状態で含む。

言い換えれば、検出可能実体は好ましくは、非細胞性物質および／または非細胞性成分を含む。検出可能実体は好ましくは実質的な量の細胞物質を含まず、例えばこれは「無細胞（cell−free）」である。この目的のために、検出可能実体の化学合成または組み換え産生が好ましい。

結合因子の性質は検出可能実体に依存するが、非特異的な、または好ましくは特異的な結合因子を含んでもよい。従って、色素のような非特異的な結合因子、例えば、代表的には色織布に対して用いられる色素は、結合因子として使用され得る。しかし、特異的な結合因子が好ましい。

検出可能実体は、「低分子（small molecule）」、例えば、単純な無機化合物または有機化合物を含んでもよい。検出可能実体は、詳細には、ハプテン、例えばジ−ニトロフェノール（DNP）を含んでもよい。この検出可能実体は色素、例えば、蛍光色素を含んでもよい。

高度に好ましい実施形態では、検出可能実体は、核酸、例えば、DNA、RNA、PNAもしくはLNA、またはポリペプチド、例えばタンパク質もしくは抗原、または他のエピトープ含有ポリペプチドを含む。タンパク質などの検出可能実体を含む参照標準が免疫組織化学（IHC）に好ましいが、核酸などを含む参照標準はインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）に好ましい。

検出可能実体が核酸を含む場合、結合因子は詳細には、核酸プローブを含んでもよい。この目的のためには、これは、核酸、例えば、DNAもしくはRNA、またはその誘導体、例えば、ペプチド核酸、PNAもしくはロックされた核酸LNAを含んでもよい。核酸プローブは好ましくは、検出可能実体中の配列に特異的に、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。詳細には、核酸プローブは、検出可能実体中のある配列に相補的な少なくともある配列を含んでもよい。好ましくは、核酸結合因子またはプローブは、一本鎖部分を含むか、または変性されて結合部分を露出する。

検出可能実体が抗原のようなタンパク質を含む場合、この結合因子は好ましくは、タンパク質に特異的に結合し得る任意の分子を含む。詳細には、この結合因子は抗原に特異的に結合し得る抗体（モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても）を含んでもよい。

上記の例では、核酸は代表的には、核酸を含む結合因子によって検出されるが、タンパク質は代表的には抗体によって検出される。しかし、検出可能実体−結合因子の対がタンパク質核酸相互作用に基づいて選択され得ることが理解される。従って、例えば、ジンクフィンガータンパク質、HLHタンパク質などのような核酸結合タンパク質が特異的な核酸配列に結合し得るということは公知である。従って、核酸結合タンパク質は、同族の核酸を含む検出可能実体を検出する結合因子として用いられてもよく、そして核酸は、同族の核酸結合タンパク質を含む検出可能実体を検出する結合因子として用いられてもよい。

好ましくは、検出可能実体は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホスフィレート（phosphylated）ペプチド、リン酸化ペプチド、グルケート（glucated）ペプチド、グリコペプチド、核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドの合成アナログ、リボヌクレオチドの合成アナログ、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸アナログ、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸アナログ、ステロイド、プロテオグリカン、脂質および炭水化物またはそれらの組み合わせ（例えば、タンパク質およびDNA成分の両方、またはエフェクターの対もしくはセットを含む染色体物質であって、1つ以上が、例えば酵素的に別のものから活性型に変換する）、からなる群より選択される。

好ましい実施形態では、検出可能実体は、ポリペプチドまたは核酸を含む。極めて好ましい実施形態では、検出可能実体は適切には、細胞の健康状態または疾患状態の指標のような細胞の状態の指標を含む。

例えば、検出可能実体の存在または量は、細胞が健康、正常または機能的な状態であることを示すように機能し得る。しかし、好ましくは、検出可能実体は、それが細胞の異常な状態、例えば疾患状態の指標であるようになっている。言い換えれば、検出可能実体は細胞または組織に存在する場合、これを含む細胞または組織または器官または個体が疾患状態であると推測され得る。この検出可能実体は、単一の疾患、または多数の疾患、またはAIDSのような症状、または医学的状態の診断因子であり得る。好ましくは、この疾患、症状または状態は治療可能なものである。

好ましくは、細胞または組織中の検出可能実体の存在、量または濃度を検出して、細胞または組織の状態、好ましくは細胞または組織の病的状態の指標を提供する。従って、参照標準が診断標準として使用される実施形態では、検出可能実体は任意の診断上関連する要素を含んでもよい。

従って、好ましい実施形態では、検出可能実体は本質的に、病理的状態のマーカーまたは疾患マーカーであり、細胞中におけるその存在または量によって、その細胞が疾患状態であるかまたは疾患状態になる可能性が高いことが示される。検出可能実体の存在は診断因子であり得るか、またはそれは単に指標として機能して、他の指標、例えば指標のパネルと一緒に、疾患の確率を示し得る。細胞または組織における検出可能実体の量、すなわち、疾患の指標である閾値レベルを超えるか否かは、重要であり得る。

好ましくは、疾患はガンを含む。従って検出可能実体は好ましくはガンマーカーまたはガンタンパク質またはガン核酸である。多数のガンおよびガン関連のタンパク質、例えば、ras、BRCA1、HER2、ATM、RhoC、テロメラーゼなどが、当該分野で公知である。癌胎児性抗原（CEA）は消化管のガン（例えば結腸癌）、ならびに他の悪性障害および非悪性障害に関連する。他のガンマーカーの例を以下に示しており、これらをコードする核酸がまた、検出可能実体としても用いられ得ることが理解される。

前立腺特異的抗原（PSA）のレベルは、前立腺癌において、時には肥大した前立腺状態（例えば、BPH）または前立腺炎において上昇する。

CA 19．9は主に胃腸のガンに関連する。時には転移を有する患者において、および非悪性状態、例えば、肝炎、肝硬変、膵炎においても値の増大が観察されている。

HER2は、乳癌に関連する。HER2タンパク質の値の増大、過剰発現はしばしば、転移性状態をもたらし得る腫瘍細胞の急速な増大と関連している。HER2タンパク質を過剰発現する転移性の患者はHERCEPTIN治療（抗HER2抗体を用いる治療）によって有益な効果を得ることができる。

上昇したCA125値はしばしば、卵巣のガンに関連している。しかし、非悪性状態、例えば、子宮内膜症、妊娠第一期、卵巣嚢胞または骨盤内炎症性疾患（骨盤感染症）もCA 125レベルの上昇を引き起こし得る。家族歴とガンの頻度との間の連関はよく報告されている。

CA 15．3値はしばしば、乳癌を有する患者で上昇する。家族のなかでガンの病歴がある場合、患者は乳房のX線撮影を行うことも勧められ得る。乳癌以外に、他の非悪性状態（例えば、硬変、卵巣および乳房の良性疾患）もCA15．3レベルの上昇を引き起こすことが公知である。

αフェトプロテイン（AFP）レベルはしばしば肝臓癌（肝細胞性）および精巣癌（精上皮腫ではない）において上昇する。レベルの上昇はまた、妊娠中またはいくつかの胃腸の癌にも存在する。AFPはまた開放神経管欠損症のスクリーニング試験として他の試験と組み合わせて用いられる。

上咽頭癌（NPC）は非リンパ系、非腺質の扁平上皮細胞癌であり、上咽頭の上皮細胞から生じる。これは上咽頭ガンの最も一般的な形態であり、成体で頻度が高い。いくつかの臨床症状としては、鼻または耳の問題、鼻粘膜の血液、首の腫瘤、リンパ節腫脹（通常頸部）および鼻閉塞感が挙げられる。エプスタインバーウイルス（EBV）はNPCと直接の関係を有することが示されており、これがNPC腫瘍およびNPCを有する患者において検出され得る場合、一般的な集団よりも高力価のEBV特異的抗体を有する傾向がある。スクリーニングを通じた早期の検出によって、通常は良好な予後がもたらされる。

腫瘍サプレッサータンパク質、例えばp53およびRbはまた、検出可能実体として用いられ得る。

検出可能実体は、免疫グロブリンのκおよびλの軽鎖を含んでもよい。検出可能実体は、1つ以上の予後マーカー、例えば、エストロゲンレセプター（ER）αおよびβならびにプロゲステロンレセプター（PR）、p53タンパク質、増殖関連タンパク質、例えば、Ki−67および増殖細胞核抗原（PCNA）を含んでもよい。検出可能実体は、1つ以上の細胞接着分子、例えば、カドヘリンE、および腫瘍サプレッサータンパク質、例えば、p16、p21、p27およびRbを含んでもよい。この検出可能実体は、1つ以上の血液学的因子、例えば、CD3、CD15、CD20、CD30、CD34、CD45、CD45RO、CD99、κおよびλ軽鎖および第VIII因子を含んでもよい。これらのいずれかをコードする核酸も検出可能実体として用いられ得る。

検出可能実体は、1つ以上の上皮分化マーカー、例えば、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺特異的アルカリホスファターゼ（PSAP）、サイトケラチン、上皮膜抗原、癌胎児性抗原（CEA）、多形性上皮ムチン、間葉分化マーカー、デスミン、アクチン、ビメンチン、IV型コラーゲンを含んでもよい。検出可能実体は、1つ以上のメラニン形成細胞マーカー、例えば、S−100、HMB45を含んでもよい。検出可能実体は、1つ以上のマーカー、例えばCD117、CD133、CD45、CD4、CD8、CD19、CD20、CD56、CD13、CD33、CD235a、CD15、BerEP4、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、クロモグラニン、シナプトフィジン、c−Kit、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、HER2／neu、HER3およびHER4、ならびにそれらのリガンド、例えば、EGFおよびTGFαおよび他のレセプタータンパク質−チロシンキナーゼ、例えば、インスリンレセプター（IR）、血小板由来増殖因子レセプター（PDGFR）、ならびに血管内皮増殖因子レセプター（VEGFR−1、VEGFR−2およびVEGFR−3）、アポトーシス関連タンパク質、例えば、M30、Bcl−2、p53、カスパーゼおよびFasを含んでもよい。

本明細書に記載されるような参照標準において上記の検出可能実体のタンパク質を用いることは厳密には必要がないこと、そしてこのタンパク質をコードする核酸の使用によって抗原を検出することが可能であることが理解される。従って、参照標準は、上記のようなポリペプチド検出可能実体のいずれかをコードし得る核酸である検出可能実体を含んでもよいということが理解されるべきである。言うまでもなく、この場合の結合因子または顕在化因子は好ましくは、核酸、好ましくは核酸検出可能実体の少なくとも一部に特異的に結合し得る核酸、好ましくは相補的な核酸を含む。

検出可能実体が、ポリペプチドを含む場合、これは未修飾であってもよく、または1つ以上の翻訳後修飾、好ましくはリン酸化を含んでもよい。例えば、検出可能実体は、リン酸化HER2またはリン酸化EGFRを含んでもよい。検出可能実体はまた、適切には抗原、好ましくは診断上関連する抗原であって、関連の抗体に対する結合によって検出可能である抗原を含んでもよい。任意の適切な抗原を使用してもよく、どの抗原がどの診断目的に適切であるかは当業者には公知である。

本明細書において用いる場合、「検出可能実体（detectable entity）」という用語は、限定はしないが原子または分子を包含し、ここで分子とは無機であっても有機であっても、ハプテンであっても、生物学的なエフェクター分子および／または生物学的エフェクター分子のような因子をコードする核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホスフィレート（phosphylated）ペプチド、リン酸化ペプチド、グルケート（glucated）ペプチド、グリコペプチド、核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、核酸、DNA、RNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックされた核酸（LNA）、ヌクレオチドの合成アナログ、リボヌクレオチドの合成アナログ、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸アナログ、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸アナログ、ステロイド、プロテオグリカン、脂質および炭水化物であってもよい。検出可能実体は、溶液中であっても懸濁物中であってもよい（例えば、結晶型、コロイド形態、または他の粒子形態）。検出可能実体は、単量体、二量体、オリゴマーなどの形態、またはそうでなくても複合体であってもよい。

単一の検出可能実体を用いることは必須ではないということ、そして参照標準において2つ以上の検出可能実体を用いることが可能であるということが理解される。従って、「検出可能実体」という用語はまた、本明細書に開示されるような原子、分子などの混合物、融合物、組み合わせおよび結合体を包含する。例えば、検出可能実体としては、限定はしないが：ポリペプチドと組み合わされた核酸；お互いに対して結合体化された2つ以上のポリペプチド；生物学的に活性な分子に結合体化されたタンパク質（プロドラッグのような低分子であってもよい）；またはこれらのいずれかと生物学的に活性な分子との組み合わせを挙げることができる。

好ましい実施形態では、検出可能実体は、「生物学的なエフェクター分子（biological effector molecule）」または「生物学的に活性な分子（biologically active molecule）」を含む。これらの用語は、生物学的な系において活性を有する要素を指し、限定はしないが、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが挙げられ、これには、限定はしないが、構造的タンパク質、酵素、サイトカイン（例えば、インターフェロンおよび／またはインターロイキン）抗生物質、その抗体もしくはその一部は天然であっても合成であってもヒト化されていてもよい、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらの有効な部分、例えば、F（ab）2、F（ab'）もしくはFvフラグメント、ペプチドホルモン、レセプター、シグナル伝達分子または他のタンパク質；以下に記載のような核酸であって、限定はしないが、オリゴヌクレオチドもしくは修飾オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、cDNA、ゲノムDNA、人工もしくは天然の染色体（例えば、酵母人工染色体）またはその一部、mRNA、tRNA、rRNAを含むRNA、またはリボザイム、またはペプチド核酸（PNA）、ロックされた核酸（LNA）、ウイルスもしくはウイルス様粒子を包含する核酸；修飾されても修飾されていなくてもよい、ヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその合成アナログ；修飾されても修飾されていなくてもよい、アミノ酸またはそのアナログ；非ペプチド（例えば、ステロイド）ホルモン；プロテオグリカン；脂質；あるいは炭水化物が挙げられる。無機化合物および有機化合物を含む低分子も、検出可能実体として用いられる。特に好ましい実施形態では、生物学的に活性な分子は、薬学的に活性な検出可能実体、例えば、アイソトープである。

検出可能実体は、検出可能シグナル、例えば、光または他の電磁放射線を放射し得る。検出可能実体は、当該分野で公知のような放射性同位体、例えば、³²Pもしくは³⁵Sもしくは⁹⁹Tc、またはこのような放射性同位体と結合体化された、以下に説明されるような核酸、ポリペプチドもしくは他の分子のような分子であってもよい。検出可能実体は、X線照射のような放射線に対して不透明であってもよい。検出可能実体はまた、それが動物の体内の特定の細胞、組織、器官もしくは他の成分に対して指向される標的手段を含んでもよい。例えば、検出可能実体は、生物体中の規定の分子、組織または細胞に特異的な放射性標識化抗体を含んでもよい。

検出可能実体は、色素を含んでもよく、これにはアゾ色素、有機顔料、チブラクロンブルー（cibracron blue）などが挙げられる。

検出可能実体は、上記のような要素を1つ以上含んでもよく、詳細には、上記の任意の要素のうち2つ以上もしくは複数、または上記の要素の1つ以上の組み合わせを含んでもよいことが理解される。

細長い経路
本明細書に記載する参照標準は、支持媒体中の概して細長い経路(elongate path)に、検出可能実体を含む。したがって検出可能実体は、本明細書の記載する参照標準では、概して細長い形状を持つ。

検出可能実体を構成する分子または原子はどんな形状でもよいので、「細長い経路」または「細長い形状」という用語が、検出可能実体を構成する分子または原子の特定の形状を指すわけではないことは、上記から理解されるだろう。むしろこの用語は、支持媒体内での検出可能実体の大まかな配置または局在を指していると解釈すべきである。例えば、検出可能実体の塊またはバルク（例えば連続した状態にあるもの）は、支持媒体に配置される時に、好ましくは「細長い形状」を持つ。

「細長い」とは概して幅より長さの方が大きい形状を意味する。したがって、そのような細長い形状は、有意に異なる少なくとも2つの異なる長さ寸法を持つ。好ましくは、検出可能実体の最長寸法は、最短寸法よりも有意に大きい。

好ましくは、最長寸法と最短寸法の比は5：1以上、より好ましくは少なくとも10：1、最も好ましくは少なくとも20：1、50：1、または100：1以上である。この比は、特に、5：1以上、6：1以上、7：1以上、8：1以上、9：1以上、10：1以上、15：1以上、20：1以上、25：1以上、30：1以上、40：1以上、45：1以上、50:1以上、55：1以上、60：1以上、65：1以上、70：1以上、75：1以上、80：1以上、85：1以上、90：1以上、95：1以上、または100：1以上であることができる。

したがって、適用可能な場合、好ましくは、経路の長さは、その幅または直径の少なくとも10倍、好ましくはその幅または直径の10倍以上、好ましくは20倍以上、最も好ましくは100倍以上である。

しかし、経路の形状が、よりコンパクト、またはより均一、またはより規則的であり、それでもなお細長い実施形態、例えば風船形、葉巻形、ソーセージ形、円板形、涙滴形、球形または長円形なども考えられる。ただし、長さ寸法がほぼ同じもしくは同等である規則的形状または最長寸法と最短寸法の比が5：1未満である規則的形状は、本明細書に記載の参照標準には包含されない。

経路は非直線的であってよく、1以上の曲線部分を含む曲線的配向を持ちうる。例えば図4Aに図解するように巻き毛状または波状であってもよい。ただし、好ましい実施形態では、細長い経路はまっすぐまたは実質的にまっすぐである。したがって、そのような好ましい実施形態における検出可能実体は、直線的構成をとる。

特に、経路は棒状(rod-like)の形状または配向を持ちうる。例えば経路は直線的な棒を含みうる。2以上の細長い経路が検出可能実体に含まれる場合は、当該または各検出可能実体が支持媒体または包埋媒体中で棒状経路をとる。それらの棒は、好ましくは、平行な棒が支持媒体または包埋媒体中で束を形成するように平行な配向を持つ。当該または各検出可能実体は、好ましくは、実質的に長軸方向の配向を持つ。しかし、棒は支持媒体または包埋媒体の短辺に平行であってもよい。

一部の実施形態では、検出可能実体のとる経路が、不均一な断面を持つ。したがって経路はレンズ形またはソーセージ形を持ちうる。ただし、好ましい実施形態では、経路は、少なくとも経路の要部で、好ましくは実質的に経路の長さでは、均一な断面を持つ。したがって、そのような実施形態では、検出可能実体のあらゆる部分で、検出可能実体の経路の断面積は実質的に同じである。しかし、検出可能実体が経路に沿って均一に分布していない実施形態も考えることできる。例えば、検出可能実体は、例えば、図4Aに示すように「数珠状（beads on string）」構成をとることができる。

経路の断面プロファイル、すなわち断面中の検出可能実体を含む所定の区域は、様々な構成を持ちうる。好ましくは、所定の区域は、環状または楕円もしくは長円状である。しかし、所定の区域は、ピル（pill）形状、規則的形状または不規則的形状を持ちうる。適切な輪郭を持つ経路を使って、様々な断面プロファイルを樹立することができる。

非常に好ましい実施形態では、断面プロファイルが、細胞（例えば原核細胞または真核細胞、好ましくは動物細胞、そして最も好ましくはヒト細胞）の大きさもしくは形状またはその両方に似ている。したがって、参照標準のスライスにおける断面プロファイルは、試料中の本物の細胞を真似た形状を呈することになる。これにより、試料中の細胞と、スライス中に存在する断面プロファイルとの間で、直接比較を容易に行うことが可能になる。使用者は、例えば、細胞が「陽性」であるか「陽性」でないかについて判断を下すために、細胞の染色レベルと断面プロファイルの染色レベルとを（目視により）容易に比較することができる。

好ましくは、経路の断面プロファイルまたは経路の最短寸法は、約0.5μm〜100μm、より好ましくは1μm〜100μm、さらに好ましくは10μm〜20μm、そして最も好ましくは2μm〜20μmの直径（または最大寸法）を持つ。特に好ましい実施形態は、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μmまたは20μmの、または大体その程度の、直径または最大寸法を持つものである。

これらの大きさが限定でないことは理解されるだろう。そして、用途に応じて大きさを変化させることは、使用者には理解されるだろう。さらに、参照標準が2以上の検出可能実体もしくは2以上の経路またはその両方を含む場合、それらのそれぞれが独立して上述の特徴および特性を持ちうることは理解されるだろう。さらに、参照標準が2以上の経路を含む場合、それらは同じ密度で、または異なる密度で染色されうる。

参照標準が2以上の経路を含む場合、それらは同じ密度で、または異なる密度で染色されうる。

好ましい実施形態では、検出可能実体を含む経路が、検出可能実体を含む繊維を使って支持媒体中に樹立されるか、または検出可能実体を含む包埋媒体中のチャネルを樹立することによって支持媒体中に樹立される。さらに「中空糸」「ブロックコポリマー」およびマクロ構造（特に自己集合性マクロ構造）の使用も考えられる。これらの各方法を以下の項でさらに詳しく説明する。

繊維
好ましい実施形態では、検出可能実体が細長い繊維に付着され、前記実体を含む繊維が支持媒体中に支持される。好ましい実施形態で包埋媒体を使用する場合は、検出可能実体を含む繊維が包埋媒体に包埋される。

この文書で使用する「繊維」という用語は、あらゆる天然または人造の繊維または糸もしくは紐を包含すると解釈すべきである。繊維は典型的には細く、細長い形状を持つ。繊維には、動物の毛、ケラチンなどの天然繊維が包含される。この用語はさらに、集合することによって長くて細い糸を形成する、例えばアクチンやチューブリンなどの任意のポリマーも包含する。押出または引取りによって製造される繊維も包含され、細長いミセル構造も同様である。実際、例えば成分の自己集合などによって形成される任意のマクロ構造も包含される。しかし、布地にまたは衣料産業で使用される合成繊維および天然繊維は、特に好ましい。

検出可能実体は、繊維に付着し、カップリングし、融合し、混合し、組合せ、または他の方法でつなぐことができる。検出可能実体と繊維の間の取り付け等は、永続的または一時的であることができ、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用（水素結合、イオン相互作用、疎水力、ファンデルワールス相互作用などを含む）を伴いうる。

「付着した(attached)」という用語は、繊維と検出可能実体の間の永続的または半永続的会合を含意するが、これらの可能性に限定されると解釈すべきでない。そうではなく、付着とは、それがいかに一時的であろうとも、またはルーズであろうとも、その会合が、支持もしくは包埋時のまたは支持もしくは包埋後の繊維の位置決めによって実質的に定められる経路を検出可能実体がとるのに十分である限り、検出可能実体と繊維の間の任意の会合を指すと解釈すべきである。重要なのは、媒体中に支持または好ましくは包埋する工程の間に、繊維が検出可能実体をその場に保持するということだけである。

繊維は、単に検出可能実体を留置するだけ、または拡散するか洗浄除去されるのを他の方法で防ぐだけでもよい。留置は一時的でもよいし、支持工程または包埋工程の大部分、好ましくはその工程の全体にわたって、持続してもよい。染料および他の分子を繊維にカップリングするための薬剤として当技術分野で知られている媒染剤の使用も有益でありうる。

好ましい実施形態では、検出可能実体を繊維に共有結合で取り付ける。そのような好ましい実施形態では、繊維を構成している1以上の分子に、検出可能実体を化学的にカップリングまたは架橋する。好ましい化学カップリング法については、後に「カップリング」という見出しを付けた項で、さらに詳しく説明する。言うまでもなく、この実施形態で繊維にカップリングされる検出可能実体の量は、断面にどれくらいの検出可能実体が提示されるかを、そしてそれ故に、達成される染色レベルを、制御することになる。

さらに、一定の実施形態では、検出可能実体と繊維または繊維の成分との間に間隔確保手段を含めることが望ましい場合がある。そのような間隔確保手段は、当技術分野で知られているリンカーまたはスペーサーを適切に含みうる。間隔確保手段の目的は、例えば立体障害を避けるためおよび検出可能実体の検出を促進するために、検出可能実体と繊維（または経路の他の成分）との間に間隔をあけることである。したがって、用途に依存して、短いスペーサーの使用が好ましい場合も、長いスペーサーの使用が好ましい場合もある。

間隔確保手段は、様々な長さのポリマー（その長さは重合度を制御することによって制御しうる）であるリンカーまたはスペーサーを含みうる。数多くのスペーサーおよびリンカーが当技術分野では知られており、用途に応じたそれらの選択方法および使用方法は、当業者にはわかるだろう。どのスペーサー長を使用すべきかも、当業者にはわかるだろう。

スペーサーは、例えばポリエチレングリコール、PEG誘導体、またはポリアルカン、またはホモポリアミノ酸などから作ることができる。当技術分野で既知のデキストランおよびデンドリマーも使用することができる。特に、リンカーまたはスペーサーは、ヌクレオチドポリマー（核酸、ポリヌクレオチドなど）またはアミノ酸ポリマー（タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなど）を含みうる。

例えば、検出可能実体がペプチドまたはポリペプチドを含む場合は、それを、さらなるアミノ酸残基（これらがスペーサーまたはリンカーを構成する）と一緒に合成すること、または（例えば融合タンパク質として）発現させることができる。リンカーまたはスペーサーは検出可能実体と連続している必要はなく、それ自体を、共有結合であれ非共有結合（上述したもの）であれ任意の適切な手段を使って、例えば後述する架橋剤を使って、検出可能実体にカップリングすることができる。

ペプチドをスペーサーとして使用する場合、そのペプチドスペーサーの構成および長さを制限するのは、ペプチド合成法そのものだけであることは理解されるだろう。したがって、例えば、ペプチド合成法の柔軟性により、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を持つペプチドを含めて、長いペプチド、短いペプチドおよび分岐ペプチドを合成することが可能になる。特に、分岐スペーサー、例えば分岐ペプチド構造の使用は望ましい。なぜなら、それは１分子を超える検出可能実体を1つのスペーサーまたはリンカーに付着させることを可能にするからである。さらに、分岐構造または樹状構造を持つスペーサーにより、1種類を超える検出可能実体のカップリングまたは付着が可能になる。例えば、第1検出可能実体をスペーサーの1つのアームにカップリングし、第2検出可能実体を第2のアームにカップリングすることなどができる。さらに、異なる量の同じまたは異なる検出可能実体を各アームにカップリングすることもできる。

繊維は任意の適切な材料を含みうる。好ましくは、繊維は紡糸繊維である。繊維は天然由来の繊維でも合成繊維でもよい。天然繊維および合成繊維ならびそれらの取得源は当技術分野ではよく知られている。使用に適した天然繊維の例には、綿、リネン、絹、セルロース、ケラチンなどがある。使用に適した合成繊維の例には、レーヨン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーバメートなどがある。ナイロンはポリアミド繊維を含み、他の任意の適切なポリアミド繊維も使用することができる。レーヨンは主としてセルロースを含み、当技術分野で知られている他のセルロース繊維も、ここに記載する目的に適切に使用することができる。

これらの繊維の2以上を様々な量で含む混紡物も使用することができ、混紡繊維および混紡技術は、当技術分野では公知である。例えば、紡織繊維、ポリアミドとセルロースの適切な混紡物、ポリアミド/ポリエステルまたはポリエステル/絹を使用することができる。好ましくは、少なくとも多少の機械耐性、少なくとも多少の化学的攻撃に対する耐性、または熱処理に対する耐性、またはそれらの任意の組合せを持つだろう。

使用することができる合成繊維には、ポリエステル（例えばダクロンおよびテリレン）、ポリアクリロニトリル（例えばオーロン）、アクリル繊維、ポリアミド（例えばナイロン）、ポリオレフィン、ポリプロピレン、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリ(1,4-ジメチレンシクロヘキサンテレフタレート)、ポリ(テトラメチレンテレフタレート)、ポリウレタン、ポリ(塩化ビニル)、ポリ(塩化ビニリデン)、ポリ(ビニルアルコール)、後塩素化ポリ(塩化ビニル)（CPVC）およびポリテトラフルオロエチレンなどがあるが、これらに限るわけではない。

これらの繊維のコポリマー（例えばポリエステルとポリエチレンのコポリマー（例えばカラット(Karat))を含む）も使用することができる。特に興味深いのは、最も細い産業用紡織繊維、例えばポリエステル、ナイロンまたはアクリルポリマーなどのいわゆる超極細繊維である。使用できる他の繊維には、レーヨン、アセテートレーヨン、セルロース、乳タンパク質（例えばアララック）または木材パルプ（例えばリヨセルまたはテンセル）のような半天然起源のものが含まれる。合成繊維は、湿式、乾式または溶融紡糸によって製造することができる。

ヒツジ、ヤギ、ウサギ、アルパカ、ラマなどの動物外被に由来するウール繊維群、綿、絹、例えばカイコの繭に由来するもの、アマ由来のリネン、麻、ラミー、サイザルおよびジュートなど（ただしこれらに限るわけではない）の天然繊維も有用である。

好ましい実施形態では、繊維をパラフィン包埋媒体に包埋する。この実施形態による参照標準の作り方を示すフローチャートを、図7および図8に示す。後に詳述するアガロース包埋工程は任意である。

参照標準には2以上の繊維が存在しうる。例えば、それぞれが異なる検出可能実体を含む2以上の繊維を使用することができる。さらに、異なる量の同じ検出可能実体を異なる繊維上に設けることもできる。最後に、1つの繊維に1を超える検出可能実体をコンジュゲートまたは付着させることができる。それぞれが同じ量または異なる量の1または2以上の検出可能実体を含む複数の繊維を使用することができる。

当該または各検出可能実体を含む当該または各繊維は、実質的に参照標準の全体にわたって、または少なくともその一部分にわたって、伸びることができる。例えば、参照標準が長方形箱の形態である場合、当該または各繊維は一端から他端まで（すなわちその長方形箱の実質上全長にわたって）伸びることができる。

好ましくは、チャネルは、約0.5μm〜100μm、より好ましくは1μm〜100μm、さらに好ましくは10μm〜20μm、そして最も好ましくは2μm〜20μmの直径を持つ。

検出可能実体または各繊維は、同定および/または位置特定が容易になるように、当技術分野で既知の様々な染料のどれでも1つを使って着色することができる。参照標準内に2以上の繊維が含まれる場合、繊維を着色するならば、繊維間の識別が容易になるように、好ましくは、異なる色を使って各繊維を着色する。

上述のように、当該または各繊維は、試料（例えばアッセイすべき細胞または組織）そのものと同じ包埋媒体に、試料をその媒体に包埋するのと同時に、またはその前に、またはその後で、包埋することができる。好ましい実施形態では、当該または各繊維を、パラフィンを含む包埋媒体に同時包埋する。好ましくは、そのような繊維包埋は、FFPEにおける試料のパラフィン包埋工程の一部として行われる。

膨潤
一部の実施形態では、検出可能実体との会合前または会合中に、繊維を少なくとも部分的に膨潤させることができる。好ましい実施形態では、検出可能実体への化学カップリング前または化学カップリング中に、繊維を部分的にまたは完全に膨潤させることができる。

「膨潤」という用語は、文脈によっては、不溶性ポリマーゲルにおける溶媒の取り込みを指すと解釈することができるが、ここでは、この用語をより一般的な意味で使用し、具体的には、繊維などの細長い経路の体積もしくは表面積または部位（好ましくは内部部位）への到達可能性を増加させるための機械的、物理的または化学的処理を包含する。

繊維の膨潤により、検出可能実体は、表面部分だけでなく繊維の内部にも到達することが可能になる。次に、繊維の芯部分への検出可能実体の浸透度を、したがって繊維の芯部分へのカップリングの程度を、調整または制御することができる。その結果として繊維内に生じる種々の調整された検出可能実体の分布パターンは、種々の検出可能実体に、細胞におけるそれらの分布に応じて使用することができる。

繊維は様々な手段によって膨潤させることができる。例えば繊維は、展開することなどにより、機械的に処理することができる。繊維は、起毛することなどにより、機械的に開くことができる。膨潤または収縮の程度は、場合に応じて、展開または起毛の量を制御することによって、調節することができる。

しかし、好ましくは、膨潤剤（その吸収または吸着によって繊維の体積を変化させること、好ましくは増加させることができるもの）に曝露することによって繊維を膨潤させる。膨潤剤の好ましい一例は水である。膨潤剤を使用する場合、膨潤度は様々な方法によって調整することができる。例えば、一定量の繊維に曝露する、水などの膨潤剤の量を変化させることができる。さらに、曝露する量を制御すると共に、またはその代わりに、膨潤剤または水を繊維に曝露する時間もしくは温度またはその両方を変化させることもできる。

好ましい実施形態では、検出可能実体と繊維とのカップリングが、有機溶媒などの非水性媒体中で最適に起こるようなカップリングである。好ましい有機媒体は、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、アセトンまたはジメチルホルムアミドである。なぜなら、これらは好ましいカップリングおよび活性化試薬、例えばビニルスルホン、アズラクトン、塩化シアヌル、ジクロロトリアジン、クロロトリアジン、イソシアネート、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、アルデヒド、エポキシド、カルボニルジイミダゾール、臭化シアン、塩化トレシル、臭化ブロモアセチルおよび臭化アルキルなどと相溶性だからである。

そのような場合、膨潤量または膨潤度は、非水性媒体に様々な量の異なる溶媒を加えることによって、簡便に制御することができる。言い換えると、膨潤の程度は、様々な比率の非水性媒体および水の混合物中でカップリングさせることによって、またはトルエンとアルコールのような異なる非水性溶媒を混合することによって、制御することができる。

有機溶媒か無機溶媒、水混和性か水不混和性などにかかわらず、溶媒の混合物も使用することができる。溶媒混合物は、使用する繊維およびカップリング化学反応に適合する任意の混合可能な溶媒、例えば、好ましくはアルコールと水、アセトンと水、アルコールとトルエン、トルエンとジメチルホルムアミドなど、またはそれらの任意の混合物であることができるだろう。

そのような場合、膨潤量または膨潤度は、非水性媒体に様々な量の水を加えることによって、好都合に制御することができる。言い換えると、膨潤の程度は、様々な比率の非水性媒体と水との混合物中でカップリングさせることによって、制御することができる。水の存在量が多いほど、膨潤量は多くなる。

図6Aは、カップリング中またはカップリング前に、繊維を実質上完全に膨潤させている実施形態を示している。この場合、検出可能実体は、繊維の内部または芯に到達することができ、それにカップリングして、そのような芯部分に少なくとも多少の染色をもたらすことができる。極端な場合、検出可能実体は繊維の断面の実質上全ての部分にカップリングされる。適当な抗体に曝露すると、均質な染色（すなわち繊維の芯領域と辺縁領域の両方での染色）が起こる。したがって、繊維および参照標準の断面プロファイルは、検出可能実体の均一な分布を持つ。そのような実施形態は、検出可能実体が細胞膜にも細胞質にも分布を持つことが知られている場合、さらには検出可能実体が細胞の実質上全ての部分にわたって分布することが知られている場合に、好ましい。

検出可能実体が、細胞質にも多少の分布を持つが、おそらく大半は細胞膜中に存在することがわかっているか、またはそのように疑われる場合は、カップリング中またはカップリング後に繊維を部分的に膨潤できるようにすること、またはそのように膨潤させることにより、そのような分布または染色パターンを模倣することができる。部分的な膨潤は、図6Bに示すように、断面が芯部分よりも表面部分に実質的に多くの検出可能実体を持つような繊維をもたらす。抗体染色は不均質であり、繊維の辺縁領域または表面領域に集中して、内部染色は限定される。

膨潤を起こさせない場合は、検出可能実体の分子が繊維の表面部分とだけ反応し、カップリングするだろう。検出可能実体は、繊維の辺縁部分または表面部分に到達し、カップリングすることしかできない。繊維の内部または芯部分ではカップリングは起こらず、実質的に表面に限定された染色をもたらす（濃い表面染色、内部染色なし）。

これは、検出可能実体の断面分布が実質上、繊維の外側部分に限定され、繊維の内部または芯部分では実質上染色が起こらない繊維をもたらす。したがって、結果として得られるプロファイルは「リング」形状である。そのような分布を図6Cに示す。そのようなリング形状は、検出可能実体が細胞内で細胞表面に限定されることが知られている場合に有用だろう。なぜならどちらの場合も染色パターンが似ることになるからである。したがって、膨潤を起こさせないこの参照標準は、例えば膜タンパク質または細胞表面受容体などである検出可能実体の存在、量および/または分布を計測するための標準として有用に使用することができる。

さらに、膨潤を調整することによって上述のように達成される様々な分布を、ある薬剤の細胞進入を監視する目的で使用することができることは、理解されるだろう。したがって、それらは例えば、ある特定薬剤（薬物など）が細胞膜を通過して細胞中に浸透できるかどうかを追跡するために使用することができる。ショウジョウバエ・アンテナペディアタンパク質またはHIV TAT（またはそれらの断片）などの膜移行配列（membrane translocation sequence：MTS）の効率を、この方法で監視することができる。

繊維によって規定される細長い経路は、媒体中に、いくつかの方法で樹立される。最も簡単には、検出可能実体が付着している繊維の周りに、媒体を形成させる。例えば、パラフィンなどの包埋媒体を加熱処理して融解させ、融解した包埋媒体を繊維の周りに注ぐ。固化すれば包埋媒体はその中に繊維を包むことになる。そのような場合、その工程中は、例えば足場または他の支持体を使って、繊維をしかるべき位置に保持しておくことが望ましいだろう。そのような足場は、繊維を張った状態で（張力を与えて）保持することができ、その装置に1本を超える繊維、好ましくは実質上平行な配向を持つ複数の繊維を収容させることができる。包埋媒体が固化したら、足場を繊維から解放してよい。

また、包埋媒体に包埋する前に、繊維を別の媒体中に包埋または支持してもよい。アガロース包埋工程を含むそのような実施形態を、図7および図8のフローチャートに示す。この実施形態では、繊維をアガロースゲルに対してしかるべき位置に保持し、アガロースを融解し、繊維の周りに注ぐことにより、その繊維を包むことができる。この操作中は、上述のように足場を使って、繊維をしかるべき位置に保持することができる。次に、繊維がその中に包まれているアガロースゲルのストリップを切り出すことができる。次に、そのアガロースストリップそのものを、例えば上述のように包埋媒体を融解し、注ぎ、そして固化させることなどによって、包埋媒体中に包埋する。そのような実施形態の利点は、アガロースゲルはむき出しの繊維よりも取り扱いが容易であり、その細長い形態を保ちやすいことである。言うまでもなく、アガロースゲルは十分な堅さを持つべきであり、0.5％〜1％、2％、3％、4％、5％以上のアガロース濃度が要求されうる。

図9を構成する写真に、アガロースストリップの使用を例示する。まず、繊維をフレームに張り、張力をかける。次にフレームを容器に入れ、融解したアガロースをフレームに注ぐ。アガロースを固まらせ、固まったアガロースを取り出す。個々の繊維を含有するアガロースのストリップをアガロースブロックから切り出し、個々の繊維を含有するアガロースブロックをパラフィンに包埋する。ただし、アガロースへの繊維の包埋は、パラフィンが固まりつつある間に繊維を所望する形態（ここでは細長い形態）に保つ目的で行われることは、理解されるだろう。したがって、パラフィン包埋工程中に、パラフィン包埋工程のために繊維を望ましい形態に保つことができる限り、アガロース包埋工程は任意である。

アガロースに包埋された繊維（パラフィン包埋を行っていないもの）自体を参照標準として使用できることも明らかだろう。そのような実施形態では、包埋媒体はアガロース自体である。包埋された繊維を含有するアガロースブロックを、本明細書の他の項で説明するように切片に切断して、スライスまたは切片を作成した後、固定および染色操作を行うことができる。この目的のために、スライスが容易になるように、アガロースブロックを凍結することができる。

チャネル
もう一つの実施形態では、検出可能実体の細長い経路が、支持媒体中のチャネルによって規定される。そのような実施形態では、細長いチャネルが支持媒体中に開けられ、検出可能実体がその中に入れられる。異なる量の検出可能実体もしくは異なる検出可能実体またはその両方を支持するために、複数のチャネルを形成させることができる。

さらに、チャネルが中空糸（下記参照）の形態で設けられる実施形態も提供する。そのような実施形態では、チャネルを、中空糸自体の中、もしくは支持媒体（例えばパラフィンブロック）中、またはその両方に設けることができ、要すれば上述の繊維と組み合わせることもできる。

チャネルは、任意の手段によって、例えば彫刻または穿孔などによって、支持媒体中に形成させることができる。チャネルは、細い針を使って支持媒体を刺すことによって、形成させることができる。通常の金属針またはポリマー製の針を使用することができる。支持媒体が十分に柔らかい場合、例えばパラフィンなどの場合は、適切な堅さを持つ飲料用ストローを使って、穴を開けることもできる。

あるいは、またはさらに、プレースホルダー、例えば棒（金属製または他の材料製）を、液化包埋媒体中に置くことによって、チャネルを形成させることもできる。包埋媒体を固化させ、プレースホルダーを取り除く。この目的には、1つまたは複数のプレースホルダーを含む適切な鋳型を使用することができる。そのような技術は、例えばパラフィン中にチャネルを作成するのに役立つ。レーザー照射を使ってチャネルを焼くまたは彫刻することも可能である。

次に、チャネルには、ある量の検出可能実体を、任意の適切な手段によって入れることができる。例えば、検出可能実体が固体状態にある場合は、単にそれをチャネル内に入れて、必要ならば充填または圧縮することができる。検出可能実体が粉末または粒子である場合は、それらを一つに束ねるために、糊または他の媒体を使用することが考えられうる。また、検出実体を液体媒体に溶解し、その液体媒体をチャネル内に注入して固化させることもできる。例えば、アガロースの融解溶液を作り、検出可能実体をそこに溶解するか懸濁することができる。そのアガロース溶液をチャネル内に注入するか他の方法で入れ、固化させることができる。検出可能実体を単量体溶液に溶解または懸濁し、その単量体溶液をチャネル内に注入するかチャネル内に入れて、重合させることができる。

好ましくは、チャネルは、約0.5μm〜100μm、より好ましくは1μm〜100μm、さらに好ましくは10μm〜20μm、そして最も好ましくは2μm〜20μmの直径を持つ。

本明細書に記載する参照標準は、生産に際して、1つずつ製造するか、バッチ式に製造することができる。バッチ式の製造は好ましい。

一部の実施形態では、チャネルを試料と同じ包埋媒体中に形成させる。したがって、試料を保持するための包埋媒体に、チャネルを形成させるための上述の工程をどれでも行うことができる。これを達成するために、標準的なFFPE包埋操作を相応に変更することができる。例えば、パラフィンなどの液化包埋媒体中に上述のようにプレースホルダーを置くことによって、試料含有包埋媒体中にチャネルを形成させることができる。パラフィンを固化させて、試料とプレースホルダーの両方を覆わせ、プレースホルダーを取り除く。あるいは、試料を含むパラフィンブロックを前もって作製し、穿孔により、そのブロックにチャネルを形成することもできる。次に、検出可能実体を上述のようにチャネルに入れることができる。

中空糸
参照標準に中空糸を利用できることは理解されるだろう。

本明細書で使用する中空糸という用語は、その全長を貫通する穴を1つ以上持っている繊維である。中空糸は、例えば、環または環状開口部を持つスピナレットを通して孔形成液または凝固剤と一緒にポリマー溶液を押し出すことにより、乾湿式相分離法などで製造される。

使用されるポリマーは、典型的には、シリコーン、ポリプロピレン、セルロース、セルロース誘導体、ポリスルホンまたはポリエステルである。中空糸は、例えば膜濾過装置、布地または内装などに広く使用されている。

中空糸は簡単な押出によって製造されることが多いので、内側の穴は空であるか、または製造工程中は別の材料で満たされている。これにより、本発明の参照物質での使用にとって魅力的な中空糸が得られる。切片化すると、繊維は、細胞または細胞構造を模倣しうる予測可能な形態を示す。

したがって、検出可能実体は、参照標準中の中空糸を含むか、または参照標準中の中空糸に結合させることができる（中空糸は検出可能実体の支持体である）。さらに、中空糸が穴またはチャネルを含む場合、これらの穴またはチャネルは検出可能実体の経路を形成しうる。言い換えると、検出可能実体の細長い経路は、中空糸中のチャネルによって規定される。その場合、検出可能実体は、上記「チャネル」の項で述べたように1以上の中空糸チャネル内に置くことができる。

したがって、そのような実施形態では、中空糸自体を参照標準と見なしうることは理解されるだろう。

図10に、本明細書に記載の参照標準での使用に適した様々な中空糸を図解する。図10Aおよび図10Bは、中空糸のプロファイルまたは断面を示している。空洞またはチャネルが明確に見えている。図10Cは、いくつかの中空糸が各中空糸または全ての中空糸にカップリングされた1以上の同じまたは異なる検出可能実体を含みうる実施形態を示す。上記に代えて、または上記に加えて、当該または各中空糸の当該または各空洞もしくはチャネルは、同じまたは異なる検出可能実体を含むこともできる。

コアシェル型繊維は中空糸と同じ特性をいくつか有し、本明細書に記載する参照標準に使用することができる。コアシェル型繊維は、異なる材料でできた殻に取り囲まれた芯材料からなる。それら2つの材料は、例えばPVC、テフロン、ポリアミド、セルロース、セルロース誘導体、ポリスルホン、ポリエステルまたはポリカーボネートの組合せであることができる。

ブロックコポリマー
自己集合性高分子は予測可能な構造および形態を持つ材料になりうる。重要な高分子群の一つはブロックコポリマーである。したがって、本明細書に記載する参照標準では、高分子、例えば自己集合性分子ならびにブロックコポリマーの使用が考えられる。

ブロックコポリマーは、2以上の化学的に異なるホモポリマーのブロック（それぞれは線状の一続きの同一単量体）をつなぐことによって製造される。複数のホモポリマーブロックの組合せを使って、目的に合った物理特性を持つ材料を製造することができる。

一部のブロックコポリマーは、マクロ相分離により、マクロなドメイン構造に自発的に自己集合する。繰り返し構造は、例えば球状、円柱状、ダブルジャイロイド、ダブルダイアモンドまたはラメラ構造であることができる。

異なるポリマーブロックは異なる化学的特性を持つので、例えばさらにブロックの一つを選択的に修飾し、他のブロックを修飾せずに残しておくことなどができる。

自己集合性ブロックコポリマーの繊維は、本発明の参照物質での使用にとって魅力的である。切片化後は、繊維の高度に秩序だった構造が、細胞または細胞構造を模倣しうる予測可能な染色パターンおよび形態を与える。

参照標準形状
本明細書に記載する参照標準は任意の適切な形状をとりうる。

参照標準は無定形、例えば細長い無定形形状を持ちうるが、好ましくは所定の形状を持つ。これは一般的には球状の形をとりうるが、好ましくは、参照標準は多面体形状を持つ。

より好ましくは、参照標準は、実質的に、正多面体、角柱、直角柱、正直角柱、直方体、長方形箱および立方体からなる群より選択される形状を持つ。

参照標準は、好ましくは、長軸を持つように、細長い形状を持つ。好ましい実施形態では、検出可能実体によって規定される当該（または2以上存在する場合は各）細長い経路は、長軸に沿って、またはその長軸に実質上平行に、配置される。そのような縦方向の配向は好ましい。

著しく好ましい実施形態では、参照標準が直方体形状を持つ。本明細書で使用する直方体という用語は、互いに向き合っていて互いに直角につながれている3対の長方形面から構成された閉じた箱を指し、直平行六面体とも呼ばれる。直方体は、直角柱（平行六面体の特殊な例）でもあり、日常的には（長方形）「箱」と呼ばれているものに相当する。そのような好ましい実施形態では、検出可能実体を規定している当該または各細長い経路が、直方体の長辺に対して実質的に平行な配向にある。

スライスまたは切片を参照標品から採取する場合、それらは、好ましくは、検出可能実体がとる細長い経路に対して実質的に直角な平面で採取される。上記に代えて、または上記と組み合わせて、切片またはスライスを、参照標準の配向に対して横方向に採取することもできる。

支持媒体
検出可能実体を支持することができる任意の材料または媒体を「支持媒体」として使用することができる。

好ましくは、そのような支持媒体は、検出可能実体がその形状または形態を実質的に保つように、検出可能実体を支持する能力を持つ。好ましい実施形態では、支持媒体が細長い経路内の検出可能実体を支持する。支持媒体は、固体、半固体またはゲルを含みうる。支持媒体は、その上に例えば検出可能実体が支持されるマトリックスもしくはウェブまたはネットワークもしくはグリッドから構成されうる。このマトリックス、ウェブ等は、任意の適切な繊維性材料、例えば炭素繊維または繊維ガラスから構成されうる。目の粗いマトリックス、ウェブ等を使用して、実質的に開放的な構造にすることができる。あるいは、一定の実施形態では、より密な構造が好ましい場合もある。

著しく好ましい実施形態では、支持媒体が包埋媒体を含む。包埋媒体は、好ましくは、検出可能実体の少なくとも一部分、好ましくはその全体を、包囲または封入する。この目的には、例えば免疫組織化学（IHC）用またはインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）用の包埋媒体など、当技術分野で知られる任意の包埋媒体を使用することができる。ポリマー（好ましくは単量体の重合によって製造されるもの）を、後述のように、使用することができる。そのような包埋媒体の好ましい例には、パラフィンおよびアガロースが含まれる。

支持媒体または包埋媒体は均質であることもできるし、不均質であって他の材料を含むこともできる。この「他の材料」は、細胞、細胞の一部、組織断片、染料、顆粒状材料などを含みうる。

この他の材料を含める目的は、参照標準から採取される任意のスライスまたは切片に「グラウンド」または「バックグラウンド」を作ることである。この「グラウンド」の存在は、検出可能実体を含む所定の区域を、さらにより容易に検出または位置特定することを可能にする。すなわち、コントラストを増加させる。さらに、「グラウンド」の存在は、観察者が、支持媒体内の検出可能実体の存在または量を、より正確に決定することも可能にする。その理由は、眼がバックグラウンドに依存して同じ強度の2つのシグナルを異なる強度であると感じ取るという周知の「光学効果」にある。したがって例えば、臨床試料では、眼によって検出されるべきシグナル（例えば染色される細胞）は、他の細胞、異なるタイプの他の細胞、血管、骨組織などを含むバックグラウンドを持ちうる。したがって、支持媒体中に他の物質を使用することにより、問題の試料に由来するシグナルと類似する強度を持つ参照標準由来のシグナルを、眼が、異なる強度ではなく類似しているかまたは同一であると感じ取ることが保証される。

支持媒体または包埋媒体はさらに配向手段も含むことができる。配向手段は、使用者がその配向または方向または位置を決定するのを助けるかまたは可能にする媒体内の任意の可視表示を含みうる。配向手段は、媒体内の網目または線のネットワークを含みうる。配向手段は、1以上の平面にある1以上の概して平行な線を含みうる。好ましくは、それぞれが平行な線を含むそのような平面の三次元ネットワークが含まれる。したがって、マトリックスは、使用者がスライド上を観察する助けになるように、例えば亀甲金網のように見える可視構造を含む。なぜなら病理学者は「亀甲金網」構造を探すように訓練されるからである。

支持媒体または包埋媒体は、生物学的材料、例えば細胞、組織、器官など、またはそれらの任意の一部分、例えば細胞器官、細胞構造などを含みうる。生物学的材料は検出可能実体を完全に包囲するか、または検出可能実体からは位置的に離れていることができる。どちらの構成でも、平面切片またはスライスは、組織などの切片と共に、検出可能実体を含む所定の区域を含むだろう。前者の構成では、所定の区域が組織の切片内にあり、両者をより容易に比較しうる。

包埋媒体
著しく好ましい実施形態では、支持媒体が検出可能実体を包埋するので、これを「包埋媒体」と見なすことができる。包埋媒体は任意の適切な材料、例えば免疫組織化学において組織または試料を包埋するために使用される材料、例えばパラフィンなどを含みうる。

好ましくは、包埋媒体は不活性である。より好ましくは、包埋媒体は、放射線に対して透明であり、好ましくは可視光に対して透明である。

パラフィンは最もよく使用される包埋媒体であるが、他のどのタイプの適切な包埋剤でも、使用することができる。アラルダイトM、ダンマル樹脂、ジビニルベンゼン、ドゥルクパン（Durcupan）（Fluka）、エポキシ包埋媒体、エチレングリコールジメタクリレート、グリコールメタクリレート、ヒストクリル（Histocryl）包埋樹脂、ローウィクリル（Lowicryl）HM20、ブチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、メチルメタクリレート、パラフィンワックス、パラプラスなどの材料がある。包埋媒体は、メタクリル酸単量体およびスチレン単量体などの単量体の重合によって形成させることができる。重合によって包埋媒体を形成させる方法に関するさらなる詳細は、以下の「ポリマー」という見出しの項に記載する。

包埋媒体は氷、すなわち内部に組織などが包埋されている凍った水を含む凍結切片を含むことができる。したがって、一定の実施形態では、細長い経路が、試料組織、細胞、器官自体と同じ包埋媒体中に支持される。そのような実施形態は、参照標準用の切断切片と試料用の切断切片とを取り扱う必要がなく、単一の切断切片を取り扱うだけでよいので、有利である。

そのような参照標準の実施形態は、試料と同じ包埋媒体中に後述する繊維を包埋することによって達成することができる。あるいは、以下にさらに詳しく述べるように、検出可能実体の細長い経路を、その同じ支持媒体中のチャネルによって規定する。試料を支持媒体に包埋するのと同時に、またはその前に、またはその後に、その媒体中に細長い経路を規定しうることは、理解されるだろう。言い換えると、繊維は、支持媒体への試料の包埋に対して任意の時点で、支持媒体中に包埋（および/またはチャネル切断）することができる。好ましくは、細長い経路が繊維を含む場合は、これをFFPEにおけるパラフィン包埋工程の一部として包埋する。

切片およびマウンティング
参照標準は、単一物として用意して、それをさらに加工せずに使用することができる。しかし、好ましくは、参照標準はスライスまたは切片に切断して、それらの切片またはスライスをそれら自身標準として使用することができる。図2Cに図解するように、スライスまたは切片は、検出可能実体を含む所定の区域を含み、複数のスライスまたは切片を1つの参照標準から作製することができる。

検出可能実体を含むスライスまたは切片中の所定の区域が細長い形状の形態をとりうること、そしてそれらは支持媒体中に支持されるので、それら自体が、好ましくは、本明細書に記載する「参照標準」として処理されうることは、理解されるだろう。

スライスまたは切片は、任意の適切な手段（例えばベンチミクロトームまたはロッキングミクロトームなどのミクロトーム）を使って採取することができる。スライスまたは切片の厚さは典型的には標準的ミクロトームスライスの厚さである。好ましくは、スライスまたは切片は厚さが約0.5〜300μm、好ましくは5〜200μm、好ましくは約10〜100μm、好ましくは約1〜100μm、好ましくは約20〜30μm、最も好ましくは約2〜10μmである。非常に好ましい実施形態では、スライスまたは切片が厚さ5μm程度である。

FFPE試料の場合と同様の方法で、参照標準の複数の切片またはスライスを採取することができる。得られた参照標準の切片またはスライスは、他の任意の固定および包埋組織または細胞試料と同様に処理することができる。

参照標準のスライスまたは切片は、取り扱いを助けるために、適切な支持体にマウントすることができる。そのような支持体は、好適には、ガラス製または他の材料製のスライド、例えば顕微鏡スライドを含みうる。参照切片の切片またはスライスは、FFPE包埋材料の切片と同様の方法でマウントすることができる。そのようなマウント技術は当技術分野では知られている。切片またはスライスは一時的、永続的または半永続的にマウントすることができ、特に、例えば接着剤または表面張力によって、支持体に固定することができる。

スライスまたは切片は、スライスまたは切片を支持することができる材料の薄い平面的一片であるライナー上に置くこともできる。スライスまたは切片は、1つのライナー片に1つのスライスもしくは切片または複数のスライスもしくは切片を載せて、ライナーと共に輸送または販売することができる。例えば、そのようなライナーは、紙製、ボール紙製、プラスチック製、酢酸セルロース製などであることができる。ライナーの表面には、スライスまたは切片の付着を防止するための処理を、例えばシリコーンなどによって施すことができる。したがって、そのようなライナーの好ましい実施形態はシリコーン処理紙を含む。そのようなライナーを使用することにより、スライスまたは切片を、好ましくは患者から得た試料に続いて、顕微鏡スライドに容易にマウントすることができる。

スライドに切片を付着またはマウントする方法には、きれいなスライドを使用し、糊に頼らずに毛管引力に頼ることが含まれる。他の技術には、卵白グリセリン、グリセリン-ゼラチン混合物、酢酸ポリビニル糊、クロムミョウバンゼラチンおよびポリリジンコーティングなどの糊が含まれる。切片のマウントを容易にする手段としての切片の加熱または「バーニング（burning）」は、組織が破壊される可能性があるので、注意して用いるべきである。

支持体は、検出可能実体の定量化を助けるための指標を含みうる。そのような指標は、好ましくは、検出可能実体を含む区域の近傍に置くことができる。指標は検出可能実体の量に関係するか、または検出可能実体のその量もしくは性質に割り当てられた等級に関係することができる。

次に、スライスまたは切片中の染色量を試料中の染色量と比較することにより、後者の染色レベルの有意性を評価することができる。参照標準から採取したスライスまたは切片は加工操作に付すことが好ましいが、一部の実施形態では、参照標準そのものを加工することが望ましい場合もあることは理解されるだろう。

検出および可視化
参照標準は、既に可視状態にある検出可能実体、言い換えると、その存在または量を同定するためにさらなる加工を必要としない形態をとっている検出可能実体、を含みうる。したがって検出可能ラベルは、蛍光ラベルまたは放射性ラベルなどのラベルを含むことができ、あるいは放射線を放射する能力を持つ薬剤でタグ付けされうる。ラベルは好ましくは光を放射し、最も好ましくは、その光は蛍光の結果として放射される。検出可能実体は、検出可能ラベルによるシグナル放射（またはシグナル放射の変化）の検出によって、検出することができ、その検出は、検出可能ラベルを励起して蛍光放射を監視することをさらに含みうる。検出可能実体の存在量を示すために、放射されるシグナルの量を測定することができる。

ただし、好ましい実施形態では、参照標準は、その天然型から実質的に修飾されていない（例えば非標識の）検出可能実体を含む。そのような実施形態では、検出可能実体の存在および/または量は、例えば生物学的試料中の検出可能実体を明らかにするために通常とられる工程を設けることになどによって、参照標準をさらに加工しなければ、明らかにはならない。

したがって、検出可能実体に（好ましくは特異的に）結合する結合剤などの一次顕示手段の適用を用いることができる。さらに、検出可能実体、結合剤、またはそれら2つの組合せは、二次顕示手段を使って検出することができる。結合剤が抗体を含み、検出可能実体が抗原を含む場合は、抗体、抗原または抗原-抗体複合体を、二次抗体によって明らかにすることができる。二次抗体は、発色性基質と反応させた場合にシグナルを生成する能力を持つ酵素に、コンジュゲートすることができる。生物学的試料中の検出可能実体を顕示、検出または定量するために使用することができる任意の工程または任意の一連の工程を、参照標準またはその切片に適用できることは、理解されるだろう。好ましくは、そのような工程は、免疫組織化学で通常使用されているもの、例えばFFPE切片中の実体を検出するための検出工程などである。

参照標準の切片またはスライスは、特に、FFPE包埋試料またはその切片を染色するために用いられる操作の任意の1以上に付すことができる。したがって、参照標準のスライスまたは切片は、抗原を明らかにするために、組織試料の染色に用いられる典型的な包埋後操作の任意の1以上に付すことができる。好ましい実施形態では、切片またはスライスを、そのような操作の全てまたは実質上全てに付す。それゆえに好ましくは、切片またはスライスを、以下の任意の1以上、好ましくは全てに付す：スライドへのマウント、べーキング（baking）、脱パラフィン、再水和、抗原回復、ブロッキング、抗体への曝露、一次抗体への曝露、洗浄、二次抗体-酵素コンジュゲートへの曝露、酵素基質への曝露、発色性基質への曝露、および対比染色。

ベーキングとは、パラフィンスライスを載せたスライドを穏やかに加熱することを指す。パラフィンは部分的に融解し、組織がガラス表面に付着する。

好ましい実施形態では、検出可能実体を抗体に曝露し、抗体の結合をいくつかある方法のいずれかで可視化する。様々な免疫細胞化学可視化技術の概論については、例えば、Lars-Inge Larsson「Immunocytochemistry: Theory and Practice」（CRC Press inc.，フロリダ州ボカラトン，1998，ISBN 0-8493-6078-1）や、「Methods in Molecular Biology」シリーズのJohn D. Pound編「Immunochemical Protocols, vol 80」（Humana Press，ニュージャージー州トトワ，1998，ISBN 0-89603-493-3）を参照されたい。

免疫組織化学で最もよく使用される検出方法は、蛍光または金粒子の直接可視化および酵素による比色検出である。

直接蛍光試験の場合、ラベルは、例えば5-(および6)-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5-(および6)-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、テトラメチルローダミン、およびCy2、Cy3およびCy5などの染料、AMCAなどの置換されていてもよいクマリン、PerCP、R-フィコエリトリン（RPE）およびアロフィコエリトリン（APC）などのフィコビリタンパク質、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびその類似体、ならびにR-フィコエリトリンまたはアロフィロエリトリンと例えばCy5またはテキサスレッドとのコンジュゲート、ならびに半導体ナノ結晶に基づく無機蛍光ラベル（例えば量子ドットおよびQdot（商標）ナノ結晶）、ならびにEu3+およびSm3+のようなランタニドに基づく時間分解蛍光ラベルなどであることができる。

コロイド金またはコロイド銀は、電子顕微鏡法および光学顕微鏡法に、免疫細胞化学試験用の直接ラベルとして使用することができる。シグナルの増幅は、コロイド金粒子のさらなる銀増強によって得ることができる。

一般酵素法では、標識アビジンまたはストレプトアビジン-ビオチン（LABまたはLSAB）、アビジンまたはストレプトアビジン-ビオチン複合体（ABC）、酵素抗酵素複合体（PAPおよびAPAAP）、直接型デキストランポリマーベース抗体-酵素複合体（EPOS、DakoCytomation）、間接型デキストランポリマーベース抗体-酵素複合体（EnVision、DakoCytomation）またはダブルブリッジ酵素抗酵素複合体を使用する。

酵素染色では、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ（GAL）、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ（GO）などの酵素ラベルを使用する。

よく使用されるセイヨウワサビペルオキシダーゼ用基質の例には、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）、ニッケル増強付きのジアミノベンジジン、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC）、ベンジジン二塩酸塩（BDHC）、ハンカー-イエーツ（Hanker-Yates）試薬（HYR）、インドファンブルー（Indophane blue：IB）、テトラメチルベンジジン（TMB）、4-クロロ-1-ナフトール（CN）、□-ナフトールピロニン（□-NP）、o-ジアニシジン（OD）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（BCIP）、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、塩化2-(p-ヨードフェニル)-3-p-ニトロフェニル-5-フェニルテトラゾリウム（INT）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（TNBT）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-β-D-ガラクトシド/フェロ-フェリシアン化物（BCIG/FF）などがある。

よく使用されるアルカリホスファターゼ用基質の例には、ナフトール-AS-B1-ホスフェート/ファストレッドTR（NABP/FR）、ナフトール-AS-MX-ホスフェート/ファストレッドTR（NAMP/FR）、ナフトール-AS-B1-ホスフェート/ファストレッドTR（NABP/FR）、ナフトール-AS-MX-ホスフェート/ファストレッドTR（NAMP/FR）、ナフトール-AS-B1-ホスフェート/ニューフシン（new fuschin）（NABP/NF）、ブロモクロロインドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-d-ガラクトピラノシド（BCIG）などがある。

最も強力な検出系の一つは、触媒レポーター沈着法（CARD）である。この増幅法は、HRPの酵素作用による組織への標識チラミドの沈着に基づいている。HRP免疫染色後に、標識チラミドを適用し、HRP活性部位の近傍に結合させる。次に、結合した標識チラミドを、従来の蛍光検出または比色酵素検出によって検出する。

上述の標識化化合物は一般にプローブおよび抗体の両方（または所望の標的を検出するために使用される他の任意の物質）に適用することができる。

染色標本を見る方法には、明視野顕微鏡またはスキャナー、蛍光顕微鏡またはスキャナー、透過電子顕微鏡（TEM）または走査電子顕微鏡（SEM）などがある。

コストを下げ、スライド調製の均一性を増加させ、労力を要する定型的作業を減らし、最も重要なことには人為ミスを減らすために、自動染色システムが導入されている。

現在の自動システムは、免疫蛍光、間接免疫アッセイ操作、酵素または金染色法を含めて、どの免疫化学アッセイでも取り扱うことができる。現在の自動システムは、免疫組織化学アッセイの全工程を、複雑さや、それらの順序に関係なく、指定した時間および温度で実施する。

免疫組織化学技術では、従来、特異的抗原を同定し可視化するために特異的抗体を使用してきた。この技術は複雑で、特異的染色には多くの工程および高い親和性を持つ分子が必要である。

下記の別項に記載する「特殊染色」も、単独で、または免疫組織化学的可視化と組み合わせて、使用することができる。

染色および免疫染色
以下に、染色操作の個々の工程の一部について説明する。これらの工程のそれぞれ、または一部、または全部を、参照標準またはそのスライスもしくは切片に適用することができる。

固定剤は、細胞および組織を再現性よく生きている時のように保存するために必要である。これを達成するには、組織ブロック、切片または塗抹標本を固定液に浸漬するか、塗抹標本の場合は乾燥する。固定剤は細胞および組織を安定化し、よってそれらを加工および染色技術の苛酷さから保護する。

任意の適切な固定剤、例えばエタノール、酢酸、ピクリン酸、2-プロパノール、3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩二水和物、アセトイン（単量体の混合物）および二量体、アクロレイン、クロトンアルデヒド（シス＋トランス）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、四酸化オスミウム、パラホルムアルデヒド、塩化水銀、トリレン-2,4-ジイソシアネート、トリクロロ酢酸、タングステン酸などを使用することができる。好ましいタイプの固定剤としてホルマリン（ホルムアルデヒド水溶液）が挙げられ、中性緩衝ホルマリン（NBF）は最もよく使用されるものの一つである。他の好ましい保存剤には、グルタルアルデヒド、アクロレイン、カルボジイミド、イミデート、ベンゾキノン、オスミウム酸および四酸化オスミウムなどがある。

新鮮生検標本、細胞標本（捺印標本および血液塗抹標本を含む）、凍結切片および免疫組織化学解析用の組織は一般に、エタノール、酢酸、メタノールおよび/またはアセトンを含む有機溶媒中で固定される。

抗体
好ましい実施形態では、検出可能実体に結合する能力を持つ抗体を使って、その存在を明らかにする。

抗体は免疫グロブリン分子を含む。免疫グロブリン分子は、最も広義には、免疫グロブリンスーパーファミリー（2つのβシートと、通常は保存されたジスルフィド結合とを含有する抗体分子に特有の免疫グロブリンフォールドを含むポリペプチドのファミリー）のメンバーである。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系における広範な役割（例えば抗体、T細胞受容体分子など）、細胞接着への関与（例えばICAM分子）および細胞内シグナル伝達（例えば、PDGF受容体などの受容体分子）など、生体内で、細胞相互作用および非細胞相互作用の多くの側面に関与する。したがって、本明細書に記載する検出可能実体検出方法および参照標準使用方法では、標的に結合する能力を持つ任意の免疫グロブリンスーパーファミリー分子を利用することができる。免疫グロブリンに由来するペプチドまたは断片も使用することができる。

本明細書にいう抗体とは、選択した標的に結合する能力を持つ完全な抗体または抗体断片を指し、Fv、ScFv、F(ab')およびF(ab')₂、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体およびヒト化抗体を含む人工抗体、ならびにファージディスプレイ法またはその代替技術を使って作製される人工的に選択した抗体を含む。FvおよびScFvなどの小断片は、そのサイズが小さく、その結果として優れた組織分布を持つために、診断用途および治療用途にとって有利な特性を持つ。好ましくは、抗体は一本鎖抗体またはScFvである。

抗体は、毒素またはラベルなどのエフェクタータンパク質を含む改変抗体であってもよい。標識抗体の使用により、生体内での抗体の分布のイメージングが可能になる。そのようなラベルは、患者の体内で容易に可視化できる放射性ラベルまたは放射線不透過性ラベル、例えば金属粒子であることができる。さらに、蛍光ラベル（例えば本明細書に記載するもの）または患者から採取した組織試料上で可視化できる他のラベルであることもできる。エフェクター基を持つ抗体は、上述した任意の会合手段に連結することができる。

抗体は動物の血清から得るか、モノクローナル抗体またはその断片の場合には、細胞培養中で産生させることができる。組換えDNA技術を使って、細菌、酵母、昆虫、または好ましくは哺乳動物細胞培養中で、確立された手法に従って抗体を産生させることができる。選択する細胞培養系は、好ましくは、抗体産物を分泌する。

ハイブリドーマ細胞または哺乳類宿主細胞のインビトロでの成長は、通常の標準的培養培地である適切な培養培地、例えばダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）またはRPMI1640培地中、要すれば哺乳動物血清、例えばウシ胎仔血清、または微量元素および成長維持添加物、例えばフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ、2-アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸などを補給して行われる。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖も同様に当技術分野で既知の適切な培養培地で、例えば細菌の場合はLB、NZCYM、NZYM、NZM、テリフィックブロス、SOB、SOC、2×YT、またはM9最少培地などの培地で、酵母の場合はYPD、YEPD、最少培地、または完全最少ドロップアウト培地などの培地で行われる。

タンパク質を発現させるための宿主として昆虫細胞を使用することには、クローニングおよび発現工程が比較的容易で迅速だという利点がある。また、細菌発現または酵母発現と比較すると、正しく折りたたまれた生物学的に活性なタンパク質が得られる可能性も高い。昆虫細胞は、血清含有培地よりも安価で安全な無血清培地で培養することができる。組換えバキュロウイルスは、当技術分野では知られているように、発現ベクターとして、およびいくつかの鱗翅目細胞株のいずれか、特にSpodoptera frugiperda Sf9をトランスフェクトするために使用されるコンストラクトして、使用することができる。昆虫宿主細胞における組換えタンパク質の発現は、Altmannら（1999）Glycoconj J 1999, 16, 109-23ならびにKostおよびCondreay（1999）Curr Opin Biotechnol, 10, 428-33に概説されている。

インビトロ産生は、比較的純粋な抗体調製物をもたらし、所望の抗体を大量に得るためのスケールアップが可能である。細菌細胞、酵母、昆虫および哺乳類細胞培養の技術は当技術分野では知られており、例えば気泡反応槽もしくは連続撹拌反応槽における均一懸濁培養、または例えば中空糸中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上もしくはセラミックカートリッジ上での固定化もしくは封入細胞培養などがある。

哺乳類細胞を生体内で増殖させることによって、所望の抗体を大量に得ることもできる。この目的には、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、組織適合哺乳動物に注射して、抗体産生腫瘍を成長させる。任意に、その注射に先立って、動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの鉱油で感作する。1〜3週間後に、それらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、適切な骨髄腫細胞とBalb/cマウス由来の抗体産生脾細胞との融合によって得られるハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Sp2/0由来のトランスフェクト細胞を、任意にプリスタンによる前処理後に、Balb/cマウスの腹腔内に注射し、1〜2週間後に、それらの動物から腹水を採取する。

上記の技術および他の技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるKohlerおよびMilstein（1975）Nature 256: 495-497、US4,376,110、HarlowおよびLane「Antibodies: a Laboratory Manual」（1988，コールドスプリングハーバー）などで論じられている。組換え抗体分子の製造技術は上記の文献、ならびに例えば、参照により本明細書に組み込まれるEP0623679、EP0368684およびEP0436597などに記載されている。

細胞培養上清は、好ましくはイムノブロッティングにより所望の標的を発現している細胞の免疫蛍光染色により、酵素免疫アッセイ、例えばサンドイッチアッセイもしくはドットアッセイ、またはラジオイムノアッセイにより、所望の抗体についてスクリーニングされる。

抗体を単離するために、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対する透析、選択膜を通した濾過などによって、濃縮することができる。必要ならば、そして/または所望であれば、通常のクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE-セルロースでのクロマトグラフィーおよび/または免疫アフィニティクロマトグラフィー、例えば標的を含有するタンパク質またはプロテインAを使ったアフィニティークロマトグラフィーなどによって、抗体を精製する。

上記の手法に従って生成した抗体は、標準的手法に従って細胞から核酸を単離することによって、クローン化することができる。有用なことに、抗体の核酸可変ドメインを単離し、それを使ってscFvなどの抗体断片を構築することができる。

本明細書に記載する方法では、好ましくは、抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え核酸を使用する。当然、そのような核酸は、コード一本鎖核酸、コード核酸とそれに相補的な核酸とからなる二本鎖核酸、またはそれらの相補（一本鎖）核酸そのものを含む。

さらに、抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードする基準配列またはその突然変異体を持つ酵素的または化学的に合成された核酸であることができる。基準配列の突然変異体は、上述した抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインであって、その中の1以上のアミノ酸が欠失しているか、1以上の他のアミノ酸と交換されているものをコードする核酸である。好ましくは、修飾は、抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（CDR）外にある。そのような突然変異体核酸は、1以上のヌクレオチドが同じアミノ酸をコードする新しいコドンを持つ他のヌクレオチドで置き換えられているサイレント突然変異であることも考えられる。そのような突然変異配列は縮重配列でもある。縮重配列は、数多くのヌクレオチドが元々コードされているアミノ酸配列の変化をもたらさずに他のヌクレオチドで置換されるという点で、遺伝コードが持つ意味の範囲内で縮重している。そのような縮重配列は、異なる制限部位を持ち、および/または、重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインの最適な発現を達成するために特定の宿主、特に酵母、細菌または哺乳類細胞が好む特定コドンの頻度を持つので、有用でありうる。

突然変異体という用語は、当技術分野で既知の方法によるDNAのインビトロまたはインビボ突然変異誘発で得られるDNA突然変異体を包含するものとする。

組換えDNA技術は、抗体を改良するために使用することができる。従って、診断用途または治療用途におけるその免疫原性を減少させるために、キメラ抗体を構築することができる。さらに、CDR移植法［欧州特許第0239400号（Winter）］および要すればフレームワーク修飾法［欧州特許第0239400号、Riechmannら（1988）Nature 322: 323-327、および国際特許出願WO90/07861（Protein Design Labs）に概説されているもの］で抗体をヒト化することにより、免疫原性を最小限に抑えることもできる。

抗体の重鎖可変ドメインがヒト定常ドメインγ、例えばγ1、γ2、γ3またはγ4、好ましくはγ1またはγ4に融合されているものをコードするインサートを含む組換え核酸を使用することができる。同様に、抗体の軽鎖可変ドメインがヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合されているものをコードするインサートを含む組換えDNAも使用することができる。

さらに好ましくは、CDR移植抗体、好ましくはCDR移植軽鎖および重鎖可変ドメインだけであるものを使用することができる。有利には、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、要すれば、宿主細胞における抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列および/または抗体の精製を容易にするペプチドおよび/または切断部位および/またはペプチドスペーサーおよび/またはエフェクター分子をコードするDNAを含む、スペーサー基を使って連結される。そのような抗体はScFvsと呼ばれている。

抗体は、抗体遺伝子の突然変異誘発で人工的な抗体レパートリーを作製することによって、生成させることもできる。この技術により、後に詳述する抗体ライブラリーの作製が可能になる。抗体ライブラリーは市販品もある。したがって、人工的な免疫グロブリンレパートリー、好ましくは人工的ScFvレパートリーを免疫グロブリン供給源として使用することができる。

単離またはクローン化された抗体は、他の分子、例えば核酸またはタンパク質連合手段に、化学カップリングにより、当技術分野で既知のプロトコールを使って連結することができる（例えば、HarlowおよびLane「Antibodies: a Laboratory Manual」（1988，コールドスプリングハーバー）、ならびにManiatis, T.，Fritsch, E.F.およびSambrook, J.（1991）「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，Cold Spring Harbor Laboratory Press））。

核酸プローブ
上述のように、検出可能実体は核酸を含むことができ、核酸検出可能実体を含むそのような参照標準実施形態は、インサイチュハイブリダイゼーションにおける標準として、好適に使用される。そのような実施形態では、その核酸検出可能実体に結合する能力を持つ核酸プローブを使って、その存在を明らかにする。

核酸プローブは、特に好ましくは、少なくとも、検出可能実体中の配列にハイブリダイズする能力を持つ配列を含む。特に、核酸プローブは、少なくとも、そのような配列に相補的な配列を含みうる。核酸プローブは好ましくは一本鎖であり、特に一本鎖DNAまたは一本鎖RNAを含みうる。

本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸鎖を塩基対形成により相補鎖につなげるプロセス」を指す。好ましくは、核酸プローブは、ストリンジェントな条件下（例えば50℃および0.2×SSC｛1×SSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸Na₃、pH7.0｝）で検出可能実体中の少なくとも1つのヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を持つ配列を含む。より好ましくは、核酸プローブは、高ストリンジェント条件下（例えば65℃および0.1×SSC｛1×SSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸Na₃、pH7.0｝）でハイブリダイズする能力を持つ配列を含む。

検出可能実体中のヌクレオチド配列またはその相補体に選択的にハイブリダイズする能力を持つ核酸プローブは、一般的には、検出可能実体中の対応する相補ヌクレオチド配列の少なくとも20、好ましくは少なくとも25または30、例えば少なくとも40、60または100以上の連続するヌクレオチドからなる領域に対して、少なくとも75％、好ましくは少なくとも85または90％、より好ましくは少なくとも95％または98％相同であるだろう。好ましいプローブは、検出可能実体中のヌクレオチド配列に対して好ましくは少なくとも80または90％、そしてより好ましくは少なくとも95％相同な領域を、少なくとも1つは含む。

「選択的にハイブリダイズしうる」という用語は、核酸プローブが、バックグラウンドより有意に高いレベルで、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を持つことを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えばISH用に加工された試料中に他のヌクレオチド配列が存在するために生じうる。この場合、バックグラウンドは、標的DNAとの間に観察される特異的相互作用の10倍未満、好ましくは100倍未満の強さであるプローブとライブラリーの非特異的DNAメンバーとの間の相互作用によって生成するシグナルのレベルを暗示する。相互作用の強さは、例えばプローブを³²Pなどで放射標識することなどによって、測定することができる。

ハイブリダイゼーション条件は、BergerおよびKimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, カリフォルニア州サンディエゴ）に教示されているように核酸結合複合体の融解温度（Tm）に基づき、以下に説明するように所定の「ストリンジェンシー」を付与する。

最大ストリンジェンシーは、典型的には、約Tm−5℃（プローブのTmの5℃下）で生じ、Tmの約5℃〜10℃下では高ストリンジェンシー、Tmの約10℃〜20℃下では中ストリンジェンシー、Tmの約20℃〜25℃下では低ストリンジェンシーである。当業者には理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を含むプローブを同定するために使用することができ、中（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似または近縁ポリヌクレオチド配列を含むプローブを同定するために使用することができる。

検出可能実体中の配列に対して100％相同ではないが、プローブとして使用することができるヌクレオチド配列は、いくつかの方法で取得することができる。保存された配列は、例えばいくつかの変異体/相同体に由来するアミノ酸配列を整列させることによって、予測することができる。配列整列は、当技術分野で既知のコンピュータソフトウェアを使って実施することができる。例えばGCGウィスコンシンパイルアッププログラムは広く使用されている。

プローブは、組換え法、合成法または当業者が利用できる任意の手段によって、製造することができる。一般的には、プローブは、所望のヌクレオチド配列を一度に1ヌクレオチドずつ段階的に作製する合成手段によって製造される。自動技術を使ってこれを達成する技術は当技術分野では容易に利用することができる。

核酸プローブとして使用するためのさらに長いヌクレオチド配列は、一般に、組換え手段を使って、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使って、製造されるだろう。この技術では、クローニングしようとするターゲティング配列の領域に隣接する一対のプライマー（例えば約15〜30ヌクレオチドのもの）を作製し、それらのプライマーを動物またはヒト細胞から得たmRNAまたはcDNAと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（PCR生成）を実施し、増幅された断片を（例えば反応混合物をアガロースゲルで精製することなどによって）単離し、増幅されたDNAを回収することになる。増幅されたDNAを適切なクローニングベクターにクローニングすることができるように、プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。

核酸プローブは、当技術分野で知られる様々な手段で標識することができる。例えば、プローブは、³¹P、³³Pまたは³²Sなどの放射性ラベルを使って標識するか、ジゴキシゲニンなどのラベルまたは蛍光ラベル（当技術分野では非常に多くのものが知られている）を使って非放射性に標識することができる。

染色剤および染料
抗体は検出可能実体を明らかにする際に用いる結合剤として好ましいが、他の適切な染色剤または染料を使って、標的を明らかにすることもできる。例えば、繊維を着色するために典型的に使用される染料は、標的もしくは検出可能実体または繊維そのものを染色するために使用することができる。そのような染料は典型的には化学量論的に結合するので、多くの検出可能実体または繊維が存在するほど、多くの染料が結合する。しかし、存在および/または位置を明らかにするための簡単な染色で、十分な情報が得られる場合も多い。

「特殊」染色剤および染料
したがって、本明細書に記載する参照標準は、例えば抗体などを使った免疫学的認識によって染色しうるだけでなく、化学薬品を使って染色すること（これを「特殊染色」という）もできると理解すべきである。

最もよく使用されるのは、一般ヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色、例えば真菌由来の糖質などを同定するのに有用なゴモリのメテナミン銀染色（GMS）、ならびに例えばグリコーゲン、酸性および中性粘液物質、真菌細胞壁、基底膜、コラーゲン線維および細網線維などを同定するのに有用な過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色である。

トリクロームブルー、マッソントリクローム染色、プルシアンブルー、ギムザ、ディフクイック、レティキュラム（Reticulum）、コンゴーレッド、アルシアンブルー、ステイナー（Steiner）、AFB、PAP、グラム、ムチカルミン、ヴァーヘフ-ファン・ギーソン、エラスチカ（Elastic）、カルボールフクシンおよびゴルジ染色など、数多くの特殊染色製剤、変法および組合せがある。

上述の特殊染色剤の一部は、本明細書に記載の参照標準に容易に導入される染色標的プローブ、例えば一部の糖質または疎水性部分などを、特異的に染色することも、理解すべきである。さらに、1以上の免疫染色と1以上の特殊染色の任意の組合せを実行することもできる。

例えば、適切な染色剤および染料には、以下のものをどれでも含めることができる：1,4-フェニレンジアミン、塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム、2,4-ジニトロ-5-フルオロアニリン、2-ナフトール（β）、3,3'-ジアミノベンジジン、4-クロロ-1-ナフトール、4-クロロ-1-ナフトール、アクリジンオレンジ、アクリジンオレンジ塩酸塩水和物、プロテイン銀、アルシアンブルー8GX、アリザリン、アリザリンレッドS、アルカリブルー4B、モリブデン酸アンモニウム四水和物、アニリン塩酸塩、オーラミンO、アゾカルミンB、アゾカルミンG、アゾフロキシン、アズールA、アズールB、アズールII、アズールII-エオシン、アズール混合物sicc.ギムザ染色（Azure Mixture sicc. Giemsa Stain）、ベンガルローズB、ベンゾプルプリン4B、可溶性プルシアンブルー、不溶性プルシアンブルー、ビスマルクブラウンY(G)、ビスマルクブラウンR、塩基性硝酸ビスマス(III)、酢酸鉛(II)三水和物、クエン酸鉛(II)三水和物、硝酸鉛(II)、硝酸鉛（II）、酒石酸鉛（II）、四酢酸鉛、、ホウ砂カルミン液（Grenacher）、ブリリアントグリーン、ブリリアントクレシルブルー、'ブリリアントクレシルブルー'、ブリリアントクレシルブルー液、ブロモクレゾールグリーンおよび錯滴定、ブロモクレゾールグリーンナトリウム塩、ブロモクレゾールパープル、ブロモフェノールブルー、ブロモスルファレイン、ブロモチモールブルーナトリウム塩、カルボールフクシン染料粉末、カルボールフクシン液（Kinyoun）、カルボールフクシン液（Ziehl-Neelsen）、カルボールゲンジアナバイオレット液、カルボールメチレンブルー液、カルミン、カルミン酸、セレスチンブルー、キナクリンマスタード二塩酸塩、キノリンイエロー、クロラゾールブラック、酸化クロミウム(VI)、酸化クロミウム(VI)、クロモトロップ2Rおよび錯滴定、クリソイヂジンG、塩化第一コバルト無水物、ナフテン酸コバルト、約10％Co、シアノシン（Cyanosine）、ウマ心臓凍結乾燥塩類非含有粉末由来のシトクロムc、ウマ心臓由来のシトクロムc、ウマ心臓由来のシトクロムc、ウシ心臓由来のシトクロムc、ハト胸筋由来のシトクロムc、分別染色液、ダイレクトレッド、ダイレクトレッド80、ファストブルーB塩、ファストブルーBB塩、ファストブルーRR塩、ファストグリーンFCF、ファストレッド3GL塩、ファストレッドRC塩、ファストバイオレットB塩、エオシンアルコール可溶性、エオシンイエロイッシュ、エオシンイエロイッシュ液、エオシンヘマトキシリン液（Ehrlich）、エオシンメチレンブルー（Leishman）、エオシンメチレンブルー（Wright）、エオシンメチレンブルー、エオシンメチレンブルー液（Wright）、エオシンメチレンブルー液（Wright-Lillie）、エオシンスカーレット、エリオクロームレッドB、エリスロシンエキストラブルーイッシュ、酢酸液、エチルバイオレット、エバンズブルーFluka、染液（ボロヴィクツェニー（Boroviczeny）A：トルイジンブルー-サフラニン固定液）、染液（ボロヴィクツェニー（Boroviczeny）B：エオシン液）、ウマ脾臓由来のフェリチン、ファットレッドブルーイッシュ、ファットブラック、フルオレセインイソシアネート、フクシン、フクシン液、ガロシアニン、ゲンチアンバイオレット、ギムザ液、塩化金水和物（約52％Au）、塩化金水和物（ACS，＞49％Au）、金液、コロイド、ヘマラウン（Hemalaun）、ヘマテイン、ヘマトキシリン、ヘマトキシリン液A（Weigert）、ヘマトキシリン液B（Weigert）、ヘマトキシリン液（Boehmer）、ヘマトキシリン液（Delafield）、ヘマトキシリン液（Mayer）、ハンカー-イエーツ試薬、ハイエム液、ヘスペリジン、インジゴカルミン、塩化インジウム(III)水和物、塩化インジウム(III)無水物、塩化ヨードニトロテトラゾリウム、イソクロリダゾン液、ヤヌスグリーンB、二クロム酸カリウム、ヘキサヒドロキソアンチモン酸(V)カリウム、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸カリウム（Hg＜0.000005％，ACS）、カルミン液アンモニア性（Best）、カルミン液酸性（Mayer）、ヌクレアーファストレッド、コンゴーレッド，指示薬、クレゾールレッド、クレシルバイオレット酢酸塩、クリスタルバイオレット指示薬、クリスタルバイオレット液、ラクトフェノールブルー液、硝酸ランタン六水和物、ライトグリーンSFイエロイッシュ、リピッドクリムゾン（Lipid Crimson）、炭酸リチウム、ルゴール液、マラカイトグリーンシュウ酸塩、メイ・グリュンワルド液、メタニルイエロー、メチレンブルー塩化亜鉛複塩、メチレンブルー、メチレンブルー濃縮物（Ehr-lich）、メチレンブルー液アルカリ性（Loeffler）、メチレングリーン亜鉛複塩、メチルグリーン、メチルオレンジ、メチルバイオレット、モリン、ムチカルミン、N-(4-アミノ-2,5-ジエトキシフェニル)ベンズアミド、N,N-ジメチルアニリン、N,N-ジメチル-p-トルイジン、ナフトールAS-アセテート、ナフトールAS-BI-β-D-グルクロニド、（以下のナフトール誘導体は酵素（AP）基質である）、ナフトールAS-BI-ホスフェート二ナトリウム塩七水和物、ナフトールAS-BI-ホスフェート、ナフトールAS-BI-ホスフェート、ナフトールAS-BS-ホスフェート、ナフトールAS-クロロアセテート、ナフトールAS-D-アセテート、ナフトールAS-D-クロロアセテート、ナフトールAS-E-アセテート、ナフトールAS-E-ホスフェート、ナフトールAS-MX-アセテート、ナフトールAS-MX-ホスフェート二ナトリウム塩九水和物、ナフトールAS-MX-ホスフェート，組織学用、ナフトールAS-ホスフェート，組織学用、ナフトールAS-TR-ホスフェート、ナフトールAS-TR-ホスフェート、ナフトールブルーブラック、ナフトールイエローS、ナフトールグリーンBおよび錯滴定、タングステン酸ナトリウム二水和物、チョウジ油、塩化ネオテトラゾリウム、ニューコクシン、ニューフクシン、ニューメチレンブルーN、ニュートラルレッド、ニグロシンBアルコール可溶性、ニグロシン水溶性、ナイルブルーA、塩化ナイルブルー、ニンヒドリン、ニンヒドリン、ニトラジンイエロー、塩化ニトロテトラゾリウムブルー、塩化ニトロテトラゾリウムブルー、ニトロテトラゾリウムブルークロル、オレンジG、オレンジG液（アルコール性）、オルセイン、オルセイン、塩化パラジウム(II)無水物、酸化パラジウム(II)水和物、パラフクシン、パラフクシン塩酸塩、セイヨウワサビ由来のペルオキシダーゼ（凍結乾燥粉末塩類非含有約100U/mg）、フェノサフラニン、リンモリブデン酸アンモニウム塩水和物、リンモリブデン酸水和物、リンモリブデン酸ナトリウム塩水和物、五酸化リン、リンタングステン酸水和物、フタロシアニン、水で湿らせたピクリン酸（H2O約40％）、ヨウ化ピナシアノール、酸化白金（IV）水和物、ポンソーBS、ポンソーS、ピリジン、ピロニンY(G)、レゾルフィン、ローダミンB、塩化ルテニウム(III)無水物、ルテニウムレッド、サフラニンT、サフラニン液（Olt）、酸性フクシンカルシウム塩、酸性フクシン指示薬、スカーレットR、アルデヒド用シッフ試薬、銀，コーデックスフランス（Codex France），コロイド状、硝酸銀、シリウスローズBB、'ステインズ・オール（Stains all）'、スーダンブルーII、スーダンオレンジG、スーダンレッドB、スーダンブラックB、スルホローダミンB酸塩化物、タルトラジン、塩化テトラニトロブルーテトラゾリウム、塩化テトラゾリウムブルー、テトラゾリウムバイオレット、硝酸タリウム(I)、チアゾールイエローG、吸着指示薬、臭化チアゾリルブルーテトラゾリウム、チオカルボヒドラジド、チオフラビンT、酢酸チオニン、トルイジンブルー、トロパエオリン000No.1、トロパエオリン000No.2、トリパンブルー、トリパンブルー液，0.4％、チュルク（Tuerk）液、酢酸ウラニル二水和物、硝酸ウラニル六水和物、バリアミンブルーB塩、ベスビン（Vesuvine）液（Neisser）、ビクトリアブルーB、ウォーターブルー、ワイゲルト液、タングストケイ酸水和物、ライト染剤、キシレンシアノールFF（酸化還元指示薬）。

抗原回復
固定された組織における特異的認識を容易にするには、多くの場合、標的の大部分の反応性を増加させるために、標本を前処理することによって標的を賦活またはアンマスクする必要がある。この操作を「抗原回復」、「標的回復」または「エピトープ回復」「標的アンマスキング」または「抗原アンマスキング」という。抗原回復（抗原アンマスキング）の広範囲にわたる概説は、Shi S-R，Cote RJ，Taylor CR「Antigen retrieval immunocytochemistry: past, present, future.」J Histochem Cytochem 1997：45(3)；327-343に見いだすことができる。

抗原回復または標的賦活には、特異的検出試薬との相互作用に関する標的の利用可能性を最大にする様々な方法が含まれる。最も一般的な技術は、適当な緩衝液におけるタンパク質分解酵素（例えばプロテイナーゼ、プロナーゼ、ペプシン、パパイン、トリプシンまたはノイラミニダーゼ）による酵素消化、または通常はEDTA、EGTA、トリス-HCl、クエン酸、尿素、グリシン-HClもしくはホウ酸を含有する適当にpH安定化した緩衝液におけるマイクロ波照射、通常オーブンでの加熱、オートクレービングまたは加圧調理を使った熱誘発エピトープ回復（HIER）である。

界面活性剤は、エピトープ回復を増加させるためにHIER緩衝液に加えるか、非特異的結合を低下させるために希釈媒体および/または洗浄緩衝液に加えることができる。

また、試薬類のインキュベーション前またはインキュベーション中の真空および超音波の適用または切片の凍結および融解を含む、様々な物理的方法によって、信号対雑音比を増加させることもできる。

内在性ビオチン結合部位または内在性酵素活性（例えばホスファターゼ、カタラーゼまたはペルオキシダーゼ）を、染色操作の1工程として除去することができる。

同様に、HSA、BSA、オバルブミン、ウシ胎仔血清もしくは他の血清などの不活性タンパク質、またはツィーン20、トリトンX-100、サポニン、ブリッジもしくはプルロニックなどの界面活性剤による非特異的結合部位のブロッキングは、広く使用されている。特異試薬の非標識型および標的非特異型による組織中または細胞中の非特異的結合部位のブロッキング。

その他の技術
いわゆる「free floating(自由浮動)技術」を使用する染色方法では、組織切片が懸濁液中の様々な試薬および洗浄緩衝液と接触させられるか、または例えば微量遠心チューブなどの適切な容器中で自由浮動させられる。

組織切片は、染色手順中に、例えば「釣り針様」器具、スパチュラまたはガラスリングを用いて、様々な試薬および緩衝液と共にチューブからチューブへ移すことができる。

様々な試薬および緩衝液は、穏やかなデカンテーションまたは真空吸引によってさらに変化させることもできる。あるいは、組織切片を備える容器の内容物をCorning社製「Netwell」などの特殊染色ネット内にあけて、そして組織切片を洗浄して次の染色工程のためにチューブへ戻すこともできる。

例えば固定、抗原回復化、洗浄、ブロッキング試薬、免疫特異的試薬とのインキュベーションを含むすべての個々の染色手順の工程、および例えば着色色素の酵素触媒発色は、組織切片が自由に浮動しているか、またはネット上に保持されている間に実施される。色素の発色後、組織切片はスライド上に載せられ、乾燥させられた後に、対比染色させられ、そしてカバースリップが被せられた後に例えば顕微鏡で分析される。

場合によっては、組織切片は免疫特異的試薬との臨界的インキュベーション後にスライド上に載せられる。次いで、残りの染色工程は、スライド上に載せた組織切片に対して実施される。

フリーフローティング法は、主として厚みのある組織切片に使用されている。染色工程中に組織切片を決して完全に乾燥させてしまわないことが重要である。

フリーフローティング法の長所には、免疫組織化学的染色用試薬が均一かつ良好に浸透する点が含まれる。フリーフローティング法を使用すると、高濃度の試薬を使用でき、良好な混合が可能になる。

組織学的材料、技術および分析
一般に、組織学的材料は2つのカテゴリーに分けられる。本明細書に記載した参照標準は、各タイプの分析に適切に使用できる。

第1カテゴリーには、一般にアルデヒドを基剤とする固定剤を用いて固定されていない新鮮組織および/または細胞である標本が含まれる。これらの試験片は一般に、組織化学的に分析しなければならない、外科手技の進行中に分析できる生検材料(冷凍切片)、細胞学的標本(例えば捺印標本および血液塗抹を含む)、および組織を含んでいる。そのような試験片はスライドもしくはカバースリップ上に直接載せられるか、または冷凍されてスライド上で切片作製される。そのような試験片は、次に通常はアルコールもしくはアセトンを基剤とする固定剤を用いて固定され、そして染色される。

より一般的な第2カテゴリーには、固定したパラフィン包埋組織試験片、多くの場合に保存された物質が含まれる。これらはしばしば、「ホルマリン固定およびパラフィン包埋」(FFPE)試験片と呼ばれている。これらの試験片は、通常はホルマリンを基剤とする固定剤を用いて固定され、例えばキシレンを用いて脱水され、例えばパラフィンもしくはプラスチック(例えば、Epon、Araldite、Lowicryl、LR Whiteもしくはポリアクリルアミド)などの適切な包埋媒体中に包埋され、切片作製してスライド上に載せられ、脱パラフィンされるか、またはさもなければ処理され、再水和させられ、そして染色される。

生物学的試料は、染色して参照標準と比較する前に、本明細書に記載されるような細胞学的および組織学的技術を用いて処理することができる。

試料は精製もしくは濃縮することができるか、または分析前に細胞を単離することができる。試料は、さらに分析前にパラフィン中に包埋して切片作製することができる。そのような手順は、当業者には容易に知られている。

試料は支持体上に載せることができる。用語「載せられる」は、実質的に平面状の支持体上に置かれるか、またはそれに付着させられることを意味する。あらゆる適切な支持体を用いることができる。例えば顕微鏡用スライド上で可視化するために、支持体上に組織もしくは細胞試料を置く工程が含まれる。試料は、さらに支持体の取り扱い中に試料が落下したり、滑り落ちたりするのを防止するために付着させることができる。支持体へ付着させる方法には、物理的な毛細管引力、接着剤および化学的結合に依存する工程が含まれる。この試料は固定されても、または固定されなくてもよい。

詳細には、支持体はガラススライド、膜、フィルター、ポリマースライド、チャンバースライド、皿、またはペトリ皿であってよい。

試料もしくは試料の一部分は、適切には分析前に支持体上で直接的に増殖もしくは培養させることができる。適切な培地の例には、血清もしくは組織抽出物などの生物学的起源の培地;化学的に規定された合成培地；またはそれらの混合物が含まれる。細胞培養は、通常は例えばガラスもしくはプラスチック面上、フラスコ中もしくはチャンバースライド上の細胞単層として、または液状もしくは半固形培地中の懸濁液としてのいずれかで増殖させられる。細胞は、例えばガラススライドなどのより適切な支持体上に移して載せることができる。例えば顕微鏡で可視化するために適合するチャンバースライド上で増殖させると、細胞は支持体上に残存する可能性がある。

しかし、細胞を分析前に増殖させるか、または培養する必要はない。多くの場合、試料は培養せずに直接分析される。直接分析のための試料は上記に記載した処理方法を受ける場合があることを理解されたい。

試料は、直接的に、または1つ以上の処理工程を受けた後のいずれかに、主として2つの主要タイプの方法、つまりインサイチュ法(インサイチュ分析)およびインビトロ法(インビトロ分析)で分析することができる。

これに関連して、インサイチュ法は試料細胞の形態が本質的に保存されるアッセイであると理解されたい。「本質的に保存される」は、組織もしくは細胞の構造的組成の一部もしくは全部を同定できるようにするために、すべての形態が保存されることを意味する。その例は、塗抹標本、生検標本、捺印標本および支持体上での試料の伸展である。試料は、分析前に場合によって固定、透過化、またはその他の処理工程を受ける可能性がある。

インビトロ法は、全体的形態が保存されない方法であると理解されたい。インビトロ法の場合には、試料は細胞構造の形態を破壊する処理を受ける。そのような処理法は当業者には知られており、有機溶媒による処理、高濃度のチオシアン酸グアニジンなどの強力なカオトロピック試薬による処理、酵素処理、界面活性剤処理、ビーズビーティング、熱処理、超音波処理および/またはフレンチプレスの適用が含まれる。

詳細な手順
以下の項では、FFPE試料の作製手順、ならびに抗体染色手順および検出手順について詳細に説明する。これは標準的教科書であるEd Harlow(編者), David Lane(編者)による「抗体:実験マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」(1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855から取り出した。

パラホルムアルデヒドの調製
ホルムアルデヒドからパラホルムアルデヒドへの重合を阻害するために10-15%メタノールを用いて標準的な市販の37%ホルムアルデヒド溶液を安定化させる。ほとんどの固定剤に対して、市販のホルムアルデヒドの代わりにパラホルムアルデヒドを使用すべきである。パラホルムアルデヒドは水に溶解して工程中にホルムアルデヒドを遊離させる。パラホルムアルデヒドの4%溶液を調製するには、8gを水100 mLに添加する。ヒュームフード内で60℃へ加熱する。溶解を促進するために数滴の1N NaOHを添加する。固体が完全に溶解したら、この溶液を室温へ冷却させ、100 mLの2×PBSを添加する。このストック液は、毎日新しく調製しなければならない。

パラフィン包埋組織切片の調製
1. 約1 cm²×0.4 cmの小さなブロックを切断する。2. 新しく調製した4%パラホルムアルデヒド溶液またはブアン固定液のどちらかの中に入れる(1 Lを調製するためには、500 mLの脱イオン水中に2 gのピクリン酸を溶解させる。ワットマン1番濾紙もしくは同等物に通して濾過する。パラホルムアルデヒド20 gを添加し、そしてヒュームフード内で60℃へ加熱する。溶解させるために数滴の1N NaOHを添加する。冷却して500 mLの2×PBSを添加する)。3. 2時間から一晩インキュベートする。4. 標準のパラフィン包埋法に従う。5. 4 μm切片を清潔なガラススライド上に採取する。6. 60℃のオーブンに30分間入れる。7. キシレン中でろうを除去する。3分間毎に2回取り換える。8. 段階的にアルコールを通過させることによって再水和させる(無水エタノールを3分間毎に2回取り換え、その後に95%エタノールを3分間毎に2回取り換える)。9. 水中ですすぎ洗いする。

これで、以下に記載するように、試験片に抗体を適用することができる。

ペルオキシダーゼ標識検出法を使用しなければならない場合は、抗体を適用する前に試験片内の内因性酵素活性の遮断または阻害が必要になることがある。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングするためには、試験片を20分間にわたりメタノール4部対3%過酸化水素1部からなる溶液と一緒にインキュベートする。過酸化水素は一般に30%溶液で供給され、約1カ月間は品質が維持される4℃で保存すべきである。脾臓または骨髄などの高ペルオキシダーゼ活性を含有する試験片に対しては、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)中の0.1% 塩酸フェニルヒドラジン溶液を使用することによってより良好な結果が得られる。

固定
全固定プロトコールは、(1)抗原漏出を防止し、(2)抗体の接近を許容するために細胞を透過化し、(3)抗体が効率的に認識できるような形態で抗原を保持し、そして(4)細胞構造を維持しなければならない。

一般に広範囲の固定剤が使用されており、正しい方法の選択は、試験対象の抗原の性質および抗体標本の特性に左右されるであろう。固定法は一般に、有機溶媒法および架橋試薬法の2つのクラスに分類される。アルコールおよびアセトンなどの有機溶媒は、脂質を除去して細胞を脱水させ、細胞構造上のタンパク質を沈降させる。架橋試薬は、通常は遊離アミノ基を介して分子間架橋を形成するので、したがって架橋抗原網を作り出す。どちらの方法もタンパク質抗原を変性させる場合があるので、そこで、細胞染色のためには変性したタンパク質に対して調製された抗体の方が有用な可能性がある。一部の場合は、機能できる唯一の抗体は抗変性タンパク質抗体である。

パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド中での付着した細胞の固定
パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド中などのタンパク質架橋試薬中での固定は細胞構造を有機溶媒より良好に保持するが、一部の細胞成分の抗原性を低下させることがある。パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドによる単純な固定は抗体が試験片に接近するのを許容しないので、このため有機溶媒または非イオン性界面活性剤を使用する透過化工程が続いて行われる。有機溶媒は容易に使用できるが、細胞構造の一定の要素を破壊することがあるので、パラホルムアルデヒドによる事前の固定は細胞構造を保存するのに役立つ。細胞構造の保存が重要である場合は、最善の第1選択は非イオン性界面活性剤を使用することである。

1. 染色の前に、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド溶液のどちらかを調製する。パラホルムアルデヒドについては、4%溶液を調製する。グルタルアルデヒドについては、PBS中の1%溶液(電子顕微鏡等級)を調製する。注意:グルタルアルデヒドは毒性である。ヒュームフード内で作業すること。2. PBS中でカバースリップ、スライド、またはプレートを静かに洗浄する。3. パラホルムアルデヒドについては、室温において4%溶液中で10分間インキュベートする。グルタルアルデヒドについては、室温においてヒュームフード内の1%溶液中で１時間インキュベートする。4. PBSで細胞を2回洗浄する。この段階で、グルタルアルデヒドによって固定した細胞をヒュームフードから取り出すことができる。5. 以下のいずれかの中でインキュベートすることによって、固定した細胞を透過化する:(i)PBS中の0.2% Triton X-100を室温で2分間。一部の抗原は15分間を要することがある。これを各抗原に対してチェックする;(ii)メタノールと室温で2分間;または(iii)アセトンと室温で30秒間(組織培養プレート上で増殖させた細胞に対しては、50%アセトン/50%メタノールを使用する)。(任意で)グルタルアルデヒドについては、室温で2時間、0.2M エタノールアミン(pH 7.5)と一緒にインキュベートすることによって、またはPBS中の0.5 mg/mL水素化ホウ素ナトリウムを用いて5分間毎に3回取り換えながらインキュベートすることによって遊離反応性アルデヒド基をブロッキングする。これは一部の場合にパラホルムアルデヒド固定細胞にも役立つことがあるが、一般には不要である。6. 5分間にわたってPBS中で4回取り換えて静かにすすぎ洗う。

これで、以下に記載するように、試料へ抗体を適用する準備が整う。

プロテアーゼによる隠れたエピトープのアンマスキング
ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド中での固定は、一部のエピトープをマスキングまたは変化させることがある。これらのエピトープは、しばしば試料をプロテアーゼ中で穏やかにインキュベートすることによって再露出させることができる。トリプシンが良好に作用する。試験片を室温において0.1%トリプシン、0.1% CaCl₂、20mM Tris(pH 7.8)溶液中で2-20分間インキュベートする。試験片を低温の水道の流水下で5分間すすぎ洗うことによって消化を停止させる。

付着した細胞に抗体を結合させる
抗体は、一般に試験対象の組織の細胞領域へ直接適用する。

1. 細胞を固定かつ洗浄する。加湿チャンバー内にカバースリップ、スライドまたはプレートを配置する。スライドまたはカバースリップは、水飽和フィルターを含有するペトリ皿内に配置することができる。カバースリップはパラフィルム層上に置くのが最もよい;これは抗体溶液がカバースリップの辺縁から流れ落ちるのを停止させるために役立ち、パラフィルムは圧縮性であるので、鉗子でカバースリップをつまみ上げるのを容易にする。2. 一次抗体溶液を添加する。全希釈はタンパク質含有溶液中で実施しなければならない。例えば、3% BSAを含有するPBSを使用する。未標識一次抗体に対して:モノクローナル抗体を組織培養上清として適用するのが最もよい(20-50 mg/Lの特異的抗体濃度、正確に使用する)。腹水、精製モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびに粗ポリクローナル血清は、0.1-10 mg/Lの特異的抗体濃度を産生することが目指される範囲内の希釈率で試験すべきである。抗体試料の特異的抗体濃度が不明の場合は、出発物質の1/10、1/100、1/1000、および1/10,000の希釈液を調製して試験する。標識一次抗体に対して:一次抗体は、酵素、蛍光色素、またはヨウ素を用いて標識できる。正確な作用範囲を決定するためには、予備試験において数種の希釈率でアッセイしなければならない。濃度が高すぎると高度のバックグラウンドが生じる;濃度が低すぎると試験下の抗原の存在度および抗体の特異性の両方に左右される。3. 室温の加湿チャンバー内でカバースリップ、スライド、またはプレートを少なくとも30分間インキュベートする。いくつかの反応について、24時間までの長時間のインキュベーションは感受性を増加させる可能性がある。4. 5分間にわたってPBS中で3回取り換えながら洗浄する。バックグラウンド問題に役立つように、この緩衝液には1% Triton X-100またはNP-40を添加することができる。

一次抗体が標識されると、試験片を検出工程に進める準備が整う。また別な方法では:

5. 標識二次試薬を適用する。すべての希釈をPBS中の3% BSAまたはPBS中の1%免疫グロブリン(検出試薬と同一種から調製する)などのタンパク質含有溶液中で実施するのが不可欠である。有用な二次試薬には、抗免疫グロブリン抗体、プロテインA、またはプロテインGが含まれる。それらは、酵素、蛍光色素、金、またはヨウ素を用いて標識できる。標識二次試薬は、数社の供給業者から購入できるか、または調製することができる。酵素標識試薬について:市販の標本を使用する場合は、1/50から1/1000の第2抗体の希釈率を試験する。アルカリホスファターゼ標識試薬は、PBSではなくTris緩衝生理食塩水を用いて取り扱うべきである。蛍光標識試薬について:市販の標本を使用する場合は、1/10から1/300の希釈率を試験する。金標識試薬について:PBS中で金粒子を1回洗浄する。1%ゼラチンを含有するPBS中で希釈し、試験片に添加する。ヨウ素標識試薬について:ヨウ化抗体を約0.1 mg/Lで添加する。通例は、10から100 Ci/gの特異的活性を使用する。

6. 室温の加湿チャンバー内で標識二次試薬と一緒に少なくとも20分間インキュベートする。金標識試薬につては、十分なシグナルが得られるまで顕微鏡下で定期的に観察する。7. PBS(またはTris生理食塩液)中で5分間にわたって3回取り換えながら洗浄する。

これで試験片を検出工程にかける準備が整う。

酵素標識試薬を用いた検出
酵素標識試薬は、酵素作用後に沈降し、酵素局在部位で不溶性着色生成物を産生する可溶性色原体性基質を用いて検出される(Avrameas and Uriel 1966; Nakane and Pierce 1967a,b; Avrameas 1972)。各酵素に対してはある範囲の基質を利用することができ、以下のプロトコールは最も有用な代替法の一部を表している。広範囲の共役結合試薬は市販で入手できるか、または記載されたとおりに調製できる。酵素は、抗免疫グロブリン抗体、プロテインA、プロテインG、アビジン、またはストレプトアビジンに結合させることができる。

ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識試薬
ジアミノベンジジン、クロロナフトール、およびアミノエチルカルバゾールを含むある範囲の基質が有用である。好ましい実施形態では、ジアミノベンジジンの使用が指示されている。

ジアミノベンジジン
ジアミノベンジジン(DAB)は最も一般的に使用される基質であり、ホースラディッシュペルオキシダーゼに対して最も高感受性の基質である。DABは、水およびアルコールのどちらにも不溶性である強い褐色の生成物を産生する。DAB染色は、広範囲の一般的な組織学的染色液と適合する。

1. 6 mgのDAB(DAB四塩酸塩を使用する)を10 mLの0.05M Tris緩衝液(pH 7.6)中に溶解させる。2. H₂O中のH₂O₂の3%溶液0.1 mLを添加する。H₂O₂は一般に30%溶液で供給され、約1カ月間は品質が維持される4℃で保存すべきである。3. 沈降物が現れたら、ワットマン1番濾紙(または同等物)に通して濾過する。4. 試験片に適用し、1-20分間インキュベートする。水中で洗浄することによって反応を停止させる。(任意で)必要であれば、対比染色する。5. DPXに載せる。

ジアミノベンジジン/金属
ホースラディッシュペルオキシダーゼに対するジアミノベンジジン基質は、基質溶液にコバルトまたはニッケルなどの金属塩を添加することによってより高感受性にすることができる。この反応生成物の色はスレートグレーから黒色であり、この生成物は水中およびアルコール中のどちらにおいても安定性である。DAB/金属染色は、広範囲の一般的な組織学的染色液と適合する。

1. 6 mgのDAB(DAB四塩酸塩を使用する)を9 mLの0.05M Tris緩衝液(pH 7.6)中に溶解させる。2. H₂O中の塩化ニッケルの0.3%(W/V)ストック液1 mLを添加する(代替物として同一量の塩化コバルトを使用できる)。3. H₂O中のH₂O₂の3%溶液0.1 mLを添加する。H₂Oは一般に30%溶液で供給され、約1カ月間は品質が維持される4℃で保存すべきである。4. 沈降物が現れたら、ワットマン1番濾紙(または同等物)に通して濾過する。5. 試験片に適用し、1-20分間インキュベートする。H₂O中で洗浄することによって反応を停止させる。(任意で)必要であれば、対比染色する。6. DPXに載せる。

結合
検出可能実体は、多数の方法によって繊維へ結合させることができる。例えば、検出可能実体は、臭化シアンを使用することによって繊維へ結合させることができる。

化学架橋剤を使用して、例えばリガンド−受容体相互作用、３次構造における構造変化、またはタンパク質標識化を試験する目的で、タンパク質を共有結合により修飾する。架橋剤は、2つの同一反応性基を含有するホモ二官能性架橋剤、または2つの相違する反応性基を備えるヘテロ二官能性架橋剤に分けられる。ヘテロ二官能性架橋剤は、重合を最小限に抑える連続的共役を可能にする。

これらの試薬の各々は、例えばCalbiochem社(第2欄にコード番号)、またはPiece Chemical Company社などの多数の製造業者から入手できる。

繊維は、その反応性を増加させるために、結合前に活性化することができる。好ましい実施形態では、繊維はクロロ酢酸を使用し、その後にEDAC/NHS-OHを用いて結合させることによって活性化される。繊維は、さらにまた一級アミノ基を生じさせるためにヘキサンジイソシアネートを用いて活性化することができる。そのような活性化繊維は、いずれかのヘテロ二官能性架橋剤と組み合わせて使用することができる。一定の実施形態における繊維は、ジビニルスルホンを用いて活性化される。そのような活性化繊維は、例えばペプチド上でアミノ基もしくはチオール基と反応できる成分を含んでいる。

繊維は、さらにまたアミノ基またはチオール基と反応することのできる成分を生じさせる塩化トレシルを用いて活性化することもできる。繊維は、さらにまたアミノ基またはチオール基と反応できる成分を生じさせる塩化シアノゲンを用いて活性化することもできる。

ペプチド結合
好ましい実施形態では、検出可能実体にはペプチドが含まれる。本項ではペプチドの繊維への結合について詳細に説明する。

ペプチドは、固相合成法によって入手できる。Merrifieldによって最初に導入されたこの技術(R. B. Merrifield、「固相ペプチド合成。テトラペプチドの合成(Solid Phase Peptide Synthesis. The synthesis of a Tetrapeptide)」、J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154頁, (1963)およびR. B. Merrifield、「固相合成法(Solid Phase Synthesis)」、Science 232, 341-347頁, (1986))の第1段階は、ポリマー支持体上の保護アミノ酸誘導体とのペプチド鎖アッセンブリーから構成される。この技術の第2段階は、粗遊離ペプチドを生じさせるための全側鎖保護基の同時開裂を伴う支持体からのペプチドの開裂である。これらの工程を連続的に繰り返すと、より大きなペプチドを入手することができる。

この方法の柔軟性は、天然型および非天然型アミノ酸、相違するリンカーおよびいわゆるスペーサーを備えるペプチドを含む長鎖状、短鎖状および分枝状ペプチドの合成を可能にする。スペーサーは、典型的にはポリエチレングリコール、PEG誘導体またはポリアルカンもしくはホモポリアミノ酸から構成される。固相合成法は、繊維材料への化学選択的結合スキームのために、末端に反応性官能基を備える例えば遊離チオール類などのペプチドの調製を可能にする。

アミノ酸の配列は、特異的抗体との免疫反応性を増強するために最終ペプチド配列において繰り返すことができる。反復かつ反応性配列は、直鎖状ペプチド内の非関連性のアミノ酸配列で間隔をあけることができる。さらに、多抗原ペプチド(MAP)などの分枝状または樹枝状ペプチド構築体を合成することによって、免疫反応性を増強することができる。

様々な化学的保護スキームならびに固体および可溶性支持体を含む一般的方法を概観するためには、例えば、G. Barany, N. Kneib-Cordonier, D. G. Mullen、「固相ペプチド合成:25周年記念報告書(Solid-phase peptide synthesis:A silver anniversary report)」、Int. J. Peptide Protein Res. 30, 705-739頁, (1987)、およびG. B. Fields, R. L. Noble、「9-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸を利用した固相ペプチド合成(Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids)」、Int. J. Peptide Protein Res. 35, 161-214頁(1990)を参照されたい。

ペプチドを入手するためのその他の方法には、酵素によるフラグメントライゲーション、例えば特定部位の突然変異誘発などの遺伝子工学技術が含まれる。標準的DNAクローニング技術を使用した重要なアミノ酸配列をコードするDNA物質のオリゴヌクレオチド、PCR産物、またはクローン化フラグメントの遺伝子組換え技術はポリペプチドを入手する明確に確立された方法であった。あるいは、これらのペプチドは、タンパク質精製および消化などの天然起源からの単離後に入手できる。

標的分子(例えば、ペプチド)のコンジュゲーションは、共有結合を形成することによって、または強力な結合対、例えばイオン結合、ビオチン−アビジンを使用することによって達成できる。ストレプトアビジン、アビジンおよび誘導体ならびにビオチンおよびビオチンアナログ以外の他の結合要素の例は、AP-1(Jun and fos)のロイシンジッパードメイン、hexa-his(金属キレート成分)、hexa-hat GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)グルタチオン親和性、三価バンコマイシン、D-Ala-D-Ala、炭水化物、脂質ならびに例えばCon A(Canavalia ensiformis)およびWGA(小麦胚芽アグルチニン)およびテトラネクチンまたはプロテインAもしくはGなどのタンパク質を含む多種多様な化合物に結合するレクチン類である。これらおよびその他の方法は、コンジュゲーションの分野の当業者にはよく知られている。

共有コンジュゲーションは、分解に対する上昇した抵抗性を含む、数種の長所を授与する。

コンジュゲーションのために有用な結合法は、関係する標的および繊維の化学構造に依存する。使用される典型的な化学試薬は、いわゆるゼロ長架橋剤、ホモ二官能性、ヘテロ二官能性またはポリマー架橋剤である。

1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)またはl-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミドメト-p-トルエンスルホネート(CHMC)およびその他のカルボジイミドなどのゼロ長架橋剤は、例えばGluもしくはAspとリシン残基および例えばペプチドのN末端との間の直接結合を促進できる。

グルタル(ジ)アルデヒド、イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジン、ビス(イミドエステル)、ビス(スクシンイミジルエステル)、ジイソシアネート、二酸塩化物、ジビニルスルホンなどのホモ二官能性架橋剤は、アミノまたはヒドロキシル基が短鎖リンカー分子を介して共有結合されるのを可能にする。ホルムアルデヒドまたはグルタル(ジ)アルデヒドはさらにまた繊維とペプチド間の架橋結合も促進することができる。

ヘテロ二官能性架橋剤の使用は、コンジュゲーションの当業者に知られている方法によって繊維へのペプチドの架橋結合についてより詳細に記載されている。

ヘテロ二官能性架橋剤は、例えばホモ二官能性架橋剤に依存する方法より架橋結合に対してより大きな制御を提供するという利点を有している。

ヘテロコンジュゲートを形成するために最も一般的なスキームは、通常は2段階または3段階反応配列によって、1つの生体分子上のアミン基と第2生体分子上のチオール基との間接的結合を含んでいる。多数の生体分子中のチオールおよびそれらの相対的希少性の高反応性は、チオール基を、制御された化学的架橋のための理想的標的にする。

チオールが存在しない場合は、数種の方法によってチオール基を導入することができる。1つの一般的方法は、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)を使用し、その後にDTTまたはTCEPを用いて3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルコンジュゲートを還元させる方法を含んでいる。還元は、チオール化の程度を決定するために使用できる発色団である2-ピリジンチオンを遊離する。

あるいは、チオール化の程度は、チオール基と反応すると発色団の5-メルカプト-2-ニトロ安息香酸を化学量論的に産生する5,5’-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸)(DTNB、エルマン試薬)を用いて測定できる。

ヘテロ二官能性架橋剤は、典型的には一端ではアミノ基と反応できる活性化カルボキシル基を含み、そして反対側の端ではシステイン残基のスルフヒドリル基と容易に反応するマレイミド基もしくはヨードアセトアミド基を含有している。

頻回に使用される2種のヘテロ二官能性架橋剤は、N-γ-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS)およびスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カーボネート(SMCC)である。

架橋剤は光活性化反応性成分を含有していてよいことを理解されたい。光反応性成分は、遮蔽化された反応性基として機能する。光反応性結合法を使用することによって、共有結合のために光反応性基を使用する前に例えば繊維の特定部分内へ標的分子を持ち込むことが可能である。

典型的には、ペプチドはNもしくはC末端のどちらかで単一システイン残基を用いて合成される。あるいは、リンカー上の内部Cys残基またはCys残基を使用できる。ペプチドがチオール基を含有しない場合は、典型的にはアミノ基の1つを修飾することによって、数種のチオール化法の1つを用いて1つ以上を導入することができる。

例えばペプチドなどの標的プローブの結合はチオール選択的結合スキームの使用によって限定されないことを理解されたい。

化学選択スキームまたはランダムコンジュゲーションスキームの両方にとって有用なその他の化学成分には、カルボキシル基、ヒドロキシル基、芳香族基、フェノール基またはアミノ基が含まれる。特にアミノ基が有用であるが、それはそれらが関連pHで極めて反応性であり、強力な化学結合を形成することができ、そしてシルク繊維、タンパク質、およびペプチドを含む生物学的材料内に広く分布しているためである。

リシンまたはポリリシンの側鎖内のアミノ基を含むペプチドのN末端内のアミノ基を使用するコンジュゲーションスキームを使用する将来性は、本明細書に記載した組成物および方法にとって特に重要である。

架橋剤は最初に繊維上のアミノ基と反応させられ、次に例えばデカンテーションまたは遠心分離を用いて未反応架橋剤の除去が実施される。活性化担体は、次にCys含有ペプチドと反応させられる。過剰のペプチドは、例えば脱塩カラム、透析または遠心分離を用いて除去される。付着させられたペプチドまたは架橋剤の量は、様々な直接的または間接的分析方法によって評価できる。

コンジュゲーション配列は、繊維上のチオールへ付着させる前に、最初にヘテロ二官能性架橋剤をペプチドへ付着させることによって逆向きにさせることができる。

コンジュゲーション反応中、遊離チオールはEDTA、EGTAもしくはトリブチルホスフィンなどの添加によって、または保護大気を使用することによってしばしば自発酸化に対して保護される。

その他の共有架橋結合方法には、ホモまたはヘテロ官能性ポリマー架橋剤の使用が含まれる。試薬の例には、トレシルまたはビニルスルホン活性化デキストランまたは活性化ポリアクリル酸ポリマーもしくは誘導体が含まれる。例えば繊維上のヒドロキシル基を活性化させるために特に好ましいのはジビニルであるが、これは結果として生じる第2ビニルスルホンがチオールに対して高度に反応性である。

結合したペプチドの量は、ペプチド上のシステイン残基に隣接する1つのβ-アラニン残基を組み入れることを含む数種の方法によって決定できる。次にアミノ酸分析を使用すると、結果として生じるコンジュゲートの精製後に存在するβ-アラニンの量を決定できる。

架橋剤は、トレーサーまたは検出可能な成分を含める可能性を提供できる。この成分を使用すると生体分子に結合した架橋剤の量を測定できる。トレーサーは、蛍光、放射性、ハプテンまたはいずれかその他の検出可能な分子であってよい。

ポリマー
一定の実施形態では、支持体は包埋媒体の形状であってよい。そのような包埋媒体は、本項で詳細に記載するように、モノマーの重合によって作製することができる。

重合可能なモノマーから製造されたポリマーは極めて広範囲の用途を有する。例えば、ポリマーは、塗料および接着剤などの被覆用途のための添加物として使用される。

ポリマーは、エマルジョン重合、溶液重合、懸濁液重合またはバルク重合によるように、1つ以上のタイプの重合可能なモノマーを重合することによって調製される。1つ以上のモノマーは、乳化剤、安定剤、界面活性剤、開始剤(光開始剤など)、阻害剤、分散剤、酸化剤、還元剤、粘度修飾剤、触媒、結合剤、活性化剤、促進剤、粘着性付与剤、可塑剤、鹸化剤、連鎖移動剤、界面活性剤、充填剤、色素、金属塩、および溶媒のいずれか1つなどの任意の成分の存在下で重合することができる。

重合可能なモノマーの重合に関しては極めて多数の参考文献がある。例えば一部の教示はD. C. Blackleyによる「エマルジョン重合:理論および実践(Emulsion Polymerization:Theory and Practice)」(1975年にWiley社から公表された)およびF. A. Boveyらによる「エマルジョン重合(Emulsion Polymerization)」(1965年にInterscience Publishersから公表された)の中に見いだすことができる。例えば、ポリマーは、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸2-エチルヘキシル、アクリル酸デシル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、スチレン、ブタジエン、エチレン、酢酸ビニル、ビニルエステル、C₉、C₁₀およびC₁₁第3級モノカルボン酸、塩化ビニル、ビニルピリジン、ビニルピロリジン、塩化ビニリデン、アクリロニトリル、クロロプレン、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸およびフマル酸などのモノマーから調製できる。

重合可能なモノマーの重合に関するさらなる教示の例は、C. E. Schildknechtによる「ビニルおよび関連ポリマー(Vinyl and Related Polymers)」(New York:John Wiley & Sons 1952)およびE. H. Riddleによる「モノマーアクリル酸エステル(Monomeric Acrylic Esters)」(New York:Reinhold Publishing Corp. 1954)ならびにA. G. Alexander(J Oil Colour Chemists’ Association [1962]4512)およびG. G. Greth and J. E. Wilson(J Appl Polymer Sci [1961] 5 135)の中に見いだすことができる。

重合法に関するより近年の教示は、欧州特許出願第0622378号、欧州特許出願第0634428号、欧州特許出願第0623632号、欧州特許出願第0635522号、欧州特許出願第0633273号、欧州特許出願第0632157号、欧州特許出願第0630908号、欧州特許出願第0630641号、欧州特許出願第0628614号、欧州特許出願第0628610号、欧州特許出願第0622449号、欧州特許出願第0626430号および欧州特許出願第0625529号の中に見いだすことができる。

用語「架橋剤」は、重合中のモノマーの架橋度を架橋剤の不在下でのそのモノマーの重合と比較して増加させる化合物を意味する。

それらのモノマーは重合可能な組成物の形状で提供されてよい。重合可能な組成物は、さらにまた乳化剤、安定剤、界面活性剤、開始剤(光開始剤など)、阻害剤、分散剤、酸化剤、還元剤、粘度修飾剤、触媒、結合剤、活性化剤、促進剤、粘着性付与剤、可塑剤、鹸化剤、連鎖移動剤、架橋剤、界面活性剤、充填剤、色素、金属塩、および溶媒のいずれか1つ以上などの従来型の追加の成分を含むことができる。

例えば、界面活性剤および分散剤は、脂肪ロジンおよびナフテン酸の塩、ナフタレンスルホン酸および低分子量のホルムアルデヒドの縮合生成物、適切な親水性-親油性バランスを備えるカルボン酸ポリマーおよびコポリマー、ラウリル硫酸ナトリウムなどの高級硫酸アルキル、ドデシルベンゼンスルホン酸、イソプロピルベンゼンスルホン酸またはイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムもしくはカリウムなどのアルキルアリールスルホン酸塩;ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムアルカリ金属高級アルキルスルホコハク酸、例えばオクチルスルホコハク酸ナトリウムなどのスルホコハク酸、N-メチル-N-パルミトイル-タウリン酸ナトリウム、イセチオン酸ナトリウムオレイル、アルキルアリールポリエトキシエタノール硫酸もしくはスルホン酸のアルカリ金属塩、例えば1から5のオキシエチレンユニットを有するt-オクチルフェノキシ-ポリエトキシエチル硫酸ナトリウムの縮合生成物であってよい。使用できる典型的な重合阻害剤には、ヒドロキノン、モノメチルエーテル、ベンゾキノン、フェノチアジンおよびメチレンブルーが含まれる。

好ましい実施形態では、色素は2-ヒドロキシベンゾフェノン、オキシジアゾール、サリチル酸、レゾルシノールモノベンゾエート、ベンゾトリアゾール、好ましくは2H-ベンゾトリアゾール、ベンゾチアゾロアジン、好ましくは2N-ベンゾチアゾロアジン、α-シアノ-β-フェニル桂皮酸、ポリアルキルピペリジンおよびその誘導体からなる群から選択される。

好ましくは、色素はベンゾトリアゾール、特に2H-ベンゾトリアゾールおよびその誘導体から選択される。

本組成物は、1つ以上の追加のコモノマーを含むことができる。使用できる1つ以上の追加のコモノマーの例には、(アルキルおよびシクロアルキル)アクリレート;(アルキルおよびシクロアルキル)メタクリレート;アルコキシ-、アルキルフェノキシ-、アルキルフェノキシ-(ポリエチレンオキシド)-、ビニルエステル-、置換されたアミン(それらの第4アンモニウム塩を含む)、ニトリル-、ハロ-、ヒドロキシ-、およびそれらの置換された酸(例えばホスホ-もしくはスルホ-)誘導体を含むフリーラジカル重合可能なオレフィン酸;およびそれらの組み合わせを含むその他の適切なエチレン性不飽和重合可能成分の1つが含まれる。好ましくは、アルキルおよびシクロアルキル基は、例えば(C₁-C₂₀アルキルおよびC₁-C₂₀シクロアルキル)アクリレート、および(C₁-C₂₀アルキルおよびC₁-C₂₀シクロアルキル)メタクリレートのように、20個までの炭素原子を含有している。より詳細には、典型的コモノマーにはメチルアクリレート、エチルアクリレート、n-プロピルアクリレート、イソプロピルアクリレート、n-ブチルアクリレート、イソブチルアクリレート、t-ブチルアクリレート、イソボルニルアクリレート、ペンチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、オクチルアクリレート、イソオクチルアクリレート、ノニルアクリレート、ラウリルアクリレート、ステアリルアクリレート、エイコシルアクリレート、2-エチルヘキシルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘプチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、n-ブチルメタクリレート、t-ブチルメタクリレート、イソブチルメタクリレート、ペンチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、2-エチルヘキシルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、ヘプチルメタクリレート、シクロヘプチルメタクリレート、オクチルメタクリレート、イソオクチルメタクリレート、ノニルメタクリレート、デシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、エイコシルメタクリレート、ドデシルアクリレート、ペンタデシルアクリレート、セチルアクリレート、ステアリルアクリレート、エイコシルアクリレート、イソデシルアクリレート、ビニルステアレート、ノニルフェノキシ-(エチレンオキシド)_1-20アクリレート、オクタデセン、ヘキサデセン、テトラデセン、ドデセン、ドデシルメタクリレート、ペンタデシルメタクリレート、セチルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、エイコシルメタクリレート、イソデシルメタクリレート、ノニルフェノキシ-(エチレンオキシド)_1-20メタクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、フマル酸、クロトン酸、イタコン酸、無水フマル酸、無水クロトン酸、無水イタコン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、スチレン、α-メチルスチレン、ビニルトルエン、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、エチレン、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、アクリルアミド、メタクリルアミド、メタクリルアミド2-シアノエチルアクリレート、2-シアノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレートt-ブチルアミノエチルメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート、ビニルピリジン、ビニルピロリジン、シロキサン、シランおよびそれらの混合物のいずれか1つが含まれる。その他の重合可能なモノマーは米国特許出願第2879178号、米国特許出願第3037006号、米国特許出願第3502627号、米国特許出願第3037969号および米国特許出願第3497485号に開示されている。

好ましいコモノマーには、グリセリルメタクリレート(GMA)、(2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)メチルメタクリレート(GMAK)、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)、メタクリル酸、アクリル酸、GYMA、N-ビニルピロリドン、アルキルメタクリレート(C_1-20アルキルメタクリレートなど、より好ましくはC_1-15アルキルメタクリレート、より好ましくはC_1-10アルキルメタクリレート、より好ましくはメチルメタクリレートなどのC_1-5アルキルメタクリレート)、アルキルアクリレート(C_1-20アルキルアクリレートなど、より好ましくはC_1-15アルキルアクリレート、より好ましくはC_1-10アルキルアクリレート、より好ましくはメチルアクリレートなどのC_1-5アルキルアクリレート)、アリールメタクリレート、アリールアクリレート、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、N-アルキルアクリルアミド(C_1-20N-アルキルアクリルアミドなど、より好ましくはC_1-15N-アルキルアクリルアミド、より好ましくはC_1-10N-アルキルアクリルアミド、より好ましくはメチルアクリルアミドなどのC_1-5N-アルキルアクリルアミド)、N-アルキルメタクリルアミド(C_1-20N-アルキルメタクリルアミドなど、より好ましくはC_1-15N-アルキルメタクリルアミド、より好ましくはC_1-10N-アルキルメタクリルアミド、より好ましくはメチルメタクリルアミドなどのC_1-5N-アルキルメタクリルアミド)、酢酸ビニル、ビニルエステル、スチレン、その他の置換オレフィン、N-ジアルキルアクリルアミド(C_1-20N-ジアルキルアクリルアミドなど、より好ましくはC_1-15N-ジアルキルアクリルアミド、より好ましくはC_1-10N-ジアルキルアクリルアミド、より好ましくはN,N-ジメチルアクリルアミドなどのC_1-5N-ジアルキルアクリルアミド)、N-ジアルキルメタクリルアミド(C_1-20N-ジアルキルメタクリルアミドなど、より好ましくはC_1-15N-ジアルキルメタクリルアミド、より好ましくはC_1-10N-ジアルキルメタクリルアミド、より好ましくはN,N-ジメチルメタクリルアミドなどのC_1-5N-ジアルキルメタクリルアミド)、3-メタクリルオキシプロピルトリス(トリメチルシリルシロキシ)シラン(TRISモノマー)、フルオロ置換アルキルおよびアリールアクリレートおよびメタクリレート(好ましくは、このときアルキルはC_1-20アルキル、より好ましくはC_1-15アルキル、より好ましくはC_1-10アルキル、より好ましくはC_1-5アルキル)、およびそれらの組み合わせのいずれか1つが含まれる。

より好ましいコモノマーには、グリセリルメタクリレート(GMA)、(2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)メチルメタクリレート(GMAK)、2-ヒドロキシエチルメタクリレート(2-HEMA)、メタクリル酸、アクリル酸およびグリシジルメタクリレート、またはそれらの組み合わせのいずれか1つが含まれる。

コモノマーのリストには、さらにまたハロゲン化モノマーなどのモノマーの置換誘導体、特にフッ素化モノマー誘導体、ならびにアセタールおよびケタール誘導体が含まれる。

該組成物の重合可能なモノマーおよび1つ以上の追加のコモノマーは、該組成物が本質的にGMAおよびHEMAから構成されるように選択できる。

あらゆる典型的で適切な重合法を使用できる。好ましい方法は、熱またはUV開始されるフリーラジカル重合法である。

さらなる局面
ここで以下の番号付けしたパラグラフで、本発明のさらなる局面および態様を提示する;本発明はこれらの局面を包含していると理解されたい。

パラグラフ1。検出可能実体に対する参照標準であって、該検出可能実体は(a)支持体;および(b)該支持体によって支持されたある量の検出可能実体を含み、このとき該検出可能実体が細長い経路を有し、このとき検出可能な量の該検出可能実体が該参照標準の横断面の規定された領域内に存在する参照標準。

パラグラフ2。該規定された領域が該参照標準の少なくとも1つの他の横断面内に存在し、好ましくは類似した量の検出可能実体を含む、パラグラフ1記載の参照標準。

パラグラフ3。該検出可能実体が該細長い経路に沿って実質的に均一に分布している、パラグラフ1または2記載の参照標準。

パラグラフ4。該支持体が包埋媒体を含み、その中に該検出可能実体が包埋されている、パラグラフ1、2または3記載の参照標準。

パラグラフ5。該検出可能実体が実質的に細胞物質を含んでいない、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ6。該検出可能実体が診断上関連のある標的を含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ7。該検出可能実体が抗原、エピトープ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、または2つ以上もしくは複数の上記のいずれか、あるいは1つ以上の上記の組み合わせを含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ8。該検出可能実体の存在および/または量が結合剤、好ましくは標識された結合剤によって明らかにできる、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ9。該結合剤が:抗体、好ましくは該検出可能実体に特異的に結合できる抗体、DNAもしくはRNAなどの核酸、好ましくは該検出可能実体に特異的に結合できる核酸、タンパク質核酸(PNA)、色素、特殊染料、ヘマトキシリン-エオシン(H&E)、ゴモリのメテナミン銀染色 (GMS)、過ヨウ素酸シッフ (PAS)染色液、トリクロームブルー（Trichrome Blue）、マッソントリクローム、プルシアンブルー、ギムザ染色液、ディフ-クイック染料、小網(Reticulum)染料、コンゴーレッド、アルシアンブルー、ステイナー(Steiner)、AFB、PAP、グラム（Gram）、ムチカルミン、ヴァーヘフ-ヴァン・ギーソン、エラスチカ（Elastic）、石炭酸フクシンおよびゴルジ染料(Golgi’s stains)からなる群から選択される、パラグラフ8記載の参照標準。

パラグラフ10。細胞、組織、器官または生体内の該検出可能実体の存在が疾患または状態の指標である、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ11。該検出可能実体が該参照標準の全横断平面中に実質的に同一の面積、量または濃度で存在する、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ12。該規定された領域が参照領域を含み、該参照領域が事前に規定された量で該検出可能実体を含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ13。該参照領域内の該検出可能実体の量が試料中の該検出可能実体の量と比較されて試料中の該検出可能実体の存在、量または濃度が決定される、パラグラフ11記載の参照標準。

パラグラフ14。参照標準が長方形の箱の形状にあり、かつ該検出可能実体が該参照標準の長軸に沿ってまたは実質的に平行に配置された実質的に直線状の棒の形状にある、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ15。該検出可能実体が好ましくは化学結合して細長い繊維に付着している、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ16。検出可能実体に対する参照標準であって、(a)好ましくは実質的に長方形の箱の形状にある包埋媒体;および(b)それに結合したある量の検出可能実体を備える細長い繊維を含み、このとき該細長い繊維が該包埋媒体中に縦方向に包埋されている参照標準。

パラグラフ17。該繊維が:ポリアミド繊維、セルロース繊維、ポリカルバメート繊維、絹繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、レーヨン繊維、およびそれらの混合物からなる群から選択される、パラグラフ14または15記載の参照標準。

パラグラフ18。該検出可能実体が該繊維の中核および表面部分の両方で実質的に均一である、パラグラフ14、15または16記載の参照標準。

パラグラフ19。該繊維の表面部分にある該検出可能実体が中核部分より多くの量存在する、パラグラフ14、15または16記載の参照標準。

パラグラフ20。該繊維の中核部分が検出可能実体を実質的に含んでいない、パラグラフ14、15または16のいずれか記載の参照標準。

パラグラフ21。該検出可能実体が該包埋媒体中の細長いチャネル内に形成されている、パラグラフ1から13のいずれか記載の参照標準。

パラグラフ22。該繊維またはチャネルが実質的にその全長にわたり均一な横断面積を有する、パラグラフ14から21のいずれか記載の参照標準。

パラグラフ23。該繊維またはチャネルが約0.5μmから100μm、好ましくは2μmから20μmの直径を有する、パラグラフ14から22のいずれか記載の参照標準。

パラグラフ24。実質的に平行な方向で、好ましくは束状で2本以上の線状の繊維またはチャネルを含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ25。2つ以上の相違する検出可能実体を含み、それらの各々が個々の繊維またはチャネル内または上に置かれている、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ26。各々が同一の検出可能実体を含む2本以上の繊維またはチャネルを含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ27。相違する量の検出可能実体を各々の上に含む2本以上の繊維またはチャネルを含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ28。参照標準の平面切片が、その上に該検出可能実体が相違する密度で存在する複数の領域を含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ29。参照標準の平面切片が該検出可能実体を実質的に診断上有意な密度で含んでいる第1の領域を含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ30。検出可能実体を実質的に含んでいない繊維またはチャネルを含む対照をさらに含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ31。該検出可能実体が:ハプテン、生物活性分子、抗原、エピトープ、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ヘテロ二本鎖、ナノ粒子、ヌクレオチドの合成アナログ、リボヌクレオチドの合成アナログ、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸アナログ、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸アナログ、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、炭水化物、色素、および上記の混合物、融合物、組み合わせまたはコンジュゲートからなる群から選択される、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ32。該検出可能実体がHER2、ER、PR、p16、Ki-67およびEGFRタンパク質、ならびにそのようなタンパク質をコードする核酸のいずれか1つ以上を含む、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ33。該包埋媒体が:氷、ろう、パラフィン、アクリル樹脂、メタクリレート樹脂、エポキシ、Epon、Araldite、Lowicryl、K4MおよびLR WhiteならびにDurcupanからなる群から選択される、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準。

パラグラフ34。規定量で周囲の媒体内に配置されたある量の検出可能実体と一緒に周囲の媒体を含む検出可能実体に対する参照標準であって、該検出可能実体が該周囲の媒体中で概して縦方向の配置で配置されている参照標準。

パラグラフ35。マトリックス内に規定容積で配置されたある量の検出可能な作用剤であって、該マトリックスの平面切片が事前に規定された量で該検出可能な作用剤を提示するように、該物質が実質的に細胞物質を含んでいない検出可能な物質。

パラグラフ36。該検出可能実体に特異的に結合できる結合剤と一緒に、任意で使用説明書と一緒に、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準を含むキット。

パラグラフ37。先行パラグラフのいずれか記載の参照標準の、好ましくは実質的に均一な厚さの平面切片、好ましくは横断平面。

パラグラフ38。その上に載せられたパラグラフ37記載の平面切片を含む、好ましくは顕微鏡用スライドなどのスライドである支持体。

パラグラフ39。先行パラグラフのいずれか記載の参照標準、キットまたは平面切片であって、該参照標準が好ましくは抗体または核酸プローブを用いて染色されている参照標準、キットまたは平面切片。

パラグラフ40。生物学的試料中の検出可能実体の存在または量を検出するための診断キットであって:(a)先行パラグラフのいずれか記載の参照標準、平面切片またはスライド;(b)該検出可能実体に特異的に結合できる結合剤;および任意で(c)使用説明書、を含む診断キット。

パラグラフ41。個体における疾患または状態の少なくとも1つの症状を治療または緩和することのできる治療剤を一緒に含むパラグラフ1から40のいずれか記載の参照標準、平面切片、スライドまたは診断キットの組み合わせ。

パラグラフ42。生物学的試料または成分中の検出可能実体の量が該参照標準中の量と類似であるか、またはそれより多い場合に、該個体が該疾患または状態に罹患している、または罹患しやすいと診断される、パラグラフ41記載の組み合わせ。

パラグラフ43。該結合剤または治療剤が該検出可能実体に対する抗体を含む、パラグラフ40記載の診断キットまたはパラグラフ41もしくは42記載の組み合わせ。

パラグラフ44。生物学的試料中の検出可能実体の存在または量を決定するための、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準、平面切片またはキットの使用。

パラグラフ45。生物学的試料中の検出可能実体の量を参照標準と比較する方法であって、該方法が:(a)生物学的試料を提供して、該生物学的試料、またはそれらの成分中の検出可能実体の量を示す第1のシグナルを得る工程;(b)パラグラフ1から39のいずれか記載の参照標準、平面切片またはキットを提供する工程;(c)該参照標準またはその平面切片内の検出可能実体の量を示す第2の参照シグナルを得る工程;および(d) 工程(a)で得た第1のシグナルを該参照シグナルと比較する工程、を含む方法。

パラグラフ46。該検出可能なシグナルが:放射線、光学密度、反射率、放射能、蛍光、酵素活性からなる群から選択される、パラグラフ45記載の方法。

パラグラフ47。該参照標準またはその平面切片が該生物学的試料と同一の、1つ以上の、好ましくは実質的に全部の工程または条件に供される、パラグラフ45または46記載の方法。

パラグラフ48。該参照標準またはその平面切片が以下の工程：スライド上に載せる工程、ベーキングする工程、脱パラフィンする工程、再水和する工程、抗原回復化する工程、ブロッキングする工程、抗体へ曝露する工程、一次抗体へ曝露する工程、核酸プローブへ曝露する工程、洗浄する工程、二次抗体-酵素コンジュゲートへ曝露する工程、酵素基質へ曝露する工程、色原体基質へ曝露する工程、および対比染色する工程の、1つ以上、好ましくは全部の工程を通して処理される、パラグラフ45、46または47記載の方法。

パラグラフ49。該生物学的試料が細胞、組織もしくは器官、好ましくは疾患または状態に罹患していることが疑われる生物体の細胞、組織もしくは器官を含む、パラグラフ45から48記載の方法または使用。

パラグラフ50。個体における疾患または状態を診断する方法であって、該方法が:(a)該個体から生物学的試料を得る工程;および(b)パラグラフ43記載の方法において生物学的試料またはその成分中の検出可能実体の量を参照標準と比較する工程、を含み、このとき該生物学的試料または成分中の該検出可能実体の量が該参照標準中の該検出可能実体の量と類似またはそれより多い場合に、該個体が該疾患または状態に罹患している、または罹患しやすいと診断される方法。

パラグラフ51。個体における疾患または状態を治療する方法であって、該方法がパラグラフ50記載の方法において個体における該疾患または状態を診断する工程、および該個体へ治療剤を投与する工程、を含む方法。

パラグラフ52。該治療剤が該検出可能実体に結合できる抗体を含む、パラグラフ51記載の治療方法。

パラグラフ53。検出可能実体に対する参照標準を作製する方法であって:該方法が:(a)支持体を提供する工程;および(b)細長い経路内で、該支持体中である量の検出可能実体を支持する工程、を含む方法。

パラグラフ54。該細長い経路内、または第2の細長い経路内である量の第2の検出可能実体を支持する工程をさらに含む、パラグラフ53記載の方法。

パラグラフ55。該細長い経路内、または第2もしくはさらなる細長い経路内で第2の相違する量の該または各検出可能実体を支持する工程をさらに含む、パラグラフ53または54記載の方法。

パラグラフ56。該支持体が包埋媒体を含み、該または各検出可能実体が該包埋媒体内に包埋することによって支持される、パラグラフ53、54または55記載の方法。

パラグラフ57。以下の(a)概して細長い経路内である量の第2の検出可能実体を形成し、そして該包埋媒体内に該第2の検出可能実体を包埋する工程;および(b)概して細長い経路内で第2の相違する量の該検出可能実体を形成し、そして該包埋媒体内に第2の量の検出可能実体を包埋する工程、から選択される1つ以上の工程をさらに含む、パラグラフ53から56のいずれか記載の方法。

パラグラフ58。該または各検出可能実体の該細長い経路が、該または各検出可能実体を細長い繊維へ付着させることによって、好ましくは共有結合させることによって規定される、パラグラフ53から57のいずれか記載の方法。

パラグラフ59。該または各検出可能実体が、該繊維の表面部分へ付着させられるが、中核部分へは実質的に付着させられない、パラグラフ58記載の方法。

パラグラフ60。該繊維が、該または各検出可能実体が該繊維の中核部分へ接近および共有結合できるように、検出可能実体の付着前または付着中に少なくとも部分的に膨潤させられる、パラグラフ58または59記載の方法。

パラグラフ61。該または各検出可能実体が該繊維の表面に付着させられたポリマー鎖へ共有結合させられることによって該繊維へ付着させられる、パラグラフ58、59または60記載の方法。

パラグラフ62。検出可能実体に対する参照標準を作製する方法であって、該方法が、細長い繊維を提供する工程、ある量の検出可能実体を該繊維へ付着または共有結合させる工程、および該繊維を包埋媒体内に縦方向に包埋する工程、を含む方法。

パラグラフ63。該繊維が:ポリアミド繊維、セルロース繊維、ポリカルバメート繊維、絹繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、レーヨン繊維、およびそれらの混合物からなる群から選択される、パラグラフ58から62のいずれか記載の方法。

パラグラフ64。工程(b)における該または各検出可能実体の該細長い経路が該包埋媒体内でチャネルを形成する工程、および該チャネルに検出可能実体を充填する工程によって規定される、パラグラフ53から57のいずれか記載の方法。

パラグラフ65。液状の、好ましくはアガロースまたは寒天溶液中の検出可能実体が該チャネル内に注入されて凝固させられる、パラグラフ64記載の方法。

パラグラフ66。該包埋媒体が:氷、ろう、パラフィン、アクリル樹脂、メタクリレート樹脂、エポキシ、Epon、Araldite、Lowicryl, K4MおよびLR WhiteならびにDurcupanからなる群から選択される、パラグラフ53から55のいずれか記載の方法。

パラグラフ67。検出可能実体に対する参照標準であって、該参照標準が:(a)支持体;および(b)該支持体によって支持されたある量の検出可能実体、を含み、該検出可能実体が細長い経路を有する参照標準。

パラグラフ68。検出可能な量の該検出可能実体が該参照標準の横断面内の規定領域内に存在する、パラグラフ67記載の参照標準。

パラグラフ69。少なくとも2つの横断面内の該検出可能実体の該検出可能な量が類似である、パラグラフ2から33、67または68のいずれか記載の参照標準。

パラグラフ70。各横断面内の該検出可能実体の該検出可能な量が類似である、パラグラフ2から33、67、68または69のいずれか記載の参照標準。

パラグラフ71。検出可能実体に対する参照標準であって、(a)包埋媒体;(b)概して細長い経路内で、該包埋媒体中に配置されたある量の検出可能実体、を含む参照標準。

パラグラフ72。該検出可能実体が横断面内で規定された面積、量または濃度で存在する、パラグラフ71記載の参照標準。

パラグラフ73。検出可能実体に対する参照標準を作製する方法であって、該方法が:(a)包埋媒体を提供する工程;(b)概して細長い経路内である量の検出可能実体を形成する工程;および(c)該包埋媒体内に該検出可能実体を包埋する工程、を含む方法。

パラグラフ74。検出可能実体に対する参照標準であって、該参照標準が:(a)支持体;および(b)該支持体によって支持されたある量の検出可能実体、を含み、該検出可能実体が非細胞成分および/または非細胞物質を含む参照標準。

パラグラフ75。検出可能な量の該検出可能実体が該参照標準の横断面内の規定領域内に存在する、パラグラフ74記載の参照標準。

パラグラフ76。パラグラフ2から34、69または70の特徴のいずれかをさらに含む、パラグラフ74または75記載の参照標準。

パラグラフ77。手順の有効性または首尾を評価する方法であって、該方法が:(a)先行パラグラフのいずれか記載の参照標準を提供する工程であって、該手順の結果として該検出可能実体の検出可能な特性が変化させられる工程;(b)該参照標準に基づいて該手順を実施する工程;および(c)該検出可能実体の該検出可能な特性における変化を検出する工程、を含む方法。

パラグラフ78。該検出可能実体の検出可能な特性が成功した手順の結果として変化させられ、該検出可能実体の該検出可能な特性におけるその変化が該手順が成功であることを確定するために検出される、パラグラフ77記載の方法。

パラグラフ79。該検出可能実体の検出可能な特性が不成功の手順の結果として変化させられ、該検出可能実体の該検出可能な特性におけるその変化が該手順が成功でないことを確定するために検出される、パラグラフ77記載の方法。

パラグラフ80。該手順がインサイチュハイブリダイゼーション手順、免疫組織化学的手順、脱パラフィン、抗原回復化、ブロッキング、内因性ビオチンブロッキング、内因性酵素ブロッキング、洗浄工程、一次抗体などの曝露剤とのインキュベーション、第2可視化成分とのインキュベーション、色原体染色、染色情報の取得および解析からなる群から選択される、パラグラフ77、78または79記載の手順を確認する方法。

パラグラフ81。該手順が抗原回復化手順であり、かつ該検出可能実体の該検出可能な特性が1つ以上のエピトープのマスキングまたは脱マスキングを含む、パラグラフ77、78、79または80記載の方法。

パラグラフ82。該参照標準内の該検出可能実体が1つ以上のエピトープをマスキングするために修飾され、成功である抗原回復化手順では一部または全部のそれらのエピトープが脱マスキングされる、パラグラフ77、78、79、80または81記載の方法。

パラグラフ83。該手順が脱パラフィン手順であり、かつ該検出可能実体の該検出可能な特性が脱パラフィン手順後の該参照標準内の検出可能実体の存在または量を含む、パラグラフ77、78、79または80記載の方法。

パラグラフ84。該参照標準内の該検出可能実体が脱パラフィン媒体に可溶性であり、かつ該検出可能実体の少なくとも一部分、好ましくは全部が脱パラフィン手順の成功後には取り除かれる、パラグラフ77、78、79、80または83記載の方法。

パラグラフ85。抗原回復化確認標準、脱パラフィン標準、ブロッキング確認標準、洗浄確認標準、一次抗体確認標準、二次抗体確認標準、較正標準、または診断標準としての、先行パラグラフのいずれか記載の参照標準の使用。

パラグラフ86。支持体内の細長い経路内に配置された検出可能実体を含む参照標準。

パラグラフ87。上記のパラグラフ1から85記載の特徴のいずれか1つ以上をさらに含む、パラグラフ86記載の参照標準。

パラグラフ88。該検出可能実体がスペーサーまたはカプラーなどのスペーサー手段によって取り付けられた細長い繊維から間隔をあけている、参照標準、または参照標準の製造方法、または先行パラグラフのいずれか記載の参照標準を使用する方法。

パラグラフ89。添付の図面の図2から38を参照しながら実質的に上述され、それらの図面に図示されている参照標準。

パラグラフ90。添付の図面の図2から38を参照しながら実質的に上述され、それらの図面に図示されている好ましくは実質的に均一な厚さの参照標準の平面切片。

パラグラフ91。生物学的試料中の検出可能実体の存在または量を決定するための参照標準または平面切片の使用であって、かかる使用が添付の図面の図2から38を参照しながら実質的に上述して図示されている使用。

パラグラフ92。添付の図面の図2から38を参照しながら実質的に上述され、それらの図面に図示されている生物学的試料内の検出可能実体の量を決定する方法。

パラグラフ93。添付の図面の図2から38を参照しながら実質的に上述され、それらの図面に図示されている個体における疾患または状態を診断する方法。

一般的有用性および本明細書に記載した一般的局面の一部を例示するために、様々な繊維材料、ハプテンの付着、および色素の使用、ならびにスライドへの良好な付着を許容するために該物質を包埋する方法を含めて、数種の参照物質を調製して評価してきた。

参照物質は、パラフィン包埋(FFPE)標本として作製し、明視野顕微鏡で評価した。

実施例１．フルオレセインおよびDNP参照物質の調製
以下の実施例では、i)染色強度における変動、およびii)それらの繊維を膨潤させることによる染料の局在化を例示するために、3種の相違する繊維を用いて、相違する濃度で水性または有機溶媒中で結合させたモデル参照物質を含有するフルオレセインおよびジニトロフェニル(DNP)の調製について記載する。

フルオレセインおよびジニトロフェニル部分はどちらも、診断アッセイのための周知の一般的ハプテンである。これらのハプテンは、どちらも特異的抗体を使用して認識できる。

これらのモデルのハプテンを選択して、活性化アリールハロゲンおよびイソチオシアネート反応性基の2種の、結合に関する相違する化学的性質の使用を例示する。

使用した3種の相違する繊維は以下のとおりである:
Unifloss繊維(50%ナイロン、50%レーヨン、15ヤード、600 1X、シングルストランド・フロス、青色(UNI Products J. G. Cote inc.(カナダ国ケベック州)社、LP Fly Shop(DK-8900デンマーク国ラナース)社から入手)、
LP floss繊維(人絹、セルロース、白色、LP Fly Shop(DK-8900デンマーク国ラナース)社から入手)、および
Lagertun繊維(天然絹糸、白色、フランス製で米国でスプールされた製品をLP Fly Shopから入手、マルチストランド絹8ヤード)。

全繊維は長さ40 cmに切断し、繊維束が巻き上がるのを回避してそれらを互いに識別するために端に結び目を作る。

3種の相違する繊維を、下記の4種の結合実験の各々において同一反応容器(ねじぶたを備えた5 mLの暗色ガラス瓶)内に入れる。

1A. 水溶液中のDNPの結合
サンガー試薬の1.0Mストック液(2,4ジニトロフルオロベンゼン、F-DNP、Sigma社コード番号D1529、200μLの無水N-メチル-ピリリドン(NMP)(Lab-Scan社、コード番号C2538)中に36.4 mg)を調製する。

繊維を含む3つの反応容器に水、NMPおよび炭酸緩衝液(pH9.0)を添加し、20分間にわたり膨潤させ、その後ストック液からサンガー試薬を添加する。

全反応溶液(3.0 mL)は50mM炭酸緩衝液(pH 9.0)、20% NMP水溶液および各々5、10または25mM F-DNPを含んでいる。

30℃の水浴中に18時間入れた後、9本の繊維をHEPES緩衝液(10mM HEPES(Sigma社コード番号H-3375、100mM NaCl、pH 7.0)を用いて2分間ずつ2回洗浄し、その後脱イオン水を用いて2回、そして無水エタノールを用いて4回洗浄する。

UniflossおよびLP floss繊維は未修飾繊維と変化しないままであるが、Lagertun繊維は全3本の標本について未修飾繊維より黄色になる。

1B. 有機溶液中のDNPの結合
繊維を含む2つの反応容器にトルエン(Lab-Scan社、コード番号C2522)、NMPおよびトリエチルアミン(Aldrich社コード番号13,206-0)を添加し、20分間にわたり膨潤させ、その後ストック液からサンガー試薬を添加する。

全反応溶液(3.0 mL)は10mMトリエチルアミン、20% NMPトルエン溶液および各々5または10mM F-DNPを含んでいる。

30℃の水浴中に18時間入れた後、6本の繊維をNMPを用いて2分間かけて1回洗浄し、次にトルエンを用いて4回および無水エタノールを用いて4回洗浄する。

全6本の繊維は、未修飾繊維と比較して視覚的に変化していない。

1C. 水溶液中のFITCの結合
170μLのNMP中に65.1 mgを含むFITC(フルオレセインイソチオシアネート異性体1、Molecular Probes社(コード番号F-1906、米国ユージーン)の1.0Mストック液を調製する。

繊維を含む3つの反応容器に水、NMPおよび炭酸緩衝液を添加し、20分間にわたり膨潤させ、その後ストック液からFITCを添加する。

全反応溶液(3.0 mL)は50mM炭酸緩衝液(pH 9.0)、20% NMP水溶液および各々5、10または25mM FITCである。反応時間、条件および洗浄は、実施例1Aと同様である。

未修飾繊維と比較して、全3種の標本について、結果として生じたUnifloss繊維は緑がかったオリーブ色に見え、そしてLP floss繊維およびLagertun繊維は淡黄色に見える。

1D. 有機溶液中のFITCの結合
繊維を含む2つの反応容器にトルエン、NMPおよびトリエチルアミンを添加し、20分間にわたり膨潤させ、その後ストック液からFITCを添加する。

全反応溶液(3.0 mL)は10mMトリエチルアミン、20% NMPトルエン溶液および各々5または10mM FITCを含んでいる。反応時間、条件および洗浄は、実施例1Bと同様である。

全6本の繊維は、未修飾繊維と比較して視覚的に変化していない。

全30本の繊維標本を無水エタノール(2-8℃)中に保存し、その後包埋し、切断し、染色し、そして試験する。

未修飾Unifloss、LP flossおよびLagertun繊維は、陰性対照と類似の方法で保存する。

実施例２．参照物質の包埋
以下の実施例では、実施例1で調製した繊維を含む様々な繊維を用いてパラフィンブロックを調製する一般的方法について記載する。

修飾または未修飾繊維を9×9 cmスチール製フレーム(図11A)上に載せ、後になってゲルを取り除くのに役立つようにスチール製バスケットを備えた10×10×2 cmの金属製容器(図11B)内に入れる。

アガロース溶液(80 mL、脱イオン水中で2重量%、HSA 1000 タンパク質等級、FMC BioPolymer/Litex、Medinova Scientific A/S社(デンマーク国ヘレロップ)から入手)を60℃の水浴中で加熱し、次に繊維に注ぎ入れる(図11C)。

このゲル溶液を室温へ冷却するに任せ、凝固させる。

結果として生じた凝固したゲルを容器(図11D)から取り出し、手術用メスを用いてスチール製フレームから切り取る。ゲルスラブを次に厚さおよそ5×5 mm、長さおよそ1.5-2.0 cmの長方形の断片(図11E)に切断する。繊維をアガロースゲルピースの中心に包埋する。

各ゲルピースを中性緩衝ホルマリン(NBF(20 mL、50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、pH 7.6、37%ホルムアルデヒド(Merck社コード番号4003)から4%ホルムアルデヒドへ調整、10%メタノールストック液)を含む容器(30 mLポリスチレンNunc/Nalgene試験管)に移し、換気式実験室用フード内に一晩放置する(18時間、室温で)。

ホルマリン固定アガロースゲル包埋繊維各々をマーク付き組織カプセル(Sekura ProHosp:Mega-cassette社コード番号59040、およそ32×26×10 mm)内に入れ、そしてこれらのカプセルを70%エタノール中に15分間、96%エタノール中に15分間ずつ2回、99%エタノール中に15分間ずつ2回、そしてキシレン中に15分間ずつ2回連続的に入れることによって脱水する。

収縮してわずかに黄色がかった全部のゲルピースを溶融パラフィン(Merck社コード番号7337.9020、融点56-58℃)へ移し、60℃で一晩放置する。

ゲルピースを新鮮な温かいパラフィンへ移し、そこでさらに2時間放置し、次に鋳型(Sekura、ProHosp 4166 mega、約31×23×13.55 mm)内のパラフィンを用いて包埋し、そして冷却して最終的なパラフィンブロックを形成する。

包埋した繊維を含有するマーク付きパラフィンブロックを室温で保存し、次に切断し、載せ、染色する。

実施例３．フルオレセインおよびDNP参照物質の免疫染色
以下の実施例では、段階的染色強度および染料の制御局在化とともにフルオレセインおよびDNP修飾モデル参照物質の切断および染色について記載する。

実施例２からのパラフィンブロックは、繊維の長さを切断方向に対して垂直にしてミクロトーム(Leica 0355型RM 2065、Feather社、刃S35、5μmに設定)に載せる。最初の数mmを速やかに切り取り、次にパラフィン切片を室温で厚さ5μmに切断し、採取する。これらのパラフィン切片を60℃の温水浴上で静かに引き伸ばし、次にマーク付き顕微鏡用ガラススライド(Superfrost plus、Menzel-glaser社コード番号041300)上に載せる。

これらのスライドを乾燥させ、60℃のオーブン内でベーキングし、ティシュペーパーで過剰な溶融パラフィンを拭い取る。

スライドは、キシレン中で2-5分間ずつ2回、96%エタノール中で2-5分間ずつ2回、70%エタノール中で2-5分間ずつ2回、およびTBS(50mM Tris-HCl(Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタンp.a.、Crystal Chem inc.社(米国イリノイ州)、150mM NaCl(pH7.6))中で5分間にわたり1回、連続的にインキュベートすることによって脱パラフィンする。

材料上の試薬の良好な被覆を保証するために、参照物質を備えるスライド上の領域をシリコンバリア(「DakoPen」、DakoCytomation社コード番号S2002)で取囲む。

スライドは、下記の手順工程中に乾燥してしまうのを回避するために小さなチャンバー内のラックへ移す。

全部のスライドはブロッキングバッファー(カゼインベースのブロッキングバッファー濃縮液、Sigma-Genosys Ltd社(英国)コード番号SU-07-250、15分間)と一緒にインキュベートし、TBSを用いて1分間ずつ3回洗浄し、次にChemMate(商標)ペルオキシダーゼブロッキング液(DakoCytomation社コード番号S2023)と一緒にインキュベートすることによってペルオキシダーゼ活性をブロッキングし、次に2分間かけてTBSを用いて1回洗浄する。

DNP修飾繊維の免疫可視化は、DNPに対するホースラディッシュ標識F(ab’)ウサギ抗体(DakoCytomation社コード番号P5102、希釈率1:100、スライド1枚当たり100μL、60分間のインキュベーション)を用いて実施する。

スライドはTBS緩衝液中で2分間ずつ3回静かに洗浄し、次にジアミノベンジジン色原体基質系(DAB+、DakoCytomation社コード番号3468)と一緒に10分間インキュベートする。

フルオレセイン修飾および未修飾繊維の免疫可視化は、FITCに対するホースラディッシュ標識F(ab’)ウサギ抗体(DakoCytomation社コード番号P5100、希釈率1:100、スライド1枚当たり100μL、60分間のインキュベーション)を用いること以外は、DNP修飾物質についてと全く同様に実施する。

全スライドはTBS緩衝液を用いて2回洗浄し、次に蒸留水を用いて1回洗浄する。これらのスライドには装填用水性媒体Faramount(DakoCytomation社コード番号S3025)を用いてカバースリップを被せ、8に設定した光線強度を用いて倍率10xまたは40xの明視野顕微鏡(Leica社DM LB)で試験し、デジタル撮影し(Olympus DP50-CU)、画像を白色背景で補正する。

図12は従来技術のHerceptest(商標)(図12A)を用いて染色したヒト乳房組織、DNPを用いて修飾して抗DNP-HRP/DABを用いて染色したLagertun絹繊維(図12B)およびHerceptest(商標)からの染色HER2 +3参照細胞(図12C)の総合的比較を示している。参照標準の全体的形態および外観は、サイズ、形状および分布に関して参照細胞を使用した従来の組織染色の全体的形態および外観に類似している。絹繊維は、Herceptest参照細胞に比較してサイズに関してより均質である。ヒト組織は、両方の参照系と比較してより複雑な形態を有している。

結果
図13は、倍率10×の、結果として生じた染色を示している。図13A:Unifloss、図13B:LP flossおよび図13C:Lagertun繊維(いずれも25mM F-DNP水溶液と結合されている)、ならびに比較として図13D:陰性対照としての未修飾Unifloss繊維。

UniflossおよびLP floss繊維は、繊維の外表面上または辺縁だけが極めて弱く染色しているだけである。Lagertun繊維は、表面上および内部のどちらにおいても陽性染色(およそ2+)された。染色は、全繊維について均質である。

結論として、サンガー試薬水溶液を用いて修飾したUniflossおよびLP floss繊維はバックグラウンドと有意に相違しない程度まで染色されるが、他方lagertun絹繊維は均質かつ高度に染色される。

図14は、倍率10×で観察した、結果として生じた染色を示している。図14A:Unifloss、図14B:LP flossおよび図14C:Lagertun繊維(いずれも10mM FITCトルエン溶液と結合されている)、ならびに比較として図14D:陰性対照としての未修飾Unifloss繊維。

UniflossおよびLP floss繊維は、表面上を、ほとんどバックグラウンドとは有意に相違しない程度まで、極めて弱く染色しているだけである。lagertun繊維は、主として表面上では弱く(およそ1＋)染色し、内部では染色されていないように見えた。染色は、全繊維について均質である。

結論として、FITCトルエン溶液を用いて修飾したUniflossおよびLP floss繊維は、バックグラウンドとは有意に相違しない程度まで染色する。lagertun絹繊維は均質に、そしてほとんど繊維の外表面上でのみ染色される。これは、水中およびトルエン中での絹の相違する膨潤特性に起因する局在化における変化を示している図13Cに描出した水性/F-DNP修飾Lagertun繊維についての染色パターンとは相違する。絹は、トルエン中ではあまり膨潤しない。

その結果として、トルエン中での結合中には、反応性基は未膨潤絹繊維の内側部分には到達できなかった。これは図14Cに示されている。

実施例４．二次可視化系を用いるフルオレセインおよびDNP参照物質の免疫染色
以下の実施例では、上記の実施例3で用いた一次または直接染色系より高感受性である二次可視化系を用いて、段階的染色強度および染料の制御局在化を生じるフルオレセインおよびDNP修飾モデル参照物質の染色について記載する。

参照物質は、上記の実施例3に記載したとおりに切断し、スライド上に載せ、そして脱パラフィンする。

同様に、タンパク質を用いたブロッキングおよびペルオキシダーゼ活性に対するブロッキングは実施例3のとおりである。

全体的手順は、最初にDNPまたはフルオレセインに対する一次抗体を含有するコンジュゲートを用いてインキュベートし、次に洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼならびにヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウスの両方を含有するポリマーデキストランコンジュゲート混合物と一緒にインキュベートし、そしてHRP色原体を用いて染色することである。

より詳細には、DNP修飾繊維は、DNPに対するHRP標識F（ab’）ウサギ抗体（DakoCytomation社コード番号P5102、希釈率1:100、スライド1枚当たり100μL）と一緒に60分間インキュベーションする。

FITC修飾繊維は、FITCに対するHRP標識F（ab’）ウサギ抗体（DakoCytomation社コード番号P5100、希釈率1:100、スライド1枚当たり100μL）と一緒に60分間インキュベーションする。

全スライドをTBS緩衝液中で2分間ずつ静かに3回洗浄し、次にEnvision＋／HRPコンジュゲート（DakoCytomation社コード番号K5007、スライド1枚当たり100μL）と一緒に30分間インキュベートする。

スライドをTBS緩衝液中で2分間ずつ3回静かに洗浄し、次にジアミノベンジジン色原体基質系（DAB＋、DakoCytomation社コード番号K3468）と一緒に10分間インキュベートする。

全スライドを、実施例3と同様に、洗浄し、カバースリップを被せ、顕微鏡下で試験し、写真撮影する。

図15は、倍率10×での、10mM FITCトルエン溶液と結合させた（a）Unifloss、（b）LP flossおよび（c）Lagertun繊維ならびに（d）未修飾Uniflossの染色を示している。すべてFFPE試料として処理し、抗FITC−HRP／EnVision＋／DAB＋（DakoCytomation社コード番号P5100およびK4010／4011）を用いて染色する。

UniflossおよびLP floss繊維は専ら表面上だけが染色している（およそおよそ1＋〜1 1/2＋）。lagertun繊維は、外表面上でより高強度で染色している（およそ2＋）。染色は、全繊維について均質である。

図16は様々な条件下でサンガー試薬（F−DNP）と結合したUnifloss繊維の染色を示している:a）水性溶媒中の5mM F−DNPと結合、b）水性溶媒中の25mM F−DNPと結合、c）トルエン中の5mM F−DNP溶液と結合、d）トルエン中の10mM F−DNP溶液と結合、およびe）未修飾繊維。

水溶液中で修飾したUnifloss繊維は、繊維の表面上および内部の両方で染色する。染色強度は、5mM F−DNPを用いた場合はおよそ1／2＋であり、25mM F−DNPを用いると1＋へ上昇する。

トルエン中で修飾したUnifloss繊維はほとんど専ら表面上のみが染色する。5mM F−DNPを用いて修飾した繊維は、未修飾繊維よりほんのわずかに高い染色強度を有している。他方、10mM F−DNPを用いて修飾した繊維はより高度に（およそ1／2〜1＋）染色する。

染色は、全繊維について均質である。未修飾繊維は染色しない。辺縁の近くでは、繊維からの影しか見ることができない。

図17は様々な条件下でサンガー試薬（F−DNP）と結合したLP floss繊維の染色を示している:a）水性溶媒中の5mM F−DNPと結合、b）水性溶媒中の25mM F−DNPと結合、c）トルエン中の5mM F−DNP溶液と結合、およびd）トルエン中の10mM F−DNP溶液と結合。

水溶液中で修飾したLP繊維は、繊維全体を通して均質に染色する。強度は、5mM F−DNPを用いた場合はおよそ1＋であり、25mM F−DNPを用いると2＋へ上昇する。

トルエン中で修飾したLP繊維は表面上が低強度で染色される。10mM F−DNPを用いて修飾した繊維は、5mM F−DNPを用いて修飾した繊維よりほんのわずかに高度に染色する。染色は、全繊維について均質である。

図18は様々な条件下でのサンガー試薬（F−DNP）と結合したLagertun絹繊維の染色を示している:a）水性溶媒中の5mM F−DNPと結合、b）水性溶媒中の25mM F−DNPと結合、c）トルエン中の5mM F−DNP溶液と結合、およびd）トルエン中の10mM F−DNP溶液と結合。

水溶液中で修飾したLagertun絹繊維は、表面上および内部の両方で高強度で染色する。低濃度のF−DNPで修飾した繊維は、表面上ではおよそ2.0〜2.5＋および内部ではおよそ1＋で染色する。25mM F−DNPを用いて修飾した繊維は、表面上ではおよそ3＋および内部ではおよそ2＋と大いにより高い強度で染色する。

トルエン中で修飾したLagertun繊維は主として表面上がほんの弱く染色するだけである。25mM F−DNPを用いて修飾した繊維は、5mM F−DNPを用いて修飾した繊維とほぼ同程度に染色する。染色は、全繊維について均質である。

結論として、上記の様々な染色は、修飾条件、ここでは2種の反応性ハプテンであるFITCおよびサンガー試薬の濃度に依存して、様々な強度で染色することが可能であることを示している。

さらに、標的を特異的に低強度で、しかしバックグラウンドを明白に超えて染色することが可能である。

これは、多数のIHC染色に対する診断上興味深い閾値染色がおよそ1＋であり、非特異的染色から明確に識別可能でなければならないので、極めて望ましいことが多い。これを達成するのが極めて困難な可能性があるが、それは弱い特異的染色はしばしば非特異的バックグラウンド染色に紛れてしまうからである。

染色強度は、用いたハプテンおよび修飾中に用いた溶媒にも左右される。明らかに、FITC修飾繊維はF−DNP修飾繊維より弱く染色する。さらに、修飾中のより良好な膨潤はより高い染色強度を生じさせる。

染色の局在化は、修飾中の溶媒の膨潤特性に左右される可能性がある。一般に、トルエン中ではいずれの繊維も膨潤しなかったので、その結果として主として表面上で染色する。

Lagertun絹繊維は水性溶媒中で膨潤したので、このため繊維の内部にも染色する。

LP flossおよびUni flossは、修飾中に水性条件を用いた場合に、繊維の表面上と中央部では様々な強度で染色する。

実施例５．サイズおよび形状の比較
以下の実施例では、参照物質のサイズおよび形状をHercepTest（商標）に含まれる参照系と比較する。

図16B、図17Bおよび図28Bに示した染色したUnifloss、LP flossおよびLagertun繊維のスライド（全部を実施例4からの水性条件で25mM F−DNPと結合させた）のサイズを、ソフトウエア「Olympus DP−soft、バージョン3.1」を用いて測定する。

倍率40×で明視野顕微鏡下で実施した10回の測定値の平均によって、DNP染色したUnifloss、LP flossおよびLagertunについて各々3.3、3.5および1.6μmの平均径が得られた。

図19は、上記のソフトウエアを用いて挿入したスケールバーとともに、全3本の繊維のサイズおよび形状を示している。

図20Aは、HercepTest（商標）（DakoCytomation社コード番号K5204）を用いてHER2に対して染色した3＋レベルの参照細胞の倍率10×で撮影した写真である。

図20Bは、同一倍率で撮影した同一キット中で使用された染色した陰性対照参照細胞の写真である。

3＋細胞株（図20A）は強度の（3＋）膜染色を生じ、細胞質染色は生じなかった。染色は均質であり、この標本が死細胞をほとんど含んでおらず、数個の細胞残屑を含有していることがわかる。

図21は、DakoCytomation EGFR PharmDxキット（コード番号K1492）からのDAB＋染色およびヘマトキシリン対比染色EGFR参照細胞を倍率10×で撮影した写真である。

この写真は、強度の膜染色（3＋）およびいくらか弱い細胞質染色（1＋）を示している。染色は均質であり、この標本は数個の死細胞およびいくらかの細胞残屑を含有している。

図14から19の染色した繊維のサイズ、分布および形状は、HercepTest（商標）およびEGFR PharmDxキットに使用された参照細胞（図20および21）と比較できる。

繊維のサイズ測定は、個々のドットが例えばHercepTest（商標）において用いられた細胞と大まかに同一サイズであることを示している。詳細には、UniflossおよびLP floss繊維は同一サイズであり、Lagertun繊維は有意により小さい。

さらに、サイズ分布は、細胞が無作為に切断されていて様々なサイズの細胞断片および細胞を生じさせているHercepTest（商標）細胞（図20）に比較してより均質で狭い。

参照細胞株とは対照的に、いずれの繊維も可視の残屑または断片様残屑を有していない。

Unifloss繊維は、起伏のあるケバ状の辺縁を備える球状ドットのように見える。LP flossは辺縁でははるかにより平坦であるが、球状ではない。

Lagertun繊維は、辺縁では平坦で、多くの結晶に似てわずかに楕円形である。

これらの繊維の形状は天然の細胞に完全には似ていないが、サイズおよび全体的輪郭は細胞様である。

実施例６．反応性色素を用いた着色繊維
本実施例では、永久的に着色した（collared）参照物質の調製ならびにそれらが脱パラフィンおよびエピトープ回復化に抵抗する能力を例示する。

2.0 mのUnifloss、Uni FlossおよびLagertum繊維を個別に反応性赤色色素溶液（662.5μLの脱イオン水中の33 mgのプロシオンレッド（Procion Red） MX−5B、Aldrich社製品番号40,436−5、615.34 Da）または反応性青色色素溶液（662.5μLの脱イオン水中のシバクロンブルー（Cibacron Blue） 3 GA、Sigma−Aldrich社製品番号C−9534、774.2 DA）を含む試験管中に入れる。密封した全試験管を30分にわたり60℃の水浴上で加熱し、10分毎に振とうする。

各試験管に塩化ナトリウム（25μL、4M）および炭酸ナトリウム（312.5μL、0.8M、pH 9.0）を添加し、10分毎に振とうしながら80℃で2時間インキュベートする。

繊維から色素が漏出しなくなるまで繊維を水道水で洗浄する。これらの繊維をアジ化ナトリウム（15mM、2−8℃）を含有する脱イオン水中に保存し、次に上記の実施例2と同様に、アガロースゲル中に包埋し、ゲルブロックへ切断し、脱水してパラフィン包埋する。

染色した繊維を含有するパラフィンブロックを室温で保存し、次に実施例3と同様に、切断して、スライド上に載せる。

スライドは3つの群に分ける:第1のスライドには脱パラフィン工程の直前にカバースリップを被せ、第2群はカバースリップをかける前に脱パラフィンし、そして第3群は沸点よりわずかに低温（95−99℃）の水浴中で40分かけて脱パラフィンしてエピトープ回復化工程（DakoCytomation社、コード番号S1700）に供し、20分かけて室温へ冷却させ、TBSを用いて5分間かけて1回洗浄し、その後にカバースリップを被せる。

脱パラフィンおよびカバースリップを被せる工程は実施例3と同様に実施する。

カバースリップを被せた全スライドを顕微鏡下で、倍率10×で、かつ光を8に設定して明視野顕微鏡下で試験する。

一般に、全繊維は高度に着色しており（collared）、脱パラフィンおよびエピトープ回復化後に色素含量は同一であり、これはこれらの色素が標準IHC手順工程に対して安定性であることを強く示している。

さらに、lagertun絹繊維は、他の2種の繊維よりはるかに強度に赤色または青色に染色する。

より詳細には、プロシオンレッド修飾LP flossおよびUnifloss繊維について:
図22は、脱パラフィン前、脱パラフィン後およびエピトープ回復化工程後各々のプロシオンレッド修飾LP flossのデジタル写真である。
図23は、脱パラフィン前、脱パラフィン後およびエピトープ回復化工程後各々のプロシオンレッド修飾Uni flossのデジタル写真である。

驚くべきことに、赤色は明瞭に可視であり、明らかに様々な工程後に同一強度またはレベルを有している。このため繊維の染色は、標準的IHC工程中に永久的かつ安定性である。

Uniflossは、一般にLP flossほど着色されないと思われる。

LP floss繊維は、Unifloss繊維よりわずかにより均質に染色されると思われる。

図23Bでは、そして図23Cではある程度まで、LP floss繊維は繊維長に対して不完全に垂直に切断されたように見え、このため楕円形の、非球状のドットが生じる。

実施例７．様々な包埋媒体およびガラススライドが及ぼす影響
以下の実施例では、参照物質が化学的に過酷な抗原回復化手順後にスライド上でいかに完全なままであるのかを例示する。

包埋媒体中の様々な添加物を様々なガラススライドと結合させ、そして様々な、型にはまったエピトープ回復化法を用いる。

この実施例では未修飾繊維（unifloss、LP flossおよびLagertun）を用いた。

3種の相違する繊維をスチール製フレーム上に載せ、そして相違するアガロースゲル調製物中に包埋する:（i）2％アガロース、（ii）4％アガロース、（iii）2％アガロース、0.25％ PVA（Fluka社コード番号81386）、（iv）2％アガロース、0.25％ PEI（Fluka社コード番号03880）。

アガロースは実施例3と同一である。

ゲル包埋繊維は、実施例3に記載したとおりに固定し、脱水し、パラフィン包埋し、切断し、そしてスライド上に載せる。

用いたスライドは次のとおりである:（1）Super Frost（Menzel−glaeser社コード番号041300）、（2）ChemMate（商標） Capillary Gap顕微鏡用スライド（DakoCytomation社コード番号S2024）、（3）DakoCytomationシラン化スライド（コード番号S3003）、（4）ポリ−L−リシンスライド（Electron Microscpy Sciences社、コード番号63410−01）。

様々なスライド上に載せた切片を脱パラフィンし、顕微鏡下で試験し、写真撮影し、次のエピトープ回復化手順の1つを用いて処理する。
（a）95−99℃の水浴中で高pHエピトープ回復化緩衝液（pH 9.9）（DakoCytomation社コード番号S3308）中に40分、20分かけて室温に冷却させ、TBSを用いて5分間かけて1回洗浄し、その後カバースリップを被せる。
（b）エピトープ回復化用の緩衝液、クエン酸（pH 6.1）（DakoCytomation社コード番号S1700）中に入れ、水浴中で20分間加熱して脱イオン水中で洗浄する以外は（a）と同一手順。
（c）クエン酸（pH 6.2）（10mM）、（a）と同一手順。
（d）ChemMate（商標）抗原回復化用緩衝液、クエン酸（pH 6.0）（DakoCytomation社コード番号S2031）、（a）と同一手順

抗原回復化手順後、全標識スライドにカバースリップを被せ、広視野顕微鏡で試験し、再び写真撮影する。

繊維、ゲル調製物、スライドおよび抗原回復化法の全組み合わせは2回ずつ実施する。

各スライド上の各繊維束からのドット数は、抗原回復化の前後に写真を比較することによって推定する。

表1〜4では、4種のエピトープ回復化手順の各々についての結果がまとめられている。

脱パラフィンおよびエピトープ回復化後に残っているドット数は、近似値として示す。＜10％:10％未満のドットが残った。＜20％:20％未満のドットが残った。＞20％:20％を超えるドットが残った。＞90％:20％を超えるドットが残った。

図24および25は、脱パラフィンおよび抗原回復化の前後に撮影した代表的写真である。

図24は、倍率10×で撮影した、脱パラフィンおよびDakoCytomationクエン酸抗原回復化緩衝液（pH 6.1）を用いた抗原回復化の前後にChemMate（商標）スライド上に載せた0.25％ PEIを含む2％アガロース中に包埋したUnifloss繊維の写真である（実験8 − 表2中のChemMate（商標）Capillary Gap顕微鏡用スライド）。

Unifloss繊維は、スライド上のアガロース（agaraose）とパラフィンマトリックスとの間の小球として見ることができる（図24A）。脱パラフィンおよび抗原回復化後には、繊維は個別のドットとしてより明瞭に見ることができる（図24B）。

個別ドットの約50−60％は、脱パラフィンおよび抗原回復化後にもスライドに付着したままであった。

図25は、倍率10×で撮影した、脱パラフィンおよび高pH緩衝液（DakoCytomation社コード番号S3308）を用いた抗原回復化前後のポリL−リシンスライド上に載せた、0.25％ PEIを含む2％アガロース中に包埋したLP繊維の写真である。（実験20 − 表1におけるポリ−L−リシンスライド）。

90％を超える個別ドットが、脱パラフィンおよび抗原回復化後にもスライドに付着したままであった。

図25A上の左の方の影はパラフィンスラップの辺縁であり、束中の繊維数の推定を妨害しない。

これらの表から、高pHエピトープ回復化（DakoCytomation社コード番号S 3308、pH 9.9）は一般に、繊維のタイプとはほとんど無関係に、参照物質にとって最も過酷であることが明らかである。

アガロースゲル配合の影響は、0.25％ PEIを含む2％アガロースが他の3種の配合物よりはるかに優れていることを強力に指摘している。4％アガロースは2％アガロースおよび0.25％ PVAを含む2％アガロースより優れている。

一般に、これらの実験で最善に機能するスライドはポリ−L−リシンスライドであり、どちらもシラン被覆スライドより良好であったChemMate（商標）およびSuperfrostより優れている。

一般に個別ドットが抗原回復化手順工程後にスライドに付着したままであったのは驚くべきことである。

さらにまた、例えば2％アガロースとPEI、リシン被覆スライドおよび最も過酷な抗原回復化条件の組み合わせが個別ドットの大多数がスライドに付着したままであるのを許容することも驚くべきことである。

これに比較して、50％の天然細胞が抗原回復化中にスライドから落下するのは珍しいことではない。

表１．様々なゲル配合物、スライドおよび繊維:Unifloss（実験番号1〜4）、LP floss（実験番号17〜20）およびLagertun（実験番号33〜36）に対する脱パラフィンおよびDakoCytomation社コード番号S3308（pH 9.9）を用いた高pHエピトープ回復化後にスライドに付着したままであった繊維の推定百分率

表２．様々なゲル配合物、スライドおよび繊維:Uni floss（実験番号5〜8）、LP floss（実験番号21〜24）およびLagertun（実験番号37〜40）に対する脱パラフィンおよびDakoCytomation社コード番号S1700（pH 6.1）を用いた抗原回復化後にスライドに付着したままであった繊維の推定百分率

表３．様々なゲル配合物、スライドおよび繊維:Unifloss（実験番号9〜12）、LP floss（実験番号25〜28）およびLagertun（実験番号41〜44）に対する脱パラフィンおよび10mMクエン酸緩衝液（pH 6.2）を用いたエピトープ回復化後にスライドに付着したままであった繊維の推定百分率

表４．様々なゲル配合物、スライドおよび繊維:Unifloss（実験番号13〜16）、LP floss（実験番号29〜32）およびLagertun（実験番号45〜48）に対する脱パラフィンおよびクエン酸緩衝液（pH 6.0）（DakoCytomation社コード番号S2031を用いたエピトープ回復化後にスライドに付着したままであった繊維の推定百分率

実施例８．Igg参照物質の調製および免疫染色
本実施例では、可視化系の機能についての対照としてのCDI活性化およびIgGまたはビオチン化IgG修飾繊維の使用について例示する。

繊維は、カルボニルジイミダゾールを用いて官能化する。結果として生じる、繊維に導入された反応性イミダゾールカルバメートを用いてウサギIgGまたはビオチン化ウサギIgGへ直接結合させた。繊維はEn Vision／DAB plusを用いて免疫可視化する。より詳細には:

長さ20 cmのLagertun繊維片を無水DMF（Aldrich Chemical社製、4Åモレキュラーシーブの上で乾燥）を用いて洗浄し、次に5分間かけてDMF:アセトン（1:1、AldrichChemical co社製、固体炭酸カリウムの上方でアセトンを乾燥）中で洗浄する。

各繊維を1.0 mlの新しく調製したカルボニルジイミダゾール溶液（CDI、Aldrich Chemical社カタログ番号11,553−3、10％（w／v）、1:1 DMF:アセトン）と一緒に室温で60分間かけて密封容器内で静かに攪拌する。

IgGまたはビオチン化IgG（ウサギIgG、DakoCytomation x0936、ビオチン化ウサギ抗マウスIgG、E0354）を0.10M NaClに対して10 kDa MwCO（3 ml:1000 ml、4回取り換える）を用いて透析し、次に各々12.5および8.0 g／lに濃縮する。

繊維をCDI反応容器から取り出し、濾紙上で過剰な液体を取り除いてIgGまたはビオチン化IgG溶液に直接移し、次に炭酸緩衝液（総計で、5g／l IgG、0.10M NaCl、50mM炭酸緩衝液、pH 9.0）を添加し、室温で一晩（17時間）かけて静かに攪拌する。

エタノールアミン（10mMエタノールアミン、50mM炭酸緩衝液、pH 9.0）を用いて6時間かけて洗浄することによって残留している活性基を失活(quench)させる。

並行して、CDIを添加せずに繊維を処理する。

修飾繊維は、一般的手順にしたがって、容器から取り出し、過剰な液体を濾紙上で取り除いて水中で繊維を1回洗浄して2〜8℃で保存し、次にホルムアルデヒドで固定し、アガロース中に包埋し、脱水し、パラフィン包埋し、切断してポリリシン塗布スライド上に載せ、さらに脱パラフィンする。

一部のスライドについては、Dakocytomation S1700AR緩衝液を用いて95℃で40分かけて抗原回復化を実施する。

未修飾繊維またはIgG修飾繊維を載せたスライドは、最初にGenosys緩衝液を用いてブロッキングし、TBS緩衝液を用いて3回洗浄し、Chemmateペルオキシダーゼブロッキング緩衝液（DakoCytomation S2023）を用いてブロッキングし、TBS緩衝液を用いて3回洗浄し、EnVision dual link（DakoCytomation K5007、マウスおよびウサギIgGに対して）またはEnVision抗マウス（DakoCytomation K4001、マウスIgGに対して）と一緒にインキュベートし、TBS緩衝液で3回洗浄し、DABで10分間インキュベートし、その後TBS緩衝液を用いて3回洗浄し、そして水道水で1回洗浄することによって染色する。スライドにカバースリップを被せ、顕微鏡下で検査した。上記すべての工程は、一般的手順にしたがって実施する。

ビオチン化IgGを用いて修飾した繊維を載せたスライドは、EnVisionコンジュゲートの代わりにストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（DakoCytomation P0397、TBS中で1000倍に希釈）と一緒にインキュベートすることによって染色する。

図26は、Lagertun繊維のDAB染色を示している、倍率40倍で撮影した顕微鏡写真である。
ウサギIgGと結合させ、ウサギEnvision HRP／DABを用いて染色したCDI活性化繊維（図26A）。
ウサギIgGと結合させ、抗原回復化し、ウサギEnvision HRP／DABを用いて染色したCDI活性化繊維（図26B）。
ビオチン化ウサギIgGと結合させ、ストレプトアビジンHRP／DABを用いて染色したCDI活性化繊維（図26C）。
CDI非処理、ウサギIgG処理、およびEnvision HRP／DABを用いて染色した天然繊維（図26D）。
Envision HRP／DABを用いて染色した天然繊維（図26E）。
ウサギIgGと結合させ、AR処理し、抗マウスEnvision HRP／DABにより染色したCDI活性化繊維（図26F）。

ウサギIgGと結合させてウサギEnvision HRP／DABを用いて染色したLagertun絹繊維は、繊維の辺縁上にのみ局在する明確な染色を生じさせる（図26A）。染色強度は約0.5＋である。

一部の繊維の抗原回復化（図26B）は、同様の染色局在およびわずかにより高度の染色強度を生じさせる。

ビオチン化ウサギIgGと結合させてストレプトアビジンHRP／DABを用いて染色したLagertun絹繊維は、繊維の辺縁上にのみ局在する明確な染色を生じさせる（図26C）。染色強度は約0.25＋である。

CDI活性化処理なしLagertun繊維（図26 D）、天然繊維（図26E）およびウサギIgGと結合させ、AR処理し、抗マウスEnvision HRP／DABを用いて染色した繊維は、いずれも可視可能なDAB染色を生じさせない。結論として、非特異的バックグラウンドは有意ではない。

カルボニルジイミダゾール活性化法は、参照物質の容易な調製を可能にする。修飾は繊維の外面上に限られる。

2種の相違する可視化系（EnVisionおよびSA−HRP）はどちらも特異的染色を生じさせる。強度は同一ではないが、これは標的が相違し、そして可視化系の性質が相違するためである。

本実施例では、二次または間接的免疫可視化系の機能性を検証するために有用な参照物質の調製および染色について例示する。

実施例９．Her2参照物質の調製および免疫染色
本実施例では、一次抗体および可視化系の機能に対する対照としてのHER2ペプチド修飾繊維の調製および免疫染色について例示する。標的ペプチドは、化学選択的ヘテロ二官能性架橋剤を介してアミノリンカーに結合させた。

より詳細には:
繊維は、最初にヘキサンジイソシアネートとの反応、次に加水分解によってリンカーに結合させた一級アミノ基を用いて修飾した。

アミノ基はGMBSを用いて官能化し、次にチオール含有ペプチドと結合させた。繊維は、HercepTest（商標）可視化系を用いて免疫可視化した。

いっそうより詳細には:
各繊維Lagertun、LP flossおよびUniflossの長さ20 cmの6片は、無水DMSO（Aldrich Chemical社製、4Åモレキュラーシーブの上で乾燥）を用いて洗浄し、3時間かけてDMSO中で膨潤させた。

繊維は、静かに攪拌しながら1,6−ヘキサンジイソシアネート溶液（HDI、Aldrich Chemical社製、D12,470−2、DMSO中で10％（W／V））を用いて室温で一晩処理した。

繊維はDMSO中で2回洗浄し、次に室温でDMSO／水溶液（l:1）を用いて繊維を一晩処理することによってイソシアネート基を加水分解した。繊維はDMSO中で洗浄し、2〜8℃で水中に保存し、ペプチドへ結合させた。

アミノ基修飾繊維は濾紙上で部分的に乾燥させ、静かに攪拌しながら室温で120分間かけてN−スクシンイミジル−4−マレイミドブチレート溶液（10 mm GMBS、Pierce社カタログ番号22309、10mMジプロピルエチルアミン（DIPEA）、Aldrich社製、DMSO）を用いて処理した。

繊維を反応容器から取り出し、濾紙を用いて過剰な溶媒を除去した。修飾繊維はDMSOを用いて2回洗浄し、次にペプチドをチオール活性マレイミド基へ結合させた。

陰性結合対照として、繊維はGMBSを添加せずに並行処理した。

新しく調製したHer2ペプチド溶液を各繊維に添加し（総計で、0.10 gペプチド／ml、5mM EDTA、500mM HEPES、30％ DMSO、pH 8.0）、室温で60分間静かに攪拌した。

Her2ペプチドはNeosystems社（ストラスブール、T−16−C−SP991729E）から入手したC末端にシステインを備える16アミノ酸ペプチド（1678 Da）であり、DakoCytomation HercepTest（商標）キットによって認識されるHER2ペプチドモチーフを含有していた。

過剰な反応性基は、10分間かけてエタノールアミン（100 mm、100mM HEPES、pH 8.0）と一緒に攪拌することによって失活させた。

繊維は、先の実施例に記載したとおりに、HEPES緩衝液（100mM、pH 8.0）を用いて2回洗浄して2〜8℃で保存し、0.05％ PEIを含むアガロース中に包埋し、固定し、脱水し、パラフィン包埋し、切断し、ポリリシンスライド上に載せた。

スライドの半数は、S1700（DakoCytomation）を用いて40分間かけて抗原回復化した。

スライドはすべて、Herceptest（商標）キット（DakoCytomation K5205）中の取扱説明書にしたがって染色した。

手短には、スライドをウサギ抗HER2と一緒にインキュベートし、次に色原体としてDABを用いてEnVision HRP抗ウサギ可視化系と一緒にインキュベートした。

並行して、天然繊維およびGMBS非処理繊維を染色した。

図27は、倍率40倍で撮影した染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図27A〜図27Eは、HER2修飾LP floss（A）、Uni floss（B）、およびLagertun繊維（C）、抗原回復化を実施したHER2修飾Uni floss（D）および抗原回復化を含むHER2修飾Lagertun（E）を示している。

図27Fは、並行して処理した非活性化Lagertun繊維を用いた陰性結合対照である。

図27G〜図27Iは、HER2修飾LP floss繊維（G）、Uni floss繊維（H）、およびLagertun繊維（I）の陰性一次抗体対照を示している。

天然繊維および修飾繊維は染色を全く示さなかった。

図27Jは、倍率10倍で撮影した、HercepTest（商標）キットに含まれる染色した0、1＋および3＋対照細胞株を示している。

これらの全3種の繊維は、繊維の辺縁に局在する明確なDAB染色を生じさせる。（図27A〜C）。染色強度は約1.0＋である。

同一のHER2修飾UniflossおよびLagertun繊維の抗原回復化（図27Dおよび図27E））は、同一の染色局在およびより高度の染色強度を生じさせる。一部の個別ドットは、AR処理後にスライドから落下する。

陰性結合対照、陰性一次抗体および天然繊維（図27F〜図271）は染色を全く生じさせず、これは全体的バックグラウンドが極めて低いことを示していた。

入手した染色強度は、典型的には0.5〜1.5＋の染色閾値が診断上重要であるために実際的に有用である。

参照細胞と比較することによって、本発明の参照系が染色局在および強度の両方に関してより均一に見えることが明らかになった。

結論として、HDI活性化および化学選択的結合法はHER2ペプチドを含有する参照物質の調製を許容した。染色は、主として繊維の外面上に局在する。

本実施例では、免疫可視化系の機能性を検証するために有用な参照物質の調製および染色について例示する。

実施例１０．段階的Her2およびP16参照物質の調製および免疫染色
本実施例では、例えば一次抗体および可視化系の機能に対する対照としてのHER2ペプチドおよびp16ペプチド修飾繊維の調製および段階的免疫染色について例示する。

2種のペプチドの混合物は、化学選択的ヘテロ二官能性架橋剤を介してアミノリンカーに結合させる。

長さ20 cmのUniflossマレイミド基修飾繊維片は実施例9に記載したとおりに調製する。手短には、繊維はHDIを用いて処理し、加水分解し、GMBSを用いて処理する。

陰性結合対照として、繊維はGMBSを添加せずに並行処理する。

多数の新しく調製したHER2−p16ペプチド混合物（総計で0.20 gペプチド／ml、5mM EDTA、100mM HEPES、30％ DMSO、pH 8.0、1000マイクロリットル）は、以下のスキームにしたがって調製した:
a）0.20 g／lのHer2ペプチド ＋ 0.00 g／lのp16ペプチド
b）0.19 g／lのHer2ペプチド ＋ 0.01 g／lのp16ペプチド
c）0.15 g／lのHer2ペプチド ＋ 0.05 g／lのp16ペプチド
d）0.10 g／lのHer2ペプチド ＋ 0.10 g／lのp16ペプチド
e）0.05 g／lのHer2ペプチド ＋ 0.15 g／lのp16ペプチド
f）0.01 g／lのHer2ペプチド ＋ 0.19 g／lのp16ペプチド
g）0.00 g／lのHer2ペプチド ＋ 0.20 g／lのp16ペプチド

新しく調製したHER2−p16ペプチド混合物を各繊維に添加し、室温で60分間静かに攪拌した。

Her2ペプチドはNeosystems社（ストラスブール、T−16−C−SP991729E）から入手したC末端にシステインを備える16アミノ酸ペプチド（1678 Da）であり、DakoCytomation HercepTest（商標）キットによって認識されるHER2ペプチドモチーフを含有していた。

p16ペプチドはBoc／TFA戦略を用いて固相ペプチド合成法によって合成し、HPLCによって精製し、MALDI−TOF分析によって同定する。17アミノ酸ペプチド（2114 Da）はC末端でシステインアミド、アミノ末端でフルオレセイン、およびDakoCytomation CINtec（商標）p16−INK4組織学検査キットによって認識されたペプチドモチーフを含有している。

過剰な反応性基は、エタノールアミン（100mM、100mM HEPES、pH 8.0）と一緒に10分間攪拌することによって失活させる。

繊維は、先の実施例に記載したとおりに、HEPES緩衝液（100mM、pH 8.0）を用いて2回洗浄して2〜8℃で保存し、0.05％ PEIを含むアガロース中に包埋し、固定し、脱水し、パラフィン包埋し、切断し、ポリリシンスライド上に載せる。

全スライドは、抗原回復化工程を除いて、Herceptest（商標）キット（DakoCytomation K5205）およびCINtec（商標）p16−INK4組織学検査キット（DakoCytomation K5334）に添付の取扱説明書にしたがって染色する。

手短には、スライドはウサギ抗HER2またはマウス抗p16抗体と一緒にインキュベートし、次に色原体としてDABを用いてEnVision HRP抗ウサギ／マウス可視化系と一緒にインキュベートする。

並行して、天然繊維およびGMBS非処理繊維を染色し、陰性対照抗体および可視化染色を対照として用いる。

さらに、手順にしたがって抗原回復化後にHerceptest（商標）に含まれる参照細胞株を染色する。

図28は、倍率40倍で撮影したHER2染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図28A、B、C、D、EおよびFは、各々0.20、0.19、0.15、0.10、0.05および0.01 g／lのHER2ペプチドを用いて調製したHER2染色スライドの顕微鏡写真である。

図28Gは結合対照、すなわちHER2ペプチドを含有せず、0.20 g／lのp16ペプチドだけを含有するスライドである。

図28Hは、GMBSまたはペプチドを添加せずに調製された結合対照である。

図28Iは、ナンセンスウサギ抗体（DakoCytomation K5205）を用いた一次抗体陰性対照である。

図28Jは天然非修飾繊維対照である。

図28Kは、抗マウスIgG Envision HRP（DakoCytomation K4006）を用いた二次可視化陰性対照である。

図28L、MおよびNは、各々0＋、1＋および3＋細胞を備えるHerceptest（商標）内に含まれる染色参照細胞である。

p16ペプチドだけを含有してHer2ペプチドを含有しないスライド（図28G）は染色を全く、またはほんのわずかしか生じさせない。

Her2標的の段階的レベルを備えるスライド（図28A〜F）は、主として繊維の辺縁上に局在する明確なDAB染色を生じさせる。

染色強度は各々、約1.5＋、1.5＋、1.5＋、1.0〜1.5＋、1.0 ＋および0.5＋である。

GMBS活性化なし、ナンセンス一次抗体、天然繊維およびナンセンス二次可視化系を含む陰性対照スライドを示した図28H、I、JおよびKは、可視可能なDAB染色を示さず、これはバックグラウンドが極めて低いことを示している。

図29は、倍率40倍で撮影したp16染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図29Aは結合対照、すなわちp16ペプチドを含有せず、0.20 g／lのHER2ペプチドだけを含有するスライドである。

図29B、C、D、E、FおよびGは、各々0.01、0.05、0.10、0.15、0.19および0.20 g／lのp16ペプチドを用いて調製したp16染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図29Hは、GMBSを添加せずに調製された結合対照である。

図29Iは、ナンセンスウサギ抗体（CINtec（商標）p16−INK4組織学検査キットの一部）を用いた一次抗体陰性対照である。

図29Jは天然非修飾繊維対照である。

図29Kは、抗ウサギIgG Envision HRP（DakoCytomation 4003）を用いた二次可視化陰性対照である。

HER2ペプチドだけを含有してp16ペプチドを含有しないスライド（図29A）は染色を全く、またはほんのわずかしか生じさせない。

p16標的の段階的レベルを備えるスライド（図29B〜G）は、主として繊維の辺縁上に局在する明確なDAB染色を生じさせる。

染色強度は各々、約0〜0.5＋、1.0＋、1.0〜1.5＋、1.5〜2.0＋、1.5＋および1.5＋である。

p16スライド上の一部については、繊維の外側の一部の非特異的染色を観察することができた。これは、乾燥アガロース残留物へのコンジュゲートまたは抗体結合に起因した。スライド上の染色は、アガロースマトリックス中のDAB染色から容易に同定することができる。

GMBS活性化なし、ナンセンス一次抗体、天然繊維およびナンセンス二次可視化系を含む陰性対照スライドを示した図29H、I、JおよびKは、可視可能な染色を示さず、これはバックグラウンドが極めて低いことを示している。

本実施例では、免疫可視化系の機能性を検証するために有用な参照物質の調製および染色について例示する。

入手した染色強度は、典型的には0.5〜1.5＋の染色閾値が診断上重要であり、技術的に入手するのが困難であることが多いために実際的に有用である。

染色に対するダイナミックレンジはおよそ0.01〜0.15 g／lのペプチド範囲であると思われることに留意されたい。すなわち、染色は0.15 g／lを超えるペプチドとコンジュゲートした繊維についてとほぼ同一である。これがどちらのペプチドについても同一であることは偶然であろう。

これら2種のペプチドは相互に対して影響を及ぼすとは思われなかった。その結果、例えばHER2ペプチドを繊維に結合させ、p16染色のためのナンセンスペプチドとして機能させることができた。これは、材料を作製するために重要であるが、それは作製標準作業手順におけるコンジュゲーション中に一定のペプチド濃度を有することが好まれることが多いからである。引き続いて望ましい染色レベルは、ナンセンスペプチドを添加することによって調整した。

Herceptest（商標）参照細胞と比較することによって、本発明の参照系が染色局在および強度の両方に関してより均一に見えることが明らかになった。

結論として、化学選択的結合スキームおよびシステイン官能化ペプチドの混合物を用いて、極めて低い非特異的バックグラウンドを備える段階的レベルのHER2およびp16を含む参照物質を調製することができる。

実施例１１．染色手順中に一次試薬を正確に添加するための対照材料の調製および免疫染色
本実施例では、スライドへ一次抗体溶液を正確に添加するための対照系として用いるための着色およびハプテン修飾繊維の使用について例示する。

プロシオンレッド修飾Lagertun繊維およびDNP修飾（水性反応条件、25mM F−DNP）Lagertun繊維は、実施例6および1と同様に調製する。

プロシオンレッド修飾Lagertun繊維ならびにDNP修飾LagertunおよびUnifloss繊維を束状にし、上記に記載したように一緒に包埋する。結果として生じたパラフィンブロックは赤色繊維および無色DNP修飾繊維をすぐ近くに含有していた。

ウサギ抗HER2 IgGを含有する一次抗体溶液は、ウサギ抗DNP IgG HRPコンジュゲート（Herceptest（商標）キット（DakoCytomation K5205）からの2772 mlのRa−a−Her2 IgGおよび0.028 mlのRa−a−DNP−HRP（DakoCytomation 5102））を用いてスパイクする。

FFPE Mammae（乳房）組織切片ならびにプロシオンレッドおよびDNP修飾繊維を含有するブロックからの切片を顕微鏡用スライド上に載せる。これらの繊維を組織切片の隣に載せる。

スライドを、上述したように(bake)し、脱パラフィンし、そして処理する。

スライドは、オリジナルのHER2抗体溶液の代わりにスパイクした一次抗体溶液を用いることを除いて、Herceptestキット（DakoCytomation K5205）に添付の取扱説明書にしたがって免疫染色する。

さらに、スライドは、HercepTest（商標）キット（DakoCytomation K5205）内の取扱説明書にしたがって正確に染色する。

手短には、スライドは一次抗体溶液と一緒にインキュベートし、次に色原体としてDABを用いてEnVision HRP抗ウサギ可視化系と一緒にインキュベートする。

並行して、天然繊維を含むスライドを染色する。

さらに、スライドは可視化系のための陰性抗体、対照抗体、および陰性対照を用いて染色する。

図30Aは染色したスライドの顕微鏡写真である。DAB染色乳房組織は、スライドの下方部分に見られる。繊維参照物質は、スライドの上方部分に見られる。

図30BからEは、HercepTest（商標）染色プロトコール上で抗DNPスパイクした一次試薬溶液を用いた同一の染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図30BおよびCは、倍率4倍および40倍で撮影した左／下方へのDAB染色DNP繊維および右／上方への赤色Lagertun繊維である。

図30DおよびEは、各々倍率4倍および40倍で撮影した、DAB染色乳房組織である。

図30F〜Iは、オリジナルのHerceptest（商標）染色プロトコールを用いて、スパイクした一次試薬を用いていない、同一の染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図30FおよびGは、各々倍率4倍および40倍で撮影した左／下方への染色DNP繊維および右／上方への赤色Lagertun繊維である。

図30Hは、倍率10倍で撮影した、DAB染色乳房組織である。

図30I〜Lは、Herceptest（商標）染色キットからの陰性ウサギIgG抗体対照試薬を用いた同一の染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図30Iは、倍率40倍で撮影した左／下方への染色DNP繊維および右／上方への赤色Lagertun繊維である。

図30Jは、倍率10倍で撮影した、赤色Lagertun繊維である。

図30KおよびLは、各々倍率10倍および4倍で撮影した、DAB染色乳房組織である。

図30M〜Nは、Herceptest（商標）染色プロトコールからの抗体試薬の代わりに100倍に希釈したウサギ抗DNP−HRPコンジュゲート（DakoCytomation K5102）を用いた同一の染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図30Mは、倍率40倍で撮影した、左／下方への染色DNP繊維および右／上方への赤色Lagertun繊維である。

図30Nは、倍率4倍で撮影した、染色乳房組織である。

図30O〜Rは、Herceptest（商標）染色プロトコール内の抗ウサギEnVision可視化試薬の代わりにマウスEnVision HRP可視化コンジュゲートを用いた同一の染色スライドの顕微鏡写真を示している。

図30Oは、倍率40倍で撮影した、左／下方へのDAB染色DNP繊維および右／上方への赤色Lagertun繊維である。

図30Pは、各々倍率10倍で撮影した、DAB染色乳房組織である。

図Qは、倍率10倍で撮影した、DAB赤色Portion繊維である。

図30Rは、倍率4倍で撮影した、染色乳房組織である。

図30Sは、HercepTest（商標）染色天然Lagertun繊維の顕微鏡写真を示している。

図30T、UおよびVは、各々Herceptest（商標）染色した0＋、1＋および3＋参照細胞の顕微鏡写真である。

染色したスライドを試験することによって、下記の通りに要約することができる。

Herceptest（商標）内の抗DNP IgGスパイクした一次試薬は、DNP繊維を約1＋の強度へ染色し、同時に乳房組織も染色する。

オリジナルのHercepTest染色キットはDNP繊維を染色しないが、乳房組織を染色する。

ナンセンス抗体は乳房組織を染色せず、DNP修飾繊維も染色しない。

抗DNP HRP IgGはDNP修飾繊維を染色したが、乳房組織は染色しなかった。それはナンセンス二次可視化系を用いても染色した。これは、抗DNPコンジュゲートがDABに対する基質であるHRPを含有していたために予想される。

HRP含有抗DNPコンジュゲートを用いてスパイクすることによって、正しい二次抗体可視化系の作用は部分的に取り消すことができた。

herceptest（商標）キットは、キットからの参照細胞によると、良好に機能した。

赤色着色繊維は、様々な染色手順による影響を受けない。

結論として、本実施例は、スライドへ正しい一次試薬を正確に適用するための単純な対照材料を作製できることを例証する。

赤色繊維は、本実施例での対照材料を容易に同定した。陽性DAB染色は、一次抗体試薬が正確に添加されたことを検証した。

着色繊維は、スライド上の参照繊維を迅速に見いだすことを可能にする。自動画像処理システムを用いると、参照ドットを見つけ、染色が閾値強度の上方にあるかどうかをチェックし、それにより一次試薬の正確な添加を確証すると想定することができる。

実施例１２．様々な色および形状を有する参照物質の束の調製
本実施例では、スライド上の位置および形状についての指標としての複数の着色繊維の組み合わせを例示する。

実施例6と同様に赤色色素（プロシオンレッドMX−5B）または青色色素（シバクロンブルー3GA）を用いて修飾したUnifloss、LP flossおよびLagertun繊維は実施例9からのHER2修飾繊維を用いて修飾した繊維と一緒に束状にし、先の実施例で記載したとおりに0.05％ PEIを含むアガロース中に包埋し、固定し、脱水し、パラフィン包埋し、切断し、ポリリシンスライド上に載せる。

図31A、BおよびCは、5倍（A）、10倍（B）および40倍（C）の倍率で撮影した、赤色および青色着色Unifloss、LagertunおよびLP floss繊維の顕微鏡写真を示している。

様々な形状および色を明白に同定し、相互から分離することができる。

本実施例は、スライドの方向付け(orient)に役立ち、自動画像分析システムを構成するために着色繊維を使用できる可能性を例示している。

実施例１３．HER2標的を含有する無作為に方向付けられた参照物質の調製および免疫染色
本実施例では、無作為に切断した短繊維を使用し、蛍光色原体を用いて染色対照を染色する、染色参照物質の調製を例示する。

実施例9からのHER2修飾繊維を2〜5 mm片に切断し、先の実施例に記載したとおりに小さな試験管内の0.05％ PEIを含むアガロース中に包埋し、次に固定し、脱水し、パラフィン包埋し、切断し、そしてポリリシンスライド上に載せる。

HER2修飾繊維を含むスライドの半数は、Herceptest（商標）を取扱説明書にしたがって用いてDAB染色する。

図32AおよびBは、倍率4倍で撮影した免疫染色HER2修飾Lagertun繊維の顕微鏡写真を示している。

図32Cは、倍率20倍で撮影した免疫染色HER2修飾Lagertun繊維の顕微鏡写真である。

陰性抗体対照および陰性EnVision対照は染色を全く示さなかった（図示していない）。

スライドの残りの半数は、アルカリホスファターゼ（AP）Envision dual link（DakoCytomation K4017）およびファーストレッド（Fast red）色原体（DakoCytomation K0597）を用いる以外は、Herceptestを取扱説明書にしたがって用いて染色する。染色したスライドにはFaramount装填用水性媒体を載せ、明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡の両方で試験する。

図32DおよびEは、各々40倍（D）および20倍（E）の倍率で撮影した、ファーストレッド免疫染色して無作為に切断したHER2修飾Unifloss繊維の明視野顕微鏡で撮影した顕微鏡写真を示している。

図32FおよびGは、各々40倍（F）および20倍（G）の倍率で撮影した、ファーストレッド免疫染色して無作為に切断したHER2修飾Lagertun繊維の明視野顕微鏡で撮影した顕微鏡写真を示している。

図32HおよびIは、倍率20倍で撮影した、陰性対照抗体ファーストレッド免疫染色して無作為に切断したHER2修飾Unifloss（H）およびLagertun（I）繊維の明視野顕微鏡で撮影した顕微鏡写真を示している。

図32JおよびKは、倍率20倍（G）で撮影した、ファーストレッド免疫染色して無作為に切断した天然Unifloss（J）およびLagertun（K）繊維の明視野顕微鏡で撮影した顕微鏡写真を示している。

図32LおよびMは、倍率40倍で撮影した、ファーストレッド免疫染色して無作為に切断したHER2修飾Unifloss（L）およびLagertun（M）繊維の蛍光顕微鏡で撮影した顕微鏡写真を示している。

図32Nは、倍率40倍で撮影した、陰性対照抗体ファーストレッド免疫染色して無作為に切断したHER2修飾Unifloss繊維の蛍光顕微鏡で撮影した顕微鏡写真を示している。

これらをまとめると、無作為に方向付けられた繊維は染色強度を決定するのをより困難にする。

ファーストレッド色原体は、強力に現れ、繊維の辺縁上に極めて明確に局在した。

蛍光染色パターンは、明視野顕微鏡で見られるDABおよびファーストレッド染色に類似している。繊維は、繊維の中央で青色のけむりのように見える一部の自己蛍光を有している。

陰性対照の染色は、繊維上で可視可能な染色を生じさせない。Uni floss繊維の外側では、一部の弱い非特異的染色を検出することができる。

実施例１４．様々な修飾参照物質の調製およびヘマトキシリン−エオシン染色
本実施例では、非免疫学的染料であり、しばしば一般的対比染料として使用されるヘマトキシリンとエオシン（「HE」）を用いて、様々な天然および修飾繊維の染色について例示する。

繊維を含有する様々なFFPEブロックから切断し、スライド上に載せ、染色した:
実施例9からのFFPEブロック、HDI処理および加水分解繊維ブロック内の天然繊維。
実施例8からのCDI活性化およびウサギIgG修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維。
実施例1（水性反応条件、25mM F−DNP）からのDNP結合LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維。

フルオレセイン修飾HDI繊維。アミノ基は、HDI処理およびその後の加水分解によって上記の実施例9に記載したとおりに導入する。3種の相違するアミノ官能化繊維をフルオレセインN−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液（Molecular Probes社（米国オレゴン州ユージーン）カタログ番号C−1311、総計で10mM FLU−NHS、20％ DMSO、50 mm HEPES、pH 8.0）に添加し、室温で一晩かけて静かに攪拌する。エタノールアミン（10mMエタノールアミン、50mM炭酸緩衝液、pH 9.0）と一緒に30分間攪拌することによって残留している活性基を失活させる。フルオレセイン修飾繊維はDMSOおよび水を用いて3回洗浄する。繊維は、先の実施例に記載したとおりに、水中に2〜8℃で保存し、0.05％ PEIを含むアガロース中に包埋し、固定し、脱水し、パラフィン包埋し、切断し、そしてポリリシンスライド上に載せる。

天然繊維および修飾繊維を含有するブロックは、上述したとおりに切断し、スライド上に載せ、脱パラフィンする。

スライドを垂直スライドホルダー内に入れ、濾過したMayerのHaematoxylin浴（Bie & Bertsen社、Lab00254デンマーク国Roedovre）内に室温で5分間浸漬する。スライドは流水道水下で5分間洗浄し、新しく調製したエオシン溶液（190 mlの70％エタノールおよび3 mlの0.20M HClと混合した70％エタノール中の10 mlの1％ Eosin溶液（Bie & Bertsen社、デンマーク国Roedovre））中に浸漬する。

スライドホルダーを溶液から取り出し、濾紙を用いて過剰な試薬を除去する。スライドは一連のエタノール浴およびキシレンによる処理（96％エタノール中で2回、99.9％エタノール中で2回、およびキシレン中で2回）によって脱水する。

スライドを風乾させ、永続的装填用媒体（DakoCytomation S3026）を用いて装填する。

比較のために、FFPE乳房組織を並行してヘマトキシリンとエオシンで染色する。

図33は、倍率20倍で撮影した図33S以外は倍率40倍で撮影したヘマトキシリンとエオシンで染色したスライドの顕微鏡写真を示している。

図33A、BおよびCは各々、ヘマトキシリンとエオシンで染色した天然LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図33D、EおよびFは各々、ヘマトキシリンとエオシンで染色したヘキサンジイソシアネート修飾および加水分解LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図33G、HおよびIは各々、ヘマトキシリンとエオシンで染色したウサギIgG修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図33J、KおよびLは各々、ヘマトキシリンとエオシンで染色したフルオレセイン修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図33M、NおよびOは各々、ヘマトキシリンとエオシンで染色したDNP修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図33Pは、DNP修飾繊維を含むプロシオンレッド修飾繊維束（右）である。

図33Q、RおよびSは、比較のためのHE染色FFPE乳房組織である。

一般に、染色パターンは繊維材料内に均一に分布している。

Lagertun繊維は、他の天然および修飾繊維に比較して全部がわずかにより青色／赤色に着色している。

フルオレセイン修飾繊維は、天然繊維またはその他の修飾繊維よりも多くの色を吸い上げると思われた。これはおそらく高疎水性および荷電フルオレセイン分子の両方のためであろう。

一般に、ヘマトキシリンとエオシンでの染色は、様々な繊維材料に対して強力かつ局在性の染色パターンを生じさせなかった。これは、ヘマトキシリンとエオシンでの染色が一般的形態を同定するために役立つ一般的対比染色として使用されるので、高度に有益である。

実施例１５．様々な修飾参照物質の特殊染色の実施例
以下の実施例では、非免疫学的染料、いわゆる特殊染料の例を用いて様々な天然繊維および修飾繊維の染色について例示する。

上述したように、天然および修飾繊維を含有する上記の実施例14からのFFPEブロックから切断し、ポリリシンスライド上に載せる。

スライドは、多数の特殊染色を実施できるArtisan（Cytologix社、マサチューセッツ州ケンブリッジおよびDakoCytomation社）自動染色装置上に載せる。スライドは、以下を用いてArtisan装置でキット取扱説明書にしたがって染色する:
過ヨウ素酸シッフ染料（DakoCytomation社カタログ番号AR165）、
アルシアンブルー（Alcian Blue）（pH 2.5）染料（DakoCytomation社カタログ番号AR160）、
Jones Basement膜染料（DakoCytomation社カタログ番号AR180）、または
マッソントリクローム染料（DakoCytomation社カタログ番号AR173）。

染色後、スライドを99.9％エタノール中で5分間洗浄し、2時間風乾し、次に永久的装填用媒体（Dako Cytomation社製品番号S3026）を載せ、一晩保存して検査し、デジタル写真を撮影する。

図34、35、36および37は、倍率40倍で撮影した特殊染色スライドの顕微鏡写真である。

図34A、BおよびCは各々、過ヨウ素酸シッフ染色した天然LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図34D、EおよびFは各々、過ヨウ素酸シッフ染色したフルオレセイン修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図34G、HおよびIは各々、過ヨウ素酸シッフ染色したDNP修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図35AおよびBは各々、アルシアンブルー染色した天然UniflossおよびLagertun繊維である。

図35C、DおよびEは各々、アルシアンブルー染色したヘキサンジイソシアネート修飾および加水分解LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図35F、GおよびHは各々、アルシアンブルー染色したウサギIgG修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図35I、JおよびKは各々、アルシアンブルー染色したフルオレセイン修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図35L、MおよびNは各々、アルシアンブルー染色したDNP修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図36AおよびBは各々、Jones Basement膜染色した天然UniflossおよびLagertun繊維である。

図36C、DおよびEは各々、Jones Basement膜染色したヘキサンジイソシアネート修飾および加水分解LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図36FおよびGは各々、Jones Basement膜染色したウサギIgG修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図36H、IおよびJは各々、Jones Basement膜染色したフルオレセイン修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図36K、LおよびMは各々、Jones Basement膜染色したDNP修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図37A、BおよびCは各々、マッソントリクローム染色した天然LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図37D、EおよびFは各々、マッソントリクローム染色したヘキサンジイソシアネート修飾および加水分解LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図37GおよびHは各々、マッソントリクローム染色したウサギIgG修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図37I、JおよびKは各々、マッソントリクローム染色したフルオレセイン修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

図37L、MおよびNは各々、マッソントリクローム染色したDNP修飾LP Floss、UniflossおよびLagertun繊維である。

一般に、相違する繊維について染色強度および分布に関して有意な相違がある。

過ヨウ素酸シッフ染色は、天然繊維をあまり染色しなかった。フルオレセイン修飾LP flossおよびUnifloss繊維は辺縁の近くで明確な赤みがかった染色を有するが、Lagertun繊維はより均一かつ強度に染色する。

DNP修飾LP flossおよびUnifloss繊維は過ヨウ素酸シッフ染色に起因する染色を全く、またはほとんど示さないが、DNP修飾Lagertunは均一な赤みがかった染色を示す。

アルシアンブルー染色は一般に全Unifloss繊維を内部では青色に、そして辺縁では赤みがかった色に着色したが、他方Lagertun繊維は弱く均一に赤みがかって見えただけであった。

LP flossは青色に見え、様々な修飾に対してある程度の相違を伴った。HDIおよび加水分解繊維は赤みがかって見えるが、IgG修飾LP flossは青色である。

フルオレセイン修飾LP flossは辺縁上では赤みがかった、そして内部では青色の染色を示す。同様のことはフルオレセイン修飾Uni floss繊維上でいっそう強力に見ることができる。一部のブルーのバックグラウンド染色は、アルシアンブルー染色全部について全繊維間で観察できる。

全Uni flossおよびLP floss繊維は、Jones Basement膜染色によって強力に染色する。様々なLagertun繊維は弱く赤みがかって見えただけである。

Jones Basement膜染色全部について青色のバックグラウンドが極めて強度であるが、全繊維は容易に同定することができる。

マッソントリクローム染色は全Lagertun繊維に関して強力な明るい赤色染色を生じさせるが、他方UniflossおよびLP flossは全く染色しなかった。DNP修飾繊維は、他のLagertun繊維と比較していくらか弱く染色される。

結論として、本実施例は、例えば特殊染色の機能性を検証するために参照物質を使用できる可能性を例示している。オリジナルの繊維の性質は、染色強度、色および全体的外観にとって様々な化学修飾より重要であると思われる。

実施例１６．様々な厚さで切断された参照物質の調製、免疫染色および使用
本実施例では、切片の厚さを監視かつ検証するための参照物質の使用について例示する。

永久的に着色した繊維およびDNP修飾繊維を含有するFFPEブロックを様々な厚さでミクロトーム上で切断し、スライド上に載せ、免疫染色し、顕微鏡下で鑑定する。

より詳細には:
赤色色素（プロシオンレッドMX−5B）を用いて実施例6と同様に修飾したUniflossおよびLagertun繊維は、先の実施例に記載したとおりに、水性結合中に25mM DNPを用いて実施例6および1からのDNP修飾LagertunおよびUnifloss繊維を用いて修飾した繊維と束状にし、0.05％ PEIを含むアガロース中に包埋し、固定し、脱水し、パラフィン包埋する。

3種のタイプの繊維を一緒に包埋し、永久的に着色した繊維および共有結合したDNPハプテンを含む未着色繊維を含むパラフィンブロックを生じさせる。

並行して、天然UniflossおよびLagertun繊維を含有するFPPEブロックから切断し、スライド上に載せる。

ブロックは、先の実施例に記載したように、標準的ミクロトーム上で厚さ3、5または7μmに切断し、次にポリリシンスライド上に載せる。

スライドを実施例4と同様にウサギ抗DNP−HRPおよび抗ウサギEnVision HRP／DAB plusを用いて免疫染色する。

並行して、スライドは先の実施例に記載したように、陰性一次抗体対照（DakoCytomation社製、ウサギ陰性対照、N1699）または陰性二次可視化系対照（抗マウスEnVision HRP／DAB plus）を用いて染色する。

結果として生じた染色したスライドを倍率40倍で検査する。

図38は、3μm（a）、5μm（B）および7μm（C）で切断したプロシオンレッド修飾Lagertun繊維の顕微鏡写真である。

図38は、3μm（D）、5μm（E）および7μm（F）で切断した抗DNP Envision HRP／DAB染色DNP修飾Lagertun繊維の顕微鏡写真を示している。

図38は、3μm（G）、5μm（H）および7μm（I）で切断した抗DNP Envision HRP／DAB染色DNP修飾Unifloss繊維の顕微鏡写真を示している。

図38は、厚さ5μmで切断した天然Unifloss繊維（J）、厚さ5μmで切断した天然Lagertun繊維（K）、厚さ7μmで切断したDNP修飾Lagertun繊維の陰性一次抗体染色（L）および厚さ5μmで切断したDNP修飾Lagertunの陰性Envision対照染色（M）の顕微鏡写真である。

染色強度は各々、3μm（D）、5μm（E）および7μm（F）で切断したDNP修飾Lagertun繊維（図38D、EおよびF）に対して約0.5〜1.0＋、0.5〜1.0＋および1.0〜1.5＋と判定される。DNP修飾Unifloss繊維（図38G、HおよびI）は各々、3μm（G）、5μm（H）および7μm（I）で切断した繊維に対して約0.5＋、1.0＋および1.5＋と判定される。DNP修飾Unifloss繊維はLagertun繊維よりわずかに容易に等級付けできると思われた。

図38Dは、DAB染色繊維および永久的に着色した繊維の両方を示している。

プロシオンレッド修飾繊維は繊維全体を通して均一に着色されるが、免疫染色によって影響を受けない。

DAB染色は主として辺縁に局在しており、内部ではいくらか散在性の染色を伴う。

繊維間では一部の非特異的染色が見られる。バックグラウンドはアガロースマトリックス内に局在するように見える。一部の顕微鏡写真は光学焦点からわずかに外れた繊維を示している。

繊維は長さが均一であるので、相違する高さを備える柱としてスライド上に載せられることを理解されたい。

繊維上にはかすかな影を暗色縁として見ることができた。切片の厚さが厚いほど、より大きな影が可視化されるようである。しかし沈降したDAB染色は容易に可視化されて局在しかつ定量される。

陰性抗体対照および陰性EnVision対照は染色を全く示さなかった。

様々な形状および色を明白に同定し、相互から分離することができる。

結論として、本発明の参照物質は、直接染色材料および免疫染色材料の両方について、様々な厚さで切断して様々な強度を得ることが可能である。

本実施例は、ミクロトーム切断厚さを検証するために役立つように免疫染色繊維を使用できる可能性を例示した。

本実施例は、スライドの方向付けに役立ち、参照物質の形状、サイズおよび色に関して自動画像分析システムを校正するために着色繊維を使用できる可能性をさらに例示している。

本明細書で言及した特許出願や特許の各々、および各特許出願や特許の係属(prosecution)中を含む上記の特許出願や特許の各々で引用または参照された各文書（「特許出願引用文書」）、ならびに特許出願や特許の各々および特許出願引用文書のいずれかで引用または言及されたいずれかの製品の製造業者の取扱説明書またはカタログは、これにより参照して本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で言及した全文書、および本明細書で言及した文書で言及または参照された全文書、ならびに本明細書で引用または言及されたいずれかの製品の製造業者の取扱説明書またはカタログはこれにより参照して本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載した方法および本発明の系の様々な改変および変形は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者には明白であろう。本発明を特定の好ましい実施形態と結び付けて記載してきたが、主張された本発明はそのような特殊な実施形態に必要以上に限定されるべきではないと理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に明白である本発明を実施するための本明細書に記載した方法の様々な改変は特許請求項の範囲内に含まれることが意図されている。

図１はタンパク質発現の評価のための抗原染色の代表的な類別またはスコア付けのシステムを示す。ヒト乳房腫瘍を、HER2抗原については、HercepTest^TM，Dakocytomationコード番号K5024を用いて、抗HER2抗体で染色する。図1A：スコア0（陰性）。染色が観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の10％未満で観察される；図1B：スコア1＋（陰性）。10％を肥える腫瘍細胞においてかすかなまたはわずかな認知可能な膜染色が検出される。細胞は、膜の一部でのみ染色される；図1C：スコア2＋（弱い陽性）。弱〜中程度の完全な膜染色が10％を超える腫瘍細胞で観察される。図1D：スコア3＋（強度に陽性）。強力な完全な膜染色が10％を超える腫瘍細胞で観察される。 図２は、本明細書に記載する参照標準の実施形態を示す。この実施形態では、細くかつ均質な繊維を、診断上関連する標的で化学的に修飾して、パラフィンブロックに包埋する。複数の繊維を切断方向に対して垂直な束にして、均一な参照ドットを含む薄いスライスに切断する。このスライスは、任意の他の「組織（tissue）」としてIHCまたはISHで染色されてもよい。図2Aは、タンパク質のような検出可能実体が細長い通路（例えば、ロッドの形状）に維持されており、包埋媒体に包埋されているブロックを示す。図2Bは、ブロックを通してとった横断面を示す。図2Cは、種々の検出可能実体を有する複数の通路を有するか、または種々の量の同じ検出可能実体を含む実施形態を示す。ブロックの平坦スライスをとり、これには検出可能実体を「ドット（dots）」として含む。 図３は、参照標準（例えば、上記の図2において生成した平坦スライス）を、固定され、包埋されて、スライスされている生物学的試料と好ましくは平行に処理し得る方法の例を示している。平坦スライスをガラスの顕微鏡スライドに装填して、パラフィン包埋媒体を除く。次に、スライド上に装填された平坦スライスを有するスライドを再水和して、標準的抗原回復技術に供してもよい。このスライドを次に特定の抗体を用いて染色して、抗原の存在および分布を明らかにする。対比染色および二次染色は、二次染色が酵素結合される色素体基質を必要に応じて用いるが、これを行なうこともできる。 図４は、本明細書に記載する参照標準のいくつかの実施形態を示す。この参照標準は、種々の形状をとってもよく、この検出可能実体の細長い形状は種々の形態をとってもよい（図4A）。検出可能実体の束は、その少なくとも1つまたはいくつかが細長い形状であり、そのいくつかまたは全部が支持媒体より短くてもよく、支持媒体中に支持され得る（図4B）。この検出可能実体は、種々の直径および形状を有してもよく、少なくとも一部は、切断方向に対してまたはお互いに、ねじれているか、波打っているか、または完全に垂直には配列されていない。 図５は、本明細書に記載される参照標準の実施形態を示しており、細胞、組織などを含む試料は、検出可能実体と一緒に支持媒体に支持される。例えば、組織試料および検出可能実体は、同じ媒体に包埋されてもよい。参照標準のスライスまたは切片は、組織などと一緒に検出可能な量の検出可能実体を含む。 図６は、本明細書に記載される参照標準のいくつかの実施形態を示しており、ここでは検出可能実体が繊維に結合されているが、この繊維は、この繊維におけるこの要素の種々の程度の浸透を可能にするように種々の方法で処理されており、これによって染色の程度が調節される。薄い灰色の領域は染色されている領域であるが、濃い灰色の領域は、染色されていないかまたは部分的に染色されている領域である。図６Ａは、検出可能実体が繊維の横断面における実質的に全部分に結合するように、結合の間または前に繊維が膨潤するようにされている態様を示す。関連の抗体に対する曝露によって、均一な染色が得られる（すなわち、繊維のコア領域および周辺領域の両方での染色）。図６Ｂは、例えば、有機溶媒に対する水の量もしくは濃度、および／または水に対する曝露の時間を制御することによって、結合の間または前に繊維が部分的に膨潤するようにされている態様を示す。抗体染色は均一ではなく、この繊維の末梢または表面領域上に集中しており、内部染色は限られている。図６Ｃは、繊維が結合の間に実質的に膨潤されない態様を示す。この検出可能実体は、繊維の末梢または表面部分に対してのみ接近および結合することが可能である。繊維の内部またはコア部分では結合は生じず、その結果として染色は表面に実質的に限定される（高密度表面染色。内部染色なし）。図６Ｄは、繊維が膨潤されないが、中間結合手段（この例では、ポリマー鎖）を導入するために結合の前に前処置される態様を示す。このポリマー鎖は、活性化され、その結果この検出可能実体はポリマー鎖のみに結合するが、繊維自体には結合しない。得られた染色パターンは、明確さを欠く表面染色を含み、繊維の内部またはコア部分では実質的に染色はない。 図７は、本明細書に記載された参照の態様を実施および取り扱う方法のフローチャートを示す。「繊維取り扱い（Fibre Handling）」：繊維は活性化され、検出可能実体を含む標的はこの繊維上に結合され、そして得られた繊維は、アガロースに包埋されて固定される。「標準的IHCユニット操作（Standard IHC Unit Operations）」：繊維は、パラフィンに包埋されてスライスに切断される。このスライスを、ガラス顕微鏡スライドに載せて、標準的な免疫組織化学（IHC）染色手順に供する。 図８は、本明細書に記載の参照標準の態様を実施および取り扱う方法のフローチャートを示す。繊維を洗浄し、次いでペプチドまたは色素のような適切な検出可能実体で化学的に修飾する。この修飾された繊維をアガロースゲルに必要に応じて包埋して、次いでホルマリンで固定する。このアガロースブロックを次いで長い円柱に切断して、脱水して、パラフィンに包埋する。スライスに切断して他のFFPE試料と同様に処理する。 図９は、本明細書に記載の参照標準の態様のホルマリンにおける種々の工程の写真である。ゲルに包埋された繊維をバーに切断して、トリミングし、その後に固定のために組織カプセルに入れ、その後に脱水、パラフィン浸潤、切断、焼付け、スライドへの載せ、抗原回復、ブロッキング、染色、カバーガラスをおくことなどを行なう。「Histo capsules（組織カプセル）」とは、例えば、研究室において用いられる、Sekura（日本）によって製造されたような、通常用いられるプラスチックの小さい容器をいう。図9A：繊維をフレーム上に張って張力をかける。図9B：フレームを容器に入れて、このフレーム上に溶融アガロースを注ぐ。図9C：アガロースをセットさせる。図9D：セットしたアガロースを取り出す。図9E：個々の繊維を含むアガロースのストリップをアガロースブロックから切断する。図9F：個々の繊維を含むアガロースブロックをパラフィンに包埋する。 図10は、種々の形状および構造の繊維を図示する、繊維を含む、本明細書に記載される参照標準の態様を示している。例えば、この繊維は、単純でも複雑でもよい内部構造を含み得る。図10Aは、いくつかの市販の繊維の写真を示す。図10Bは、中空繊維、他の繊維に包埋された繊維および他の性質の材料を含む繊維を包含する、複雑な構造を有する繊維の例を示している。図10Cは、複雑な形態およびパターンを有する参照システムを生じる、種々の繊維および繊維の組み合わせの包埋された束の切断の模式図である。 図11A〜11Eは、実施例2からの結果を示す。図11A：フレームに装着された繊維であって、背景にはバスケットデバイスおよび容器がある。図11B：フレーム上に装着され容器に入れられた繊維であって、後の工程において包埋された繊維を持ち上げるのを補助するバスケットデバイスと一緒である。図11C：温めたアガロースを、フレーム上に装着された繊維を含む容器に注ぐ。図11D：フレーム上に装着され凝固されたゲルに包埋された繊維を容器の外側に穏やかに取り出す。図12E：ゲル包埋した繊維を、メスを用いて鋼のフレームから切り取り、さらに、小さい長方形の小片に切断する。この繊維をアガロースゲル小片の中央に包埋する。 図12は、本明細書に記載の参照システムの比較を示しており、ここには対照細胞株および陽性に染色された組織試料も含む。図12A：HercepTest^TM（DakoCytomationコード番号K5204）を用いて抗HER2抗体で染色したHER2陽性ヒト組織。図12B：Lagertun、25mM DNPで修飾され、水性溶媒に結合された天然のシルク。図12C：HercepTest^TM（DakoCytomationコード番号K5204）を用いて抗HER2抗体で染色したHER2対照細胞株であって、3＋の染色スコアに相当する。図は、同じ光学倍率ではない。 図13は、実施例3からの結果を示す。図13A：Unifloss、図13B：LP floss、そして図13C：水溶液中の25mM F−DNPと結合したLagertun繊維、そして図13D：陰性対照としての未修飾のUnifloss繊維。全てをFFPE試料として処理して、ウサギF（ab'）抗DNP−HRP／DAB＋（DakoCytomationコード番号P5102およびK3467／3468）で染色した。倍率10倍、対比染色ではない。 図14は、実施例3からの結果を示す。図14A：Unifloss、図14B：LP floss、そして図14C：トルエンに含まれる10mM FITCと結合したLagertun繊維、そして図14D：陰性対照としての未修飾のUnifloss繊維。全てをFFPE試料として処理して、ウサギF（ab'）抗FITC−HRP／DAB＋（DakoCytomationコード番号P5100およびK3467／3468）で染色した。倍率10倍、対比染色ではない。 図15は、実施例4からの結果を示す。図15A：Unifloss、図15B：LP floss、そして図15C：トルエンに含まれる10mM FITCと結合したLagertun繊維、図15D：陰性対照としての未修飾のUnifloss。全てをFFPE試料として処理して、ウサギF（ab'）抗FITC−HRP／EnVision＋／DAB＋（DakoCytomationコード番号P5100およびK4010／4011）で染色した。倍率10倍、対比染色ではない。 図16は、実施例4からの結果を示す。Unifloss繊維は、種々の状態でサンガー試薬（F−DNP）と結合した。図16A：水性溶媒に含まれる5mM F−DNPと結合した、図16B：水性溶媒に含まれる25mM F−DNPと結合した、図16C：トルエンに含まれる5mM F−DNPと結合した、図16D：トルエンに含まれる10mM F−DNPと結合した、そして図16E：未修飾の繊維。全てをFFPE試料として処理して、ウサギF（ab'）抗DNP−HRP／EnVision＋／DAB＋（DakoCytomationコード番号P5102およびK4010／4011）で染色した。写真は倍率10倍で撮る。 図17は、実施例4からの結果を示す。LP Floss繊維は、種々の状態のサンガー試薬（F−DNP）と結合する。図17A：水性溶媒に含まれる5mM F−DNPと結合した、図17B：水性溶媒に含まれる25mM F−DNPと結合した、図17C：トルエンに含まれる5mM F−DNPと結合した、そして図17D：トルエンに含まれる10mM F−DNPと結合した。全てをFFPE試料として処理して、ウサギF（ab'）抗DNP−HRP／EnVision＋／DAB＋（DakoCytomationコード番号P5102およびK4010／4011）で染色した。写真は倍率10倍で撮る。 図18は、実施例4からの結果を示す。Lagertunシルク繊維は、種々の状態のサンガー試薬（F−DNP）と結合する。図18A：水性溶媒に含まれる5mM F−DNPと結合した、図18B：水性溶媒に含まれる25mM F−DNPと結合した、図18C：トルエンに含まれる5mM F−DNPと結合した、そして図18D：トルエンに含まれる10mM F−DNPと結合した。全てをFFPE試料として処理して、ウサギF（ab'）抗DNP−HRP／EnVision＋／DAB＋（DakoCytomationコード番号P5102およびK4010／4011）で染色した。写真は倍率10倍で撮る。 図19は、実施例5からの結果を示す。Olympus DP−softソフトウェアを用いて、抗DNP−HRP／EnVision＋／DAB＋（DakoCytomationコード番号P5102およびK4010／4011）染色した平均直径の測定、図19A：Unifloss、3．3μm 図19B：LP Floss 3．5μm、そして図19C：Lagertun繊維1．6μm。下の右側の角に目盛りバーを示す。 図20は、実施例5からの結果を示す。HercepTest^TMで染色したHER2参照細胞（DakoCytomation、コード番号K5204、抗HER2／Envision／HRP／DAB染色、キットに付随する指示書に従う）であって、10倍の倍率で撮った。3＋細胞株図20A：強力な膜染色（3＋）を示し、細胞質染色はない。染色は、均一であって、調製物は死細胞をほとんど含まず、ある程度の細胞砕片を含む。図20B：HER2陰性対照細胞株であって、可視の染色はない。 図21は、実施例5からの結果を示す。EGFRで染色し、ヘマトキシリン対比染色したEGFR参照細胞（DakoCytomation、コード番号K1492、抗EGFR／Envision／HRP／DAB染色を用い、キットに付随する指示書に従う）。20倍の倍率で撮ったところ、結果として強力な膜染色（3＋）および弱い細胞質染色（1＋）が生じる。染色は均一であって、調製物はある程度の死細胞およびある程度の細胞砕片を含む。 図22は、実施例6からの結果を示す。10倍の倍率で撮った、スライド上に載せたプロシオンレッド修飾LP floss繊維の写真であって、図22A：脱パラフィンの前、図22B：脱パラフィン後およびエピトープ回復工程の前（Dakocytomationコード番号S 1700）そして図22C：脱パラフィンおよびエピトープ回復の後。下部の右側のバーは、長さのスケールを示す。エピトープ回復は、クエン酸pH6．0を用いて行なった。 図23は、実施例6からの結果を示す。10倍の倍率で撮った、スライド上に載せたプロシオンレッド修飾Unifloss繊維の写真であって、図23A：脱パラフィンの前、図23B：脱パラフィン後およびエピトープ回復工程の前（Dakocytomationコード番号P5102およびK4010／4011）そして図23C：脱パラフィンそしてエピトープ回復の後。下部の右側のバーは、長さのスケールを示す。エピトープ回復は、クエン酸pH6．0を用いて行なった。 図24は、実施例7からの結果を示す。10倍の倍率で撮った、ChemMate^TM Capillary Gap Microscope Slides（DakoCytomationコード番号S 2024）の上に載せた、0．25％ PEI（ポリ−エチレンイミン）を含む2％アガロースに包埋されたUnifloss繊維の写真であって、図24A：前、そして図24B：脱パラフィンおよびエピトープ回復の後（Dakocytomationコード番号S1700）。 図25は、実施例7からの結果を示す。10倍の倍率で撮った、Poly−L−リジンスライドの上に載せた、0．25％ PEIを含む2％アガロースに包埋されたLP floss繊維の写真であって、図25A：脱パラフィンおよび高pH緩衝液、pH9．9を用いたエピトープ回復（Dakocytomationコード番号S3308）の前、そして図25B：後。 図26は、Lagertun繊維のDAB染色を示す、対比染色なしで40倍の倍率で撮った、実施例8由来の結果を示す。 図26A：ウサギIgGと結合され、ウサギEnvision HRP／DABで染色されたCDI活性化繊維。図26B：ウサギIgGと結合され、抗原回復され、ウサギEnvision HRP／DABで染色されたCDI活性化繊維。図26C：ビオチン化ウサギIgGと結合され、ストレプトアビジンHRP／DABで染色されたCDI活性化繊維。図26D：CDIなしで、ウサギIgGで処理され、Envision HRP／DABで染色された、未変性の繊維。図26E：Envision HRP／DABで染色された、未変性の繊維。図26F：ウサギIgGと結合され、AR処理されて、抗マウスEnvision HRP／DABで染色されたCDI活性化繊維。 図27は、種々の繊維のDakoCytomation HercepTest^TM染色を示す、対比染色なしの40倍の倍率で撮った、実施例9由来の結果を示す： 図27A：HER2修飾LP floss、図27B：HER2修飾Uniフロス、図27C：HER2修飾Lagertun繊維、図27D：抗原回復を含む、HER2修飾Uniフロス、そして図27E：抗原回復を含む、HER2修飾Langertun。図27F：非活性化Langertun繊維を用いる陰性結合対照。図27G：HER2修飾LP flossの陰性一次抗体対照。図27H：HER2修飾Uniフロスの陰性一次抗体対照、そして図27I：HER2修飾Lagertun繊維の陰性一次抗体対照。 図28は、段階的な修飾を有する種々の繊維のDakoCytomation HercepTest^TM染色を示す、対比染色なしで40倍の倍率で撮った、実施例10由来のHER2染色結果を示す：図28A、B、C、D、EおよびFは、それぞれ、0．20；0．19；0．15；0．10；0．05および0．01g／lのHER2ペプチドを用いて調製したHER2染色スライドの顕微鏡写真である。図28Gは、結合の対照であって、すなわち、このスライドはHER2ペプチドを含まず、わずか0．20g／lのp16を含む。図28Hは、GMBSまたはペプチドの添加なしで調製された結合対照である。図28Iは、ナンセンスウサギ抗体（DakoCytomation K5205）を用いる一次抗体陰性対照である。図28Jは、ネイティブな未修飾の繊維対照である。図28Kは、抗マウスIgG Envision HRP（DakoCytomation K4006）を用いる二次可視化陰性対照である。図28L、MおよびNは、Herceptest^TMに含まれる染色された参照細胞であって、それぞれ0＋、1＋および3＋の細胞である。 図29は、段階的な修飾を有する種々の繊維のDakoCytomation CINtec^TM p16−INK4組織学検査キット染色を示す、対比染色なしで40倍の倍率で撮った、実施例10由来のp16染色結果を示す： 図29Aは、p16ペプチドなしで、かつ0．20g／lのHER2ペプチドのみを有する結合対照である。図29B、C、D、E、FおよびGは、それぞれ、0．01；0．05；0．10；0．15；0．19；および0．20g／l p16ペプチドを用いて調製したp16染色スライドの顕微鏡写真である。図29Hは、GMBSの添加なしで調製した結合の対照である。図29Iは、ナンセンスウサギ抗体（CINtec^TM p16−INK4組織学検査キットの一部）を用いる一次抗体陰性対照である。図29Jは、ネイティブな未修飾の繊維対照である。図29Kは、抗ウサギIgG Envision HRP（DakoCytomation 4003）を用いる二次可視化陰性対照である。 図30は、実施例11からのHER2染色結果を示す。 図30Aは、スライドの底部上にDAB染色乳房組織を含む染色されたスライドの顕微鏡写真である。繊維参照物質は、スライドの上部に示される。図30B〜Eは、Herceptest^TM染色プロトコール上で抗DNPスパイクされた一次試薬溶液を用いる同じ染色されたスライドの顕微鏡写真である。図30BおよびCは、それぞれ4倍および40倍の倍率で撮った、左／下がDAB染色されたDNP繊維、および右／上が赤色Lagertun繊維である。図30DおよびEは、それぞれ10倍および4倍の倍率で撮った、DAB染色乳房組織である。図30F〜Iは、スパイクされた一次試薬なしで、もとのHerceptest^TM染色プロトコールを用いた、同じ染色されたスライドの顕微鏡写真である。図30FおよびGは、それぞれ4倍および40倍の倍率で撮った、左／下が染色されたDNP繊維、および右／上が赤色Lagertun繊維である。図30Hは、10倍の倍率で撮った、DAB染色乳房組織である。図30I〜Lは、Herceptest^TM染色キット由来の陰性のウサギIgG抗体対照試薬を用いる、同じ染色されたスライドの顕微鏡写真である。図30Iは、40倍の倍率で撮った、左／下が染色されたDNP繊維、および右／上が赤Lagertun繊維である。図30Jは、10倍の倍率で撮った、赤色Lagertun繊維である。図30KおよびLは、それぞれ10倍および4倍の倍率で撮った、DAB染色乳房組織である。図30M〜Nは、Herceptest^TM染色プロトコール由来の抗体試薬の代わりに100倍希釈されたウサギ抗DNP−HRP結合体（DakoCytomation K5102）を用いる、同じ染色されたスライドの顕微鏡写真である。図30Mは、40倍の倍率で撮った、左／下が染色されたDNP繊維、および右／上が赤色Lagertun繊維である。図30Nは、4倍の倍率で撮った、染色された乳房組織である。図30O〜Rは、Herceptest^TM染色プロトコールにおいて、抗ウサギEnVision可視化試薬の代わりにマウスEnvision HRP可視化結合体を用いる、同じ染色されたスライドの顕微鏡写真である。図30Oは、40倍の倍率で撮った、左／下がDAB染色されたDNP繊維、および右／上が赤色Lagertun繊維である。図30Pは、それぞれ10倍の倍率で撮った、DAB染色された乳房組織である。図Qは、10倍の倍率で撮ったDAB染色赤色Portion繊維である。図30Rは、4倍の倍率で撮った、染色された乳房組織である。図30Sは、Herceptest^TM染色された、未変性のLagertun繊維の顕微鏡写真である。図30T、UおよびVは、Herceptest^TM染色された、それぞれ0＋、1＋および3＋の参照細胞の顕微鏡写真である。 図31は、実施例12由来の結果を示す：赤色および青色のUnifloss、LagertunおよびLP flossの繊維の顕微鏡写真。 図31A：5倍の倍率、図31B：10倍の倍率、および図31C：40倍の倍率。 図32は、実施例13からの結果を示す：図32AおよびBは、4倍の倍率で撮った免疫染色したHER2修飾Lagertun繊維の顕微鏡写真である。図32Cは、20倍の倍率で撮った免疫染色したHER2修飾Lagertun繊維の4つの顕微鏡写真である。図32DおよびEは、それぞれ40倍（D）および20倍（E）の倍率で撮ったファーストレッド免疫染色した、無作為に切断したHER2修飾Uni floss繊維の明視野顕微鏡で撮った顕微鏡写真である。図32FおよびGは、40倍（F）および20倍（G）の倍率で撮った、ファーストレッド免疫染色した無作為に切断したHER2修飾Lagertun繊維の明視野顕微鏡で撮った顕微鏡写真である。図32HおよびIは、20倍（E）の倍率で撮った、陰性対照抗体ファーストレッド免疫染色した、無作為に切断したHER2修飾Unifloss（H）およびLangertun（I）繊維の明視野顕微鏡で撮った顕微鏡写真である。図32JおよびKは、20倍（G）の倍率で撮ったファーストレッド免疫染色した無作為に切断した未変性のUnifloss（J）およびLagertun（K）繊維の明視野顕微鏡で撮った顕微鏡写真である。 図32LおよびMは、40倍の倍率で撮った、ファーストレッド免疫染色した、無作為に切断したHER2修飾Unifloss（L）およびLagertun（M）繊維の、蛍光顕微鏡で撮った顕微鏡写真である。図32Nは、40倍の倍率で撮った、陰性対照抗体ファーストレッド免疫染色した、無作為に切断したHER2修飾Unifloss繊維の、蛍光顕微鏡で撮った顕微鏡写真である。 図33は、実施例14由来の結果を示す：20倍の倍率で撮った図33S以外は、40倍の倍率で撮った、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したスライドの顕微鏡写真。 図33A、BおよびCは、それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシン染色された未変性のLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図33D、EおよびFは、それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシン染色されヘキサンジイソシアネート修飾および加水分解されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図33G、HおよびIは、それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシン染色されウサギIgG修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図33J、KおよびLは、それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシン染色されフルオレセイン修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図33M、NおよびOは、それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシン染色されDNP修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図33Pは、Procion Red修飾された繊維の束であり、DNP修飾された繊維（右側）も伴う。図33Q、RおよびSは、HE染色されたFFPE乳房組織である。 図34は、実施例15由来の過ヨウ素酸Schiff染色の結果を示す。 図34A、BおよびCは、それぞれ、過ヨウ素酸Schiff染色された未変性のLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図34D、EおよびFは、それぞれ、過ヨウ素酸Schiff染色された、フルオレセイン修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図34G、HおよびIは、それぞれ、過ヨウ素酸Schiff染色された、DNP修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。 図35は、実施例15由来のAlcian Blue染色の結果を示す：図35AおよびBは、それぞれ、Alcian Blue染色された、未変性のUniflossおよびLagertunの繊維である。図35C、DおよびEは、それぞれ、Aclian Blue染色され、ヘキサンジイソシアネート修飾され、加水分解されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図35F、GおよびHは、それぞれ、Alcian Blue染色されウサギIgG修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図35I、JおよびKは、それぞれ、Alcian Blue染色されフルオレセイン修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図35L、MおよびNは、それぞれ、Alcian Blue染色されDNP修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。 図36は、実施例15由来のJones Basement膜染色の結果を示す。 図36AおよびBは、それぞれ、Jones Basement膜染色された、未変性のUniflossおよびLagertunの繊維である。図36C、DおよびEは、それぞれ、Jones Basement膜染色され、ヘキサンジイソシアネート修飾され、加水分解されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図36FおよびGは、それぞれ、Jones Basement膜染色されウサギIgG修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図36H、IおよびJは、それぞれ、Jones Basement膜染色されフルオレセイン修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図36K、L、およびMは、それぞれ、Jones Basement膜染色されDNP修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。 図37は、実施例15由来のMasson's Trichrome（マッソントリクローム）染色の結果を示す。図37A、BおよびCは、それぞれ、Masson Trichrome染色された未変性のLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図37D、図37Eおよび図37Fは、それぞれ、Masson Trichrome染色され、ヘキサンジイソシアネート修飾および加水分解されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図37GおよびHは、それぞれ、Masson Trichrome染色され、ウサギIgG修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図37I、JおよびKは、それぞれ、Masson Trichrome染色されフルオレセイン修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。図37L、MおよびNは、それぞれ、Masson Trichrome染色されDNP修飾されたLP Floss、UniflossおよびLagertunの繊維である。 図38は、実施例16からの結果を示す：図38は、3μm（A）、5μm（B）および7μm（C）で切断したProcion Red修飾Lagertun繊維の顕微鏡写真である。図38は、3μm（D）、5μm（E）および7μm（F）で切断した抗DNP Envision HRP／DAB染色しDNP修飾されたLagertun繊維の顕微鏡写真である。図38は、3μm（G）、5μm（H）および7μm（I）で切断した抗DNP Envision HRP／DAB染色しDNP修飾されたUnifloss繊維の顕微鏡写真である。図38は、5μmの厚みで切断した未変性のuniフロス繊維（J）、5μmの厚みで切断した未変性のLagertun繊維（K）、7μmの厚みで切断したDNP修飾Lagertun繊維の陰性一次抗体染色（L）、および5μmの厚みで切断した、DNP修飾Lagertunの陰性Envision対照染色（M）の顕微鏡写真である。

Claims (46)

1. (a)(i)支持媒体；および(ii)支持媒体により支持される量の検出可能実体を含有する参照標準またはその平面切片を提供する工程、ここで検出可能実体は細長い経路を有し、所定の量の検出可能実体が参照標準の横断面の規定された領域に存在する；
   (b)参照標準、その平面切片、または規定された領域における検出可能実体の存在または量を示す第１の参照シグナルを得る工程；
   (c)生物学的試料を提供し、生物学的試料、その平面切片、または規定された領域中の検出可能実体の存在または量を示す第２のシグナルを得る工程；および
   (d)(c)で得られた第２のシグナルに対して(b)で得られた参照シグナルを比較する工程、
   を含む方法。
2. 参照シグナルが、試料中の検出可能実体の存在、量または濃度を決定するために第２のシグナルと比較される請求項１記載の生物学的試料中の検出可能実体の存在、量または濃度の指標を得る方法。
3. 参照標準またはその平面切片が、生物学的試料と同じ１以上の工程または条件、好ましくは実質的に全ての工程または条件に曝される請求項１または２記載の方法。
4. 参照標準またはその平面切片が１つ以上、好ましくは全ての以下の工程：
   スライドへの装填、ベーキング、脱パラフィン、再水和、抗原回復、ブロッキング、抗体への暴露、二次抗体−酵素コンジュゲートへの暴露、酵素基質への暴露、色素基質への暴露および対比染色を通じて処理される請求項１、２または３記載の方法。
5. 検出可能実体が、ハプテン、生物学的活性な分子、抗原、エピトープ、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ヘテロ二重鎖、ナノ粒子、ヌクレオチドの合成アナログ、リボヌクレオチドの合成アナログ、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸アナログ、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸アナログ、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、糖質、色素、診断関連標識、好ましくは：抗原、エピトープ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、または２つ以上もしくは複数の任意の上記のもの、または１以上の上記のものの混合物、融合物、組み合わせもしくはコンジュゲートからなる群より選ばれる前記請求項いずれか記載の方法。
6. 検出可能実体が任意の１以上のHER2、ER、PR、p16、Ki-67およびEGFRタンパク質、およびそのようなものをコードする核酸を含む前記請求項いずれか記載の方法。
7. 第２の参照標準またはその平面切片を提供する工程、第２の参照標準、その平面切片または規定された領域内の検出可能実体の量を示す第２の参照シグナルを得る工程；および第１の参照シグナルおよび第２の参照シグナルに対して(c)で得られた第２のシグナルを比較する工程をさらに含む前記請求項いずれかに記載の方法。
8. 検出可能実体の存在および／または量が、結合因子、好ましくは標識された結合因子、好ましくは抗体、好ましくは検出可能実体に特異的に結合可能な抗体、DNAまたはRNA等の核酸、好ましくは検出可能実体に特異的に結合可能な核酸、タンパク質核酸(PNA)、色素、特別な染料、ヘマトキシリン-エオシン(H & E)、Gomoriメテナミン銀染料(GMS)、過ヨウ素酸-シッフ(PAS)染料、トリクロムブルー、マッソントリクロム、プルシアンブルー、ギムザ、Diff-Quik、Reticulum、コンゴレッド、アルシアンブルー、シュタイナー、AFB、PAP、グラム、ムチカルミン、Verhoeff-van Gieson、エラスチカ、カルボールフクシンおよびゴルジ染料からなる群より選ばれる結合因子により前記請求項いずれか記載の方法。
9. 検出可能なシグナルが：放射線、光学密度、反射率、放射能、蛍光、酵素活性からなる群より選ばれる前記請求項いずれか記載の方法。
10. (a)参照標準が長方形の形状であり、検出可能実体が、参照標準の長軸に沿うかもしくは実質的に平行して配置される実質的に直線状のロッドの形態である；もしくは
    (b)規定された領域が、類似した量の検出可能実体を好ましくは含有する少なくとも１つの他の参照標準の切断面に存在する；もしくは
    (c)検出可能実体が細長い経路に沿って実質的に均一な分布を有する；もしくは
    (d)検出可能実体が参照標準の全ての横断する平面切片において実質的に同じ面積、量または濃度で存在する；
    または上記の任意の組み合わせ
    である前記請求項いずれか記載の方法。
11. 支持媒体が包埋媒体を含み、検出可能実体が包埋され、包埋媒体が、好ましくは、氷、ワックス、パラフィン、アクリル樹脂、メタクリル酸樹脂、エポキシ、Epon、アラルダイト、Lowicryl、K4MおよびLR WhiteおよびDurcupanからなる群より選ばれる前記請求項いずれか記載の方法。
12. 検出可能実体が、好ましくは、ポリアミド繊維、セルロース繊維、ポリカルバメート繊維、絹繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、レイヨン繊維およびそれらの混紡からなる群より選ばれる細長い繊維に付着、好ましくは化学結合している前記請求項いずれか記載の方法。
13. 検出可能実体が繊維のコアおよび表面部分の両方で実質的に均一である請求項１２記載の方法。
14. 繊維の表面部分の検出可能実体がコア部分よりも大きい量で存在し、好ましくは繊維のコア部分は実質的に検出可能実体を含まない請求項１２記載の方法。
15. 検出可能実体が包埋媒体内の細長いチャネルにおいて形成される請求項１〜１１いずれか記載の方法。
16. 繊維またはチャネルが、実質的にその全長を横切る均一な横断面領域を有し、好ましくは繊維またはチャネルが約0.5μm〜25μm、好ましくは1.5μm〜15μmの直径を有する請求項１２〜１５いずれか記載の方法。
17. 参照標準が、
    (a)実質的に平行な方向の、好ましくは一束の２つ以上の直線繊維またはチャネル；または
    (b)各々が個々の繊維またはチャネル中もしくはその上に配置されている２つ以上の異なる検出可能実体；
    (c)各々が同じ検出可能実体を含有し、好ましくは各々の上に異なる量の検出可能実体を含有する２つ以上の繊維またはチャネル、；
    または上記の任意の組み合わせ
    を含有してなる前記請求項いずれか記載の方法。
18. 参照標準の平面切片が異なる密度の検出可能実体が存在する複数の領域を含む前記請求項いずれか記載の方法。
19. 参照標準の平面切片が、実質的に診断上有意な密度で検出可能実体を含有する第一の領域を含有し、好ましくは検出可能実体を実質的に含有しない繊維またはチャネルを含有する対照をさらに含有する前記請求項いずれか記載の方法。
20. 生物学的試料中の検出可能実体の存在または所定の量の検出可能実体の存在が、該試料が採取された個体における疾患または状態の可能性を示す、個体の疾患または状態の可能性の指標を得るための前期請求項いずれか記載の方法。
21. 生物学的試料が、細胞、組織または器官、好ましくは疾患または状態を患うことが疑われる生物の細胞、組織または器官を含む前記請求項いずれか記載の方法。
22. (a)個体から生物学的試料を得ること；および
    (b)前記請求項いずれか記載の方法において、生物学的試料中の検出可能実体またはその成分の量と参照標準とを比較すること；
    を含み、生物学的試料または構成成分中の検出可能実体の量が、参照標準と同様であるか、または参照標準よりも多い場合、個体が疾患または状態を罹患しているか、またはそれが疑われる、個体における疾患または状態の診断方法。
23. 請求項２２記載の方法の個体における疾患または状態を診断すること、および個体に治療剤、好ましくは検出可能実体に結合可能な抗体を含む治療剤を投与することを含む、個体における疾患または状態の処置方法。
24. (a)参照標準またはその平面切片を提供する工程、参照標準が、
    (i)支持媒体；および
    (ii)参照媒体により支持される量の検出可能実体
    を含む；検出可能実体が細長い経路を有する；
    所定の量の検出可能実体が参照標準の横断面の規定された領域に存在する；
    検出可能実体の検出可能特性が手順の結果として変化する；
    (b)参照標準において手順を行う工程；
    (c)検出可能実体の検出可能特性における変化を検出する工程
    を含む、手順の有効性または首尾を評価する方法。
25. 手順が、試料と実質的に並行して参照標準または平面切片において行われる、試料において行われる手順の有効性または首尾を評価するための請求項２４記載の方法。
26. 検出可能実体の検出可能特性が首尾よい手順の結果として変化し、検出可能実体の検出可能特性における変化が、手順が首尾よいことを確証するために検出される、請求項２４または２５記載の方法。
27. 検出可能実体の検出可能特性が、失敗した手順の結果として変化し、検出可能実体の検出可能特性における変化が、手順が失敗したことを確証するために検出される請求項２４または２５記載の方法。
28. 手順が、インサイチュハイブリダイゼーション手順、組織免疫学的手順、脱パラフィン、抗原回復、ブロッキング、内因性ビオチンブロッキング、内因性酵素ブロッキング、洗浄工程、一次抗体等の指示薬とのインキュベーション、二次可視化成分とのインキュベーション、色原体染色、染色情報取得および分析からなる群より選ばれる請求項２４〜２７いずれか記載の方法。
29. 手順が抗原回復手順であり、検出可能実体の検出可能特性が１つ以上のエピトープのマスキングまたはアンマスキングを含む請求項２４〜２８いずれか記載の方法。
30. 参照標準における検出実体が修飾されて、１つ以上のエピトープがマスクされ、そのいくつかまたは全てが首尾よい抗原回復手順においてアンマスクされる請求項２４〜２８いずれか記載の方法。
31. 手順が脱パラフィン手順であり、検出可能実体の検出可能特性が、脱パラフィン手順後の参照標準における検出可能実体の存在または量を含む請求項２４〜２８いずれか記載の方法。
32. 参照標準中の検出可能実体が、脱パラフィン媒体に可溶性であり、検出可能実体の少なくとも一部、好ましくは全てが首尾よい脱パラフィン手順後に除去される請求項２４〜２８いずれか記載の方法。
33. ２つ以上の手順の有効性または首尾が好ましくは並行して評価される請求項２４〜２８いずれか記載の方法。
34. 参照標準が、(i)支持媒体；および(ii)支持媒体により支持される量の検出可能実体を含み；検出可能実体が細長い経路を有し；検出可能実体の所定の量が、参照標準の横断面の規定された領域に存在し、検出可能実体の検出可能特性が手順の結果として変化する、手順を確認するための参照標準の使用。
35. 参照標準が抗原回復確証標準、脱パラフィン標準、ブロッキング確証手順、洗浄確証標準、一次抗体確証標準、二次抗体確証標準、校正標準、または診断標準として使用される請求項３４記載の使用。
36. 前記請求項いずれか記載の方法において使用するための指示書と共に参照標準またはその平面切片を含有してなり、参照標準が(i)支持媒体；および(ii)支持媒体により支持される量の検出可能実体；検出可能実体が細長い経路を有し；検出可能実体の所定の量が参照標準の横断面の規定された領域に存在するキット。
37. 検出可能実体に特異的に結合することができる結合因子をさらに含有してなり、結合因子が参照標準、その平面切片または規定された領域において検出可能実体の存在または量を示すシグナルを生成する、請求項３６記載のキット。
38. 請求項３６または３７記載のキットを含む、生物学的試料において検出可能実体の診断上関連する存在または量を検出するための診断キット。
39. 個体の疾患または状態の少なくとも１つの症状を治療または軽減することができ、好ましくは検出可能実体に対する抗体を含む治療剤を伴う請求項３６〜３８いずれか記載のキットまたは診断キット。
40. 参照標準に各々由来する２つ以上の平面切片のセットであって、参照標準が(i)支持媒体；および(ii)支持媒体により支持される量の検出可能実体を含有してなり、検出可能実体が細長い経路を有し；所定の量の検出可能実体が参照標準の横断面の規定された領域において存在し；セットの少なくとも２つの平面切片が異なる量の検出可能実体を各々含有する参照標準に由来する２つ以上の平面切片のセット。
41. 検出可能実体を含有する規定された領域を各々含有する２つ以上の平面切片のセットであって、規定された領域における検出可能実体の量がセットの少なくとも２つの平面切片間で異なり、各々の平面切片が(i)支持媒体；および(ii)支持媒体により支持される量の検出可能実体を含有する参照標準に由来し；検出可能実体が細長い経路を有する、２つ以上の平面切片のセット。
42. 添付の図面の図２〜７３を参照して前記に詳述され、添付の図面の図２〜７３に示される方法。
43. 添付の図面の図２〜７３を参照して前記に詳述され、添付の図面の図２〜７３に示される、生物学的試料中の検出可能実体の存在または量を決定するための参照標準または平面切片の使用。
44. 添付の図面の図２〜７３を参照して前記に詳述され、添付の図面の図２〜７３に示される、個体における疾患または状態を診断または治療する方法。
45. 添付の図面の図２〜７３を参照して前記に詳述され、図面の図２〜７３に示される、手順の有効性または首尾を評価する方法。
46. 添付の図面の図２〜７３を参照して前記に詳述され、図面の図２〜７３に示される手順を確認する方法。
    

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