JPWO2018199335A1 - 組織切片選定方法及び包埋ブロック作製カセット - Google Patents

Abstract

検査結果に誤りが生じることを抑制できる組織切片選定方法及び包埋ブロック作製カセットを提供する。本発明では、生体組織片２２と標準物質２１とを共に同じ包埋剤２３に包埋して包埋ブロック２４を作製する包埋ブロック作製工程と、包埋ブロック２４を薄切して、組織切片４２及び標準物質切片４１ａ，４１ｂ,４１ｃ,４１ｄ,４１ｅが表面に現れているシート形状の包埋組織切片４４を作製する包埋組織切片作製工程と、標準物質切片からの光シグナルに基づいて、検査する組織切片４２を選定する組織切片選定工程とを有するので、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

Description

本発明は、組織切片選定方法及び包埋ブロック作製カセットに関する。

癌組織では特定の遺伝子が増幅されて当該遺伝子の産物であるタンパク質が過剰発現していることが知られている。癌などの検査においては、生体から採取した検体内のタンパク質の過剰発現や遺伝子の増幅を免疫組織化学染色法によって検出し、検体の状態を検査している。

例えば、乳癌などの腫瘍細胞中では、癌遺伝子の１つであるHER2/neu遺伝子の遺伝子産物であるHER2/neuタンパクが高頻度に過剰発現している。そのため、免疫組織化学染色法を用いて腫瘍細胞中のHER2/neuタンパクを検出し、HER2/neuタンパクの過剰発現の有無を判定することで、癌に罹患しているか否かの検査をすることができる。

この原理を応用した検査キットとして、腫瘍細胞中に発現されたHER2/neuタンパクを標的とした、HER2/neuタンパクの細胞外領域を認識する抗ヒトHER2/neu遺伝子産物モノクローナル抗体（SV2-61γ）（動物種：マウス）を用いた免疫組織化学染色キットが販売されている。

このような免疫組織化学染色キットでは、以下の工程を経て検体が免疫組織化学染色される（以下、単に染色されるという。）。まず、例えば人から採取した検査すべき生体組織片がパラフィンなどの包埋剤により包埋された包埋ブロックを用意する用意工程、当該包埋ブロックをミクロトームなどにより所望の厚さに薄切してゆき、組織切片の周辺が包埋剤切片で囲まれたシート形状の包埋組織切片を作製する作製工程、及び、このようにして作製した包埋組織切片をスライドガラス上に載置する載置工程を行い、染色を行える形式とした検体を準備する。

続いて、スライドガラス上の包埋組織切片からパラフィンを除去する脱パラフィン処理工程、及び、組織切片を賦活化する抗原賦活化処理工程を行う。

最後に、3V/V％過酸化水素水による内因性ペルオキシダーゼ処理などのブロッキング処理工程、組織切片中の特定抗原に一次抗体を結合させる一次抗体反応処理工程、標識酵素が結合した二次抗体を一次抗体に結合させる二次抗体反応処理工程、及び、発色基質を含む基質溶液（例えばＤＡＢ：３，３’-ジアミノベンジジン）による発色を利用して組織切片の特定抗原を染色する染色処理工程を行う。このような一連の工程を経て、組織切片は染色される（非特許文献１）。

この際、染色の適否を判定するためのコントロールスライドを、包埋組織切片とは別に用意しておき、組織切片と同時にコントロールスライドも染色する。コントロールスライドは、検体標本を有しており、当該検体標本の染色強度から染色の適否を判定し得る。コントロールスライドにより、染色が適切に行われたことが確認されると、所定の判定基準に基づいて組織切片の染色強度のスコア判定を行い、このスコア判定の結果から、組織切片に病変組織があるか否かの判断が行われる(非特許文献２)。

株式会社ニチレイバイオサイエンス「ヒストファインHER2キット（MONO） 操作手順」、[online]、平成29年4月3日検索、インターネット（URL:http://www.nichirei.co.jp/bio/technical/protocol/her2/mono03.html） 株式会社ニチレイバイオサイエンス「HER2検査 判定方法」、[online]、平成29年4月3日検索、インターネット（URL:http://www.nichirei.co.jp/bio/technical/protocol/her2/judge.html）

このような免疫組織化学染色を用いる検査用の組織切片は、上述のようにミクロトームなどの機器を用いて包埋ブロックから、通常、数μｍの厚さに薄切されて作製される。ミクロトームによる薄切作業では、技術者の熟練度、作製する環境（例えば、室内温度や湿度）や包埋した組織の種類に依存して厚さにばらつきが生じる可能性があり、さらに同じ技術者であっても手技にブレが生じて、厚さにばらつきが生じる可能性がある。

免疫組織化学染色を用いる検査においては、組織切片の厚さによって染色強度が変化してしまうことから、組織切片の厚さのばらつきが検査結果に大きな影響を与える。例えば、検査に用いる複数の組織切片の厚さにバラつきがある場合、同一の条件で同時に染色したとしても、各組織切片の染色強度が同程度とはならず、組織切片の厚さに応じて染色強度が異なってしまう。そのため、組織切片の厚さにばらつきがあると、実際の組織切片の状態とは異なったスコア判定をしてしまい、検査結果に誤りが生じる恐れがある。

また、免疫組織化学染色を用いる検査では、包埋組織切片とは別に用意したコントロールスライドを用いて染色の適否を判断して検査結果の正確性を高めているが、さらに、この際においても、検査結果に誤りが生じることを抑制して、検査結果の正確性を高めたいという要求がある。

さらに、包埋ブロックを作製する前に、例えば、ホルマリン水溶液等の固定液に生体組織片を所定時間浸漬し、生体組織片の組織形態や抗原活性を最適な状態に固定させる固定処理を行っている。しかしながら、このような固定処理時に固定時間が不適切で生体組織片について最適な固定がされていないと、生体組織片内の組織形態や抗原活性が維持されず、その後、組織切片を検査する際、検査結果に誤りが生じる可能性がある。

そこで、本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、検査結果に誤りが生じることを抑制できる組織切片選定方法及び包埋ブロック作製カセットを提供することを目的とする。

本発明の組織切片選定方法は、マーカーを特異的に検出して、検査する組織切片を選定する組織切片選定方法であって、生体組織片と標準物質とを共に同じ包埋剤に包埋して包埋ブロックを作製する包埋ブロック作製工程と、前記包埋ブロックを薄切して、前記組織切片及び標準物質切片が表面に現れているシート形状の包埋組織切片を作製する包埋組織切片作製工程と、前記標準物質切片からの光シグナルに基づいて、検査する前記組織切片を選定する組織切片選定工程とを有する。なお、本願において、光シグナルとは、光学的に検出可能なシグナルであり、例えば、標準物質切片の表面からの反射光である。

本発明の包埋ブロック作製カセットは、生体組織片が包埋された包埋ブロックを作製する包埋ブロック作製カセットであって、液状包埋剤を流し込むトレイ上に載置される箱体を備えており、前記箱体は、トレイ底面上の前記生体組織片と対向した領域に上面と下面とが貫通した貫通孔を備える枠部と、前記トレイ底面と向かい合うように設けられ、標準物質が挿入される位置決め孔を有する標準物質位置決め部とを備え、前記標準物質位置決め部は、前記トレイ底面を基準としたときの前記生体組織片の下端から上端までの高さ範囲内に前記標準物質が存在するように、前記標準物質を位置決めする。

本発明の組織切片選定方法は、マーカーを特異的に検出して、検査する組織切片を選定する組織切片選定方法であって、生体組織片を固定液に所定時間浸漬した後、前記生体組織片を包埋剤に包埋して包埋ブロックを作製する包埋ブロック作製工程と、前記包埋ブロックを薄切して、前記組織切片が表面に現れているシート形状の包埋組織切片を作製する包埋組織切片作製工程と、前記包埋組織切片に対して染色処理を行い、前記組織切片内の細胞で発現されている内因性タンパク質からの光シグナルに基づいて、前記固定液による前記組織切片の固定状態を判断する固定状態判断工程とを有する。

本発明の組織切片選定方法では、組織切片及び標準物質切片が同一表面上に現れているシート形状の包埋組織切片を用い、標準物質切片からの光シグナルに基づいて、検査する組織切片を選定するようにした。これにより組織切片選定方法では、検査に最適な組織切片に対してのみ検査を行えるので、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

本発明の包埋ブロック作製カセットでは、生体組織片と標準物質とを共に同じ包埋剤に包埋させた包埋ブロックを作製できるので、当該包埋ブロックを薄切したとき、組織切片と標準物質切片とが同一表面上に現れる包埋組織切片を作製することができる。これにより、包埋ブロック作製カセットでは、標準物質切片からの光シグナルに基づいて、検査する組織切片を選定し得、検査に最適な組織切片に対してのみ検査を行わせることができるので、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

本発明の組織切片選定方法は、固定液による組織切片の固定状態を判断できるので、検査に最適な固定状態にある組織切片に対してのみ検査を行え、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

本発明の包埋ブロック作製カセットの全体構成及び使用態様を示す概略図である。 本発明の包埋ブロック作製カセットの全体構成（１）を示す斜視図である。 本発明の包埋ブロック作製カセットの全体構成（２）を示す斜視図である。 本発明の包埋ブロック作製カセットを用いて作製した包埋ブロックの構成を示す斜視図であり、図４Ａは、板枠部除去前の包埋ブロックの構成を示す斜視図であり、図４Ｂは、板枠部除去後の包埋ブロックの構成を示す斜視図である。 包埋ブロックから薄切された包埋組織切片の構成を示す斜視図である。 変形例の包埋ブロック作製カセットを用いて作製した包埋ブロックの構成を示す斜視図である。 変形例の包埋ブロック作製カセットの上面構成を示す概略図であり、図７Ａは、５つの位置決め孔が一列に配置された標準物質位置決め部を有する包埋ブロック作製カセットを示す上面図であり、図７Ｂは、４つの位置決め孔が一列に配置された標準物質位置決め部を有する包埋ブロック作製カセットを示す上面図である。 変形例の包埋ブロック作製カセットの上面構成を示す概略図であり、図８Ａは、貫通孔が円形状をした包埋ブロック作製カセットを示す上面図であり、図８Ｂは、貫通孔が４分割された包埋ブロック作製カセットを示す上面図である。 組織切片の厚さと、厚さ標準物質の色調との関係を表す検量線を示したグラフである。 組織切片の厚さと、厚さ標準物質の色調との関係を表す検量線を示したグラフである。 組織切片の厚さとマーカー標準物質の染色強度との関係を表す検量線を示したグラフである。 組織切片選定方法を利用した免疫組織化学染色法における一連の作業（１）を説明するための概略図である。 組織切片の厚さと、マーカー標準物質切片の染色強度のスコアとを調べ、検量線に対してプロットした結果を示すグラフである。 組織切片選定方法を利用した免疫組織化学染色法における一連の作業（２）を説明するための概略図である。 検体固定時間と茶色スコアとの関係を示したグラフである。 抗CD34ウサギポリクローナル抗体の濃度検討を行う際に得られた画像を示す写真である。 ブタ乳腺組織から切り出した直後に固定液に浸漬させた組織ブロックと、濃度１／４００の抗体とを用いて検証を行った際に得られた画像を示す写真である。 図１５に示したグラフを作成する際に用いた画像の一例を示す写真である。

（１）本発明の包埋ブロック作製カセットの概略
図１に示すように、本発明の実施形態に係る包埋ブロック作製カセット１は、トレイ３０上に載置されて用いられ、標準物質２１と生体組織片２２とを共に同じ包埋剤に包埋して包埋ブロック（後述する）を作製するための治具である。包埋剤（図示せず）は、例えばパラフィンなどのように熱すると液化し、冷却すると再度固化する材料である。包埋ブロック作製カセット１は、包埋ブロックを薄切する際に、ミクロトームなどの薄切器具に装着される。そのため、包埋ブロック作製カセット１の形状及びサイズは、使用する薄切器具に合わせて適宜選択される。

以下では、免疫化学組織染色法に用いる包埋ブロックを作製する場合を例として、包埋ブロック作製カセット１について説明する。また、ここでは、生体組織に含まれるマーカーとしてHER2/neuタンパクを用い、当該HER2/neuタンパクを特異的に検出して生体の状態を検査する免疫化学組織染色法を行う場合について説明する。

包埋ブロック作製カセット１は、プラスチック、フェノール樹脂、メラミン樹脂やポリスチレン等の合成樹脂材からなり、薄切器具の装着部位に合わせて外形が形成された箱体２を備えている。箱体２には、上面３ａから下面へ貫通した開口部４を取り囲むように枠部３が形成されている。この実施形態の場合、枠部３は、直方体の側面の１つが斜面となった錐台形状に形成され、開口部４は四辺形状に形成されている。

枠部３で囲まれた開口部４内の領域には、標準物質位置決め部５と貫通孔６とが設けられている。標準物質位置決め部５は、包埋ブロック作製カセット１がトレイ３０上に載置された際に、トレイ３０の底面（以下、単にトレイ底面と呼ぶ）３４上に載置された生体組織片２２を避けて当該トレイ底面３４と向かい合うよう、開口部４の所定領域に設けられている。標準物質位置決め部５には、複数の位置決め孔５ａが設けられており、それぞれに標準物質２１（後述する）が挿入される。標準物質位置決め部５は、包埋ブロック作製カセット１がトレイ３０上に載置された際に、トレイ底面３４上に載置された生体組織片２２を避けて標準物質２１を配置させる。これにより、標準物質２１は、標準物質位置決め部５により、トレイ底面３４上で生体組織片２２と並ぶように配置される。

貫通孔６は、開口部４内において標準物質位置決め部５が設けられた領域以外の残りの領域に設けられている。貫通孔６は、上面３ａ及び下面を貫通しており、包埋ブロック作製カセット１がトレイ３０上に載置された際に、トレイ底面３４上に載置された生体組織片２２を、上方から見て貫通孔６から露出させ得る。

トレイ３０は、盆形状に凹んだ収容部３１と、収容部３１の外周に沿って設けられた肩部３２と、肩部３２の外周に設けられた一対の第１鍔部３５及び第２鍔部３６とを備えている。収容部３１には、包埋ブロックを作製する際に、収容部３１内のトレイ底面３４上に生体組織片２２が載置される。また、収容部３１は、包埋ブロック作製カセット１がトレイ３０上に載置された後に、トレイ３０に流し込まれた液状包埋剤を収容する。液状包埋剤は、包埋ブロック作製カセット１がトレイ３０上に載置された状態で収容部３１内において冷却され、固化される。

肩部３２は、包埋ブロック作製カセット１と当接し、包埋ブロック作製カセット１を支持する。第１鍔部３５と第２鍔部３６とは、肩部３２の対向する２辺にそれぞれ設けられており、包埋ブロック作製カセット１が肩部３２上に載置されるように、包埋ブロック作製カセット１をガイドする。

標準物質２１は、標準物質位置決め部５における各位置決め孔５ａの孔形状（ここでは円柱形状）に合わせて同じ形状（円柱形状）に形成されている。標準物質２１は、後述する組織切片の厚さの基準となる厚さ標準物質２１ａと、マーカーの検出結果の適否の基準となるマーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅとであり、ここでは、これら厚さ標準物質２１ａ及びマーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅをまとめて標準物質２１と呼んでいる。本実施形態では、上記のとおり、生体組織内のHER2/neuタンパクを検出する場合を例としている。生体内のHER2/neuタンパクの量は、通常、０（陰性）、１＋、２＋、３＋の４段階で評価される。

そのため、マーカーの検出結果の適否の基準となるマーカー標準物質としては、染色結果が陰性を示す細胞株MDA-MB-231で作られたマーカー標準物質２１ｂ、染色結果が１＋を示す細胞株MDA-MB-175VIIで作られたマーカー標準物質２１ｃ、染色結果が２＋を示す細胞株MDA-MB-453で作られたマーカー標準物質２１ｄ、及び、染色結果が３＋を示す細胞株SK-BR-3で作られたマーカー標準物質２１ｅを用いている。

マーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅは、上記の細胞株を包埋したコントロール細胞包埋ブロックをそれぞれ作製し、当該コントロール細胞包埋ブロックをBIOPSY PUNCH（カイ インダストリーズ社製）を用いて円柱形状にくり抜いて作製している。

厚さ標準物質２１ａは、厚さによって光シグナルとしての色調が変わる材料で作られている。例えば、青色など所定色の顔料を混ぜて作製された顔料含有発泡ウレタンなどを厚さ標準物質２１ａとして用いることができる。厚さ標準物質２１ａは厚さによって色調などの色情報が変化する材料であれば特に限定されない。

本実施形態では、厚さ標準物質２１ａを以下の手順で作製している。まず、所定の大きさ（例えば縦１００〜１１０ｍｍ、横６０〜７０ｍｍ、高さ３０〜４０ｍｍ、重量３５〜４５ｇ）の青色顔料含有発泡ウレタンを作製する。裁断面が青色顔料含有発泡ウレタンの横方向と並行となるように、約５ｍｍ幅で、高さ方向に青色顔料含有発泡ウレタンを裁断する。続いて、シート形状に裁断された青色顔料含有発泡ウレタンから、青色顔料含有発泡ウレタン中に含まれる気泡の数が少ない部分である中央付近を切り出し、さらに約５ｍｍの厚さのシート形状に裁断して、発泡ウレタン小片を作製する。

発泡ウレタン小片を市販のパラフィン包埋ブロック作製カセットEB-W（オリンパス社製）の中に載置し、密閉式自動固定包埋装置ティシュー・テックVIP（サクラファインテックジャパン社製）を用いて固定化処理する。固定化処理した発泡ウレタン小片をティシューマイクロアレイヤー装置KIN-2型（東屋医科器械社製）によって円柱形状にくり抜くことで、厚さ標準物質２１ａを作製する。

（２）包埋ブロック作製カセットの詳細構成
ここで、図１に加えて、図１との対応部分に同一符号を付した図２及び図３を参照して、包埋ブロック作製カセット１についてさらに詳細に説明する。箱体２に設けられた枠部３は、開口部４内を取り囲む内壁３ｂのうち、対向する一対の内壁３ｂ間に角棒状の横桟部９が橋架されている。横桟部９は、枠部３の下面３ｆと面一に設けられ、開口部４内を２つの領域に分けており、一方の領域を標準物質位置決め部５の形成領域とし、他方の領域を貫通孔６の形成領域とする。

標準物質位置決め部５は、枠部３と同一部材により形成されており、筒形状でなる複数の位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊを有する。これら位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊは、所定距離を設けて配置されている。隣接する位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ（５ｈ，５ｉ，５ｊ）は、角棒状の連結部５ｍにより互いに連結され、枠部３の内壁３ｂに近接する位置決め孔形成部５ｆ，５ｈ，５ｊは、それぞれ角棒状の連結部５ｍにより当該内壁３ｂに連結されている。横桟部９に隣接する位置決め孔形成部５ｇ，５ｉは、側面が横桟部９にも連結されている。標準物質位置決め部５において、位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊ及び連結部５ｍ以外の領域は、上面３a及び下面３ｆを貫通する開口部５ｋとなっている。

この実施形態の場合、位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊは、同一構成を有しており、上面３ａから下面３ｆまで貫通する柱形状の中空領域が位置決め孔５ａとなり、それぞれの位置決め孔５ａに標準物質２１が挿入され得る。本実施形態では、上記のように厚さ標準物質２１ａ、マーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅを用いるため、標準物質位置決め部５には５つの位置決め孔５ａが設けられている。

標準物質位置決め部５は、位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊを連結部５ｍや横桟部９を介在させて枠部３の内壁３ｂに対して固定しつつ、位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊ間に開口部５ｋを形成し、当該開口部５ｋからも液状包埋剤をトレイ底面３４に流し込むことができる。また、貫通孔６と標準物質位置決め部５との間にある横桟部９は、枠部３の下面３ｆと面一に設けられていることから、包埋ブロック作製カセット１がトレイ３０上に載置された際、トレイ底面３４と横桟部９と間に隙間を形成し得、トレイ３０に流し込まれた液状包埋剤が貫通孔６の領域及び標準物質位置決め部５の領域間でも流動し得る。

ここで、位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊは全て同一構成を有することから、例えば、位置決め孔形成部５ｇに着目して以下説明する。位置決め孔形成部５ｇは、位置決め孔５ａがトレイ底面３４と向き合うように、連結部５ｍや横桟部９を介在させて枠部３の内壁３ｂに対して固定されている。位置決め孔形成部５ｇは、所定の高さに形成されており、位置決め孔５aに標準物質２１が挿入された際、標準物質２１の一端をトレイ底面３４に当接させつつ、トレイ底面３４に対して標準物質２１の長手方向が垂直方向に向くように維持させ得る。これにより、位置決め孔形成部５ｇは、包埋ブロックを作製する際、トレイ底面３４を基準として、生体組織片２２の下端から上端までの高さ範囲に標準物質２１が存在するように位置決めし得る。

本実施形態の場合、箱体２は、トレイ底面３４に生体組織片２２が置かれたトレイ３０上に対し包埋ブロック作製カセット１を載置した際に、生体組織片２２の全体が貫通孔６から外部に露出するように形成されている。これにより、トレイ底面３４に生体組織片２２が置かれたトレイ３０上に対し包埋ブロック作製カセット１を載置した状態で、貫通孔６を介して生体組織片２２をトレイ底面３４上で動かし、生体組織片２２の位置調整を行ったり、或いは、液状包埋剤を流し込む際にトレイ底面３４から浮き上がった生体組織片２２をトレイ底面３４に押し付けたりすることができる。

なお、本実施形態においては、貫通孔６として、トレイ底面３４上に載置された生体組織片２２全体が、貫通孔６を通して上方から見えるように、貫通孔６の大きさを生体組織片２２よりも大きくした場合について述べたが、本発明はこれに限らない。例えば、他の実施形態による貫通孔としては、生体組織片２２の対向する両端部間の全体が、貫通孔６を通して上方から見えるような大きさの貫通孔６や、生体組織片２２の１／３以上が貫通孔６を通して上方から見えるような大きさの貫通孔６としてもよい。

かかる構成に加えて、箱体２は、図３に示すように、枠部３の下面３ｆに、四辺形状に配置された板枠部１３が立設されている。板枠部１３は、内壁面１４ａが枠部３の開口部４を囲うように設けられている。すなわち、板枠部１３は、標準物質位置決め部５の形成領域と貫通孔６の形成領域とを内壁面１４ａにより取り囲むように設けられている。

板枠部１３は、包埋ブロック作製カセット１の箱体２がトレイ３０の肩部３２に載置された際に、トレイ３０の底面３４に先端１４が当接し、トレイ底面３４及び内壁面１４ａで囲まれた空間を形成し得る。これにより、包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０に載置して開口部４から液状包埋剤を流し込んで包埋ブロックを作製する際には、トレイ底面３４及び板枠部１３で囲まれた空間に液状包埋剤が溜まってゆき、当該空間に流し込まれた液状包埋剤が貫通孔６の領域及び標準物質位置決め部５の領域間で流動することから、標準物質２１と生体組織片２２とが共に同じ包埋剤に包埋された包埋ブロックを作製できる。

（３）包埋ブロック作製カセット１の使用方法
続いて包埋ブロック作製カセット１の使用方法について説明する。生体から採取した生体組織片２２を、トレイ底面３４の所定位置に載置する（載置工程）。次いで、トレイ３０の肩部３２に、包埋ブロック作製カセット１の枠部３の下面３ｆが乗るように、当該包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０上に載置する。これにより、包埋ブロック作製カセット１の箱体２における貫通孔６の領域内に、トレイ底面３４上の生体組織片２２を配置させる。

続いて、標準物質２１を、標準物質位置決め部５の各位置決め孔５ａにそれぞれ１つずつ挿入する。この際、標準物質２１は、一端がトレイ底面３４に当接するまで位置決め孔５ａに挿入され、位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊによりそれぞれ支持される。標準物質２１は、生体組織片２２の高さに亘って配置される。本実施形態では、厚さ標準物質２１ａを位置決め孔形成部５ｆの位置決め孔５ａに挿入し、マーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅを、残りの位置決め孔形成部５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊの各位置決め孔５ａにそれぞれ挿入する（位置決め工程）。なお、トレイ３０上に包埋ブロック作製カセット１を載置した後に、貫通孔６からトレイ底面３４に生体組織片２２を載置してもよく、標準物質２１を位置決め孔５ａに挿入した後に生体組織片２２をトレイ底面３４上に載置してもよい。

本実施形態では、位置決め孔５ａの円柱形状に合わせて、標準物質２１の外形を円柱形状とし、さらに、標準物質２１の直径が、位置決め孔５ａの直径よりも僅かに小さく選定されていることから、位置決め孔５ａに標準物質２１を確実に挿入し得、また位置決め孔５ａ内に標準物質２１を支持できる。

次いで、例えばパラフィンなどの包埋剤を加熱して液化させた液状包埋剤を、開口部４からトレイ３０に注ぐ（液状包埋剤導入工程）。液状包埋剤は、トレイ底面３４上の生体組織片２２や、包埋ブロック作製カセット１の標準物質位置決め部５が覆われるまで注がれる。この際、液状包埋剤は、トレイ底面３４上において、包埋ブロック作製カセット１の板枠部１３で囲まれた空間に溜まってゆき、包埋ブロック作製カセット１の貫通孔６の領域及び標準物質位置決め部５の領域間で流動する。また、液状包埋剤は、位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊにおいて標準物質２１が挿入された各位置決め孔５ａ内の隙間や、位置決め孔５ａ内から露出した標準物質２１周辺にも溜まり、生体組織片２２、標準物質位置決め部５及び標準物質２１を全て覆うようにする。

液状包埋剤が固化するとき、標準物質２１は、位置決め孔に支持されているので、例えば、トレイ底面３４を基準としたときの生体組織片２２の下端から上端までの高さ範囲全てに存在するように、位置決めさせることができる。ここで、包埋ブロック作製カセット１の開口部４からトレイ３０上に液状包埋剤を流し込む際に、トレイ底面３４上の生体組織片２２が当該トレイ底面３４から浮いたり、或いは生体組織片２２の位置がズレたりすることもある。その場合には、ピンセットなどを、枠部３の貫通孔６からトレイ３０の収容部３１内に入れ、トレイ底面３４上の生体組織片２２をトレイ底面３４に押し付けることができる。これにより、標準物質２１が存在する高さ範囲に対して、生体組織片２２を位置合わせすることができる。

その後、液状包埋剤を冷却して固化させることで、図３との対応部分に同一符号を付して示す図４Ａのように、生体組織片２２と標準物質２１とが共に同じ包埋剤２３に包埋され、かつ包埋ブロック作製カセット１と一体化した包埋ブロック２４を作製できる（固化工程）。最後に、図４Ａとの対応部分に同一符号を付して示す図４Ｂのように、枠部３の下面３ｆに設けられている板枠部１３を取り外し、包埋ブロック２４を包埋ブロック作製カセット１から外部に露出させる。このように、包埋ブロック作製カセット１において、四辺形状に配置された板枠部１３を取り外すことで、直角に近い形状の４つの角部を有した直方体形状の包埋ブロック２４を作製できる。また、包埋ブロック作製カセット１の開口部４内における標準物質位置決め部５も含めて液状包埋剤が固化していることから、包埋剤２３が標準物質位置決め部５とも一体的となり、包埋ブロック２４が包埋ブロック作製カセット１から抜け落ちてしまうことを防止できる。

（４）本発明の組織切片選定方法
次に、本発明による組織切片選定方法の一例について説明する。ここでは、「（１）本発明の包埋ブロック作製カセットの概略」と同様に、免疫化学組織染色法によって生体組織の状態を検査する場合を例として説明する。まず、図４Ｂに示したように、包埋ブロック作製カセット１を用いて、生体組織片２２と標準物質２１とを共に同じ包埋剤２３に包埋した包埋ブロック２４を作製する。

次いで、包埋ブロック２４と一体化した包埋ブロック作製カセット１をミクロトームにセットする。ミクロトームにおいて、例えば切削刃の位置を、所望する薄切厚さ（例えば４μｍ）に設定し、当該ミクロトームによって包埋ブロック２４を薄切し、生体組織片２２と標準物質２１との切断面が両面に現れたシート形状の包埋組織切片を作製する。ミクロトームによって、例えば1ストロークで上下移動する切削刃により、１ストローク毎に、包埋ブロック２４から包埋組織切片が切り出されてゆく。

次いで、図５に示すように、シート状の包埋組織切片４４を、例えばスライドガラスなどの基板４６上に伸展させて貼り付けることで、組織切片張付基板４０を作製する。包埋組織切片４４は基板４６上で乾燥される。ここで、包埋組織切片４４には、直角に近い４つの角を有する長方形状に形成されている。そのため包埋組織切片４４の角を目安にすることで、切り出す前の包埋ブロック２４において組織切片４２がどの位置にあったかを、作業者に把握させることができる。

包埋組織切片４４は、組織切片４２と、標準物質切片としての厚さ標準物質切片４１ｅと、同じく標準物質切片としてのマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａとが、表面に露出しており、組織切片４２、厚さ標準物質切片４１ｅ、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの各周辺が包埋剤切片４３により囲まれた構成を有している。

次いで、例えば、包埋組織切片４４から包埋剤を除去する脱包埋剤処理や、抗原賦活化液によるプロテアーゼ処理、ブロッキング試液による内因性ペルオキシダーゼ処理、免疫組織化学染色法による染色処理が順次行われる。染色処理では、例えば、組織切片４２内のHER2/neuタンパクと結合する一次抗体などを用いて、組織切片４２内で抗原抗体反応を起こさせた後、二次抗体標識ポリマーを一次抗体に結合させ、さらに例えば発色試薬などを用いて組織切片４２に含まれたHER2/neuタンパクを染色し、当該HER2/neuタンパクを特異的に検出する。

次に、デジタルカメラを備えた顕微鏡のステージに組織切片張付基板４０を載置し、厚さ標準物質切片４１ｅの表面に焦点を合わせて、厚さ標準物質切片４１ｅの表面を撮影し、当該厚さ標準物質切片４１ｅの画像を取得する。このとき、あらかじめ定められた倍率（本実施形態では対物レンズ倍率２．５倍）で撮影する。なお、画像は、厚さ標準物質切片４１ｅの表面からの反射光に基づいて生成される。画像の色調も当該反射光に基づいて定まる。

厚さ標準物質切片４１ｅの画像をもとに、厚さ標準物質切片４１ｅの色調をスコア化する。本実施形態では、計測プログラムを用いて、厚さ標準物質切片４１ｅの画像から所定の色調（本実施形態では、色相範囲：２７２°‐３０５°、彩度範囲：０‐５１、Ｒ値の輝度範囲：０‐７１、Ｇ値の輝度範囲：０‐７７、Ｂ値の輝度範囲：０‐７７の範囲にある色調）のピクセルを抽出し、以下に示す式（１）を用いて色調をスコア化する。ここでは、厚さ標準物質２１ａとして青色に染色された発泡ウレタンを用いているので、上記のような色調の範囲を選定している。

具体的には、抽出したピクセルを彩度値でソートし、所定の彩度範囲毎に、当該彩度範囲に属するピクセルの数と平均輝度とを算出する。平均輝度は、各ピクセルのＲ値、Ｇ値、Ｂ値の平均値を、各彩度範囲に属するピクセル全体で平均して算出する。輝度値の上限値２５５から平均輝度を引いた値を２５５で割って各彩度範囲の平均輝度を正規化する。彩度範囲毎に正規化した平均輝度に、当該彩度範囲に属するピクセルの数を抽出したピクセル数で割って算出したピクセル割合を乗算し、乗算結果をすべて加算することでスコアを算出する。

次いで、あらかじめ作製した厚さ標準物質切片４１ｅのスコアと厚さの関係を表す検量線を用いて、上記式で算出したスコアに対応する厚さを算出し、当該厚さを組織切片４２の厚さとする。そして、組織切片４２の厚さが所定の範囲内（本実施形態では、４μｍ±０．４μｍ）にあるとき、組織切片張付基板４０の組織切片４２を検査する対象として選定する。一方、組織切片４２の厚さが所定の範囲内にないときは、組織切片張付基板４０の組織切片４２を検査しないと判断する。このように本実施形態では、厚さ標準物質切片４１ｅからの光シグナルとしての色調に基づいて、検査する組織切片４２を選定している。

続いて、マーカー標準物質切片４１ａの表面に焦点を合わせてマーカー標準物質切片４１ａの表面を撮影し、マーカー標準物質切片４１ａの画像を取得する。このとき、あらかじめ定められた倍率（本実施形態では対物レンズ倍率４０倍）で撮影する。

マーカー標準物質切片４１ａの画像をもとに、マーカー標準物質切片４１ａの染色強度をマーカー標準物質切片４１ａの色調に基づいてスコア化する。本実施形態では、計測プログラムを用いて、マーカー標準物質切片４１ａの画像から所定の色調（色相：５０°‐１８０°、彩度範囲：２‐４０、Ｒ値：１０‐１８０、Ｇ値：１０‐１４５、Ｂ値：１０‐１４０の範囲にある色調）のピクセルを抽出し、上記の式（１）を用いて厚さ標準物質切片４１ｅと同様に色調をスコア化し、当該スコアを染色強度のスコアとしている。本実施形態では、HER2/neuタンパクが茶色に染色されるので、上記のような色調の範囲を選定している。

次いで、縦軸にマーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコア、横軸に組織切片４２の厚さをとり、マーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコアと組織切片４２の厚さの関係を表す検量線を示したグラフを用意する。上記で算出した組織切片４２の厚さとマーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコアとに基づいてプロットする。

プロットした結果、マーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコアが所定の範囲内（本実施形態では、検量線の染色強度スコア±１０％の範囲）にあるとき、組織切片４２においてHER2/neuタンパクの染色が適切に行われており、マーカーの検出結果が適切であるとする。これにより、この組織切片４２については検査が可能であると判断し、組織切片張付基板４０の組織切片４２を検査する対象として選定する。

一方、プロットが所定の範囲内にないときは、組織切片４２のHER2/neuタンパクの染色が適切に行われておらず、マーカーの検出結果が適切でない可能性があるため、組織切片４２の検査に誤りが生じる恐れがあるとし、組織切片張付基板４０の組織切片４２を検査しないと判断する。このように本実施形態では、マーカー標準物質切片４１ａからの光シグナルとしての色調に基づいて、検査する組織切片４２を選定している。

これにより、検査を行う作業者は、選定された組織切片４２の色調を、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの色調と比較して、組織切片４２を検査する。

なお、マーカー標準物質切片４１ａのかわりに、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂのいずれかの染色強度のスコアを算出し、当該染色強度のスコアが所定の範囲内にあるとき、検査が可能であると判断してもよい。マーカー標準物質切片４１ｄは、陰性である細胞株でなり、適切に染色処理が行われた場合、染色されないので、染色されたか否かで、染色が適切に行われたか判断する。

マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａから選択された２つ以上のマーカー標準物質についてそれぞれ染色強度のスコアを算出し、２つ以上のマーカー標準物質の染色強度のスコアが所定の範囲内にあるとき、検査可能であると判断してもよい。さらに、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａについてそれぞれ染色強度のスコアを算出し、すべてのマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの染色強度のスコアが所定の範囲内にあるとき、検査可能であると判断してもよい。

（５）作用及び効果
以上の構成において本発明の実施形態に係る包埋ブロック作製カセット１は、生体組織片２２が包埋剤２３に包埋された包埋ブロック２４を作製する際に、液状包埋剤を流し込むトレイ３０上に箱体２を載置させる構成とした。包埋ブロック作製カセット１の箱体２では、トレイ底面３４上の生体組織片２２と対向した領域に上面３aと下面３ｆとが貫通した貫通孔６を備えた枠部３と、トレイ底面３４と向かい合うように設けられ、かつ標準物質２１が挿入される位置決め孔５ａを有した標準物質位置決め部５とを備える構成とした。また、標準物質位置決め部５では、位置決め孔５ａに標準物質２１を挿入させた際に、トレイ底面３４を基準としたときの生体組織片２２の下端から上端までの高さ範囲内に標準物質２１を存在させるようにした。

よって包埋ブロック作製カセット１では、包埋ブロック２４を作製する際、標準物質位置決め部５により、標準物質２１を生体組織片２２の下端から上端までの高さ範囲内に存在させた状態のまま、包埋ブロック作製カセット１の開口部４内に液状包埋剤が流し込まれることで、生体組織片２２と標準物質２１とが同じ包埋剤２３に包埋された包埋ブロック２４を作製できる。包埋ブロック作製カセット１では、このような包埋ブロック２４を薄切させることで、組織切片４２と、厚さ標準物質切片４１ｅと、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａとが同一表面上に現れる包埋組織切片４４を作製できる。これにより、包埋ブロック作製カセット１では、厚さ標準物質切片４１ｅや、例えばマーカー標準物質切片４１ａの色調に基づいて、検査する組織切片を選定し得、検査に最適な組織切片に対してのみ検査を行わせることができるので、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

さらに包埋ブロック作製カセット１では、開口部４内において標準物質位置決め部５の形成領域以外の領域を貫通孔６とし、上方から見て、生体組織片２２全体が貫通孔６の形成領域内に収まるようにした。これにより、包埋ブロック作製カセット１では、包埋ブロック２４の作製時に、貫通孔６から生体組織片２２をトレイ底面３４に押し付けることができる。これにより、包埋ブロック作製カセット１では、生体組織片２２の浮き上がり等を防止でき、厚さ標準物質２１ａ、マーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅの高さ範囲に合わせて組織切片４２を位置調整できる。よって、包埋ブロック作製カセット１により作製した包埋ブロック２４を薄切したときに、組織切片４２と、厚さ標準物質切片４１ｅと、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａと、が全て同一表面上に現れた包埋組織切片４４を確実に作製できる。

さらに包埋ブロック作製カセット１では、枠部３の下面３ｆの板枠部１３により、直角に近い形状の４つの角部を有した直方体形状の包埋ブロック２４を作製できるようにした。これにより、当該包埋ブロック２４を薄切して作製する複数の包埋組織切片４４の外周形状を直角形状の角部を４つ有した四辺形状にすることができ、スライドガラスに包埋組織切片４４を貼付して検査する組織切片４２を選定する際、包埋組織切片４４の４つの角部を基準とすることで異なるスライド間であっても確認すべき組織切片４２の位置をより正確に捉えることができる。

本発明の組織切片選定方法では、生体組織片２２と厚さ標準物質２１ａとマーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅとを共に同じ包埋剤２３に包埋して包埋ブロック２４を作製し（包埋ブロック作製工程）、当該包埋ブロック２４を薄切して、組織切片４２と、厚さ標準物質切片４１ｅと、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａとが全て同一表面上に現れるシート形状の包埋組織切片４４を作製するようにした（包埋組織切片作製工程）。また、組織切片選定方法では、厚さ標準物質切片４１ｅの色調（光シグナル）に基づいて組織切片４２の厚さを算出し、検査する組織切片を選定し（組織切片選定工程、組織切片厚判断工程）と、組織切片厚判断工程の後に、例えばマーカー標準物質切片４１ａの色調（光シグナル）に基づいて、検査する組織切片４２を選定するようにした（組織切片選定工程、マーカー適否判断工程）。

よって組織切片選定方法は、組織切片４２と厚さ標準物質切片４１ｅとが同一表面上に現れているシート状の包埋組織切片４４を用い、厚さ標準物質切片４１ｅの色調から組織切片４２の厚さを算出できる。これにより、組織切片選定方法では、検査に最適な厚さを有した組織切片４２のみを選択し、選択した組織切片４２に対してのみ検査を行えるので、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

また、組織切片選定方法では、組織切片４２とマーカー標準物質切片４１ａとが同一表面上に現れている包埋組織切片４４を用い、マーカー標準物質切片４１ａの色調から染色強度のスコアを算出できる。この場合、組織切片選定方法では、マーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコアに基づいて、検査する組織切片４２を選定するようにした。これにより、組織切片選定方法では、マーカーの検出結果の適否をより確実に判断できるので、検査に最適な組織切片４２に対してのみ検査を行え、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

特に、この組織切片選定方法では、厚さ標準物質切片４１ｅの色調に基づいて組織切片４２の厚さを算出し、検査する組織切片４２を選定した後、さらにマーカー標準物質切片４１ａの色調に基づいて染色強度のスコアを算出し、検査する組織切片４２を選定するようにした。これにより、この組織切片選定方法では、所望する厚さの組織切片４２のみを選択し、当該組織切片４２に対してもマーカーの検出結果の適否を判断できるので、検査結果に誤りが生じることを一段と抑制できる。

組織切片選定方法では、包埋ブロック２４を薄切することで、組織切片４２とマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａとが同一表面上に現れる包埋組織切片４４を作製できることから、同じ条件で作製し、かつ染色した、組織切片４２とマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａとを、検査時に比較できる。かくして、製造条件の違いや、染色条件の違いによる影響を防止でき、組織切片４２について、より正確に検査できる。

（６）変形例
なお、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能であり、例えば、トレイ３０の形状、サイズなどは、特に限定されず、包埋ブロック作製カセット１に合わせて適宜選択できる。例えば、包埋皿などの名称で従来から販売されているものをトレイ３０として利用でき、また、包埋ブロック作製カセットの形状、サイズなどに合わせて作製してもよい。また、位置決め孔５ａの数は標準物質２１の数と同数であってもよく、標準物質２１の数以上であってもよい。

上記の実施形態では、枠部３の下面３ｆに板枠部１３を設けた場合について説明したが、本発明はこれに限られず、枠部３の下面３ｆに板枠部１３を設けない構成としてもよい。図４Ｂとの対応部分に同一符号を付して示す図６は、枠部３の下面３ｆに板枠部１３を設けていない包埋ブロック作製カセット１により、包埋ブロック２４を作製したときの構成を示す概略図である。図６に示すように、包埋ブロック２４は、包埋剤２３の外形がトレイ３０の収容部３１と同様の形状となり得る。このため、例えば板枠部１３がない分、直方体形状における４つの各角部が丸まった包埋剤２３となるものの、図４Ａ及び図４Ｂに示したような板枠部１３を除去する作業が不要となりその分、作業負担を軽減できる。

上記の実施形態では、厚さ標準物質２１a、マーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅを用いるため、５つの位置決め孔５ａを設けた標準物質位置決め部５について説明してきたが、本発明はこれに限られず、１つの位置決め孔や、２つの位置決め孔等、少なくとも１つ以上の位置決め孔を設けた標準物質位置決め部であればよい。特に、厚さ標準物質２１ａとマーカー標準物質２１ｅとをそれぞれ１つずつ包埋ブロック２４に包埋できるように、少なくとも２つ以上の位置決め孔を有することが望ましい。

また、上記の実施形態では、直列に並んだ３つの位置決め孔形成部５ｆ，５ｈ，５ｊと、直列に並んだ２つの位置決め孔形成部５ｇ，５ｉとを２列に並べた標準物質位置決め部５について説明したが、本発明はこれに限らず、標準物質位置決め部において位置決め孔形成部を１列や３列など種々の位置に配置してもよい。例えば、図７Ａ及び図７Ｂは、他の実施形態による包埋ブロック作製カセット５１，６１の上面構成を示す概略図である。図７Ａに示すように、箱体５２における開口部４に、複数の位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊを一列に並べた標準物質位置決め部５５を設けてもよい。また、図７Ｂに示すように、箱体６２における開口部４に、４つの位置決め孔形成部５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊを一列に並べ、かつ残り１つの位置決め孔形成部５ｆを、位置決め孔形成部５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊの列とは異なる位置に配置した標準物質位置決め部６５を設けてもよい。

標準物質２１の高さは、標準物質２１の一端がトレイ底面３４に当接した状態で、当該標準物質２１を位置決め孔形成部により支持できる程度の長さが望ましいが、本発明はこれに限らない。例えば、上記の実施形態では、生体組織片２２の高さ範囲以上の標準物質２１を用い、生体組織片２２の全高さ範囲に亘って標準物質２１を配置させるようにしたが、本発明はこれに限らず、例えば生体組織片２２の高さ範囲よりも短い標準物質を用い、生体組織片２２の高さ範囲の一部領域にのみ標準物質を配置させるようにしてもよい。

上記の実施形態では、標準物質位置決め部５における各位置決め孔５ａの孔形状を円柱形状とし、それに合わせて標準物質２１を円柱形状とした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、標準物質位置決め部５における各位置決め孔５ａの孔形状を四角柱形状、多角柱形状など、その他種々の支柱状に形成し、それに合わせて標準物質２１も四角柱形状、多角柱形状など、その他種々の支柱状に形成してもよい。また、位置決め孔５ａに挿入することで標準物質２１を支持できれば、位置決め孔形成部の形状や、位置決め孔の形状、標準物質の形状は特に限定されず、例えば、位置決め孔と標準物質の形状が異なる形状であってもよい。

上記の実施形態では、開口部４内の領域に標準物質位置決め部５と貫通孔６との両方が設けられている場合について説明したが、本発明はこれに限られず、例えば、貫通孔６が形成された開口部４とは別に、上面と下面とが貫通する開口部を枠部３に設け、当該開口部に標準物質位置決め部５を設けてもよい。

上記の実施形態では、横桟部９によって２つに分けられた開口部４内の領域の一方に、四辺形状の貫通孔６が設けられた場合について説明したが、本発明はこれに限られず、例えば、円形状、三角形状、楕円形状、多角形状などの貫通孔が設けられていてもよい。例えば、図８Ａは、他の実施形態による包埋ブロック作製カセット７１の上面構成を示す概略図である。図８Ａに示すように、箱体７２における開口部４に、円形状の貫通孔７６を有する板状の貫通孔形成部７７を設けるようにしてもよい。また、上記の実施形態では、１つの貫通孔６を設けた場合について説明したが、本発明はこれに限られない。例えば、図８Ｂは、他の実施形態による包埋ブロック作製カセット８１の上面構成を示す概略図である。図８Ｂに示すように、箱体８２の開口部４の一部領域に、２つの角柱形状の部材が互いに直交する十字形状をした十字横桟部８７を設け、４分割にされた貫通孔８６を設けるようにしてもよい。

上述した実施形態では、枠部３の内壁３ｂに設けた横桟部９や、連結部５ｍにより位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊを枠部３の内壁３ｂに固定した場合について述べたが、本発明はこれに限らず、横桟部９のみ、或いは連結部５ｍのみによって、枠部３の内壁３ｂに位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊを固定してもよい。横桟部９や連結部５ｍを用いずに、枠部３の内壁３ｂに直接位置決め孔形成部５ｆ，５ｇ，５ｈ，５ｉ，５ｊを固定してもよい。

上記の実施形態では、免疫組織化学染色法による染色処理を行った後に、厚さ標準物質切片４１ｅの色調に基づいて、検査する組織切片４２を選定していたが、本発明はこれに限られず、厚さ標準物質切片４１ｅの色調に基づいて、検査する組織切片４２を選定した後に、選定した組織切片４２を有する組織切片張付基板４０にのみ免疫組織化学染色法による処理を行うようにしてもよい。

また、上記の実施形態では、各スライド間の組織切片４２の観察位置をより正確に捉えるために、包埋組織切片４４の角部を利用したが、観察位置をより高精度に管理するために、例えば、位置管理の為の基準を有するスライドガラスや、スライドガラスを載置した際、載置されたスライドガラスの回転誤差を補正する手段を有する高精度なＸＹステージなどの位置同期機能を搭載した顕微鏡システムを用いても良い。

上記の実施形態では、デジタルカメラで撮影した画像と上述した式（１）とを用いて、厚さ標準物質切片４１ｅの色調とマーカー標準物質切片４１ａの染色強度とをスコア化したが、本発明はこれに限られず、厚さ標準物質切片４１ｅの色調とマーカー標準物質切片４１ａの色調とを顕微鏡を用いて目視して、色見本や組織切片の判定例などをもとにしてスコアを決定するようにしてもよい。

上記の実施形態では、免疫化学組織染色法によって生体組織に含まれるHER2/neuタンパクを特異的に検出して生体の状態を検査する検査方法に用いる組織切片を選定する場合を例として説明したが、本発明はこれに限られず、免疫組織染色法によって、マーカーとして、ALK融合タンパク、PD-L1、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、EGFレセプター、ソマトスタチンやS-100などを検出する場合に本発明を適用してもよい。

さらに、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）法や発色インサイチューハイブリダイゼーション（CISH）法によって組織切片に含まれるHER2/neu、ALK、PD-L1、エストロゲンレセプターやプロゲステロンレセプターなどの特定遺伝子（マーカー）を特異的に検出して生体の状態を検査する検査方法に用いる組織切片を選定する場合に本発明を適用してもよい。

FISH法では、組織切片中のマーカーに、蛍光標識が結合されたプローブをハイブリダイゼーションにより結合し、蛍光顕微鏡によって組織切片の蛍光を検出することで、組織切片中のマーカーを検出する。この場合、標準物質切片からの光シグナルとしての蛍光の強度をスコア化し、組織切片４２の厚さと蛍光の強度のスコアとに基づいて検査する組織切片４２を選定する。

CISH法では、組織切片中のマーカーに、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン（DIG）抗体などが結合されたプローブをハイブリダイゼーションにより結合し、アルカリフォスファターゼ基質の発色を検出することで、組織切片中のマーカーを検出する。この場合、標準物質切片からの光シグナルとしての発色の強度をスコア化し、組織切片４２の厚さと発色の強度のスコアとに基づいて検査する組織切片４２を選定する。

上述したFISH法やCISH法の場合には、それぞれの方法に用いるマーカーを含んだマーカー標準物質を用意し、包埋ブロックの作製時に、当該マーカー標準物質を包埋ブロック作製カセット１の位置決め孔５ａに挿入させればよい。

上記の実施形態では、厚さ標準物質２１ａとして顔料含有発泡ウレタンを用いた場合について説明したが、本発明はこれに限られず、厚さ標準物質２１ａとして、内因性タンパク質を発現する種々の細胞を用いることもできる。この場合、様々な細胞において一定の発現量を示す内因性のタンパク質を免疫組織化学染色により染色し、当該細胞の染色強度の色調を光シグナルとして検出する。細胞としては、例えば、β-アクチンや、COX-4、GAPDH、ラミンB1、PCNA、チューブリン、CD34などの内因性タンパク質を発現する細胞を用いることができる。より具体的には、例えば、HER2陽性を示す細胞株SK-BR-3、細胞株MDA-MB-453やヒト子宮頸癌由来のHela細胞などを用いることができる。内因性タンパク質の発現量が各細胞においてほぼ一定であるので、厚さ標準物質２１ａの厚さに応じて、細胞の量が変化し、内因性タンパク質の発現量も変化する。そして、細胞の厚さに応じて免疫組織化学染色による染色強度の色調が変化する。そのため、細胞を厚さ標準物質２１ａとして用い、厚さ標準物質２１ａの色調に基づいて、組織切片４２の厚さを算出し、検査に用いる組織切片４２を選定することができる。

また、厚さ標準物質２１ａとして、内因性タンパク質に加えて、例えば、HER2/neuタンパクなどのマーカーも発現している細胞を用いた場合、厚さ標準物質２１ａをマーカー標準物質としても用いることができる。この場合、まず、当該厚さ標準物質２１ａを用いて包埋組織切片４４を作製し、厚さ標準物質切片４１ｅ内で発現している内因性タンパク質及びマーカーをそれぞれ免疫組織化学染色により染色する。次いで、厚さ標準物質切片４１ｅの表面を撮影する。続いて、厚さ標準物質切片４１ｅの画像から内因性タンパク質の染色強度のスコアとマーカーの染色強度のスコアを上記の（１）式を用いてそれぞれ算出し、内因性タンパク質のスコアとマーカーのスコアとの比を算出する。このスコアの比が所定の値の範囲内にあるとき、染色処理が適切であったと判断し、組織切片４２を検査する組織切片として選定する。内因性タンパク質とマーカーとを異なる色に染色するようにしているので、１枚の厚さ標準物質切片４１ｅの画像から内因性タンパク質のスコアとマーカーのスコアとを算出することができる。

（７）検証実験
（７−１）検証実験１
検証実験１では、厚さ標準物質として青色顔料含有発泡ウレタンを用い、当該青色顔料含有発泡ウレタンの色調と組織切片の厚さとの関係について検証した。なお、図５に示すように、包埋組織切片４４は包埋剤切片４３と組織切片４２とが面一に形成されているので、包埋剤切片４３の厚さを組織切片４２の厚さとした。また、包埋組織切片は、組織切片を有している場合と有していない場合とで、作製する検量線の傾きに大きな変化がないと考えられるので、以下では、検証用包埋組織切片として、組織切片４２が包埋されていないものを用いた。

（７−１−１）厚さ標準物質の作製
軟質発泡ウレタンの材料であるポリオール、発泡剤、整泡剤、触媒に、全質量の４．５％の青色顔料（レジノカラー工業社製）を加えて撹拌混合した。混合した材料を、成型後発泡させて、大きさが縦１００〜１１０ｍｍ、横６０〜７０ｍｍ、高さ３０〜４０ｍｍ、重量３５〜４５ｇの青色顔料含有発泡ウレタンを作製した。

裁断面が青色顔料含有発泡ウレタンの横方向と並行となるように、約５ｍｍ幅で、高さ方向に青色顔料含有発泡ウレタンをシート形状に裁断した。続いて、シート形状の青色顔料含有発泡ウレタンから、青色顔料含有発泡ウレタン中に含まれる気泡の数が少ない部分である中央付近を切り出し、約５ｍｍの厚さのシート形状をした発泡ウレタン小片を作製した。

発泡ウレタン小片を市販のパラフィン包埋ブロック作製カセットEB-W（オリンパス社製）の中に載置し、密閉式自動固定包埋装置ティシュー・テックVIP（サクラファインテックジャパン社製）を用いて固定化処理した。固定化処理した発泡ウレタン小片をティシューマイクロアレイヤー装置KIN-2型（東屋医科器械社製）によって円柱形状にくり抜き、厚さ標準物質を作製した。

（７−１−２）厚さ標準物質を含む包埋ブロックの作製
組織切片４２が包埋されていない検証用包埋組織切片を作製するため、ここでは、トレイ底面３４に生体組織片を載置せずに、包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０上に載置した。包埋ブロック作製カセット１の位置決め孔５ａに厚さ標準物質２１ａを差し込み、次いで、包埋ブロック作製カセット１の開口部４から液状化させたパラフィンを流し込んだ。パラフィンを冷却して固化させた後、包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０から取り外し、板枠部１３を除去して厚さ標準物質２１ａのみが包埋された包埋ブロックを得た。

（７−１−３）検証用包埋組織切片の作製
厚さ標準物質２１ａのみが包埋された包埋ブロックをミクロトーム（大和光機工業社製）にセットした。ミクロトームの薄切厚さを２μｍに設定し、ミクロトームにより包埋ブロックを薄切してゆき、名目上の厚さ（以下、名目厚さという。）が２μｍの検証用包埋組織切片を１０枚作製した。検証用包埋組織切片の両面には厚さ標準物質切片４１ｅが露出していた。

同様にして、名目厚さが３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍである検証用包埋組織切片を各厚さ１０枚ずつ作製した。検証用包埋組織切片を１枚ずつスライドガラス（武藤硝子工業社製）に貼付した後、３７℃で一晩乾燥させた。なお、検証用包埋組織切片は、組織切片とマーカー標準物質切片とが含まれていない点以外、図５に示した包埋組織切片と同様の構成であり、厚さ標準物質切片４１ｅの周辺がシート形状の包埋剤切片で囲まれている。

（７−１−４）組織切片の厚さ算出用の検量線の作製
検証用包埋組織切片を張り付けたスライドガラスを水平に維持した顕微鏡システム（ニコン社製）の試料台に載置し、Vert Scan（登録商標、株式会社菱化システム製、Ver.1.0.3）により光干渉法を用いて包埋剤切片の基板からの高さを４か所測定した。そして、４か所で測定した高さの平均値を組織切片の厚さとした。Vert Scanの測定条件は、波長フィルター530Whiteとし、二光束干渉対物レンズを１０倍とし、測定モードをWaveモードとした。

包埋剤切片の厚さの測定方法を具体的に説明する。顕微鏡システムに付属するモニターの測定画面に包埋剤切片の４辺のうちの１辺が映し出されるように、顕微鏡の試料台のＸＹステージ、Ｚステージ及び傾斜ステージを調整し、顕微鏡の試料台を移動させた。上下動ハンドルを操作してモニターに表示された画像中の干渉縞に最も強いコントラストが得られるよう調整した。試料台の傾きを調整し、モニター画像中の干渉縞が２〜７本程度となるよう調整した。測定を実行し、モニターの測定画面中のスライドガラス領域の色調が一定であることを指標とし、スライドガラスが水平に載置されているか否かをさらに確認した。

続いて、包埋剤切片の厚さの基準とするスライドガラス表面の一部領域を指定し、当該指定領域の表面の粗さやうねりの影響を除去するための補正処理を行った。包埋剤切片表面の一部領域を指定し、補正処理後のスライドガラス表面の指定領域を基準として包埋剤切片の１辺における高さを測定した。この操作を包埋剤切片の他の３辺でも行い、測定した４辺の高さの平均値を組織切片の厚さとした。

同様にして、組織切片の厚さを、用意したすべての検証用包埋組織切片で算出した。包埋剤切片の４辺のいずれか１辺で名目厚さとの厚さの差が２．０μｍを超えた検証用包埋組織切片と、厚さのばらつきを正規分布とみなしたとき存在確率が０．３％未満となる組織切片の厚さが算出された検証用包埋組織切片を除外した。その結果、名目厚さ２μｍで７個、名目厚さ３μｍで７個、名目厚さ４μｍで９個、名目厚さ５μｍで１０個、名目厚さ６μｍで９個の合計４２個の検証用包埋組織切片を得た。

これら４２個の検証用包埋組織切片について、すでに確立されている一般的な手法にて脱パラフィン処理を行うことにより、包埋剤切片を除去してスライドガラス上には厚さ標準物質切片４１ｅのみが存在するようにした。厚さ標準物質切片４１ｅの継時的な乾燥を防ぐため封入剤をスライドガラス上に滴下してカバーガラスにて厚さ標準物質切片４１ｅを覆った。

次に、デジタルカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）を備えた顕微鏡（カールツァイス社製）のステージに厚さ標準物質切片４１ｅを封入したスライドガラスを載置し、厚さ標準物質切片４１ｅの表面に焦点を合わせて、厚さ標準物質切片４１ｅの表面を撮影した。これにより、厚さ標準物質切片４１ｅの画像を取得した（撮影条件：対物レンズ：２．５倍、シャッタースピード：１／２５０、ISO：８００、LED：１９．９％、WB補正Ａ９/Ｇ９）。

厚さ標準物質切片４１ｅの画像をもとに、計測プログラム（キヤノン社製）を利用して、厚さ標準物質切片４１ｅの色調をスコア化した。具体的には、計測プログラムを用いて、厚さ標準物質切片４１ｅの画像から色相範囲：２７２°‐３０５°、彩度範囲：０‐５１、Ｒ値の輝度範囲：０‐７１、Ｇ値の輝度範囲：０‐７７、Ｂ値の輝度範囲：０‐７７にある色調のピクセルを抽出し、上述の式（１）を用いて色調をスコア化した。

そして、図９に示すように、横軸を組織切片の厚さ（包埋剤切片の高さ平均値）とし、縦軸を厚さ標準物質切片４１ｅの色調のスコアとして、結果をプロットしてゆき、当該プロットに基づいて最小二乗法により一次近似式を算出し、これを検量線とした。最小二乗法により算出した一次近似式において、相関係数の高い検量線を作製することができた。

このように、組織切片の厚さと厚さ標準物質切片４１ｅの色調のスコアとが比例関係にあることから、本検量線を用いることで、厚さ標準物質切片４１ｅの色調から、当該厚さ標準物質切片４１ｅと同じ包埋組織切片に包埋される組織切片の厚さを算出できる。

そして、例えば、ミクロトームにて薄切厚さを４μｍに設定して作製した包埋組織切片について、スライドガラスに貼付し、脱パラフィン処理、染色処理を経た後、スライドガラス上の青色顔料含有発泡ウレタン（厚さ標準物質切片４１ｅ）の色調から、組織切片の厚さを算出することができる。組織切片の厚さが４μｍを中心に予め定めた厚さ範囲内にある組織切片を、検査する組織切片として選定できる。このように、組織切片の厚さと厚さ標準物質の色調の関係を表す検量線は、検査をする組織切片を選定する指標となり得ることが確認できた。

(７−２)検証実験２
検証実験２では、厚さ標準物質２１ａとして、β-アクチンを発現する細胞を用い、細胞の色調と組織切片４２の厚さとの関係について検証した。なお、図５に示すように、包埋組織切片４４は包埋剤切片４３と組織切片４２とが面一に形成されているので、包埋剤切片４３の厚さを組織切片４２の厚さとした。また、包埋組織切片４４は、組織切片４２を有している場合と有していない場合とで、作製する検量線の傾きに大きな変化がないと考えられるので、以下では、検証用包埋組織切片として、組織切片４２が包埋されていないものを用いた。

(７−２−１)抗β-アクチンウサギポリクローナル抗体の作製について
β-アクチン合成ペプチドを免疫したウサギから抗血清を採取し、抗体精製により、抗β-アクチンウサギポリクローナル抗体を作製した。この抗体を一次抗体として免疫組織化学染色によりコントロールサンプルのマーカーを染色し、染色結果を評価したところ、既存の抗β-アクチンモノクローナル抗体（c4 SC-47778、サンタクルーズ社製）を用いるより少量の抗体量でマーカーを染色できることを確認できた。検証実験２では、このようにして作製した抗β-アクチンウサギポリクローナル抗体を使用した。

(７−２−２)厚さ標準物質の作製
検証実験２では、細胞として、HER2陽性を示す細胞株SK-BR-3（HER2 IHCスコア3+相当）を用いた。まず、SK-BR-3細胞株のみをパラフィンに包埋したパラフィン包埋ブロック作製し、当該パラフィン包埋ブロックを、ティッシュ・アレイヤー装置KIN-2型（東屋医科器械社製）を用いて円柱形状にくり抜き、厚さ標準物質２１ａを作製した。

(７−２−３)厚さ標準物質を含む包埋ブロックの作製
組織切片４２が包埋されていない検証用包埋組織切片を作製するため、ここでは、トレイ底面３４に生体組織片２２を載置せずに、包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０上に載置した。包埋ブロック作製カセット１の位置決め孔５ａに厚さ標準物質２１ａを差し込み、次いで、包埋ブロック作製カセット１の開口部４から液状化させたパラフィンを流し込んだ。パラフィンを冷却して固化させた後、包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０から取り外し、板枠部１３を除去して厚さ標準物質２１ａのみが包埋された包埋ブロックを得た。

(７−２−４)検証用包埋組織切片の作製
厚さ標準物質２１ａのみが包埋された包埋ブロックをミクロトーム（大和光機工業社製）にセットした。ミクロトームの薄切厚さを２μｍに設定し、ミクロトームにより包埋ブロックを薄切してゆき、名目上の厚さ（以下、名目厚さという。）が２μｍの検証用包埋組織切片を１０枚作製した。検証用包埋組織切片の両面には厚さ標準物質切片４１ｅが露出していた。

同様にして、名目厚さが３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍである検証用包埋組織切片を各厚さ１０枚ずつ作製し、計５０個の検証用包埋組織切片を作製した。検証用包埋組織切片を１枚ずつスライドガラス（武藤硝子工業社製）に貼付した後、３７℃で一晩乾燥させた。なお、検証用包埋組織切片は、組織切片とマーカー標準物質切片とが含まれていない点以外、図５に示した包埋組織切片４４と同様の構成であり、厚さ標準物質切片４１ｅの周辺がシート形状の包埋剤切片４３で囲まれている。

(７−２−５)組織切片の厚さ算出用の検量線の作製
検証実験１と同様の方法で、検証用包埋組織切片の包埋剤切片の高さを測定し、包埋剤切片の厚さを算出した。各検証用包埋組織切片について包埋剤切片の厚さを算出後、スライドガラスに貼付した検証用包埋組織切片について、すでに確立されている一般的な手法にて脱パラフィン処理及び抗原賦活化処理（１００℃、４０分、ｐＨ６）を行った。内因性ペルオキシダーゼを除去した後ＰＢＳで厚さ標準物質切片４１ｅを洗浄し、「(７−２−１)抗β-アクチンウサギポリクローナル抗体の作製について」で作製した抗アクチンウサギポリクローナル抗体による一次抗体反応を厚さ標準物質切片４１ｅ内のHER2陽性細胞に発現しているβ-アクチンに対して行った。厚さ標準物質切片４１ｅを再度洗浄し、シンプルステインMAX-PO（MULTI)（ニチレイバイオサイエンス社製）を４μｇ／ｍｌの濃度で厚さ標準物質切片４１ｅに滴下し、室温で３０分間、二次抗体反応を行った。再度洗浄した厚さ標準物質切片４１ｅに、一般的な手法にてＤＡＢ染色を行った後再度洗浄し、メイヤーヘマトキシリン溶液により核染色を行った。厚さ標準物質切片４１ｅを洗浄した後、脱水、透徹及び封入を行い、カバーガラスにて覆った。

上述のβ-アクチン染色処理を行った厚さ標準物質切片４１ｅが載置されたスライドガラスを顕微鏡（カールツァイス社製）の試料台に載置し、対物レンズ倍率４０倍にてＤＡＢの染色が確認される細胞の細胞膜に焦点を合わせ、顕微鏡に搭載されたカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）にて厚さ標準物質切片４１ｅを撮影した（シャッタースピード：１/２５０、ISO：８００、LED：１９．９％、WB補正Ａ９/Ｇ９)。撮影した画像から計測プログラム（キヤノン社製）を利用して、特定の色調（色相：２７２‐３０５°、彩度範囲：０‐５１、Ｒ：０‐７１、Ｇ：０‐７７、Ｂ：０‐７７）のピクセルを抽出し、上述の式（１）を用いて厚さ標準物質切片４１ｅの染色強度の色調をスコア化した。

そして、図１０に示すように、横軸を組織切片の厚さ（包埋剤切片の高さ平均値）とし、縦軸を厚さ標準物質切片４１ｅの色調のスコアとして、結果をプロットしてゆき、当該プロットに基づいて最小二乗法により一次近似式を算出し、これを検量線とした。最小二乗法により算出した一次近似式において、相関係数の高い検量線を作製することができた。

このように、組織切片の厚さと厚さ標準物質切片４１ｅの染色強度の色調のスコアとが比例関係にあることから、本検量線を用いることで、厚さ標準物質切片４１ｅの色調から、当該厚さ標準物質切片４１ｅと同じ包埋組織切片に包埋される組織切片の厚さを算出できる。

そして、例えば、ミクロトームにて薄切厚さを４μｍに設定して作製した包埋組織切片について、スライドガラスに貼付し、脱パラフィン処理、染色処理を経た後、スライドガラス上の染色したβ-アクチンを発現する細胞（厚さ標準物質切片４１ｅ）の色調から、組織切片の厚さを算出することができる。組織切片の厚さが４μｍを中心に予め定めた厚さ範囲内にある組織切片を、検査する組織切片として選定できる。このように、厚さ標準物質に内因性タンパク質を発現する細胞を使用した場合でも、組織切片の厚さと厚さ標準物質の色調の関係を表す検量線は、検査をする組織切片を選定する指標となり得ることが確認できた。

（７−３）検証実験３
検証実験３では、染色されたマーカー標準物質の色調に基づく染色強度のスコアと、組織切片の厚さとの関係について検証した。組織切片の厚さについては、検証実験１と同じ方法を用いて算出している。また、検証実験１に習い、包埋組織切片として組織切片と厚さ標準物質とを含まない検証用包埋組織切片を用いた。

（７−３−１）マーカー標準物質の作製
検証実験３では、上記実施形態と同様に、マーカーの検出結果の適否の基準となるマーカー標準物質として、染色結果が陰性を示す細胞株MDA-MB-231で作られたマーカー標準物質２１ｂ、染色結果が１＋を示す細胞株MDA-MB-175VIIで作られたマーカー標準物質２１ｃ、染色結果が２＋を示す細胞株MDA-MB-453で作られたマーカー標準物質２１ｄ、及び、染色結果が３＋を示す細胞株SK-BR-3で作られたマーカー標準物質２１ｅを用意した。

具体的には、上記の各細胞株をパラフィンでなる包埋剤に包埋してそれぞれコントロール細胞包埋ブロックを作製し、各コントロール細胞包埋ブロックをBIOPSY PUNCH（カイ インダストリーズ社製）を用いて円柱形状にくり抜き、４種類のマーカー標準物質を得た。

（７−３−２）マーカー標準物質を含む包埋ブロックの作製
組織切片４２が包埋されていない検証用包埋組織切片を作製するため、ここでは、トレイ底面３４に生体組織片を載置せずに、包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０上に載置した。包埋ブロック作製カセット１の各位置決め孔５ａに、マーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅをそれぞれ差し込み、次いで、包埋ブロック作製カセット１の開口部４から液状化させたパラフィンを流し込んだ。パラフィンを冷却して固化させた後、包埋ブロック作製カセット１をトレイ３０から取り外し、４種類のマーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅが共に同じ包埋剤に包埋された包埋ブロックを得た。

（７−３−３）検証用包埋組織切片の作製
４種類のマーカー標準物質２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅのみが包埋された包埋ブロックをミクロトーム（大和光機工業社製）にセットし、薄切厚さを２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍとして包埋ブロックを薄切してゆき、厚さ毎にそれぞれ５枚ずつの検証用包埋組織切片を作製した。検証用包埋組織切片の両面にはマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａが露出していた。そして、検証用包埋組織切片をスライドガラス（松浪硝子工業社製）１枚につき１枚ずつに貼付した。

（７−３−４）検出が適当か否かを判断するための検量線の作製について
検証実験１と同様の方法で、包埋組織切片の包埋剤切片の高さを測定した。各包埋組織切片について包埋剤切片の厚さを算出後、ヒストファインHER2キット（POLY）（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて脱パラフィン処理、抗原賦活化処理、免疫組織化学染色処理を実施した。マーカー標準物質切片の継時的な乾燥を防ぐため封入剤をスライドガラス上に滴下してカバーガラスにてマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａを覆った。

デジタルカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）を備えた顕微鏡（カールツァイス社製、Axio Imager.Z2）を使用して各スライドのマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの静止画をそれぞれ３枚撮影した（撮影条件：対物レンズ：４０倍、Aperture：０．９０、シャッタースピード：１／１２５、ISO：８００、LED：１９．９％、WB補正Ａ９/Ｇ９）。

撮影した静止画をもとに、４種類のマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの染色強度を、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの色調に基づいてそれぞれスコア化した。具体的には、計測プログラム（キヤノン社製）を用いて、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの静止画から所定の色調（色相：５０°‐１８０°、彩度範囲：２‐４０、Ｒ値：１０‐１８０、Ｇ値：１０‐１４５、Ｂ値：１０‐１４０の範囲にある色調）のピクセルを抽出し、上述の式（１）を用いて色調をスコア化した。スコア化はすべてのマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａについて行った。

図１１に示すように、横軸を組織切片の厚さ（包埋剤切片の高さ平均値）とし、縦軸を染色強度のスコアとして、結果をプロットしていった。そして、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａ毎に、プロットに基づいて最小二乗法により一次近似式を算出し、これを検量線とした。なお、陰性を示すマーカー標準物質切片４１ｄについては、染色されなかったため、図１１には示していない。図中のScore１がマーカー標準物質切片４１ｃに、Score２がマーカー標準物質切片４１ｂに、Score３がマーカー標準物質切片４１ａにそれぞれ対応する。図１１に示すように、最小二乗法により算出した一次近似式において、相関係数の高い検量線を作製することができた。

図１１に示した各検量線は、組織切片に対して適切に染色が行われたときのマーカー標準物質切片４１ｃ，４１ｂ，４１ａの色調に基づく染色強度のスコアを表している。したがって、本検量線を示すグラフに、組織切片の厚さとマーカー標準物質切片４１ｃ，４１ｂ，４１ａの染色強度のスコアをプロットして、当該プロットと検量線との差が適正範囲内か否かを見ることができる。よって、本検量線により組織切片が適切に染色されているかを確認することが可能となり、検査する組織切片を選定できる。このように、組織切片の厚さとマーカー標準物質切片４１ｃ，４１ｂ，４１ａの染色強度のスコアとの関係を表す検量線は、検査をする組織切片を選定する指標となり得ることが確認できた。

（８）組織切片選定方法を利用した免疫組織化学染色法について
（８−１）本発明の組織切片選定方法を利用した一連の作業について
次に、上述した組織切片選定方法を利用した免疫組織化学染色法について、一連の作業の流れを、図１２を用いて簡単に説明する。図１２に示すように、免疫組織化学染色法では、始めに、図１に示した包埋ブロック作製カセット１を用いて、図４Ｂに示すように、生体組織片２２と標準物質２１とを共に同じ包埋剤２３に包埋した包埋ブロック２４を作製する。

そして、包埋ブロック２４と一体化した包埋ブロック作製カセット１をミクロトームにセットし、所望する薄切厚さ（例えば４μｍ）に設定したミクロトームにより包埋ブロック２４を薄切してゆき、シート状の包埋組織切片４４を得る。その後、図１２の左側に示すように、例えばスライドガラスなどの基板４６上に包埋組織切片４４を伸展させて貼り付けた組織切片張付基板４０を作製する。

なお、このようにして作製された組織切片張付基板４０では、組織切片４２と、標準物質切片としての厚さ標準物質切片４１ｅと、同じく標準物質切片としてのマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａとが、包埋剤切片４３の表面に露出している。

次いで、例えば、上述した脱包埋剤処理やプロテアーゼ処理、内因性ペルオキシダーゼ処理が順に行われる。その後、免疫組織化学染色法による染色処理として、例えば、組織切片４２内のHER2/neuタンパクと結合する一次抗体などを用い、組織切片４２内で抗原抗体反応を起こさせた後、二次抗体標識ポリマーを一次抗体に結合させ、さらに発色試薬などを用いて組織切片４２に含まれたHER2/neuタンパクを染色し、当該HER2/neuタンパクを特異的に検出する。

次に、図１２に示すステップＳ１０に移行し、厚さ標準物質切片４１ｅの色調に基づいて、組織切片４２の厚さについて適否を判断する。なお、ステップＳ１０の組織切片厚の適否判断は、例えば、デジタルカメラを備えた顕微鏡により、厚さ標準物質切片４１ｅの表面を撮影した画像を取得し、計測プログラムを用いて、厚さ標準物質切片４１ｅの画像から所定の色調のピクセルを抽出し、上述した式（１）を用いて色調をスコア化する。

そして、厚さ標準物質切片４１ｅのスコアと、厚さとの関係を表す検量線から、上記式（１）で算出したスコアに対応する厚さを特定し、これを組織切片４２の厚さとする。その結果、組織切片４２の厚さが所定の範囲内（例えば、３〜５μｍ）にあるとき、組織切片４２の厚さは検査に適切な厚さであると判断し、次のステップＳ１１に移る。

一方、組織切片４２の厚さが所定の範囲から外れたとき（スコアに対応する厚さ＜３μｍ、スコアに対応する厚さ＞５μｍ）は、組織切片４２の厚さは検査に不適切な厚さであると判断し、組織切片４２を検査せずに、他の組織切片張付基板４０に対して、上述した免疫組織化学染色を行い、以降、上述と同様の処理を行う。このフローは、所定の厚さとなる組織切片４２が得るまで繰り返される。

厚さ標準物質切片４１ｅの色調に基づいて、検査に適切な厚さの組織切片４２であると判断すると、ステップＳ１１において、例えば、マーカー標準物質切片４１ａの色調に基づいて、組織切片４２でHER2/neuタンパクの染色が適切に行われているか否かを判断する。

なお、染色が適切に行われているか否かの適否判断は、例えば、デジタルカメラを備えた顕微鏡により、マーカー標準物質切片４１ａの表面を撮影した画像を取得し、計測プログラムを用いて、マーカー標準物質切片４１ａの画像から所定の色調のピクセルを抽出し、上述した式（１）を用いて色調をスコア化する。

そして、マーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコアと、組織切片４２の厚さと、の関係を表す検量線から、上記で算出した組織切片４２の厚さとマーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコアとに基づいて、マーカー標準物質切片４１ａの染色強度のスコアが、検量線を基準に所定の範囲内にあるか否かを判断する。

その結果、染色強度のスコアが検量線に対し所定範囲内にあるとき、組織切片４２でのHER2/neuタンパクの染色が適切であると判断し、次のステップＳ１３に移る。一方、染色強度のスコアが検量線に対し所定範囲から外れたとき、組織切片４２でのHER2/neuタンパクの染色が不適切であると判断し、組織切片４２を検査せずに、他の組織切片張付基板４０に対して、上述した免疫組織化学染色を行い、以降、上述と同様の処理を行う。このようにして、免疫組織化学染色、ステップＳ１０、ステップＳ１１のフローは、所定の染色強度となる組織切片４２が得るまで繰り返される。

ステップＳ１３（ヒト検体判定）では、HER2/neuタンパクの染色が適切であると判断された組織切片４２について、作業者により、当該組織切片４２の色調と、マーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａの色調とが比較され、組織切片４２が検査される。

（８−２）検証実験４
ここで、実際に、図１２に示した一連の作業を連続的に行い、組織切片の厚さと、マーカー標準物質切片の染色強度のスコアとを調べ、図１１に示した「Score3」の検量線と比較する検証実験を行った。ここでは検証実験１と同様に厚さ標準物質として、青色顔料含有発泡ウレタンを用い、また、マーカーの検出結果の適否の基準となるマーカー標準物質として、染色結果が３＋を示す細胞株SK-BR-3で作られたマーカー標準物質２１ｅを用いた。

厚さ標準物質２１ａ及びマーカー標準物質２１ｅが包埋された包埋ブロックをミクロトーム（大和光機工業社製）にセットし、薄切厚さを４μｍとして包埋ブロックを薄切してゆき、５枚の検証用包埋組織切片を作製した。検証用包埋組織切片の両面には、厚さ標準物質切片４１e及びマーカー標準物質切片４１ａが露出していた。そして、検証用包埋組織切片をスライドガラス（松浪硝子工業社製）１枚につき１枚ずつに貼付した。

次に、ヒストファインHER2キット（POLY）（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて脱パラフィン処理、抗原賦活化処理、免疫組織化学染色処理を実施した。マーカー標準物質切片４１ａの継時的な乾燥を防ぐため封入剤をスライドガラス上に滴下してカバーガラスにてマーカー標準物質切片４１ａを覆った。

次に、デジタルカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）を備えた顕微鏡（カールツァイス社製）のステージに上記のスライドガラスを載置し、厚さ標準物質切片４１ｅの表面に焦点を合わせて、厚さ標準物質切片４１ｅの表面を撮影した。これにより、厚さ標準物質切片４１ｅの画像を取得した（撮影条件：対物レンズ：２．５倍、シャッタースピード：１／２５０、ISO：８００、LED：１９．９％、WB補正Ａ９/Ｇ９）。

厚さ標準物質切片４１ｅの画像をもとに、計測プログラム（キヤノン社製）を利用して、厚さ標準物質切片４１ｅの色調をスコア化した。具体的には、計測プログラムを用いて、厚さ標準物質切片４１ｅの画像から色相範囲：２７２°‐３０５°、彩度範囲：０‐５１、Ｒ値の輝度範囲：０‐７１、Ｇ値の輝度範囲：０‐７７、Ｂ値の輝度範囲：０‐７７にある色調のピクセルを抽出し、上述の式（１）を用いて色調をスコア化した。そして、求めたスコアを基に、厚さ標準物質切片４１eの高さを、図９に示した検量線から測定した。

また、デジタルカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）を備えた顕微鏡（カールツァイス社製、Axio Imager.Z2）を使用してスライドのマーカー標準物質切片４１ａの静止画をそれぞれ撮影した（撮影条件：対物レンズ：４０倍、Aperture：０．９０、シャッタースピード：１／１２５、ISO：８００、LED：１９．９％、WB補正Ａ９/Ｇ９）。

撮影した静止画をもとに、マーカー標準物質切片４１ａの染色強度を、マーカー標準物質切片４１ａの色調に基づいてスコア化した。具体的には、計測プログラム（キヤノン社製）を用いて、マーカー標準物質切片４１ａの静止画から所定の色調（色相：５０°‐１８０°、彩度範囲：２‐４０、Ｒ値：１０‐１８０、Ｇ値：１０‐１４５、Ｂ値：１０‐１４０の範囲にある色調）のピクセルを抽出し、上述の式（１）を用いて色調をスコア化した。

そして、図１３に示すように、横軸を厚さ標準物質切片４１ｅの厚さとし、縦軸を染色強度のスコアとして、各検証用包理組織片の測定結果をプロットし、図１１に示した「Score3」の検量線と比較した。なお、図１３の「線形（HS standard Score3）」は図１１の「Score3」の検量線を示す。比較した結果、プロットと検量線との差が適正範囲内となり、本検量線により、いずれの検証用包理組織切片でも組織切片が適切に染色されているかを確認することができた。これにより、本発明の組織切片選定方法によって、検査する組織切片を選定できることが確認できた。

（９）組織切片の固定状態を判断する組織切片選定方法を利用した免疫組織化学染色法について
（９−１）組織切片張付基板の作製
ここでは、上述した実施形態とは異なり、組織切片の固定状態を判断する組織切片選定方法について以下説明する。包埋ブロックを作製する包埋ブロック作製工程では、通常、生体から採取した生体組織片を、例えばホルマリン水溶液等の固定液に所定時間以上浸漬している（浸漬工程）。代表的な固定液としては、ホルマリン原液を蒸留水又は緩衝液で希釈して１０％ホルマリン水溶液（４％ホルムアルデヒド溶液）が知られている。

ここで、生体組織片を固定液に浸漬させる適切な時間は、固定液や生体組織片の大きさ等によって左右される。例えば、HER2/neuタンパクを染色する場合、上記の１０％ホルマリン水溶液を固定液として用いて、６時〜７２時間生体組織片を固定液に浸漬させることが推奨されている（生体組織片を固定液に浸漬させる時間を固定時間と称する）。推奨された固定時間で生体組織片を固定液に浸漬させることで、固定液によって、生体組織片の組織形態や抗原活性を最適に固定させることができる。

このようにして、生体組織片を固定液に所定時間浸漬させた後、この生体組織片を、トレイの所定位置に載置する（載置工程）。そして、包埋ブロック作製カセットをトレイ上に載置し、例えばパラフィンなどの包埋剤を加熱して液化させた液状包埋剤を、包埋ブロック作製カセットからトレイに注ぐ（液状包埋剤導入工程）。

液状包埋剤がトレイ上の生体組織片が覆われるまで注がれ（液状包埋剤導入工程）、液状包埋剤を冷却して固化させることで、生体組織片が包埋剤に包埋され、かつ包埋ブロック作製カセットと一体化した包埋ブロックを作製できる（固化工程）。

そして、包埋ブロックと一体化した包埋ブロック作製カセットをミクロトームにセットし、所望する薄切厚さ（例えば４μｍ）に設定したミクロトームにより包埋ブロックを薄切してゆき、シート状の包埋組織切片を得る。

その後、図１４の左側に示すように、例えばスライドガラスなどの基板４６上に包埋組織切片９１を伸展させて貼り付けて、組織切片張付基板９０を作製する。なお、本実施形態の包埋組織切片９１は、組織切片４２が表面に露出しており、組織切片４２の周辺が包埋剤切片４３により囲まれた構成を有している。

（９−２）組織切片における固定状態の判断手法
ここで、包埋ブロックを作製する際、生体から採取した生体組織片の組織形態や抗原活性を最適な状態に固定させる固定処理を行っているが、固定処理を行う際に、例えば、生体組織片を固定液に浸漬する時間が十分でない場合、生体組織片が最適に固定され難い。生体組織片について最適に固定がされていないと、生体組織片内の組織形態や抗原活性が維持されず、その後、生体組織片から作製された組織切片を、免疫組織化学染色により検査する際、組織切片が染色され難く、検査結果に誤りが生じる可能性もある。

そこで、本実施形態では、組織切片張付基板９０について、固定液による組織切片４２の固定状態が最適であるか否かを判断する。この場合、免疫組織化学染色により包埋組織切片９１に対して染色処理を行い、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質からの光シグナルに基づいて、固定液による組織切片４２の固定状態が最適であるか否かを判断する。以下、この組織切片４２における固定状態の判断手法について説明する。

本実施形態においては、例えば、組織切片４２のHER2/neuタンパクの染色を行う免疫組織化学染色法による染色処理とは別に、組織切片張付基板９０に対して免疫組織化学染色法による別の染色処理を行い、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質を染色する。ここで、免疫組織化学染色法による染色処理を行う内因性タンパク質は、包埋ブロックを作製する際に行われた、固定液による生体組織片の固定状態に応じて、染色時の色調が変化するものである。作業者は、組織切片４２に含まれる内因性タンパク質の色調に基づいて、組織切片４２に対する固定処理が適切に行われていたか否かを判断する。

ここで、この判断手法で利用する、組織切片に含まれる内因性タンパク質としては、細胞により発現量がほぼ変わらない内因性タンパク質や、評価部位に安定的に発現している内因性タンパク質であることが望ましい。例えば、この種の内因性タンパク質としては、毛細血管内皮細胞に検出されるCD34が望ましい。

乳癌などの腫瘍細胞の有無を検査する生体組織片には、一般的に毛細血管も存在しているため、毛細血管内皮細胞に検出されるCD34も安定的に発現している。また、腫瘍周囲では一般的に血管新生が亢進されることが知られているため、生体組織片に腫瘍細胞がある場合、毛細血管内皮細胞に検出されるCD34が安定的に発現していると言える。

組織切片内の細胞で発現されている内因性タンパク質としてCD34を適用した場合には、内因性タンパク質を染色する抗内因性タンパク質抗体としては、抗CD34抗体を適用することができる。抗CD34抗体としては、例えば、抗CD34ウサギポリクローナル抗体を適用できる。

上記の処理工程について、より具体的に説明すると、本実施形態では、組織切片張付基板９０を得た後、例えば、上述した脱包埋剤処理やプロテアーゼ処理、内因性ペルオキシダーゼ処理が順に行われる。その後、免疫組織化学染色法による染色処理として、例えば、組織切片４２内のHER2/neuタンパクと結合する一次抗体などを用い、組織切片４２内で抗原抗体反応を起こさせた後、二次抗体標識ポリマーを一次抗体に結合させ、さらに発色試薬などを用いて組織切片４２に含まれたHER2/neuタンパクを染色し、当該HER2/neuタンパクを特異的に検出する。

また、この際、免疫組織化学染色法による別の染色処理として、さらに、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質と結合する一次抗体などを用い、組織切片４２内で抗原抗体反応を起こさせた後、二次抗体標識ポリマーを一次抗体に結合させ、さらに発色試薬などを用いて組織切片４２内に含まれた内因性タンパク質を染色し、当該内因性タンパク質を特異的に検出する。

この場合、組織切片４２に含まれたHER2/neuタンパクを染色した際の色調と、組織切片４２に含まれた内因性タンパク質を染色した際の色調と、を変えることで、HER2/neuタンパクと、内因性タンパク質との染色状態を判別することができる。

また、組織切片４２に含まれたHER2/neuタンパクを染色する場合、組織切片４２における固定状態の判断に用いる内因性タンパク質としては、例えばCD34を適用できることが、検証実験によって確認できている。固定状態の判断にCD34を適用した場合、染色されたHER2/neuタンパクの色調と、染色されたCD34の色調とが重なることを回避できることが確認されている。かくして、作業者は、組織切片４２に含まれるCD34の色調に基づいて、組織切片４２に対する固定処理が適切に行われていたか否かを判断することができる。

ここで、本実施形態における組織切片選定方法を利用した免疫組織化学染色法について、一連の作業の流れを、図１４を用いて簡単に説明する。図１４に示すように、ここでの免疫組織化学染色法では、組織切片４２に含まれるHER2/neuタンパクを染色する染色処理と、組織切片４２に含まれる内因性タンパク質を染色する染色処理と、を組織切片張付基板９０に対してそれぞれ行い、ステップＳ２１に移る。

ステップＳ２１では、染色処理により変化した組織切片４２に含まれる内因性タンパク質の染色強度に基づいて、組織切片４２の固定状態を判断する。なお、組織切片４２の固定状態の判断は、例えば、デジタルカメラを備えた顕微鏡により、組織切片４２の表面を撮影した画像を取得し、計測プログラムを用いて、組織切片４２の画像から所定の色調のピクセルを抽出し、上述した式（１）を用いて色調をスコア化する。

ここで、図１５に示すように、内因性タンパク質の色調から求めたスコアと、固定時間との関係を表すグラフ（後述する）を予め用意しておく。これにより、このグラフから、上記式（１）で算出したスコアに対応する固定時間を算出し、これを組織切片４２における固定時間として推定できる。その結果、組織切片４２の固定時間が所定時間以上（例えば、２４時間以上）にあるとき、組織切片４２に対して行われた固定処理時の固定時間が最適であり、組織切片４２が検査に適切な固定状態にあると判断し、次のステップＳ２２に移る。

一方、このグラフから求めた組織切片４２の固定時間が、所定時間未満のとき（スコアに対応する固定時間が、例えば２４時間未満のとき）は、組織切片４２に対する固定時間が不足し、検査に不適切な固定状態にあると判断し、組織切片４２を検査せずに判断処理を終了する。

ステップＳ２１において、組織切片４２に含まれる内因性タンパク質の色調に基づき検査対象となる組織切片４２を選定すると、ステップＳ２２（ヒト検体判定）において、作業者により、当該組織切片４２におけるHER2/neuタンパクの色調と、予め用意したコントロールスライドとを比較し、組織切片４２にHER2/neuタンパクが存在しているか否かが検査される。

（９−３）作用及び効果
以上の構成において、本実施形態に係る組織切片選定方法は、生体組織片を固定液に所定時間浸漬した後、生体組織片を包埋剤に包埋して包埋ブロックを作製する（包埋ブロック作製工程）。また、包埋ブロックを薄切して、組織切片４２が表面に現れているシート形状の包埋組織切片９１を作製する（包埋組織切片作製工程）。

組織切片選定方法では、マーカーを特異的に検出して、検査対象とする組織切片４２を選定する際、包埋組織切片９１に対して、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質を染色する染色処理を行うようにした。これにより、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質からの光シグナルに基づいて、固定液による組織切片４２の固定状態を判断する（固定状態判断工程）。

すなわち、本実施形態に係る組織切片選定方法では、組織切片４２に含まれる内因性タンパク質の色調から組織切片４２の固定時間を推定するようにした。これにより、組織切片選定方法では、検査に最適な固定状態を有した組織切片４２のみを選択し得、選択した組織切片４２に対してのみ検査を行えるので、検査結果に誤りが生じることを抑制できる。

（９−４）変形例
なお、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。上述した実施形態においては、免疫組織化学染色法によって、組織切片４２のHER2/neuタンパクを染色する染色処理と、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質を染色する染色処理とについて、両方行うようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らない。例えば、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質を染色する染色処理のみを行うようにしてもよい。また、組織切片４２の固定状態を判断する固定状態判断工程後に、例えば、組織切片４２のHER2/neuタンパクの染色を行う免疫組織化学染色法による染色処理を行ってもよい。

さらに、例えば、本実施形態による、組織切片４２の固定状態を判断する固定状態判断工程を、上述した「（８）組織切片選定方法を利用した免疫組織化学染色法について」に取り入れてもよい。

この場合、シート形状の包埋組織切片を作製する包埋組織切片作製工程以降であって、図１２に示したフローチャート内のステップＳ１０（組織切片厚判断工程）の前、ステップＳ１０（組織切片厚判断工程）の後、又は、ステップＳ１１（マーカー適否判断工程）の後に、図１４のステップＳ２１に示した固定状態判断工程を設けることで、実現することができる。

より具体的には、例えば、免疫組織化学染色法によって、組織切片４２のHER2/neuタンパクを染色する染色処理と、組織切片４２内の細胞で発現されている内因性タンパク質を染色する染色処理とを行った後、図１２に示したステップＳ１０の前、ステップＳ１０の後、又は、ステップＳ１１の後に、図１４のステップＳ２１を設けることで、組織切片４２の固定状態を判断することができる。

また、（ｉ）図１２のステップＳ１０に示すように、厚さ標準物質切片４１ｅの色調に基づいて、組織切片４２の厚さを判断する組織切片厚判断工程と、（ｉｉ）図１４のステップＳ２１に示すように、他の染色処理により変化した組織切片内における内因性タンパク質の色調に基づいて、固定液による組織切片４２の固定状態を判断する固定状態判断工程と、を組み合わせた組織切片選定方法であってもよい。

この場合、組織切片４２と、標準物質切片としての厚さ標準物質切片４１ｅとが、包埋剤切片４３の表面に露出している組織切片張付基板を用いて、上述したステップＳ１０及びステップＳ２１が行われる。

また、（ｉ）図１２のステップＳ１１に示すように、マーカー標準物質切片４１ａの色調に基づいて、組織切片４２内のHER2/neuタンパクの染色が適切に行われているか否かを判断するマーカー適否判断工程と、（ｉｉ）図１４のステップＳ２１に示すように、他の染色処理により変化した組織切片内における内因性タンパク質の色調に基づいて、固定液による組織切片４２の固定状態を判断する固定状態判断工程と、を組み合わせた組織切片選定方法であってもよい。

この場合、組織切片４２と、標準物質切片としてのマーカー標準物質切片４１ｄ，４１ｃ，４１ｂ，４１ａとが、包埋剤切片４３の表面に露出している組織切片張付基板を用いて、上述したステップＳ１１及びステップＳ２１が行われる。

（９−５）検証実験５
（９−５−１）抗CD34ウサギポリクローナル抗体の濃度検討
検証実験５では、ブタ乳腺組織を用意し、当該ブタ乳腺組織をミクロトーム（大和光機工業社製）にセットした。ミクロトームの薄切厚さを４μｍに設定して、ブタ乳腺組織を薄切してゆき、検証用組織切片を複数枚作製した。検証用組織切片をスライドガラス（武藤硝子工業社製）に貼付した後、濃度が異なる抗CD34ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社）で検証用組織切片のCD34について染色を行った。

濃度が異なる抗CD34ウサギポリクローナル抗体として、抗CD34ウサギポリクローナル抗体をPBSで希釈して、濃度を１／１００とした抗体と、濃度を１／２００とした抗体と、濃度を１／４００とした抗体と、濃度を１／８００とした抗体と、濃度を１／１６００とした抗体と、を用意した。そして、これら濃度が異なる５種類の抗体を用いて、ブタ乳腺組織を染色する染色処理を行った。

次に、デジタルカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）を備えた顕微鏡（カールツァイス社製）のステージに、染色処理後の検証用組織切片が封入されたスライドガラスを載置し、検証用組織切片の表面に焦点を合わせて、検証用組織切片の表面を撮影した。これにより、図１６に示すような画像９３ａ、９３ｂ、９３ｃ、９３ｄ、９３ｅをそれぞれ取得した（撮影条件：シャッタースピード：１／２５０、ISO：８００、WB補正Ａ９/Ｇ９、LED：１９．９％、アパーチャー：０．５０、対物レンズ：４０倍）。

画像９３ａは濃度を１／１００とした抗体を用いて染色した検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９３ｂは濃度を１／２００とした抗体を用いて染色した検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９３ｃは濃度を１／４００とした抗体を用いて染色した検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９３ｄは濃度を１／８００とした抗体を用いて染色した検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９３ｅは濃度を１／１６００とした抗体を用いて染色した検証用組織切片の表面を撮影した画像である。

また、ネガティブコントロールとして、上記と同じブタ乳腺組織を検証用組織切片として用意し、同様にして、検証用組織切片について撮影して画像９３ｆを取得した

図１６の結果から、濃度を１／１００とした抗体と、濃度を１／２００とした抗体とを用いて染色を行った検証用組織切片では、画像９３ａ、９３ｂに示すように、色調が濃くなることが確認できた。このように、色調が濃くなった場合、例えば、さらに、HER2/neuタンパク等を染色した場合、当該染色にも影響を及ぼす恐れがある。このため、濃度が１／２００よりも薄い抗体を用いることが望ましい。

一方、濃度を１／１６００とした抗体を用いて染色を行った検証用組織切片では、画像９３ｅに示すように、ネガティブコントロールの画像９３ｆとほぼ同様に、色調が薄くなり、染色が不十分であることが確認できた。以上より、濃度を１／２００超、１／１６００未満とした抗CD34ウサギポリクローナル抗体、より好ましくは、濃度を１／４００以上、１／８００以下とした抗体を用いて検証用組織切片を染色することが望ましいことが確認できた。

（９−５−２）ブタ乳腺組織を固定液に浸漬させた際の固定時間について、抗CD34ウサギポリクローナル抗体を用いた染色評価
次に、上述した、濃度を１／４００とした抗体を用いて検証用組織切片を染色した際に、ブタ乳腺組織を固定液に浸漬させた際の固定時間の違いにより色調が違ってくるか否かについて確認する検証実験を行った。

ここでは、ブタ乳腺組織の一部を切り出して複数の組織ブロックを得、切り出した直後の各組織ブロックをそれぞれ固定液に浸漬させた。固定液としては、１０％ホルマリン水溶液を用いた。そして、組織ブロックを固定液に浸漬させる時間（固定時間）を、組織ブロック毎に変えた。

組織ブロックの固定時間は、３時間、２４時間、４８時間、７２時間、１週間とした。各時間経過後に、薄切厚さを４μｍに設定したミクロトーム（大和光機工業社製）を用いて、各組織ブロックを薄切してゆき、検証用組織切片を作製した。

検証用組織切片をスライドガラス（武藤硝子工業社製）に貼付した後、濃度を１／４００とした、上記の抗CD34ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社）で検証用組織切片のCD34の染色をそれぞれ行った。

次に、デジタルカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）を備えた顕微鏡（カールツァイス社製）のステージに、染色処理後の検証用組織切片が封入されたスライドガラスを載置し、検証用組織切片の表面に焦点を合わせて、検証用組織切片の表面を撮影した。これにより、図１７に示すような画像９４ａ、９４ｂ、９４ｃ、９４ｄ、９４ｅを取得した。

画像９４ａは固定時間を３時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９４ｂは固定時間を２４時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９４ｃは固定時間を４８時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９４ｄは固定時間を７２時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９４ｅは固定時間を１週間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像である。

画像９４ａから、固定時間を３時間とした検証用組織切片については十分な染色が得られないことが確認できた。一方、画像９４ｂから、固定時間を２４時間とした検証用組織切片は染色されていることが確認できた。また、画像９４ｂ、９４ｃ、９４ｄ、９４ｅから、固定時間を２４時間とした場合から１週間とした場合まで、染色に大きな差が見られないことが確認できた。

以上より、固定時間を３時間とした場合と、２４時間とした場合とで染色に大きな差が生じることが確認できた。よって、濃度を１／４００とした抗CD34ウサギポリクローナル抗体を用いて組織切片を染色することで、色調の違いにより組織切片について固定時間を判断できることが確認できた。

（９−５−３）組織切片の固定状態の適否を判断するためのグラフの作製について
次に、組織切片の固定状態の適否を判断するためのグラフ（図１５）の作製について説明する。ブタ乳腺組織から複数の組織ブロックを切り出した直後に各組織ブロックを固定液に浸漬させた。組織ブロックの固定時間を、３時間、２４時間、４８時間、７２時間、１週間とした。各時間経過後に、薄切厚さを４μｍに設定したミクロトーム（大和光機工業社製）を用いて、各組織ブロックを薄切してゆき、検証用組織切片を作製した。

検証用組織切片をスライドガラス（武藤硝子工業社製）に貼付した。このようなスライドガラスを、固定時間毎にそれぞれ２枚ずつ作製した。抗CD34ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社）をPBSで希釈して濃度を１／４００とした抗体を作製し、この抗体を用い各検証用組織切片のCD34について染色をそれぞれ行った。

次に、デジタルカメラ（キヤノン社製、EOS-1D）を備えた顕微鏡（カールツァイス社製）のステージに、染色処理後の検証用組織切片が封入されたスライドガラスを載置し、検証用組織切片の表面に焦点を合わせて、検証用組織切片の表面を撮影した。撮影条件は、シャッタースピード：１／２５０、ISO：８００、WB補正Ａ９/Ｇ９、LED：１９．９％、アパーチャー：０．５０、対物レンズ：４０倍とし、例えば、図２１に示すような画像９８ａ、９８ｂ、９８ｃ、９８ｄ、９８ｅを取得した。

なお、画像９８ａは固定時間を３時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９８ｂは固定時間を２４時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９８ｃは固定時間を４８時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９８ｄは固定時間を７２時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像であり、画像９８ｅは固定時間を１週間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像である。画像９８ｆは、固定時間を４８時間とした検証用組織切片の表面を撮影した画像９８ｃの一部を拡大した画像である。

得られた画像９８ａ、９８ｂ、９８ｃ、９８ｄ、９８ｅをもとに、茶色に染色された染色箇所についてスコア化した。具体的には、計測プログラム（キヤノン社製）を用いて、例えば、各画像９８ａ、９８ｂ、９８ｃ、９８ｄ、９８ｅから所定の色調（画像内の画素の間引き：１／６４、彩度範囲：１２−２５、色相範囲：９０°−１２０°、ＲＧＢ範囲：Ｒ値：８５−１３０、Ｇ値：６５−１２０、Ｂ値：６５−１２０の範囲にある色調）のピクセルを抽出し、上述の式（１）を用いて色調をスコア化した。

図１５に示すように、横軸を組織切片の固定時間（検体固定時間）とし、縦軸を染色強度のスコア（茶色スコア）として、結果をプロットし、図１５に示すようなグラフを作製することができた。

その結果、図１５に示すように、組織切片に対して適切に固定処理が行われたときの組織切片の色調に基づく染色強度のスコアを、グラフとして表すことができた。したがって、本グラフに、組織切片を基に得られた染色強度のスコアをプロットすることで、固定時間を推測することができる。よって、本グラフにより組織切片に対して適切に固定処理が行われているかを確認することが可能となり、検査する組織切片を選定できる。このように、組織切片の染色強度のスコアと固定時間との関係を表すグラフは、検査をする組織切片を選定する指標となり得ることが確認できた。

１ 包埋ブロック作製カセット
２ 箱体
３ 枠部
４ 開口部
５ 標準物質位置決め部
６ 貫通孔
２１ 標準物質
４２ 組織切片
４３ 包埋剤切片
４４ 包埋組織切片

Claims (12)

1. マーカーを特異的に検出して、検査する組織切片を選定する組織切片選定方法であって、
   生体組織片と標準物質とを共に同じ包埋剤に包埋して包埋ブロックを作製する包埋ブロック作製工程と、
   前記包埋ブロックを薄切して、前記組織切片及び標準物質切片が表面に現れているシート形状の包埋組織切片を作製する包埋組織切片作製工程と、
   前記標準物質切片からの光シグナルに基づいて、検査する前記組織切片を選定する組織切片選定工程と
   を有する組織切片選定方法。
2. 前記包埋ブロック作製工程は、
   トレイ底面に前記生体組織片を載置する載置工程と、
   包埋ブロック作製カセットを用意し、前記包埋ブロック作製カセットの位置決め孔に前記標準物質を挿入し、前記トレイ底面を基準としたときの前記生体組織片の下端から上端までの高さ範囲内に前記標準物質が存在するように前記標準物質を位置決めする位置決め工程と、
   液状包埋剤をトレイに流し込む液状包埋剤導入工程と、
   前記液状包埋剤を固化させて、前記生体組織片と前記標準物質とが共に同じ包埋剤に包埋した前記包埋ブロックを作製する固化工程と、
   を有する請求項１に記載の組織切片選定方法。
3. 前記標準物質は、前記組織切片の厚さの基準となる厚さ標準物質である
   請求項１又は２に記載の組織切片選定方法。
4. 前記標準物質は、マーカーの検出結果の適否の基準となるマーカー標準物質である
   請求項１又は２に記載の組織切片選定方法。
5. 前記標準物質は、前記組織切片の厚さの基準となる厚さ標準物質と、マーカーの検出結果の適否の基準となるマーカー標準物質と、であり、
   前記組織切片選定工程は、
   前記厚さ標準物質からの光シグナルに基づいて、検査する前記組織切片を選定する組織切片厚判断工程と、
   前記組織切片厚判断工程の後に、前記マーカー標準物質からの光シグナルに基づいて、検査する前記組織切片を選定するマーカー適否判断工程と、を備える
   請求項１又は２に記載の組織切片選定方法。
6. 前記標準物質が内因性タンパク質を発現する細胞である
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の組織切片選定方法。
7. 前記包埋ブロック作製工程では、前記生体組織片を固定液に所定時間浸漬した後、前記包埋ブロックを作製し、
   前記包埋組織切片作製工程以降に、
   前記包埋組織切片に対して染色処理を行い、前記組織切片内の細胞で発現されている内因性タンパク質からの光シグナルに基づいて、前記固定液による前記組織切片の固定状態を判断する固定状態判断工程を有する
   請求項１〜６のいずれか１項に記載の組織切片選定方法。
8. 生体組織片が包埋された包埋ブロックを作製する包埋ブロック作製カセットであって、
   液状包埋剤を流し込むトレイ上に載置される箱体を備えており、
   前記箱体は、
   トレイ底面上の前記生体組織片と対向した領域に上面と下面とが貫通した貫通孔を備える枠部と、
   前記トレイ底面と向かい合うように設けられ、標準物質が挿入される位置決め孔を有する標準物質位置決め部と
   を備え、
   前記標準物質位置決め部は、前記トレイ底面を基準としたときの前記生体組織片の下端から上端までの高さ範囲内に前記標準物質が存在するように、前記標準物質を位置決めする
   包埋ブロック作製カセット。
9. 前記枠部は、前記生体組織片の全体、前記生体組織片の対向する両端部、又は、前記生体組織片の１／３以上が前記貫通孔の形成領域に配置される
   請求項８に記載の包埋ブロック作製カセット。
10. 前記標準物質位置決め部は、前記位置決め孔を２つ以上有している
    請求項８又は９に記載の包埋ブロック作製カセット。
11. 前記枠部は、板枠部を下面に有し、
    前記標準物質位置決め部が前記板枠部で囲まれた領域内に配置されている
    請求項８〜１０のいずれか１項に記載の包埋ブロック作製カセット。
12. マーカーを特異的に検出して、検査する組織切片を選定する組織切片選定方法であって、
    生体組織片を固定液に所定時間浸漬した後、前記生体組織片を包埋剤に包埋して包埋ブロックを作製する包埋ブロック作製工程と、
    前記包埋ブロックを薄切して、前記組織切片が表面に現れているシート形状の包埋組織切片を作製する包埋組織切片作製工程と、
    前記包埋組織切片に対して染色処理を行い、前記組織切片内の細胞で発現されている内因性タンパク質からの光シグナルに基づいて、前記固定液による前記組織切片の固定状態を判断する固定状態判断工程と、
    を有する組織切片選定方法。
    
    

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