KR100926485B1 - 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물의 비장 조직을 이용하여 면역조직화학 염색 판독용 슬라이드를 제작함으로써 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색방법에 관한 것으로, 항상 동일 양의 일차항체를 포함하고 있는 동물의 비장 조직을 대조 조직으로 이용함으로써 정량적 관찰이 어려운 기존 면역조직화학 염색법의 단점을 극복하고, 병원의 병리과뿐 아니라 조직을 이용하는 다양한 연구실에서도 널리 활용할 수 있다.

비장, 슬라이드, 면역조직화학, 염색

Description

정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법 {A method of immunohistochemical staining having easy quantitative observation}

본 발명은 물의 비장 조직을 이용하여 면역조직화학 염색 판독용 슬라이드를 제작하고 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색방법에 관한 것이다.

효소 면역조직화학 염색법은 각종 종양의 기원, 종양의 분류, 예후판정 등의 목적으로 매우 광범위하게 이용되고 있는 방법이다. 특히 최근에는 어떤 항원의 존재 여부 뿐 아니라 조직이나 세포에 존재하는 항원의 양이 암의 예후나 항암제에 대한 반응성을 결정짓는데 중요하다는 사실이 알려지면서 정량적인 면역조직화학 염색의 필요성이 대두되었다.

그러나 현재 이용 가능한 면역조직화학 염색법은 항원에 대한 일차 항체를 반응시켜 붙인 다음 직접 효소가 붙은 이차 항체를 붙이고 효소의 기질액을 반응시켜 발색을 시키거나, 바이오틴이 붙은 이차항체를 반응 시키고 이후에 바이오틴과 강력하게 붙는 성질이 있는 아비딘에 효소가 달라붙어있는 시약을 반응 시키고(ABC 법) 이후에 이 효소에 대한 기질액을 반응시켜서 색깔을 발색시켜 현미경하에서 원래 항원의 존재를 관찰하는 방법을 사용하고 있다.

이와 같은 방법은 효소의 반응 정도를 결정짓는 여러 가지 요소들에 의해 최종 발색 정도가 달라지고 특히 가장 흔히 이용되고 있는 ABC 법에서는 여러 단계를 거쳐서 염색하므로 원래 존재하는 항원은 여러 단계로 증폭되어 선명한 색깔의 발색을 얻게 되나 이 모든 단계들이 최종 발색농도에 영향을 미치기 때문에 조직 내 항원 양을 정량적으로 알고자하는 원래의 목적을 이루기에는 오히려 단점이 되고 있다.

최근 외국에서는 고가 장비를 이용하여 같은 조건에서 염색을 시행하고 발색정도를 기계로 측정하여 반 정량적으로 비교해보려는 시도가 있으나 고가 장비를 이용해야하고 일반적으로 사용되기에는 어려움이 있어서 아직 널리 이용되지는 못하고 있다. 기존 양성이나 음성으로 알려진 조직을 이용하여 절편을 만들어 검사하려는 슬라이드와 한께 면역조직화학염색을 시행하여 이들 대조 슬라이드가 각각 양성, 음성 소견을 잘 나타내면 염색이 제대로 된 것으로 판단하는 대조 염색은 종종 이용되고 있었다.

한편, 면역조직화학염색의 방법을 개괄적으로 설명하면, 탈파라핀되고 적절하게 처리된 조직에 원하는 항원에 대한 일차 항체를 반응시킨 다음 일차항체를 항원으로 해서 만든 이차 항체를 반응시키는데 이 이차 항체에는 효소가 부착되어 있 다. 다음 단계로 효소에 대한 기질액을 반응시켜 그 결과물로 색깔이 나타나게 된다.

그러나, 이같은 기존 면역조직화학 염색법에 의하면 정량적 관찰이 어려운 단점이 있어서 이를 극복할 수 있는 새로운 방법으로서, 검사하려는 동일 슬라이드에 대조염색용 동물의 비장 조직을 같이 올려서 정량 판단의 대조염색으로 이용하는 점에 착안하여 연구를 계속한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 면역조직화학 염색을 시행할 때 슬라이드에 검사하려는 조직과 함께 동물의 비장조직 일부를 같이 놓고 염색하여 염색과정과 발색 강도의 대조로 이용가능한 슬라이드를 제작하고 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색을 수행하려는데 있다.

본 발명에 의하면,
인체 조직내 타겟 단백질의 존재 유무와 존재 위치를 증명하기 위해 면역조직화학 염색을 실시함에 있어서,
상기 인체 조직내 타겟 단백질에 대한 일차항체는 생쥐 면역글로불린이고,
상기 일차항체가 조직에 붙어있는지를 확인할 목적으로 생쥐이외의 동물에게 생쥐 면역글로불린을 감작시켜 제조한 이차항체를 사용하며, 그리고
상기 인체 조직에 대한 면역 조직화학 염색의 판독 기준으로는 생쥐 비장조직을 사용하며,
여기서 상기 생쥐 비장조직은 다량의 생쥐 면역글로불린이 함유되어 상기 이차항체로 면역조직화학 염색시 진하게 염색되는 형질세포와 소량의 생쥐 면역글로불린이 세포 표면에 붙어있어 면역조직화학 염색시 연하게 염색되는 B 림프구를 모두 갖으므로 면역 조직화학 염색도중 생쥐 비장조직의 발색된 색깔 강도에 따라 인체 조직내 타겟 단백질 함량을 정량적으로 판독하는 것을 특징으로 하는 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법이 제공된다.

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본 발명에서는 일차 항체를 포함하는 동물의 비장 조직을 면역조직화학 염색 판독용으로 이용한 슬라이드를 제공한다. 이때 일차 항체를 포함하는 동물이란 생쥐, 염소, 말, 돼지, 토끼 등으로부터 선택된 일차 항체 제작가능한 동물의 비장을 이용할 수 있으며, 통상 입수가능한 생쥐의 비장을 이용하는 것이 바람직하다.
이때 일차 항체를 포함하는 동물의 비장 조직은 면역조직화학 염색법에 기초하여 선택된 것으로, 이같은 면역조직화학염색의 방법을 개괄적으로 설명하면 다음과 같다: 우선, 탈파라핀되고 적절하게 처리된 조직에 원하는 항원에 대한 일차 항체를 반응시킨 다음 일차항체를 항원으로 해서 만든 이차 항체를 반응시키는데 이 이차 항체에는 효소가 부착되어 있다.

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다음 단계로 효소에 대한 기질액을 반응시켜 그 결과물로 색깔이 나타나게 된다.

현재 가장 흔히 이용되는 일차항체는 단클론 항체인데 거의 모든 단클론 항체는 생쥐의 형질세포를 이용하여 생산하므로 생쥐의 글로불린이고 따라서 이차항체는 생쥐의 글로불린을 항원으로 하여 다른 동물(염소, 토끼, 돼지 등등)에서 생산한 글로불린이다. 그러므로 이차 항체는 생쥐의 글로불린에는 무조건 반응하여 결국 발색을 일으킨다. 그런데 면역 글로불린은 정상에서도 형질세포 세포질 내에 다량 존재하고 B림프구 세포 표면에 소량 존재한다. 따라서 정상적으로 항상 형질세포와 B 림프구들이 존재하는 비장 조직을 이용하면 항상 동일 양의 일차항체를 포함하고 있는 대조 조직을 만들 수 있으므로 본 발명에서 선택하게 된 것이다. 이때 일차 항체는 생쥐 뿐 아니라 다른 동물, 즉 염소, 토끼, 돼지, 말 등의 형질 세포를 이용할 수도 있다.

상기 슬라이드는 단일 조직 슬라이드 혹은 Tissue array 모두를 포함한다.

또한, 상기 염색 판독이란 조직내의 세포내 발색 정도가 일차 항체를 포함하는 동물의 형질세포내 강도와 B림프구 세포표면 염색강도를 기준으로 어느 정도인지를 판독하는 것을 의미한다.

이같은 면역조직화학 염색판독용 슬라이드 제작방법은 다음과 같다.

우선, 면역조직화학 염색용 단일 조직 슬라이드 혹은 Tissue array 제작시 일차 항체를 포함하는 동물의 비장조직도 함께 제작하고, 현미경 하에서 조직 내의 세포내 발색 정도가 상기 일차 항체 제작 동물의 형질세포 내 강도와 B림프구 세포표면 염색강도를 기준으로 어느 정도인지를 판독하게 된다.

이때 일차 항체를 포함하는 동물이란 생쥐, 염소, 말, 돼지, 토끼 등으로부 터 선택된 일차 항체 제작가능한 동물의 비장을 이용할 수 있으며, 통상 입수가능한 생쥐의 비장을 이용하는 것이 바람직하다.

이때 일차 항체를 포함하는 동물의 비장 조직은 면역조직화학 염색법에 기초하여 선택된 것으로, 이같은 면역조직화학염색의 방법을 개괄적으로 설명하면 다음과 같다.

우선, 탈파라핀되고 적절하게 처리된 조직에 원하는 항원에 대한 일차 항체를 반응시킨 다음 일차항체를 항원으로 해서 만든 이차 항체를 반응시키는데 이 이차 항체에는 효소가 부착되어 있다.

다음 단계로 효소에 대한 기질액을 반응시켜 그 결과물로 색깔이 나타나게 된다.

현재 가장 흔히 이용되는 일차항체는 단클론 항체인데 거의 모든 단클론 항체는 생쥐의 형질세포를 이용하여 생산하므로 생쥐의 글로불린이고 따라서 이차항체는 생쥐의 글로불린을 항원으로 하여 다른 동물(염소, 토끼, 돼지 등등)에서 생산한 글로불린이다. 그러므로 이차 항체는 생쥐의 글로불린에는 무조건 반응하여 결국 발색을 일으킨다. 그런데 글로불린은 정상에서도 형질세포 세포질 내에 존재하고 B림프구 세포 표면에 존재한다. 따라서 정상적으로 항상 형질세포와 B 림프구들이 존재하는 비장 조직을 이용하면 항상 동일 양의 일차항체를 포함하고 있는 대조 조직을 만들 수 있으므로 본 발명에서 선택하게 된 것이다. 이때 일차 항체는 생쥐 뿐 아니라 다른 동물, 즉 염소, 토끼, 돼지, 말 등의 형질 세포를 이용할 수도 있다.

이때 상기 단일 조직 슬라이드 제작시 염색하고자 하는 조직과 동일한 방식 및 두께로 일차 항체 제작 동물의 비장조직도 절편 제작한 다음 한 슬라이드 상 조직 옆에 대조군으로서 함께 재치하는 것을 특징으로 하며, 특히 두께는 이에 한정하는 것은 아니나 일반적으로 사용하는 약 4 마이크로미터 정도이면 충분하다.

또한, 상기 Tissue array 제작시 조직 하나의 위치에 기준이 되게 상기 일차 항체 제작 동물의 비장 조직을 함께 끼워 제작함을 특징으로 한다.

이를 구체적으로 살펴보면, 다음 3가지 단계로 이루어질 수 있다.

첫째, 염색하고자 하는 조직과 동일한 방법과 두께로(보통 4 마이크로미터) 일차 항체 제작 동물 비장조직도 절편을 제작한 다음 슬라이드 상에 각 절편을 함께 재치한다. 또는 Tissue array인 경우에는 조직 하나의 위치에 기준이 되게 일차 항체를 포함하는 동물의 비장 조직을 끼워 제작한다.

둘째, 면역조직화학 염색 방법은 기존 방법과 같은 방법으로 시행한다.

셋째, 현미경 하에서 조직 내의 세포내 발색 정도가 일차 항체 제작 동물의 형질세포 내 강도와 B림프구 세포표면 염색강도를 기준으로 어느 정도인지를 판독한다.

이와 같이 슬라이드를 제작하여 실험한 결과 하기 실시예에서 보듯이, 5가지 작용 효과를 규명할 수 있었다:

1. 면역조직화학 염색 단계 중 슬라이드 제작에서부터 염색의 단계 중 일차항체를 제외한 모든 단계의 대조역할을 한다.

2. 현미경 하에서 조직 내의 세포내 발색 정도가 일차 항체 제작 동물의 형질세포 내 강도와 B림프구 세포표면 염색강도를 기준으로 어느 정도인지를 판독함으로써 반정량적 보고를 할 수 있다.

3. 일차 항체를 포함하는 동물로서 생쥐를 이용할 경우 특히 생쥐 한 마리의 비장으로 200 절편이상을 제작할 수 있으며 다른 실험에 이용되고 희생되는 생쥐의 비장도 이용할 수 있다.

4. 단일 조직 슬라이드나 Tissue array 모두에 쉽게 적용할 수 있다. 즉, 면역조직화학 염색을 시행할 때 슬라이드에 검사하려는 조직과 함께 일차 항체 제작 동물의 비장조직 일부를 같이 놓고 염색하여 염색과정과 발색 강도의 대조로 이용하는 방법으로서 일차 항체를 제외한 모든 단계의 면역조직화학 염색 과정이 잘되었는지를 판단할 수 있다.

5. 생쥐 등 일차 항체 제작 동물의 비장 조직을 이용한 면역조직화학 염색의 슬라이드 내 대조염색 방법과 면역조직화학 대조 염색용으로 생쥐 등 일차 항체 제작 동물의 비장조직절편을 붙인 슬라이드를 포함하며 병원의 병리과, 조직을 이용하는 여러 종류의 연구실에서 이용 가능한 것이다.

본 발명에 의하면, 항상 동일 양의 일차항체를 포함하고 있는 동물의 비장 조직을 대조 조직을 이용함으로써 정량적 관찰이 어려운 기존 면역조직화학 염색법의 단점을 극복하고, 병원의 병리과 뿐 아니라 조직을 이용하는 다양한 연구실에서도 널리 활용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 각각의 실시예는 반복 실시하여 그 결과의 재현성을 확인하였다.

<생쥐 비장 조직에 대한 면역조직화학 염색결과>

본 발명자들은 정상적으로 항상 형질세포와 B 림프구들이 존재하는 생쥐 비장조직에 항생쥐 면역글로블린 이차항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하고, 그 결과를 도 1 및 도 2에 도시하였다.

100배 확대한 도 1에서 보듯이, 소포(→) 주위에 다수의 형질세포(◆→)가 적갈색으로 강하게 염색된 것을 확인할 수 있었다.

또한 400배 확대한 도 2에서 보듯이, 소포내에 있는 B 림프구(→)의 세포막에서 약한 염색이 확인되었으며, 이에 반해 소표 주면의 T 림프구(◆→)에 대하여는 음성 소견을 확인할 수 있었다.

<슬라이드 실시예>

염색하고자 하는 인체의 유방암 조직과 생쥐(Balb/c) 비장조직을 동일한 통상적인 방법으로 포르마린 고정 후 파라핀 포매하여 4마이크로미터씩 절편을 제작하였다. 그런 다음 1개의 슬라이드 상에 나란히 올려 염색 판독용 단일 조직 슬라이드를 제작하였다.

이어서 면역조직화학 염색을 수행하고 항 c-erb B2 일차 항체를 반응시킨 다음 효소가 부착된 이차 항체를 반응시키고, 다음 단계로 효소에 대한 기질액을 반응시켜 그 결과물로 색깔이 나타나게 하였다. 사진을 찍어 염색 정도를 도 3에서 확인하였다.

도 3에서 보듯이, 둘 다 모두 염색되었음을 확인할 수 있었다.

<Tissue array 실시예>

염색하고자 하는 유방암 조직에 대하여 조직 하나의 위치와 기준이 되게 생쥐(Balb/c) 비장 조직을 끼워 염색 판독용 Tissue array를 제작하였다.

Tissue microarray(TMA)에 생쥐 비장 조직을 끼워넣고 파라핀 블록과 슬라이드를 상기한 방법과 동일하게 제작하여 면역조직화학 염색을 수행하고 그 결과를 도 4에 정리하였다.

도 4에서 보듯이, TMA map,과 TMA 파라핀 블록, H/E 염색, 면역조직화학 염색한 결과 3군데 생쥐 비장 조직에 대하여 동일한 결과를 확인할 수 있었다.

<판독>

생쥐의 B lymphocytes(B 림프구)와 plasma cell(형질 세포)을 염색한 결과, 도 5에서 보듯이, B 림프구는 최소 강도로 염색되었고, 형질 세포는 최대 강도로 염색되었는 바, 이를 기초로 하여 도 4중 면역조직화학 염색을 시행한 슬라이드를 유방암 조직에서 C-erb B2 염색 강도를 생쥐 비장조직 결과에 대비하고자 그 현미경 관찰 결과를 도 5에 함께 나타내었다.

즉, 현미경 하에서 조직내의 세포내 발색 정도를 생쥐 형질세포내 강도와 B림프구 세포표면 염색강도를 기준으로 판독한 반정량적 결과를 얻을 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의해 제작된 슬라이드는 면역조직화학 염색 단계 중 슬라이드 제작에서부터 염색의 단계 중 일차항체를 제외한 모든 단계의 대조역할을 한다. 또한, 현미경 하에서 조직 내의 세포내 발색 정도가 생쥐 형질세포 내 강도와 B림프구 세포표면 염색강도를 기준으로 어느 정도인지를 판독하므로서 반정량적 보고를 할 수 있다. 또한, 생쥐 한 마리의 비장으로 200 절편이상을 제작할 수 있으며 다른 실험에 이용되고 희생되는 생쥐의 비장도 이용할 수 있다. 나아가 단일 조직 슬라이드나 Tissue array 모두에 쉽게 적용할 수 있는 것이다.

도 1 및 2는 생쥐 비장조직에 항생쥐 면역글로블린 이차항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행후 찍은 사진으로서 도 1은 100배 확대사진이고, 도 2는 400배 확대사진이고,

도 3은 본 발명의 일 실시예에 의하여 슬라이드 상에 검사하려는 인체 조직과 생쥐의 비장 조직을 근접시켜 제작한 단일 조직 슬라이드를 이용하여 면역조직화학 염색후 찍은 사진이고,

도 4는 Tissue microarray(TMA)에 생쥐 비장 조직을 끼워넣고 파라핀 블록과 슬라이드를 제작하여 면역조직화학 염색을 수행하고 얻어진 사진이고,

도 5는 생쥐의 B lymphocytes(B 림프구)와 plasma cell(형질 세포)을 염색한 결과 및 이를 기초로 하여 유방암 조직에서 C-erb B2 염색 강도를 대비하여 판독하는 과정을 도시한 도면이다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 인체 조직내 타겟 단백질의 존재 유무와 존재 위치를 증명하기 위해 면역조직화학 염색을 실시함에 있어서,

   상기 인체 조직내 타겟 단백질에 대한 일차항체는 생쥐 면역글로불린이고,

   상기 일차항체가 조직에 붙어있는지를 확인할 목적으로 생쥐이외의 동물에게 생쥐 면역글로불린을 감작시켜 제조한 이차항체를 사용하며, 그리고

   상기 인체 조직에 대한 면역 조직화학 염색의 판독 기준으로는 생쥐 비장조직을 사용하며,

   여기서 상기 생쥐 비장조직은 다량의 생쥐 면역글로불린이 함유되어 상기 이차항체로 면역조직화학 염색시 진하게 염색되는 형질세포와 소량의 생쥐 면역글로불린이 세포 표면에 붙어있어 면역조직화학 염색시 연하게 염색되는 B 림프구를 모두 갖으므로 면역 조직화학 염색도중 생쥐 비장조직의 발색된 색깔 강도에 따라 인체 조직내 타겟 단백질 함량을 정량적으로 판독하는 것을 특징으로 하는 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법.
5. 삭제
6. 제4항에 있어서, 상기 생쥐 비장 세포는 인체 조직이 재치된 슬라이드 상에 함께 재치되어 사용되는 것을 특징으로 하는 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 생쥐 비장 세포는 인체 조직으로된 Tissue Microarray 에 끼워넣고 파라핀 블록과 슬라이드의 형태로 제작하여 사용되는 것을 특징으로 하는 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법.

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