CN112747980A - 一种中药肉桂冷冻切片的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了中药肉桂冷冻切片的制作方法，其包括如下步骤：材料前处理：将中药肉桂样品浸泡在含70％乙醇与水按照体积比为1～2：1的溶液中1～2小时；取出，切制成长5～8mm，宽5～8mm的短段；再将所述短段样品浸泡2～3小时，取出，擦干，并放入装有水合氯醛试液的试管中，加热至沸腾5～7次；然后取出样品，擦干；样品包埋，冷冻固定；冷冻切片；展片与制片。该方法不易使组织结构变形、切片时样品不易破碎；无需染色；可快速获得结构完整的中药肉桂冷冻切片；切片组织结构清晰、细胞内含物保留完整；制作周期短，4～6个小时内即可完成从前处理至显微观察拍照，既而获得完整图像的整个过程；对中药肉桂的鉴定、扩大肉桂应用范围及相关标准的制定有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及显微组织切片技术领域，尤其一种中药肉桂冷冻切片的制作方法。
背景技术
中药肉桂是樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮。其性大热，具有补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经络的功效[1]。肉桂为药食两用之品，其相关产品涉及了医药、食品、日用品、农药等多个领域，使用范围广，用量大，是国际上重要的药用植物品种[2]。
因肉桂与伪品柴桂皆为樟科樟属植物，性状气味相似，易造成混淆[3-4]。且柴桂主要用于治疗寒湿痹痛、脘腹痛、痛经、跌打损伤等，故不能同肉桂混用[4]。又因两者化学成分相近，薄层鉴别无法区分。后采用组织切片及粉末显微鉴别，发现柴桂与肉桂有明显的差别[5]。可见，肉桂及其混伪品的鉴别以显微鉴别更有效且准确。
目前，中药横(纵)切面的显微鉴别所用切片大多采用徒手切片或者石蜡切片两种切片方法制备。徒手切片法是指手持刀片将实验材料切成薄片的制作方法，由于样品难以固定，在切片时易产生厚薄不匀现象，难以获得完整且组织结构清晰的切片。且徒手切片法受材料质地影响极大，在一定程度上，亦受人员徒手切片经验、能力的限制。石蜡切片法虽是最常用的方法，但由于材料切片前需经过固定、脱水、透明和包埋等一系列步骤，耗时长，过程繁琐，细胞内含物流失严重难以观察到，染色方法繁琐多样，且材料容易变形。
目前肉桂解剖结构的研究主要是通过制作树皮石蜡切片，然后在显微镜下观察其结构特征，但石蜡切片制作需要40个小时或更长时间，极其耗时；且因肉桂树皮质地硬而脆，易折断，在制作过程中易碎裂成粉状，难以得到具有完整显微结构特征的切片。宗希明[6]等开发的肉桂简易制片法虽然将时间缩短到24小时左右，但对材料的选择很苛刻，可观察到的样品范围较小。目前，采用冷冻切片法制作肉桂树皮冷冻切片进行结构及内含物显微观察的研究尚未开展。
中国发明专利(CN 103776657 A)中公开了一种椰子叶片冷冻切片的制作方法，即采用冷冻切片的方式可快速获得结构完整的冷冻切片，但由于：1)叶片质地及细胞组织构造与树皮完全不同；2)且该专利实施的样品为新鲜叶片，而中药肉桂为干燥树皮，厚0.2～0.8cm，外表面略粗糙，有不规则的细皱纹和横向突起的皮孔；内表面略平坦，有细纵纹，质硬而脆，易折断，断面不平坦；且细胞及组织间构造处于极度干燥的状态，没有适当的前处理方法是无法进行切制的。因此，该发明专利提供的叶片冷冻切片制作方法并不适用于中药肉桂的冷冻切片。
因此，根据中药肉桂的性状特征及质地，亟待建立一种简单、快速、实用的切片方法，有效的完成中药肉桂种质研究、真伪鉴别及相关质量标准的制定。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2020:142-143.
[2]焦少珍.世界桂皮生产、消费和贸易格局分析[J].世界农业,2016(08):124-129.
[3]庞运同,董元玉.肉桂及其伪品的鉴别[J].中国医院药学杂志,2004(12):66-67.
[4]邱燕祥,严娅娟,张丹雁,莫伟.肉桂及其常见混淆品的鉴别研究[J].安徽农业科学,2015,43(17):299-301,316.
[5]赵霞.一种肉桂混淆品的显微鉴别[J].中国民族民间医药杂志,2007(01):49-51.
[6]宗希明,李凤琴.中药肉桂简易制片法[J].佳木斯医学院学报,1996(06):44.
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种中药肉桂冷冻切片的制作方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种中药肉桂冷冻切片的制作方法，包括如下步骤：
步骤一，材料前处理：将中药肉桂样品浸泡在含有70％乙醇与水按照体积比为1～2：1的溶液中1～2小时；取出，切成长5～8mm，宽5～8mm的短段样品；将该短段样品再浸泡2～3小时，取出，擦干，并放入装有水合氯醛试液的试管中，加热至沸腾5～7次；将短段样品取出，擦干；
步骤二，样品固定：采用OCT冷冻包埋剂将短段样品固定在冷台底座上；
步骤三，冷冻切片：将冷冻切片机专用刀片水平固定住，然后将粘有短段样品的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上；先对短段样品块进行修片，待能够出现平整均匀的切片后调至切片厚度为30～40μm，将防卷板调整到适宜位置，摇动旋转手轮进行切片；
步骤四，展片与制片。
进一步地，上述中药肉桂样品的大小为1×1cm。
进一步地，70％乙醇与水的体积比为1：1。
进一步地，步骤二的具体步骤为：在Leica CM1950冷冻切片机的冷台底座先加OCT冷冻包埋剂至满足短段样品大小，预冷冻15～20s，将底座取出，将小段样品垂直置于冷冻包埋剂中，并再加OCT冷冻包埋剂使样品完全包裹住，并放在Leica CM1950冷冻切片机中的样品台上，放置30～60分钟，箱体最低设置温度为-15℃。
进一步地，放置的时间为30～50分钟。
进一步地，步骤三中修片时切片的厚度设置为50～60μm。
进一步地，步骤三切片时箱体最低设置温度为-15℃，切片头最低设置温度为-20℃。
进一步地，步骤四的具体步骤为：将切下来的切片用毛笔小心取出，放置在水中将切片上沾有多余的OCT冷冻包埋剂溶解洗涤干净，再将切片平铺至载玻片上，滴加水合氯醛试液，加盖玻片；将切片立刻置于Nikon Ni-U正置偏光显微镜下观察拍照。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的方法不易使组织结构变形、切片时样品不易破碎；无需染色；可快速获得结构完整的中药肉桂冷冻切片；切片组织结构清晰、细胞内含物保留完整；制作周期短，4～6个小时内即可完成从前处理至显微观察拍照，既而获得完整图像的整个过程；有利于进一步研究肉桂与混伪品显微组织结构差别、油细胞数计算和其内容物的观察；对中药肉桂的鉴定、扩大肉桂应用范围及相关标准的制定有重要的意义。
附图说明
图1是本发明一实施例中采用本发明提供的方法制备的中药肉桂切片样品的横切面显微结构观察效果图；
图2是采用徒手切片法制备的中药肉桂切片样品的横切面显微结构观察效果图；
图3是采用本发明提供的方法与徒手切片制备的中药肉桂切片样品的横切面显微细节观察效果对比图；其中，a显示了本发明提供的方法制备的中药肉桂切片样品的横切面观察到的油细胞，b显示了石蜡切片制备的中药肉桂切片样品的横切面观察到的油细胞。
具体实施方式
本发明利用冷冻切片的方式可快速获得结构完整的冷冻切片，提供了一种中药肉桂冷冻切片的制作方法，可以有效地缩短制片的周期，材料不易变形，且切片显微观察的效果好，能明确观察到肉桂的油细胞及其内含物；进而有利于更快更准确的完成中药肉桂及其混伪品的显微鉴别、对中药肉桂相关标准的制定及扩大肉桂应用范围、改善肉桂的供需量有重大的意义。该制作方法包括如下步骤：
步骤一，材料前处理：将中药肉桂样品浸泡在含有70％乙醇与水按照体积比为1～2：1的溶液中1～2小时；取出，切成长5～8mm，宽5～8mm的短段样品；将该短段样品再浸泡2～3小时，取出，擦干，并放入装有水合氯醛试液的试管中，加热至沸腾5～7次；将短段样品取出，擦干；
步骤二，样品固定：采用OCT冷冻包埋剂将短段样品固定在冷台底座上；
步骤三，冷冻切片：将冷冻切片机专用刀片水平固定住，然后将粘有短段样品的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上；先对短段样品块进行修片，待能够出现平整均匀的切片后调至切片厚度为30～40μm，将防卷板调整到适宜位置，摇动旋转手轮进行切片；
步骤四，展片与制片。
在本发明一优选的实施方式中，上述中药肉桂样品的大小为1×1cm。
在本发明一优选的实施方式中，70％乙醇与水的体积比为1：1。
在本发明一优选的实施方式中，步骤二的具体步骤为：在Leica CM1950冷冻切片机的冷台底座先加OCT冷冻包埋剂至满足短段样品大小，预冷冻15～20s，将底座取出，将样品垂直置于冷冻包埋剂中，并再加OCT冷冻包埋剂使样品完全包裹住，并放在Leica CM1950冷冻切片机中的样品台上，放置30～60分钟，箱体最低设置温度为-15℃。
在本发明一优选的实施方式中，放置的时间为30～50分钟。
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中修片时切片的厚度设置为50～60μm。
在本发明一优选的实施方式中，步骤三切片时箱体最低设置温度为-15℃，切片头最低设置温度为-20℃。
在本发明一优选的实施方式中，步骤四的具体步骤为：将切下来的切片用毛笔小心取出，放置在水中将切片上沾有多余的OCT冷冻包埋剂溶解洗涤干净，再将切片平铺至载玻片上，滴加水合氯醛试液，加盖玻片；将切片立刻置于Nikon Ni-U正置偏光显微镜下观察拍照。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供一种中药肉桂冷冻切片的制作方法，包括如下步骤：
(1)材料前处理：
取中药肉桂，用工具修剪下1×1cm的一段样品；放入装有70％乙醇：水＝1：1(体积比)溶液的烧杯中，浸泡1h，取出，用刀片将其切成长8mm，宽约5mm的短段样品，并将边缘修平整；再浸泡2h，使短段样品润透，取出，将表面溶液擦干，放入装有水合氯醛试液的试管中，加热至沸腾6次；将样品取出，将表面溶液擦干；
(2)样品固定：
在Leica CM1950冷冻切片机的冷台底座先加OCT冷冻包埋剂至满足短段样品大小，预冷冻20s，将底座取出，将短段样品垂直置于冷冻包埋剂中，并再加OCT冷冻包埋剂使样品完全包裹住，并放在Leica CM1950冷冻切片机中的样品台上，放置40min，箱体温度为-15℃；
(3)冷冻切片：
将冷冻切片机专用刀片水平固定住，然后将粘有短段样品的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上；调整样品到刀片的距离，先将切片厚度设置为切片50μm对样品块进行修片，待能够出现平整均匀的切片后调至35μm，箱体温度为-15℃，切片头温度为-20℃，将防卷板调整到适宜位置，摇动旋转手轮进行切片。
(4)展片与制片：
将切下来的切片用毛笔小心取出，放置在水中将切片上沾有多余的OCT冷冻包埋剂溶解洗涤干净，再将切片平铺至载玻片上，每张载玻片可铺3张切片，将切片带到载玻片上的水吸干，再滴加水合氯醛试液，加盖玻片。
(5)显微观察与拍照：
将切片立刻置于Nikon Ni-U正置偏光显微镜下观察拍照。结果如图1(40倍放大)、图3(400倍放大)所示。
采用徒手切片法制备的中药肉桂切片样品作为对照，将该样品放置在Nikon Ni-U正置偏光显微镜下观察拍照。结果如图2(40倍放大)、图3(400倍放大)所示。
由图1-3可知，采用本实施例方法所得到的中药肉桂横切面可观察到木栓细胞数列，皮层散有石细胞和分泌细胞。中柱鞘部位有石细胞群，断续排列成环。韧皮部射线宽1～2列细胞，含细小草酸钙针晶；纤维常2～3个成束；油细胞随处可见，能明显看到细胞内含物。组织结构排列清晰且可观察到的面积足够大，可用于进一步的显微组织结构研究。然而徒手切片法所观察到的中药肉桂横切面组织结构杂乱且不完整，可观察的面积较小，故呈现的组织结构没有代表性及研究意义
实施例2
本实施例对制备方法中的浸泡液中的乙醇的比例进行探究，具体的操作方法和实验结果如下：
(1)材料前处理：
将样品放入装有70％乙醇：水＝2：1(体积比)溶液的烧杯中，其他同实施例1。
(2)样品固定：同实施例1。
(3)冷冻切片：同实施例1。
(4)展片与制片：同实施例1。
(5)显微观察与拍照：同实施例1。
实验结果：由于在该方法中，浸泡液里乙醇比例较大，虽然润透样品的时间稍有缩短，但所得到的样品含水量较低，细胞间结合不够紧密，在其他条件不变时，所得到的切片更容易破损。
实施例3
本实施例对制备方法中的前处理步骤中的浸泡时间进行探究，具体的操作方法和实验结果如下：
(1)材料前处理：
将预浸泡修剪好的样品，再浸泡3.5小时，其他同实施例1。
(2)样品固定：同实施例1。
(3)冷冻切片：同实施例1。
(4)展片与制片：同实施例1。
(5)显微观察与拍照：同实施例1。
实验结果：由于在该方法中，样品浸泡时间较长，细胞间含水量较大，组织结构较疏松，样品质地过软，不仅对后续冷冻时间的控制有影响，且细胞中可能会产生冰晶，一定程度上会破坏细胞结构。
实施例4
本实施例对制备方法中的冷冻时间进行探究，具体的操作方法和实验结果如下：
(1)材料前处理：同实施例1。
(2)样品固定：
将包埋好的样品及底座放在Leica CM1950冷冻切片机中的样品台上，放置1h，其他同实施例1。
(3)冷冻切片：同实施例1。
(4)展片与制片：同实施例1。
(5)显微观察与拍照：同实施例1。
实验结果：由于在该方法中，对样品冷冻固定的时间较长，样品中的水分损失较大，切片易破碎，且细胞中产生的冰晶对细胞结构有一定的破坏作用。
实施例5
本实施例对制备方法中的冷冻切片厚度进行探究，具体的操作方法和实验结果如下：
(1)材料前处理：同实施例1。
(2)样品固定：同实施例1。
(3)冷冻切片：
待能够出现平整均匀的切片后调至25μm，其他同实施例1。
(4)展片与制片：同实施例1。
(5)显微观察与拍照：同实施例1。
实验结果：由于在该方法中，对样品冷冻切片设定的厚度较薄，样品组织结构间的相互作用较弱，切片易破损。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种中药肉桂冷冻切片的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，材料前处理：将中药肉桂样品浸泡在含有70％乙醇与水按照体积比为1～2：1的溶液中1～2小时；取出，切成长5～8mm，宽5～8mm的短段样品；将所述短段样品再浸泡2～3小时，取出，擦干，并放入装有水合氯醛试液的试管中，加热至沸腾5～7次；将所述短段样品取出，擦干；
步骤二，样品固定：采用OCT冷冻包埋剂将所述短段样品固定在冷台底座上；
步骤三，冷冻切片：将冷冻切片机专用刀片水平固定住，然后将粘有短段样品的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上；先对短段样品进行修片，待能够出现平整均匀的切片后调至切片厚度为30～40μm，将防卷板调整到适宜位置，摇动旋转手轮进行切片；
步骤四，展片与制片。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述中药肉桂样品的大小为1×1cm。
3.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述70％乙醇与水的体积比为1：1。
4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤二的具体步骤为：在LeicaCM1950冷冻切片机的冷台底座先加OCT冷冻包埋剂至满足短段样品大小，预冷冻15～20s，将底座取出，将所述短段样品垂直置于冷冻包埋剂中，并再加OCT冷冻包埋剂使样品完全包裹住，并放在Leica CM1950冷冻切片机中的样品台上，放置30～60分钟，箱体最低设置温度为-15℃。
5.根据权利要求4所述的制作方法，其特征在于，放置的时间为30～50分钟。
6.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，步骤三中修片时切片的厚度设置为50～60μm。
7.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，步骤三切片时箱体最低设置温度为-15℃，切片头最低设置温度为-20℃。
8.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，步骤四的具体步骤为：将切下来的切片用毛笔小心取出，放置在水中将切片上沾有多余的OCT冷冻包埋剂溶解洗涤干净，再将切片平铺至载玻片上，滴加水合氯醛试液，加盖玻片；将切片立刻置于Nikon Ni-U正置偏光显微镜下观察拍照。
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