CN114088493B - 一种动物眼球病理切片制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物眼球病理切片制作方法，包括以下步骤：摘取动物眼球并保留3‑8mm视神经，使用生理盐水冲洗除去血污；将动物眼球置于生理盐水中，然后用微波炉中火加热处理4‑12min；将动物眼球放入冰醋酸、氯仿和甲醇配制的固定液中，固定60‑90h；将动物眼球用正丁醇脱水2‑4次，每次0.5‑3小时；然后，将动物眼球用二甲苯透明2‑4次，每次10‑20min，二甲苯透明处理总时长30‑50min；第一次石蜡处理1‑2h，第二次石蜡处理1‑2h，处理后进行石蜡包埋；按照设定厚度进行切片。本发明方法制作动物眼球病理切片的时候，结合动物眼球结构特点，采用微波处理眼球，使得眼球结构蛋白变性实现眼球结构强度预增强，对于动物眼球细微结构的精确研究和教学具有重要意义。

Description

一种动物眼球病理切片制作方法

技术领域

本发明涉及一种动物标本制作方法，特别是一种动物眼球病理切片制作方法，属于生命科学技术领域。

背景技术

动物标本是指经过人工加工制作，用于展示动物特定组织的微观形貌的特殊科研或教学用具。现有技术对于普通的动物病理切片制作经验较为丰富，其整体制作过程也形成了一些较为规范化的操作流程，但是对于某些特殊的动物组织或器官，由于其他形态结构的特点，导致一般标本制备方法难以满足相应组织或器官的制作要求，无法获得令人满意的动物切片标本样品。

在对组织或器官进行脱水处理的时候，由于病理切片本身复杂的结构形态及成分组成，组织切片处理过程中非常容易出现切片变形，导致病理切片结构形貌变形，无法满足原始的研究或教学目的。现有技术主要通过将病理组织包埋在石蜡块中，利用石蜡对于组织固定支撑，以确保制备的病理组织切片结构完整满足研究或教学的需求。

眼球是一个结构复杂特殊器官，其结构精细，内部存在空腔结构，内部各种组织部分的软硬度相差甚多，巩膜结构致密，视网膜柔软极易脱落，晶体坚硬，玻璃体为胶状组织易丢失。由于眼球独特的结构性质，在制作病理切片的时候，石蜡块包埋是比较困难的，石蜡不容易进入到眼球内部，也就无法形成有效的支撑作用，限制最终的切片工艺实施，容易出现固定不充分、组织变形及丢失的问题。

中国专利CN110823663A公开一种动物眼球病理切片制作方法，该专利通过将眼球摘取以后，经过剪断附属肌肉，分离出眼球；然后将眼球放入4℃固定液中进行固定48小时；再经过乙醇脱水处理，实现脱水透明；进而将眼球用浸蜡包埋处理，利用石蜡分两次进行包埋；最后按照一定厚度进行切片处理。尽管该专利在一定程度上改进了眼球石蜡切片的制作方法，但仍然存在周期长、材料及步骤要求繁琐等缺点。且该专利方法仅注重了视网膜结构的完整保留，并未展示眼球整体结构的完整性，如晶状体、玻璃体等眼球组件的完整性。

另外，对于病理切片通常期望制备得到具有连续特性的病理切片，能够更好地观察组织或器官病变过程，为科研及临床治疗提供理论指导。常规病理切片工艺方法能够获得的切片较厚，且切片间隔距离较远，对于局部细节观察精度有限，无法对眼球病变发生过程精确研究，不利于临床病理诊断或学生对于眼球病理组织立体结构知识积累。

因此，非常有必要研究标准且高效的眼球病理切片制作方法，又快又好的制备切片标本，得到连续且完整的眼球结构病理切片，为眼科相关科研及临床治疗提供理论指导。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术存在眼球组织易变形、丢失，病理切片较厚，无法形成连续的高精度切片问题，提供一种动物眼球病理切片的制作方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种动物眼球病理切片制作方法，包括以下步骤：

S1、眼球摘取：摘取动物眼球并保留3-8mm视神经，使用生理盐水冲洗除去血污；

S2、微波处理：将动物眼球置于生理盐水中，然后用微波炉中火加热处理4-12min；

S3、眼球固定：将冰醋酸、氯仿和甲醇按照体积比冰醋酸：氯仿：甲醇＝1：2-4：8-12的比例混合，配制成固定液；将动物眼球放入固定液中，固定60-90h；

S4、脱水透明：将动物眼球用正丁醇脱水2-4次，每次0.5-3小时；然后，将动物眼球用二甲苯透明2-4次，每次10-20min，二甲苯透明处理总时长30-50min；

S5、浸蜡包埋：将动物眼球依次进行以下处理：第一次石蜡处理1-2h，第二次石蜡处理1-2h，处理后进行石蜡包埋；

S6、切片：按照设定厚度进行切片。

本发明动物眼球病理切片制作方法结合动物眼球结构特点，采用不同于常规病理切片的制备方法，保留一定的动物眼球视神经，便于观察研究。摘取的动物眼球先经过微波处理，使得眼球上的肌肉、结缔组织等结构发生蛋白变性，具有更好的结构强度、韧性，眼球内部的组织，如玻璃体为半固体状态，通过微波加热可以快速固定并保证视网膜各层结构贴合更加紧密，进而可以进行下一步的加工处理。

然后，本发明病理切片制作方法待动物眼球内部固定液充分渗透以后，利用正丁醇进行脱水处理，分多次脱水。不同于一般组织采用乙醇梯度脱水处理，本发明结合动物眼球组织空心结构成分特性，使用正丁醇进行脱水，正丁醇脱水相比于无水乙醇脱水具有高效性、动物眼球形貌保持更佳的优势，特别是经过微波处理的眼球组织采用正丁醇脱水效率更高，这可能与微波处理过程造成组织蛋白变性有关，正丁醇脱水后组织的形貌完整性更好，变形更小。如果采用传统的无水乙醇和二甲苯进行脱水透明，那么存在过程繁琐且对组织收缩影响较大的问题。使用正丁醇脱水可以很好地避免视网膜等结构在脱水固定过程中发生收缩变形。

另外，传统工艺采用无水乙醇脱水处理还存在导致组织脆化的问题，如果无水乙醇浸泡时间过长，则容易出现眼球组织结构脆化，进而切片困难的问题。本发明利用正丁醇进行脱水透明，很好地保持眼球组织柔软性，并增加组织结构的软化特性，使得眼球组织韧性增加、脆性减少。即使使用正丁醇脱水透明的时间延长，也不至于组织发生收缩变脆，很大程度简化了操作步骤，标本处理时间容易控制。因此，提高了本发明动物眼球病理切片制作的容错率，实验员更容易成功实现良好的眼球脱水处理效果。

重复多次正丁醇脱水直到眼球完全下沉，完成脱水，使得动物眼球稳定性提升，便于后续石蜡处理，获得适宜石蜡包埋的预处理效果。石蜡包埋好后，对动物眼球切片即可得到令人满意的动物眼球组织切片成品，可以通过简单工艺方法实现超薄切片且结构稳定、无变形，得到易于观察的动物眼球组织切片，对于科学研究或教学而言都是具有重大意义。

进一步，步骤S1中，优选地，迅速用镊子摘取眼球，以免摘取时间过长导致动物眼球变形。优选用镊子摘取眼球的总时长不超过5min，更优选摘取眼球时长不超过2min。

优选地，动物眼球保留3-6mm视神经，如保留大约4mm或5mm的视神经。

优选地，步骤S1中，分离出眼球后，用生理盐水洗去血污。生理盐水冲洗可以避免纯净水渗透压差异造成眼球结构变形，更有利于维持眼球结构的原始形貌。

进一步，步骤S2中，用微波炉中火加热处理的微波功率为400-500瓦特，优选地，时间为4-8min，更优选4-7min，例如5min、5.5min、6min。

优选地，步骤S2中，生理盐水的用量为动物眼球的20-60倍。优选地，生理盐水能够浸没眼球，确保动物眼球充分浸没在生理盐水中，避免暴露在空气中的部分受到微波加热处理的强度过高。

进一步，步骤S3中，按照体积比冰醋酸：氯仿：甲醇＝1:2.5-3.5:9-11配制得到固定液。更优选地，按照体积比冰醋酸：氯仿：甲醇＝1:3:10配制得到固定液。

优选地，将动物眼球放入固定液中，室温固定。即动物眼球放入室温的固定液中进行固定，所述室温是指15-30℃范围内的自然温度，固定液不采取额外的加热或冷却处理。

优选地，将动物眼球置于20-60倍体积的固定液中，室温固定72h；优选将动物眼球置于20-40倍体积固定液中。

更优选地，取冰醋酸20ml、氯仿60ml和甲醇120ml，混合均匀，得到固定液；然后将动物眼球放入固定液中，固定70-75h。

进一步，步骤S3中，动物眼球在固定液中处理完成后，还包括取出动物眼球进行冲洗处理。

优选地，冲洗眼球的具体方法如下：从固定液中小心取出动物眼球(如小鼠眼球)，流水冲洗1-3h，优选冲洗2h。取出动物眼球(如小鼠眼球)的时候，谨慎操作，以防动物眼球损坏。

更优选地，冲洗眼球时，将动物眼球组织置于广口瓶中，瓶口罩纱布并用线系牢，置接有橡皮管的自来水龙头下，橡皮管插入瓶内，让水从瓶底向上缓慢溢出。使用的橡皮管一端连接水龙头，另一端插入瓶子内。优选地，水洗时水流的速度不要快，以免破坏组织的完整性。流水洗涤的目的是为了去除组织中结合的固定液及沉淀物，避免组织中留有较多的固定液而妨碍脱水，甚至在组织中生成沉淀物或结晶而影响染色和结果。

进一步，步骤S4，将动物眼球用正丁醇脱水3次，每次1-3h，最优选每次1-2h，例如1h、1.5h。

脱水透明主要处理针对眼球视杯部分进行脱水透明，需要较长时间实现眼球的品质优化改善提升。和常规脱水处理工艺方法不同的，本发明针对眼球的特性采用正丁醇进行脱水透明，并且分成数次完成脱水透明处理，提高了脱水的效率，避免脱水渗透分离的杂质成分和正丁醇溶液形成浑浊溶液，对于动物眼球造成不利的影响。优选地，正丁醇脱水处理总时长3-5小时。

优选地，步骤S4，将动物眼球用二甲苯透明3次，每次13-20min，优选每次15min。透明过程中，特别要掌握好透明的时间，既要完全透明，又不可过度，优选二甲苯透明处理总时长约30-40min为宜。

优选地，透明过程中，如果眼球完全下沉，说明液体已完全渗透入组织中，则透明完成。

进一步，步骤S5中，浸蜡包埋过程中采用了两次石蜡处理，通过分次浸蜡处理，可以避免石蜡中混入二甲苯过多导致组织发硬，有利于保持组织内部结构形貌。

进一步，步骤S5中，浸蜡包埋前，先用软蜡预浸泡10-50min；所述软蜡由二甲苯和石蜡按照重量比1：0.8-1.2比例混合而成。

进一步，步骤S5中，石蜡包埋过程中石蜡温度为55-60℃。优选地，石蜡温度56-60℃，浸蜡温度略高于常规操作，更有利于脱水透明后残留在组织间的正丁醇分子和石蜡进行置换，确保浸蜡处理的效果。

进一步，步骤S5中，石蜡包埋完成后，冷却，进行修整、切片，或者2-6℃保存备用。

进一步，步骤S6中，切片采用轮转式石蜡切片机进行切片。

进一步，步骤S6中，切片过程中，切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，沿视神经上下方，从角膜顶点至球壁后极，平行于视神经矢状轴连续切4μm厚的切片。

进一步，还包括步骤S7，封片：将切片后的样本中载玻片上展开；然后进行脱蜡、反水、HE染色处理，最后用中性快干胶封片。所得封片即可作为用于科研或教学用途的薄片样本。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明动物眼球石蜡切片工艺方法主要结合动物眼球结构特点，采用适宜的预处理工艺方法，使得动物眼球组织形貌能够得到更好的保留，对于动物眼球细微结构的精确研究和教学具有重要意义。

2、本发明方法制作动物眼球病理切片的时候，采用微波处理眼球，使得眼球结构蛋白变性实现眼球结构强度预增强，获得更优质的动物眼球初始状态。

3、本发明方法针对动物眼球结构特点，使用特殊配制的固定液(冰醋酸、氯仿、甲醇混合溶液)固化完成后，进行缓慢冲洗处理，充分清除残留药液和沉淀物，防止沉淀物或固化液残留对于脱水透明的影响，更好的控制眼球各个部位脱水透明的效果，使得制成的动物眼球切片结构更加完整，观感更好。

4、本发明方法采用正丁醇进行脱水处理，配合微波处理动物眼球所致蛋白变性的特点，利用正丁醇实现高效充分脱水处理，确保动物眼球制备切片的性能更佳。最终制得动物眼球切片品质更高，可观察性更优。

附图说明：

图1是摘取小鼠的动物眼球。

图2是将动物眼球进行微波处理。

图3是配制得到的眼球固定液。

图4是将动物眼球经过双蒸水洗涤后放入正丁醇中脱水。

图5是(左)拭镜纸包裹后放入包埋盒中，(右)用二甲苯透明处理。

图6是将动物眼球放入包埋盒中，进行浸蜡包埋。

图7是HE染色处理后的连续切片整体图

图8是实施例1制备的动物眼球切片显微镜下的视网膜结构图。

图9是图8所示动物眼球切片显微镜下视网膜10倍放大图。

图10是图8所示动物眼球切片显微镜下视网膜40倍放大图。

图11是对比例1结合传统中性甲醛固定方法制备得到切片HE染色图像。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

首先，本发明实施例中应用的仪器设备和主要试剂来源信息如下：甲醇(成都市科龙化工试剂厂)；氯仿(成都市科龙化工试剂厂)；冰醋酸(成都市科龙化工试剂厂)；正丁醇(成都市科龙化工试剂厂)；二甲苯(成都市科龙化工试剂厂)；中性甲醛(成都市科龙化工试剂厂)；乙醇(成都市科龙化工试剂厂)；BM-Ⅸ生物组织包埋机(湖北省孝感市宏业医用仪器有限公司)；LEICARM2245轮转式石蜡切片机(德国Leica公司)；Harris苏木精(广州市秀成贸易有限公司)。

以下各个实施例中，所有的动物实验均在医学伦理委员会批准的情况下进行动物手术。

实施例1动物眼球病理切片制作

如图1-图7所示，小鼠眼球病理切片制作。摘取动物眼球并保留6mm视神经，使用生理盐水冲洗除去眼球表面血污。然后，将摘取的动物眼球置于生理盐水中，然后用微波炉中火加热处理5min。

取冰醋酸20ml、氯仿60ml、甲醇120ml，混合配制成固定液。将眼球置于50mL固定液中，室温18-22℃固定72h。从固定液取出小鼠眼球，流水冲洗2h，冲洗时将眼球组织置于广口瓶中，瓶口罩纱布并用线系牢，置接有橡皮管的自来水龙头下，橡皮管的出水端插入瓶内，让水从瓶底向上缓慢溢出。冲洗时水流的速度不要太快，以免破坏组织的完整性。

冲洗干净后，将动物眼球放入正丁醇中脱水三次，每次1小时。然后用二甲苯透明三次，每次15min，透明处理总时长45min；当动物眼球在正丁醇溶液中完全下沉时即可。

再然后，将动物眼球依次用下列试剂处理：第一次石蜡处理1小时，第二次石蜡处理1小时，处理后进浸蜡包埋。将石蜡加热到58℃，将动物眼球放入石蜡中，完成石蜡包埋。

最好，按照设定厚度，采用轮转式切片机进行切片，得到动物眼球切片样本。制备得到的动物眼球样本，切片厚度4μm，平均厚度4μm，切片完整性良好。

切片完成后，将小鼠眼球病理切片拍照如图8-图10所示，可见小鼠眼球石蜡切片在显微镜下视网膜结构清晰、完整，经过放大以后，可以观察到眼球各层清晰的结构。最重要的是，眼球各层结构保留原始形貌，满足科研分析要求。

对比例1(传统法乙醇脱水)

动物眼球病理切片制作：采用与实例12相同的工艺方法进行动物眼球病理切片制备，区别仅在于：摘取的动物眼球用10％中性甲醛固定，脱水过程中不使用正丁醇脱水处理，改用传统的乙醇梯度脱水处理。结果发现使用乙醇脱水效果不佳，需要反复多次更换乙醇溶液。具体的，使用传统方法梯度乙醇脱水处理程序如下：65％乙醇脱水1次，每次1小时；75％乙醇脱水1次，每次1小时；85％乙醇脱水1次，每次1小时；95％乙醇I脱水1次，每次1小时；95％乙醇II脱水1次，过夜；无水乙醇I脱水1次，每次0.5小时；无水乙醇II脱水1次，每次1小时；无水乙醇III脱水1次，每次1小时。

结果发现梯度乙醇脱水程序进行至95％乙醇脱水的时候，眼球出现明显变形，对于病理切片的准确性有显著干扰影响。而且，乙醇脱水后，眼球组织出现脆性增加问题，在切片过程中，多次出现切片破碎断裂的情况，故乙醇脱水处理工艺对于眼球病理切片的制作是不适用的。

制备得到的动物眼球病理切片如图11所示，眼球切面上可以观察到组织结构变形，不利于病理切片的综合展示。

实施例2-7动物眼球病理切片制作

和实施例1采用相同方法制备动物眼球病理切片，区别仅在于摘取动物眼球以后，用微波炉中火加热处理的强度不同。本实施例用微波炉小火、中火、大火加热4-10分钟，然后按照和实施例1相同的工艺方法进行加工处理，最终制备得到动物眼球切片，结果如下表所示。

表1微波处理强度对于动物眼球切片形貌的影响

实施例	火力大小	处理时长	处理效果	切片完整性
					2	中火	4min	形态良好	完整
3	中火	10min	形态良好	完整
					4	小火	4min	形态一般	少量缺损
5	小火	10min	形态一般	少量缺损
					6	大火	4min	形态欠佳	完整
7	大火	10min	形态欠佳	完整

通过比较不同的微波处理火力大小、时长，我们发现中火加热处理制备得到的动物眼球样本，切片厚度4μm，平均厚度4μm，切片完整性良好。由此可见，制备动物眼球由于微波处理的功率、时间差异，导致组织最终切片组织形态差异，完整性存在差异，选择适宜的微波处理强度和处理时间有利于获得更好的动物眼球切片品质。

查阅微波炉设备参数，确定微波炉中火处理时，实际微波功率约为400-500瓦特，故优选微波处理功率为400-500瓦特，微波处理时长4-10分钟，最好是4-8分钟。

实施例8-11动物眼球病理切片制作

摘取动物眼球并保留6mm视神经，使用生理盐水冲洗除去血污。然后，将摘取的动物眼球置于生理盐水中，然后用微波炉中火加热处理5min。

取冰醋酸20ml、氯仿60ml、甲醇120ml，混合配制成固定液。将眼球置于50mL固定液中，室温固定72h。从固定液取出小鼠眼球，流水冲洗2h，冲洗时将组织置广口瓶中，瓶口罩纱布并用线系牢，利用纱布将眼球限制于广口瓶中。将广口瓶置接有橡皮管的自来水龙头下，橡皮管插入瓶内，让水从瓶底向上缓慢溢出。水流的速度不要太快，以免破坏组织的完整性。

固定完成后，将动物眼球依次正丁醇脱水4次脱水透明，每次40min；然后，用二甲苯透明3次，每次12min，透明处理总时长36min；当动物眼球在正丁醇溶液中完全下沉时即完成二甲苯透明处理。

将处理过的动物眼球先用软蜡浸泡30min；所述软蜡由二甲苯和石蜡按照重量比1：0.8-1.2比例混合而成。然后，进行两次浸蜡包埋：第一次石蜡处理1h，第二次石蜡处理2h，处理后进石蜡包埋。

采用轮转式石蜡切片机，按照设定厚度进行切片，切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，沿视神经上下方，从角膜顶点至球壁后极，平行于视神经矢状轴连续切4μm厚的切片，切片后的样本中载玻片上展开。

最后，进行脱蜡、反水、HE染色处理，用中性快干胶封片，得到动物眼球切片样本。

制备得到的动物眼球切片样本，切片厚度4μm，平均厚度4μm，切片完整性：完整，切片形态良好且切片显微镜下清晰度优秀。

分别尝试采用几种不同的脱水透明工艺参数，比较正丁醇脱水处理的次数、时长对于动物眼球病理切片制作的效果影响。

实施例	正丁醇脱水次数	每次脱水时长	处理效果	切片完整性
					8	2	1	形态良好	组织完整
9	3	2	形态优秀	组织完整、清晰度良好
					10	3	3	形态优秀	组织完整、清晰度良好
11	4	3	形态良好	组织完整

制备得到的动物眼球切片样本，切片厚度4μm，平均厚度4μm，切片完整性良好。更优选正丁醇脱水处理3次，每次1-3小时。

实施例12动物眼球病理切片制作

摘取动物眼球并保存6mm视神经，使用生理盐水冲洗除去血污。将摘取的动物眼球置于生理盐水中，然后用微波炉中火加热处理6min。

取冰醋酸20ml、氯仿60ml、甲醇120ml，混合配制成固定液。将眼球置于50mL固定液中，室温固定72h。从固定液取出小鼠眼球，流水冲洗2h，冲洗时将组织置广口瓶中，瓶口罩纱布并用线系牢，橡皮管一端连接自来水龙头，橡皮管另一端插入瓶内，让水从瓶底向上缓慢溢出。水流溢流速度缓慢持续，避免破坏眼球组织。

冲洗干净后，将动物眼球依次正丁醇脱水3次脱水透明，每次1.5小时；然后，用二甲苯透明3次，每次15min，透明处理总时长45min。当动物眼球在正丁醇溶液中完全下沉时即可。

将处理过的动物眼球，用软蜡浸泡10-50min；所述软蜡由二甲苯和石蜡按照重量比1：0.8-1.2比例混合而成。然后，进行两次石蜡包埋：第一次石蜡处理1h，第二次石蜡处理1.5h，处理后进浸蜡包埋。

石蜡包埋完成后按照设定厚度，采用LEICARM2235轮转式切片机进行切片，切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，沿视神经上下方，从角膜顶点至球壁后极，平行于视神经矢状轴连续切4μm厚的切片。得到动物眼球切片样本，在载玻片上展开；然后进行脱蜡、反水、HE染色处理，最后用中性快干胶封片。

制备得到的动物眼球切片样本，切片厚度4μm，平均厚度4μm，切片完整性切面清晰完整。

实施例13-19动物眼球病理切片制作

和实施例12采用相同的工艺方法进行动物眼球病理切片制备，区别仅在于浸蜡包埋的过程不同，分别比较采用1-4石蜡处理的方式处理，每次石蜡处理时长30-60分钟，温度58-60℃的情况下，浸蜡包埋处理的效果差异，结果如下表所示。

实施例	浸蜡次数	浸蜡时长/min	浸蜡温度/℃	处理效果	切片完整性
						13	1次	60	60	形态良好	一般
14	2次	60	58	形态良好	组织完整
						15	2次	30	58	形态良好	组织完整
16	3次	60	58	形态良好	组织完整
						17	3次	30	58	形态良好	组织完整
18	4次	60	58	形态良好	组织完整
						19	4次	30	58	形态良好	组织完整

通过比较不同的浸蜡工艺参数，选择两次石蜡处理及石蜡温度56-60℃，浸蜡温度略高于常规操作工艺参数对于动物眼球类病理切片的制作更为有利，这主要是因为更有利于脱水透明后残留在组织间的正丁醇分子和石蜡进行置换，确保浸蜡处理的效果，和动物眼球独特的结构特点有密切关系。通过选择2-3次以上的石蜡处理，有利于保证切片的完整性，确保眼球各层结构紧密结合，另外当石蜡处理超过3次以后，切片品质基本无差异。

实施例20动物眼球病理切片制作

本实施例和实施例12采用相同的工艺方法进行动物眼球病理切片制备，区别仅在于：切片过程中，切片刀平面与组织切面间呈10°、15°、20°、30°左右的夹角，比较不同的夹角对于切片的效果的影响。

比较不同的切面角度，结果发现，不同角度切片制作影响较小，基本上都可以保证动物眼球切片的制作需求。仔细分析发现，由于眼球晶体的硬度更高，采用约15°角度进行切片会更有利于刀片和眼球的作用力度方向，是的眼球切片厚度稳定，避免刀片侧向作用力导致动物眼球切片厚度波动或变形破碎。

实施例21动物眼球病理切片制作

实施例12采用相同的工艺方法进行动物眼球病理切片制备，区别仅在于：固定完成后对眼球不进行冲洗处理。结果发现组织各个部位脱水透明效果不一致，由于沉淀物或固化液残留对于脱水透明的影响导致制片组织形态欠佳，结构完整性较差，故应对固定后的眼球进行充分的冲洗处理。

实施例22动物眼球病理切片制作

本实施例和实施例12采用相同的工艺方法进行动物眼球病理切片制备，区别仅在于：动物眼球在固定液中处理完成后，将眼球进行冲洗的时候，直接在水龙头下进行冲洗。结果发现水流强度不易控制，偶有眼球并高压水流冲刷导致眼球表面眼膜变形。故优选眼球在固定液中处理完成后，放入广口瓶中，用纱布罩住瓶口，然后将橡皮管插入瓶内，利用流水溢流的方式清洁眼球。另外，如果不对动物眼球进行冲洗，则眼球在固定液中作用产生的污垢会影响正丁醇脱水效果，造成脱水不均匀。

本申请所引用的各专利、专利申请和出版文的说明全部纳入本申请参考。引用的任何参考文献不应认为是允许这些参考文献可以用来作为本申请的“现有技术”。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、眼球摘取：摘取动物眼球并保留3-8mm视神经，使用生理盐水冲洗除去血污；

S2、微波处理：将动物眼球置于生理盐水中，然后用微波炉中火加热处理4-12min；

S3、眼球固定：将冰醋酸、氯仿和甲醇按照体积比冰醋酸：氯仿：甲醇=1：2-4：8-12的比例混合，配制成固定液；将动物眼球放入固定液中，固定60-90h；动物眼球在固定液中处理完成后，还包括取出动物眼球进行冲洗处理；

S4、脱水透明：将动物眼球用正丁醇脱水2-4次，每次0.5-3小时；然后，将动物眼球用二甲苯透明2-4次，每次10-20min，二甲苯透明处理总时长30-50min；

S5、浸蜡包埋：将动物眼球依次进行以下处理，第一次石蜡处理1-2h，第二次石蜡处理1-2h，处理后进行石蜡包埋；

S6、切片：按照设定厚度进行切片。

2.根据权利要求1所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，步骤S2中，用微波炉中火加热处理的微波功率为400-500瓦特。

3.根据权利要求1所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，步骤S2中，用微波炉中火加热处理时间为4-8min。

4.根据权利要求1所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，步骤S2中，生理盐水的用量为动物眼球的20-60倍。

5.根据权利要求1所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，步骤S3中，按照体积比冰醋酸：氯仿：甲醇=1:2.5-3.5:9-11配制得到固定液。

6.根据权利要求1所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，冲洗眼球的具体方法如下：从固定液中小心取出动物眼球，流水冲洗1-3h。

7.根据权利要求6所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，冲洗眼球时，将动物眼球组织置于广口瓶中，瓶口罩纱布并用线系牢，置接有橡皮管的自来水龙头下，橡皮管插入瓶内，让水从瓶底向上缓慢溢出。

8.根据权利要求1所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，步骤S4，将动物眼球用正丁醇脱水3次，每次1-3h。

9.根据权利要求1所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，步骤S4，将动物眼球用二甲苯透明3次，每次13-20min。

10.根据权利要求9所述动物眼球病理切片制作方法，其特征在于，透明过程中，如果眼球完全下沉，说明液体已完全渗透入组织中，则透明完成。

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