CN110987573A - 一种脑组织固定液及其制备方法、应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑组织固定液及其制备方法、应用方法，脑组织固定液的制备方法：将甲醛45～55份、氯化钠3～5份、甘油30～40份及蒸馏水200～300份超声混合均匀得a液；将甲醇26～34份、乙醇120～140份及叔丁醇46～58份充分混合均匀得b液；将a液与b液超声混合均匀得到脑组织固定液。脑组织的固定方法：将脑组织样品冷冻切片，得到脑组织冷冻切片；将脑组织冷冻切片室温静置20～40s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；将固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。采用本发明中技术方案能够保持细胞的基本形态正常，使细胞不发生明显收缩，同时使脑组织具有很好的染色性能，染色后组织结构清晰，细胞核染色鲜艳。
Description
技术领域
本发明涉及了生物技术领域，具体的是一种脑组织固定液及其制备方法、应用方法。
背景技术
随着医疗技术水平的提高，许多脑肿瘤得到明确的诊断并进行外科治疗，而脑组织冷冻切片技术和正确的病理诊断是外科手术的有力保障。冷冻切片时将脑组织冷冻后快速切片、染色的一种制片方法。而对脑组织的固定是是制备脑组织冷冻切片的关键。
脑组织中通常会含有一定量的水。脑组织中水的含量过高会导致其脆性较大，容易破碎，难以制片。传统的脑组织固定液其脱水效果较差。对于一些含水量较高的脑组织如婴儿脑组织，其处理效果较差。
因此，有必要对现有技术中的脑组织固定液以及脑组织固定方法进行进一步的改进，已能够达到更好的固定处理效果。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种脑组织固定液及其制备方法、应用方法，其能够保持细胞的基本形态正常，使细胞不发生明显收缩，同时使脑组织具有很好的染色性能，染色后组织结构清晰，细胞核染色鲜艳，核浆对比好。
本发明公开了一种脑组织固定液，以重量份计，包括以下成分：
甲醛45～55份、
甲醇26～34份、
氯化钠3～5份、
乙醇120～140份、
叔丁醇46～58份、
甘油30～40份、
蒸馏水200～300份。
本发明还公开了一种脑组织固定液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将甲醛45～55份、氯化钠3～5份、甘油30～40份及蒸馏水200～300份超声混合均匀得a液；
步骤二：将甲醇26～34份、乙醇120～140份及叔丁醇46～58份充分混合均匀得b液；
步骤三：将步骤一中的a液与步骤二中的b液超声混合均匀得到脑组织固定液。
作为优选，步骤一中超声混合的超声波功率200W，超声时间10～15min，混合温度为室温。
作为优选，步骤三中超声混合的超声波功率300W，超声时间20～25min，混合温度为30℃。
本发明同时公开了一种脑组织的固定方法，包括以下步骤：
步骤一：将脑组织样品置于冷冻切片机中，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片；
步骤二：将步骤一中得到的脑组织冷冻切片室温静置20～40s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
步骤三：将步骤二中固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成
作为优选，步骤一中所述冷冻切片机的控制条件为：箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃。
作为优选，步骤一中脑组织冷冻切片的厚度为5～8μm。
本发明的有益效果如下：
本发明制备的脑组织固定液以及脑组织固定方法具有很好的固定效果，其能够保持细胞的基本形态正常，使细胞不发生明显收缩，同时使脑组织具有很好的染色性能，染色后组织结构清晰，细胞核染色鲜艳，核浆对比好。
本发明添加了甲醇，甲醇具有较强的渗透力和迅速沉淀蛋白的作用，使脑组织细胞能够快速着色，同时甲醇对脑组织细胞内的水分具有一定的吸附作用，降低了冰晶的出现率。
本发明添加了甘油和叔丁醇，甘油具有亲水性和脱水作用，所固定的组织比较柔韧，具有很好的防碎效果。叔丁醇不会使组织收缩或变硬，同时具有很好的脱水性，尤其是与本发明中的乙醇混合好，效果更佳。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1～5以及对比例1中的染色方法均采用HE染色。
实施例1
制备脑组织固定液：
将甲醛55份、氯化钠3份、甘油40份以及蒸馏水200份超声混合均匀得a液，其中超声波功率200W，超声时间15min，混合温度为室温；
将甲醇26份、乙醇140份以及叔丁醇46份充分混合均匀得b液；
将a液与b液超声混合均匀得到脑组织固定液，其中超声波功率300W，超声时间25min，混合温度为30℃。
脑组织的固定：
将脑组织样品置于冷冻切片机中，控制箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片，脑组织冷冻切片的厚度为5μm；
将得到的脑组织冷冻切片室温静置40s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
将固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。
实施例2
制备脑组织固定液：
将甲醛45份、氯化钠5份、甘油30份以及蒸馏水300份超声混合均匀得a液，其中超声波功率200W，超声时间10min，混合温度为室温；
将甲醇34份、乙醇120份以及叔丁醇58份充分混合均匀得b液；
将a液与b液超声混合均匀得到脑组织固定液，其中超声波功率300W，超声时间20min，混合温度为30℃。
脑组织的固定：
将脑组织样品置于冷冻切片机中，控制箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片，脑组织冷冻切片的厚度为8μm；
将得到的脑组织冷冻切片室温静置20s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
将固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。
实施例3
制备脑组织固定液：
将甲醛52份、氯化钠3.5份、甘油38份以及蒸馏水240份超声混合均匀得a液，其中超声波功率200W，超声时间14min，混合温度为室温；
将甲醇28份、乙醇135份以及叔丁醇50份充分混合均匀得b液；
将a液与b液超声混合均匀得到脑组织固定液，其中超声波功率300W，超声时间24min，混合温度为30℃。
脑组织的固定：
将脑组织样品置于冷冻切片机中，控制箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片，脑组织冷冻切片的厚度为6μm；
将得到的脑组织冷冻切片室温静置35s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
将固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。
实施例4
制备脑组织固定液：
将甲醛48份、氯化钠4.5份、甘油32份以及蒸馏水260份超声混合均匀得a液，其中超声波功率200W，超声时间12min，混合温度为室温；
将甲醇32份、乙醇125份以及叔丁醇54份充分混合均匀得b液；
将a液与b液超声混合均匀得到脑组织固定液，其中超声波功率300W，超声时间22min，混合温度为30℃。
脑组织的固定：
将脑组织样品置于冷冻切片机中，控制箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片，脑组织冷冻切片的厚度为7μm；
将得到的脑组织冷冻切片室温静置25s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
将固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。
实施例5
制备脑组织固定液：
将甲醛50份、氯化钠4份、甘油36份以及蒸馏水250份超声混合均匀得a液，其中超声波功率200W，超声时间13min，混合温度为室温；
将甲醇30份、乙醇130份以及叔丁醇52份充分混合均匀得b液；
将a液与b液超声混合均匀得到脑组织固定液，其中超声波功率300W，超声时间23min，混合温度为30℃。
脑组织的固定：
将脑组织样品置于冷冻切片机中，控制箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片，脑组织冷冻切片的厚度为6μm；
将得到的脑组织冷冻切片室温静置30s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
将固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。
对比例1
本对比例与实施例5的区别在于不含甘油和叔丁醇。具体如下：
制备脑组织固定液：
将甲醛50份、氯化钠4份以及蒸馏水250份超声混合均匀得a液，其中超声波功率200W，超声时间13min，混合温度为室温；
将甲醇30份、乙醇130份充分混合均匀得b液；
将a液与b液超声混合均匀得到脑组织固定液，其中超声波功率300W，超声时间23min，混合温度为30℃。
脑组织的固定：
将脑组织样品置于冷冻切片机中，控制箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片，脑组织冷冻切片的厚度为6μm；
将得到的脑组织冷冻切片室温静置30s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
将固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。
将实施例1～5和对比例1中染色后的脑组织冷冻切片进行性能检测，结果如下：
| 细胞收缩程度 | 染色质量 | |
| 实施例1 | 细胞基本形态正常，轻微收缩 | 组织结构较清晰，核浆着色不鲜艳 |
| 实施例2 | 细胞基本形态正常，轻微收缩 | 组织结构较清晰，核浆着色不鲜艳 |
| 实施例3 | 细胞基本形态正常，无明显收缩 | 组织结构清晰，染色质略模糊 |
| 实施例4 | 细胞基本形态正常，无明显收缩 | 组织结构清晰，染色质略模糊 |
| 实施例5 | 细胞基本形态正常，无明显收缩 | 组织结构清晰，细胞核染色鲜艳，核浆对比好 |
| 对比例1 | 多处明显收缩 | 染色质模糊不清 |
由上述表格中的检验结果可知，实施例5是本发明中最佳的实施方案，采用实施例5中的技术方案处理后的脑组织具有很好的固定效果，其能够保持细胞的基本形态正常，使细胞不发生明显收缩，同时使脑组织具有很好的染色性能，染色后组织结构清晰，细胞核染色鲜艳，核浆对比好。
本发明添加了甲醇，甲醇具有较强的渗透力和迅速沉淀蛋白的作用，使脑组织细胞能够快速着色，同时甲醇对脑组织细胞内的水分具有一定的吸附作用，降低了冰晶的出现率。
本发明添加了甘油和叔丁醇，甘油具有亲水性和脱水作用，所固定的组织比较柔韧，具有很好的防碎效果。叔丁醇不会使组织收缩或变硬，同时具有很好的脱水性，尤其是与本发明中的乙醇混合好，效果更佳。
对比例1中未添加甘油和叔丁醇，其处理效果不佳，主要是由于组织中存在大量的水分，影响了制片效果。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (7)
1.一种脑组织固定液，其特征在于，以重量份计，包括以下成分：
甲醛45～55份、
甲醇26～34份、
氯化钠3～5份、
乙醇120～140份、
叔丁醇46～58份、
甘油30～40份、
蒸馏水200～300份。
2.一种脑组织固定液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将甲醛45～55份、氯化钠3～5份、甘油30～40份及蒸馏水200～300份超声混合均匀得a液；
步骤二：将甲醇26～34份、乙醇120～140份及叔丁醇46～58份充分混合均匀得b液；
步骤三：将步骤一中的a液与步骤二中的b液超声混合均匀得到脑组织固定液。
3.根据权利要求2所述的脑组织固定液的制备方法，其特征在于，步骤一中超声混合的超声波功率200W，超声时间10～15min，混合温度为室温。
4.根据权利要求2所述的脑组织固定液的制备方法，其特征在于，步骤三中超声混合的超声波功率300W，超声时间20～25min，混合温度为30℃。
5.一种脑组织的固定方法，其采用如权利要求1或2所述的脑组织固定液，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将脑组织样品置于冷冻切片机中，使用OCT冷冻胶完全包裹组织，当脑组织及其表面OCT冷冻胶变硬后，进行切片，得到脑组织冷冻切片；
步骤二：将步骤一中得到的脑组织冷冻切片室温静置20～40s后，向脑组织冷冻切片中加入脑组织固定液，固定处理2min；
步骤三：将步骤二中固定好的脑组织冷冻切片进行染色，在10min内染色完成。
6.根据权利要求5所述的脑组织的固定方法，其特征在于，步骤一中所述冷冻切片机的控制条件为：箱体温度-18℃，制冷台样品头温度-16℃。
7.根据权利要求5所述的脑组织的固定方法，其特征在于，步骤一中脑组织冷冻切片的厚度为5～8μm。
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