CN107271241A - 一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：(1)配制高尔基银染溶液；(2)将待染色的神经组织浸泡在步骤(1)所述高尔基银染溶液中；(3)将浸泡好的神经组织置于含甘油10％～20％V/V、含蔗糖15％～20％W/V的甘油‑蔗糖混合溶液中进行脱水；(4)利用冰冻切片机将脱水后的神经组织进行切片。该冰冻切片方法采用含甘油10％～20％V/V、含蔗糖15％～20％W/V的甘油‑蔗糖混合溶液对银染神经组织进行脱水处理，降低了神经组织的硬度和脆性，增强了其韧性，所制得的神经组织切片质量好，切片完整，有效减少了切片破碎和粘刀的情况，并且成本低，不影响组织显影。
Description
技术领域
本发明涉及神经病理学组织切片技术领域，具体涉及一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法。
背景技术
已有的科学研究表明，神经元是大脑神经系统的结构单位和功能单位。神经元的基本结构包括细胞体和突起两部分；神经元的突起一般包括一条长而分支少的轴突和数条短而呈树枝状分支的树突；树突和轴突具有接受刺激并将冲动传入细胞体的功能。神经元由树突间神经突触连接构筑了复杂的神经网络，并由此来传递神经信号。
树突表面可见许多棘状突起，长约0.5μm～1.0μm，粗约0.5μm～2.0μm，称树突棘，是形成突触的部位，与突触可塑性直接相关。神经元结构中的胞体位置、树突以及树突棘形态和分布，是描述神经元的重要参数。观察神经元的树突及树突棘结构的改变，有助于深入地理解脑结构，对解释大脑复杂的功能基础和神经疾病的病变机理提供了直接证据。
在组织学染色领域，高尔基银染法是目前应用最为广泛的一种观察神经元形态的染色方法，可以用来分析神经元的树突结构和树突棘形态。其结果稳定，可重复性好，染色清晰，并且组织切片厚度在200μm左右时可以清晰的显示整个神经元树突的形态。
但是，该方法处理后的神经组织通常硬而脆，冰冻切片过程容易成碎片，通常需要使用振动切片。而振动切片相对于冰冻切片而言，不仅切片速度慢，存在刀痕而导致切片质量较差，而且应用范围窄，仅能对部分类型的组织标本进行切片，相当多种类的组织仍不能进行振动切片，需要冰冻切片。因此，目前装备有振动切片机的单位或实验室很少，而几乎所有的病理检查实验室或单位均装备有冰冻切片机。没有装备振动切片机的单位或实验室如果进行高尔基染色，只能购买成品的试剂盒，如FD公司和Hito公司提供可冰冻切片的高尔基银染试剂盒，但是售价昂贵，染色成本高。
发明内容
本发明的目的在于，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种切片质量好、成本低的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液；
(2)将待染色的神经组织浸泡在步骤(1)所述高尔基银染溶液中；
(3)将浸泡后的神经组织置于含甘油10％～20％(V/V)、含蔗糖15％～20％(W/V)的甘油-蔗糖混合溶液中进行脱水；
(4)利用冰冻切片机将脱水后的神经组织进行切片。
本发明使用含甘油10％～20％(V/V)、含蔗糖15％～20％(W/V)的甘油-蔗糖混合溶液对高尔基银染神经组织(浸泡高尔基银染溶液后的神经组织)进行脱水处理。甘油-蔗糖混合溶液的组成会对神经组织的硬度和脆性产生很大的影响。其中，若甘油含量过低会导致神经组织过脆，造成切片容易破碎，无法完整切片；甘油含量过高会导致神经组织过软，易于粘刀，不易将神经组织切片从刀片上分离；而蔗糖含量过高或过低均会导致神经组织过脆，不能完整切片。本发明通过在蔗糖溶液中加入甘油，并且控制甘油和蔗糖的组份含量，形成甘油-蔗糖混合溶液，甘油的加入可以有效地软化神经组织，增强神经组织的韧性。采用此组分配比的甘油-蔗糖混合溶液对神经组织进行浸泡，可以克服传统方法冰冻切片操作难、易碎片的缺点，获得切片完整的神经组织切片。
上述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，优选的，所述步骤(4)中，对神经组织进行切片后，将切片置于明胶包被的载玻片上，放置过夜，然后将放置过夜的切片依次进行氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树脂封片。通过上述步骤对切片进行显影、制片后即可直接用显微镜对神经组织进行观察。
上述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，优选的，所述步骤(3)中，所述脱水的时间为24h～72h。如果脱水时间过短可能会造成脱水不全，导致切片困难；但若脱水时间过长又可能会影响神经组织的染色。因此，本发明综合考虑切片效果和染色效果，选择上述的脱水时间。
上述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，优选的，所述步骤(4)中，所述神经组织为脑组织，所述冰冻切片机的切片温度为-18℃～-23℃，切片温度对切片的质量有较大影响，温度过高或过低有可能导致切片困难、卷片、碎片或神经组织粘在刀片上。通常情况下，冰冻切片机中的切片温度与组织种类有关，脑组织一般采用这个温度范围，实际工作中可根据环境和要求对切片温度进行微调。
上述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，优选的，所述步骤(4)中，所述切片的厚度为100μm～200μm。切片过薄会破坏神经元的完整性，不利于分析神经元的形态；若太厚，则切片和封片难度都很大，且同一切片上神经元层数太多，同样不利于分析神经元形态。
上述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，优选的，所述步骤(2)中，将待染色的神经组织浸泡在高尔基银染溶液中的具体过程为：将待染色的神经组织浸泡在高尔基银染溶液中，其中神经组织与高尔基银染溶液的体积比为1∶(4～6)，避光放置，浸泡12h～24h，然后更换高尔基银染溶液，继续浸泡7天～14天。浸泡时间短，深部组织染色的神经元可能过少，无法进行统计分析；而浸泡时间过长，可能浅表的组织染色神经元过多，无法分析单个神经元的形态。
上述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，优选的，所述步骤(1)中，所述高尔基银染溶液通过如下方法配制得到：将质量体积比浓度均为4％～6％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按照体积比1∶(0.8～1.2)∶(0.8～1.2)的比例混合，即得高尔基银染溶液。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明将高尔基银染神经组织置于含甘油10％～20％(V/V)、含蔗糖15％～20％(W/V)的甘油-蔗糖混合溶液中进行脱水，克服了传统方法冰冻切片操作难、易碎片，必须使用振动切片机的缺点，可以快速便捷的使用冰冻切片机进行切片，并且其染色效果与传统效果相当。通过本发明的方法得到的切片相比于传统的不脱水或仅采用蔗糖溶液脱水方法得到的切片，有效地降低了神经组织的硬度和脆性，增强了韧性，切片质量更好。本发明方法为神经元形态观察提供了一种便捷的新途径，为神经领域的临床分析和科学研究提供了一种质优价廉的获得切片手段。
附图说明
图1为本发明实施例1的切片结果照片。
图2为本发明实施例2的切片结果照片。
图3为本发明实施例3的切片结果照片。
图4为本发明对比例1的切片结果照片。
图5为本发明对比例2的切片结果照片。
图6为本发明对比例3的切片结果照片。
图7为本发明实施例1所得切片中大脑前额叶皮质锥体神经元的显微图(放大40倍)。
图8为本发明实施例1所得切片中海马CA区锥体神经元的显微图(放大100倍)。
图9为本发明实施例1所得切片中神经树突棘的显微图(放大400倍)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液：
将质量体积比浓度均为5％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按1∶1∶1的体积比配制成高尔基银染溶液，避光放置备用；
(2)准备神经组织样本：
将SD大鼠经过水合氯醛深度麻醉后，快速断头取脑，获得脑组织(神经组织)样本；
(3)神经组织样本浸染：
按照1∶5的体积比将脑组织侵入高尔基银染溶液中，避光放置，浸泡18h，更换高尔基银染溶液，继续浸泡10天；
(4)脱水：
取出浸泡后的脑组织，用纯水冲洗，然后放入甘油含量为10％(V/V)、蔗糖含量为15％(W/V)的甘油-蔗糖混合溶液中浸泡处理72h进行脱水，避光放置；
(5)切片：
采用德国制造的莱卡冰冻切片机对甘油-蔗糖混合溶液浸泡脱水后的脑组织进行切片，设定切片温度为-20℃，切片厚度为200μm，得到完整的神经组织切片，然后将神经组织切片置于明胶包被的载玻片上，避光放置过夜；
(6)显影、制片及观察：
将神经组织切片依次经过氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察(本实施例中采用的是日本制造的奥林巴斯EclipseSOi光学显微镜)。
本实施例的神经组织切片结果照片如图1所示，由图1可见其切片完整，无破碎和粘刀现象。该神经组织切片中大脑前额叶皮质锥体神经元的显微图(放大40倍)如图7所示，该神经组织切片中海马CA区锥体神经元的显微图(放大100倍)如图8所示，该神经组织切片中神经树突棘的显微图(放大400倍)如图9所示。由图7、图8和图9可见，神经元整体染色清晰，树突棘结构完整，细节清楚，足以满足临床病理分析以及实验研究要求，说明本实施例中的各个条件的设定都是合理可行的，采用本实施例的方法(甘油-蔗糖混合溶液中甘油含量为10％(V/V)、蔗糖含量为15％(W/V))处理高尔基银染组织可以使用冰冻切片机顺利切片，对于神经元的显影无任何不良影响，操作方便。
实施例2：
一种本发明的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液：
将质量体积比浓度均为5％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按1∶1∶1的体积比配制成高尔基银染溶液，避光放置备用；
(2)准备神经组织样本：
将SD大鼠经过水合氯醛深度麻醉后，快速断头取脑，获得脑组织(神经组织)样本；
(3)神经组织样本浸染：
按照1∶5的体积比将脑组织侵入高尔基银染溶液中，避光放置，浸泡18h，更换高尔基银染溶液，继续浸泡10天；
(4)脱水：
取出浸泡后的脑组织，用纯水冲洗，然后放入甘油含量为20％(V/V)、蔗糖含量为20％(W/V)的甘油-蔗糖混合溶液中浸泡处理72h进行脱水，避光放置；
(5)切片：
采用德国制造的莱卡冰冻切片机对甘油-蔗糖混合溶液浸泡脱水后的脑组织进行切片，设定切片温度为-20℃，切片厚度为200μm，得到完整的神经组织切片，然后将神经组织切片置于明胶包被的载玻片上，避光放置过夜；
(6)显影、制片及观察：
将神经组织切片依次经过氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察(本实施例中采用的是日本制造的奥林巴斯EclipseSOi光学显微镜)。
本实施例的神经组织切片结果照片如图2所示，由图2可见其切片完整，无破碎和粘刀现象。本实施例的甘油-蔗糖混合溶液中甘油含量为20％(V/V)、蔗糖含量为20％(W/V)。
实施例3：
一种本发明的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液：
将质量体积比浓度均为5％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按1∶1∶1的体积比配制成高尔基银染溶液，避光放置备用；
(2)准备神经组织样本：
将SD大鼠经过水合氯醛深度麻醉后，快速断头取脑，获得脑组织(神经组织)样本；
(3)神经组织样本浸染：
按照1∶5的体积比将脑组织侵入高尔基银染溶液中，避光放置，浸泡18h，更换高尔基银染溶液，继续浸泡10天；
(4)脱水：
取出浸泡后的脑组织，用纯水冲洗，然后放入甘油含量为15％(V/V)、蔗糖含量为17.5％(W/V)的甘油-蔗糖混合溶液中浸泡处理72h进行脱水，避光放置；
(5)切片：
采用德国制造的莱卡冰冻切片机对甘油-蔗糖混合溶液浸泡脱水后的脑组织进行切片，设定切片温度为-20℃，切片厚度为200μm，得到完整的神经组织切片，然后将神经组织切片置于明胶包被的载玻片上，避光放置过夜；
(6)显影、制片及观察：
将神经组织切片依次经过氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察(本实施例中采用的是日本制造的奥林巴斯EclipseSOi光学显微镜)。
本实施例的神经组织切片结果照片如图3所示，由图3可见其切片完整，无破碎和粘刀现象。本实施例的甘油-蔗糖混合溶液中甘油含量为15％(V/V)、蔗糖含量为17.5％(W/V)。
对比例1：
一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液：
将质量体积比浓度均为5％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按1∶1∶1的体积比配制成高尔基银染溶液，避光放置备用；
(2)准备神经组织样本：
将SD大鼠经过水合氯醛深度麻醉后，快速断头取脑，获得脑组织(神经组织)样本；
(3)神经组织样本浸染：
按照1∶5的体积比将脑组织侵入高尔基银染溶液中，避光放置，浸泡18h，更换高尔基银染溶液，继续浸泡10天；
(4)脱水：
取出浸泡后的脑组织，用纯水冲洗，然后放入甘油含量为25％(V/V)、蔗糖含量为20％(W/V)的甘油-蔗糖混合溶液中浸泡处理72h进行脱水，避光放置；
(5)切片：
采用德国制造的莱卡冰冻切片机对甘油-蔗糖混合溶液浸泡脱水后的脑组织进行切片，设定切片温度为-20℃，切片厚度为200μm，得到完整的神经组织切片，然后将神经组织切片置于明胶包被的载玻片上，避光放置过夜；
(6)显影、制片及观察：
将神经组织切片依次经过氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察(本实施例中采用的是日本制造的奥林巴斯EclipseSOi光学显微镜)。
本对比例的神经组织切片结果照片如图4所示，由图4可见其切片太软，出现卷片现象。本实施例的甘油-蔗糖混合溶液中甘油含量为25％(V/V)、蔗糖含量为20％(W/V)，甘油添加过多。
对比例2：
一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液：
将质量体积比浓度均为5％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按1∶1∶1的体积比配制成高尔基银染溶液，避光放置备用；
(2)准备神经组织样本：
将SD大鼠经过水合氯醛深度麻醉后，快速断头取脑，获得脑组织(神经组织)样本；
(3)神经组织样本浸染：
按照1∶5的体积比将脑组织侵入高尔基银染溶液中，避光放置，浸泡18h，更换高尔基银染溶液，继续浸泡10天；
(4)脱水：
取出浸泡后的脑组织，用纯水冲洗，然后放入甘油含量为20％(V/V)、蔗糖含量为25％(W/V)的甘油-蔗糖溶液中浸泡处理72h进行脱水，避光放置；
(5)切片：
采用德国制造的莱卡冰冻切片机对甘油-蔗糖溶液浸泡脱水后的脑组织进行切片，设定切片温度为-20℃，切片厚度为200μm，得到完整的神经组织切片，然后将神经组织切片置于明胶包被的载玻片上，避光放置过夜；
(6)显影、制片及观察：
将神经组织切片依次经过氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察(本实施例中采用的是日本制造的奥林巴斯EclipseSOi光学显微镜)。
本对比例的神经组织切片结果照片如图5所示，由图5可见其切片太脆，无法完整切片，本实施例的甘油-蔗糖混合溶液中甘油含量为20％(V/V)、蔗糖含量为25％(W/V)，蔗糖的添加量过多。
对比例3：
一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液：
将质量体积比浓度均为5％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按1∶1∶1的体积比配制成高尔基银染溶液，避光放置备用；
(2)准备神经组织样本：
将SD大鼠经过水合氯醛深度麻醉后，快速断头取脑，获得脑组织(神经组织)样本；
(3)神经组织样本浸染：
按照1：5的体积比将脑组织侵入高尔基银染溶液中，避光放置，浸泡18h，更换高尔基银染溶液，继续浸泡10天；
(4)脱水：
取出浸泡后的脑组织，用纯水冲洗，然后放入甘油含量为30％(V/V)、蔗糖含量为30％(W/V)的甘油-蔗糖溶液中浸泡处理72h进行脱水，避光放置；
(5)切片：
采用德国制造的莱卡冰冻切片机对甘油-蔗糖溶液浸泡脱水后的脑组织进行切片，设定切片温度为-20℃，切片厚度为200μm，得到完整的神经组织切片，然后将神经组织切片置于明胶包被的载玻片上，避光放置过夜；
(6)显影、制片及观察：
将神经组织切片依次经过氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察(本实施例中采用的是日本制造的奥林巴斯EclipseSOi光学显微镜)。
本对比例的神经组织切片结果照片如图6所示，由图6可见其切片太脆，无法完整切片，本实施例的甘油-蔗糖混合溶液中甘油含量为30％(V/V)、蔗糖含量为30％(W/V)，甘油和蔗糖均添加过多。
对比实施例1～3和对比例1～3可知，甘油-蔗糖溶液中甘油和蔗糖的添加量对切片的质量有很大影响，在甘油含量大约为10％～20％(V/V)、蔗糖含量大约为15％～20％(W/V)时可获得完整的切片。因此，本发明采用上述组分配比的甘油-蔗糖溶液对银染神经组织进行脱水。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，包括以下步骤：
(1)配制高尔基银染溶液；
(2)将待染色的神经组织浸泡在步骤(1)所述高尔基银染溶液中；
(3)将浸泡后的神经组织置于含甘油10％～20％V/V、含蔗糖15％～20％W/V的甘油-蔗糖混合溶液中进行脱水；
(4)利用冰冻切片机将脱水后的神经组织进行切片。
2.根据权利要求1所述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，其特征在于，所述步骤(4)中，对神经组织进行切片后，将切片置于明胶包被的载玻片上，放置过夜，然后将放置过夜的切片依次进行氨水显影、硫代硫酸钠分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树脂封片。
3.根据权利要求1所述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述脱水的时间为24h～72h。
4.根据权利要求1所述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述神经组织为脑组织，所述冰冻切片机的切片温度为-18℃～-23℃。
5.根据权利要求1所述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述切片的厚度为100μm～200μm。
6.根据权利要求1所述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将待染色的神经组织浸泡在高尔基银染溶液中的具体过程为：
将待染色的神经组织浸泡在高尔基银染溶液中，其中神经组织与高尔基银染溶液的体积比为1∶(4～6)，避光放置，浸泡12h～24h，然后更换高尔基银染溶液，继续浸泡7天～14天。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述高尔基银染溶液通过如下方法配制得到：
将质量体积比浓度均为4％～6％的重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾水溶液按照体积比1∶(0.8～1.2)∶(0.8～1.2)的比例混合，即得高尔基银染溶液。
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