CN108572105A - 一种脑组织冰冻切片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑组织冰冻切片的制备方法，属于生物学、医学实验领域，包括以下步骤：(1)组织取材及固定脱水：将动物脑组织进行固定和梯度脱水；(2)冷冻预处理：用PBS溶液冲洗脑组织并拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，于冰冻切片机快速制冷区域冰冻后移出，等待处理；(3)半包埋处理：将脑组织进行半包埋处理，静置1分钟；(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片。(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，切片于‑20℃长期保存。本发明采用半包埋处理脑组织，可避免包埋剂对脑组织的影响，切片完整齐全，无冰晶形成，免疫荧光染色良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种脑组织切片方法，具体涉及一种脑组织冰冻切片的制备方法。属于生物学、医学实验领域。
背景技术
冰冻切片是借助于低温条件使组织达到一定的硬度然后切片的一种方法，能很好的保存组织的抗原和酶的活性，因而被广泛应用于临床快速病理诊断以及对于疾病的科学研究上。然而冰冻切片比石蜡切片要求高、难度大，而且冰冻切片、免疫荧光、免疫组化相较于临床病理诊断，其对技术的要求更高。影响冰冻切片制作质量的主要因素有取材、切片时的温度、包埋方式以及切片后的储存。冷冻适宜的组织块，适当的包埋方式，适当的切片，这样才能切出完好的切片。此外，取材及切片过程中要不断采取不同的措施用于避免冰晶的形成。
冰冻切片是免疫组织化学中最常用的切片方法。免疫荧光标记又是最常用的标记抗原的方法。目前，实验室中冰冻切片的处理方法主要有两种。方法一：动物处死后直接冰冻组织，利用OCT包埋后放于液氮液面冷冻至包埋剂中心即将变白时取出，然后立即放于-80℃冰箱保存备用切片。由于液氮的熔点低，利用液氮直接速冻的方法容易将组织冻裂；直接冰冻组织可能会影响组织形态的完整性；方法二：动物处死后立即切取组织块，并快速投入固定液中固定，固定后再利用30％蔗糖溶液(0.1M PBS溶液)进行脱水，最后以组织块沉下为准。
发明专利201310693067公开了一种脑组织快速冰冻切片的制备方法，利用经过丙酮作为冰冻包埋剂及液氮中间介质，使脑组织达到速冻的效果，在一定程度上减少冰晶的形成；发明专利201710568588公开了一种高尔基银染神经组织的冰冻切片方法，采用含甘油10％～20％V/V、含蔗糖15％～20％W/V甘油-蔗糖混合溶液对银染神经组织进行脱水处理，降低了神经组织的硬度和脆性，增强了其韧性。上述专利均采用包埋剂全包埋处理，虽然全包埋组织能够很好的保护好组织形态，但是仍存在一定的缺陷，比如：固定、脱水不完全，切片后多采用直接贴片法进行后续免疫荧光染色，此方法可造成抗体的浪费及脱片、掉片等现象，且包埋剂全包埋易造成冰晶的形成。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种脑组织冰冻切片的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种脑组织冰冻切片的制备方法，包括以下步骤：
(1)组织取材及固定脱水：使用心脏灌流取脑法取出动物脑组织，使用多聚甲醛进行固定，然后利用质量分数为10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水；
(2)冷冻预处理：将冰冻切片机和样品托提前预冷，用PBS溶液冲洗脑组织后用吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻，之后从快速制冷区域移出，等待处理；
(3)半包埋处理：在样品托上浅涂一层包埋剂打底，包埋剂厚度为1mm，当包埋剂开始变白时，厚涂一层包埋剂，厚度为3mm将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，静置1分钟，上述操作均在冰冻切片机中进行；
(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片；
(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，故每一部位均可收集6套切片，且每套切片的均一性良好，切片于-20℃长期保存。
优选的，步骤(1)所述组织取材及固定脱水的具体方法为：在左心室灌注4℃液体，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注质量分数为4％多聚甲醛，先快后慢，以全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛的50ml离心管中进行后固定，固定后再利用10％蔗糖，20％蔗糖，30％蔗糖(用浓度为0.1M的PBS溶液溶解)进行梯度脱水，每个梯度的蔗糖一般在室温条件下4小时到过夜，最后以脑组织沉下为准。
优选的，步骤(2)所述冷冻处理的具体方法为：冰冻切片机和样品托提前预冷，切片机内温度设置为-20℃，用PBS溶液冲洗脑组织后吸水纸拭干，对脑组织进行半包埋处理，防止脑组织表面的液体冻存，防止冰晶的形成；修平脑组织，用自制锡箔纸(用于记录脑组织编号)包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻3-5分钟，之后从快速制冷区域移出，等待处理。
优选的，步骤(3)所述包埋剂为普通胶水。
优选的，步骤(4)所述冰冻切片的具体方法为：将样品托固定于切片机探头上切片，在-20℃环境下作连续冠状冰冻切片，切片厚度为26微米。
将上述冰冻切片用于免疫荧光染色中，步骤如下：
(1)复温：将所需切片取出，室温恢复半小时。
(2)漂洗：用自制挑片器将切片移入PBS中，振荡漂洗6次，每次5分钟。
(3)封闭：将切片移入提前加入质量分数为1％的BSA封闭液(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡封闭1h。
(4)一抗孵育：切片移入提前加入一抗(1ml/孔)的12孔板，室温振荡孵育1h后移入4℃孵育过夜。
(5)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。
(6)二抗孵育：切片小心移入提前加入二抗(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡孵育2h，此后所有操作均在避光环境下进行。
(7)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。
(8)贴片与封片：取适量PBS至载玻片，形成独立液滴，将荧光染色后的切片平铺于液滴上，用吸水纸小心吸走多余液体，自然充分晾干后滴加适量的防荧光淬灭封片剂，盖盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察。
本发明的有益效果：
本发明提供的一种脑组织冰冻切片的制备方法，采用冷冻预处理的方法，拭干脑组织表面的液体，迅速冷冻脑组织，减少冰晶的形成；采用半包埋处理脑组织，可避免包埋剂对脑组织的影响，切片完整齐全，易于收集切片，便于存放切片，无冰晶形成，免疫荧光染色良好；同一脑组织可收集切片6套，可满足不同实验的需求，且均一性保持一致；最后采用冰冻切片漂片法进行免疫荧光染色方法，可使抗体孵育完全、防止脱片、掉片，而且还可以节约抗体成本。
附图说明
图1是半包埋处理大鼠脑组织、切片后漂片法免疫荧光染色结果图；
图2是全包埋处理大鼠脑组织、切片后直接贴片免疫荧光染色结果图。
图3是半包埋处理小鼠脑组织、切片后漂片法免疫荧光染色结果图；
图4是全包埋处理小鼠脑组织、切片后直接贴片免疫荧光染色结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
大鼠脑组织冰冻切片的制备方法及免疫荧光染色
1.组织取材及固定脱水方法
大鼠麻醉，在大鼠左心室灌注4℃液体，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注4％多聚甲醛，先快后慢，以全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛的50ml离心管中进行后固定，固定后再转入10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水，每个梯度的蔗糖溶液一般在室温条件下4小时到过夜，最后以大鼠脑组织沉至管底为准。
2.冷冻预处理方法
冰冻切片机和样品托提前预冷，切片机内温度设置为-20℃。用PBS溶液冲洗脑组织后吸水纸拭干，防止脑组织表面的液体冻存，防止冰晶的形成；修剪多余脑组织，并修平，用自制锡箔纸(编号记录)包裹放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻5min，之后从快速制冷区域移出，等待处理。
3.半包埋处理方法(半包埋处理起到固定脑组织的作用，且切片中无包埋剂的掺杂，则可以摈弃包埋剂的干扰，减少冰晶的形成)：在样品托上浅涂(厚度为1mm)一层包埋剂(普通胶水，经济合算，节约成本，且不影响切片质量)打底，当包埋剂开始变白时，厚涂(厚度为3mm)一层包埋剂，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，静置1分钟即可切片。所用操作均在冰冻切片机中进行。
4.冰冻切片方法：将样品托固定于切片机探头上切片。在-20℃环境下作连续冠状冰冻切片，切片厚度约为26微米。将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，故每一部位均可收集6套切片，且每套切片的均一性良好。切片于-20℃长期保存。
5.免疫荧光染色方法(冰冻切片漂片法)
(1)复温：将所需切片取出，室温恢复半小时。
(2)漂洗：用自制挑片器将切片移入PBS中，振荡漂洗6次，每次5分钟。
(3)封闭：将切片移入提前加入1％BSA封闭液(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡封闭1h。
(4)一抗孵育：切片移入提前加入一抗(1ml/孔)的12孔板，室温振荡孵育1h后移入4℃孵育过夜。
(5)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。
(6)二抗孵育：切片小心移入提前加入二抗(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡孵育2h，此后所有操作均在避光环境下进行。
(7)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。
(8)贴片与封片：取适量PBS至载玻片，形成独立液滴，将荧光染色后的切片平铺于液滴上，用吸水纸小心吸走多余液体，自然充分晾干后滴加适量的防荧光淬灭封片剂，盖盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察。
利用心脏灌流取脑组织的取材方法、蔗糖梯度脱水，可使脑组织充分固定并脱水完全；采用冷冻预处理的方法，拭干脑组织表面的液体，迅速冷冻脑组织，减少冰晶的形成；随后应用普通胶水半包埋大鼠脑组织可避免包埋剂对大鼠脑组织切片的影响；采用连续冠状切片并收集大鼠脑组织切片等序分成6套切片，可分别用于不同的实验，且均一性保持一致；最后采用冰冻切片漂片法进行免疫荧光染色方法，可使抗体孵育完全、防止脱片、掉片，而且还可以节约抗体成本。免疫染色结果见附图1，由图1可知，本发明方法所得切片完整齐全，无冰晶形成，免疫荧光染色良好。
本发明中在使用蔗糖梯度脱水时，第一次尝试10％蔗糖溶液过夜后转入20％蔗糖溶液，过夜后转入30％蔗糖溶液，过夜后取出脑组织。放入冰冻切片机中速冻，发现脑组织表面有白色冰霜，推测可能是脱水不充分引起的。第二次尝试10％蔗糖溶液过夜后转入20％蔗糖溶液，沉入管底时转入30％蔗糖溶液，再次沉入管底时取出脑组织，放入冰冻切片机中速冻，结果发现脑组织表面还是有少许白色冰霜，推测可能是取出脑组织时未拭去脑组织表面的蔗糖溶液。第三次尝试10％蔗糖溶液过夜后转入20％蔗糖溶液，沉入管底时转入30％蔗糖溶液，再次沉入管底时取出脑组织，由10％蔗糖溶液转入20％蔗糖溶液、由20％蔗糖溶液转入30％蔗糖溶液、由30％蔗糖溶液取出转入冰冻切片机中，每一次转移均用吸水纸拭净脑组织表面的蔗糖溶液，最后再放入冰冻切片机中速冻，结果未发现白色冰霜。
冷冻脑组织时，拭净脑组织表面的蔗糖溶液后，放入冷冻切片机中速冻，速冻时间的探索，第一次尝试10分钟，结果发现切片时切片碎裂，推测可能是速冻时间太长。第二次尝试5分钟，结果发现切片完整，不易破碎。
按照常规全包埋的方式包埋脑组织时，发现切片易卷折，放入冰冻保存液时不易深入保存液中，捞片时切片易黏连、破碎，推测可能是全包埋时切片周围有大量的包埋剂，包埋剂具有黏性，易引起切片之间黏连、破碎，不易深入保存液中，冰冻切片时易卷折。因此第二次尝试用半包埋的方式，在样品托上涂上包埋剂(厚度为6mm)，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，发现仍存在一定的问题，即由于半包埋的脑组织底部仍含有包埋剂，位于底部的组织进行切片时，切片周围仍然有大量的包埋剂，因此仍然表现出全包埋处理切片的问题，推测可能是包埋剂过多的原因。因此第三次进一步改进半包埋的方式，即在样品托上浅涂(厚度为1mm)一层包埋剂打底，当包埋剂开始变白时，厚涂(厚度为3mm)一层包埋剂，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，使包埋剂起到固定脑组织的作用，且切片中无包埋剂的掺杂，结果发现切片完整齐全，易于收集切片，捞片时不会发生黏连、破碎的现象。
采用全包埋处理大鼠脑组织，切片时发现切片易卷折；切片放入冰冻保存液时不易深入保存液中，而且切片易碎，捞片时切片之间易引起黏连。免疫荧光染色后发现切片中出现裂孔，切片中有冰晶形成，见图2。
实施例2
小鼠鼠脑组织冰冻切片的制备方法及免疫荧光染色
1.组织取材及固定脱水方法
小鼠麻醉，在小鼠左心室灌注4℃液体，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注4％多聚甲醛溶液，先快后慢，以全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛溶液的15ml离心管中进行后固定，固定后再转入10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水，每个梯度的蔗糖溶液一般在室温条件下4小时到过夜，最后以大鼠脑组织沉至管底为准。
2.冷冻预处理方法
冰冻切片机和样品托提前预冷，切片机内温度设置为-20℃。用PBS溶液冲洗脑组织后吸水纸拭干，防止脑组织表面的液体冻存，防止冰晶的形成；修剪多余脑组织，并修平，用自制锡箔纸(编号记录)包裹放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻3分钟，之后从快速制冷区域移出，等待处理。
3.半包埋处理方法(半包埋处理起到固定脑组织的作用，且切片中无包埋剂的掺杂，则可以摈弃包埋剂的干扰，减少冰晶的形成)：在样品托上浅涂(厚度为1mm)一层包埋剂(普通胶水，经济合算，节约成本，且不影响切片质量)打底，当包埋剂开始变白时，厚涂(厚度为3mm)一层包埋剂，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，静置1分钟即可切片。所用操作均在冰冻切片机中进行。
4.冰冻切片方法：将样品托固定于切片机探头上切片。在-20℃环境下作连续冠状冰冻切片，切片厚度约为26微米。将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，故每一部位均可收集6套切片，且每套切片的均一性良好。切片于-20℃长期保存。
5.免疫荧光染色方法(冰冻切片漂片法)
(1)复温：将所需切片取出，室温恢复半小时。
(2)漂洗：用自制挑片器将切片移入PBS中，振荡漂洗6次，每次5分钟。
(3)封闭：将切片移入提前加入1％BSA封闭液(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡封闭1h。
(4)一抗孵育：切片移入提前加入一抗(1ml/孔)的12孔板，室温振荡孵育1h后移入4℃孵育过夜。
(5)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。
(6)二抗孵育：切片小心移入提前加入二抗(1ml/孔)的12孔板中，室温缓慢振荡孵育2h，此后所有操作均在避光环境下进行。
(7)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟。
(8)贴片与封片：取适量PBS至载玻片，形成独立液滴，将荧光染色后的切片平铺于液滴上，用吸水纸小心吸走多余液体，自然充分晾干后滴加适量的防荧光淬灭封片剂，盖盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察。
利用心脏灌流取脑组织的取材方法、蔗糖梯度脱水，可使脑组织充分固定并脱水完全；随后应用普通胶水半包埋小鼠脑组织可避免包埋剂对大鼠脑组织切片的影响；采用连续冠状切片并收集小鼠脑组织切片等序分成6套切片，可分别用于不同的实验，且均一性保持一致；最后采用冰冻切片漂片法进行免疫荧光染色方法，可使抗体孵育完全、防止脱片、掉片，而且还可以节约抗体成本。免疫染色结果见附图3，由图3可知，本发明方法所得切片完整齐全，无冰晶形成，免疫荧光染色良好。
蔗糖梯度脱水时，第一次尝试10％蔗糖溶液过夜后转入20％蔗糖溶液，过夜后转入30％蔗糖溶液，过夜后取出脑组织。放入冰冻切片机中速冻，发现脑组织表面有白色冰霜，推测可能是脱水不充分引起的。第二次尝试10％蔗糖溶液过夜后转入20％蔗糖溶液，沉入管底时转入30％蔗糖溶液，再次沉入管底时取出脑组织，放入冰冻切片机中速冻，结果发现脑组织表面还是有少许白色冰霜，推测可能是取出脑组织时未拭去脑组织表面的蔗糖溶液。第三次尝试10％蔗糖溶液过夜后转入20％蔗糖溶液，沉入管底时转入30％蔗糖溶液，再次沉入管底时取出脑组织，由10％蔗糖溶液转入20％蔗糖溶液、由20％蔗糖溶液转入30％蔗糖溶液、由30％蔗糖溶液取出转入冰冻切片机中，每一次转移均用吸水纸拭净脑组织表面的蔗糖溶液，最后再放入冰冻切片机中速冻，结果未发现白色冰霜。
冷冻脑组织时，拭净脑组织表面的蔗糖溶液后，放入冷冻切片机中速冻，速冻时间的探索，第一次尝试8分钟，结果发现切片时切片碎裂，推测可能是速冻时间太长，冻过了。第二次尝试3分钟，结果发现切片完整，不易破碎。
包埋脑组织时，第一次按照常规全包埋的方式，发现切片易卷折，放入冰冻保存液时不易深入保存液中，捞片时切片易黏连、破碎，推测可能是全包埋时切片周围有大量的包埋剂，包埋剂具有黏性，易引起切片之间黏连、破碎，不易深入保存液中，冰冻切片时易卷折。因此第二次初步尝试用半包埋的方式，在样品托上涂上包埋剂(厚度为6mm)，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，发现位于底部的组织进行切片时，仍然表现出全包埋处理切片的问题，因此推测可能是半包埋的脑组织底部仍含有包埋剂的原因。因此第三次进一步尝试半包埋的方式，在样品托上浅涂(厚度为1mm)一层包埋剂打底，当包埋剂开始变白时，厚涂(厚度为3mm)一层包埋剂，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，使包埋剂起到固定脑组织的作用，且切片中无包埋剂的掺杂，结果发现切片完整齐全，易于收集切片，捞片时不会发生黏连、破碎的现象。
采用全包埋处理小鼠脑组织，切片时发现切片易卷折；切片放入冰冻保存液时不易深入保存液中，而且切片易碎，捞片时切片之间易引起黏连。免疫荧光染色后发现切片中出现裂孔，切片中有冰晶形成，见图4。
说明本发明提供的半包埋处理方法可避免包埋剂对脑组织的影响，切片完整齐全，易于收集切片，便于存放切片，无冰晶形成，免疫荧光染色良好。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (6)
1.一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)组织取材及固定脱水：使用心脏灌流取脑法取出动物脑组织，使用多聚甲醛进行固定，然后利用10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水；
(2)冷冻预处理：将冰冻切片机和样品托提前预冷，用PBS溶液冲洗脑组织后用吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻，之后从快速制冷区域移出，等待处理；
(3)半包埋处理：在样品托上浅涂一层包埋剂打底，厚度为1mm，当包埋剂开始变白时，厚涂一层包埋剂，厚度为3mm，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，上述操作均在冰冻切片机中进行。
(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片；
(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，每一部位均可收集6套切片，切片于-20℃长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述组织取材及固定脱水的具体方法为：在动物左心室灌注4℃液体，液体为生理盐水和4％多聚甲醛溶液，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注4％多聚甲醛溶液，先快后慢，以动物全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛溶液的50ml离心管中进行后固定，固定后再利用10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水，更换蔗糖溶液以脑组织完全下沉至管底为标准。
3.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述冷冻预处理的具体方法为：将冰冻切片机和样品托提前预冷，切片机内温度设置为-20℃，用PBS溶液冲洗脑组织后吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻3-5分钟，之后从快速制冷区域移出，等待切片，之后对脑组织进行半包埋处理。
4.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，所述包埋剂为普通胶水。
5.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述冰冻切片的具体方法为：将样品托固定于切片机探头上切片，在-20℃环境下作连续冠状冰冻切片，切片厚度为26微米。
6.将权利要求1～5任一项所述方法所得冰冻切片应用于免疫荧光染色中，其特征在于，步骤如下：
(1)复温：将所需切片取出，室温恢复半小时；
(2)漂洗：用自制挑片器将切片移入PBS中，振荡漂洗6次，每次5分钟；
(3)封闭：将切片移入提前加入1％BSA封闭液的12孔板中，室温缓慢振荡封闭1h；
(4)一抗孵育：切片移入提前加入一抗的12孔板，室温振荡孵育1h后移入4℃孵育过夜；
(5)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟；
(6)二抗孵育：切片小心移入提前加入二抗的12孔板中，室温缓慢振荡孵育2h，此后所有操作均在避光环境下进行；
(7)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟；
(8)贴片与封片：取适量PBS至载玻片，形成独立液滴，将荧光染色后的切片平铺于液滴上，用吸水纸小心吸走多余液体，自然充分晾干后滴加适量的防荧光淬灭封片剂，盖盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察。
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