JP2011209067A - 氷結晶観察用試料作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】凍結材料の氷結晶を観察するための試料を作製する氷結晶観察用試料作製方法において、凍結材料1を凍結用包埋剤で包埋固定する工程2と、包埋固定した凍結材料に、該凍結材料の温度条件下で粘着性を有する粘着面を備えたフィルムを貼着する工程3と、フィルムに貼着した凍結材料を薄切する工程4と、この薄切片を凍結状態のまま、該薄切片の温度条件下で液体である有機溶剤に浸漬して薄切片の氷を溶出させ置換するとともに該薄切片を固定する工程5と、有機溶剤に浸漬した後の薄切片を染色して薄切試料7を作製する工程6とを備え、薄切試料7のうち染色されていない部分を氷結晶の存在形態として観察するようにした。
【選択図】図1
Description
まず、凍結材料51を有機溶剤に浸漬して凍結材料を浸漬置換・固定52する。このとき、有機溶剤には、例えばホルマリン・エタノール混合液が用いられ、低温下で2〜4週間静置して固定させる。その後、固定が完了した凍結材料の固定液を除去するため、冷蔵状態にて流水で水洗い53する。次いで、水洗いした凍結材料をゼラチン溶液に浸漬54する。これは、凍結材料に均一な硬度をもたせて切片を作りやすくするための包埋処理である。さらに、ゼラチン溶液に浸漬して数日放置した材料を、薄切・染色55して、凍結試料56を作製する。凍結試料56は、標本として観察用に用いられる。
また、凍結材料の浸漬置換・固定を長時間行なうことにより凍結材料の組織に脱水収縮が生じることがあり、凍結時の氷結晶の状態を正確に観察することが困難となる場合もあった。
また、従来の凍結置換法は有機溶剤への浸漬時間が長かったため組織の脱水収縮が生じることがあったが、本発明の凍結置換法によれば浸漬時間を大幅に短縮できるため、組織の脱水収縮を最小限に抑えることが可能となり、凍結時の氷結晶の状態を正確に観察することができる。
さらにまた、凍結材料をフィルムに貼着した状態で薄切しているため、薄切時や浸漬置換・固定時における組織の変形を防ぐことが可能となり、氷結晶形態の痕跡を良好な状態のまま維持することが可能となる。
このように、濃度65〜85%のエタノールを含む有機溶剤を用いて浸漬置換・固定することにより、氷の溶出速度を速くし、固定化時間を短くすることができるため、氷の融解による復水や組織の変形を最小限に抑制することが可能である。これにより常温または零度以下の低温のいずれにおいても観察に十分な氷結晶形態の痕跡を残すことが可能となる。
さらに、前記有機溶剤が、−20°以下に冷却したエタノールを含むことが好ましく、これにより有機溶剤による薄切片の置換・固定作用が円滑に行なわれることとなる。
これは、薄切片の厚さが3μm以下の場合、氷結晶の痕跡が明瞭に残らない可能性があり、10μm以上の場合、薄切片の浸漬置換・固定に時間を要してしまうとともに、染色後の顕微鏡等の観察において鮮明な像を得られないため、上記厚さ範囲とすることで、短時間で薄切片の浸漬置換・固定が可能で、氷結晶の痕跡を精度良く観察可能となる。
また、従来の凍結置換法は有機溶剤への浸漬時間が長かったため組織の脱水収縮が生じることがあったが、本発明の凍結置換法によれば浸漬時間を大幅に短縮できるため、組織の脱水収縮を最小限に抑えることが可能となり、凍結時の氷結晶の状態を正確に観察することができる。
さらにまた、凍結材料をフィルムに貼着した状態で薄切しているため、薄切時や浸漬置換・固定時における組織の変形を防ぐことが可能となり、氷結晶形態の痕跡を良好な状態のまま維持することが可能となる。
本発明の氷結晶観察用試料の作製方法は、凍結材料1を包埋固定する包埋固定工程2と、該凍結材料1にフィルムを貼着するフィルム貼着工程3と、該凍結材料1を薄切する薄切工程4と、この薄切片を浸漬置換・固定する浸漬置換・固定工程5と、浸漬置換・固定工程後の薄切片を染色して薄切試料7を作製する染色工程6とを備え、作製された薄切試料7のうち染色されていない部分を氷結晶の存在痕跡として観察するようにしたものである。
フィルム貼着工程3は、包埋固定した凍結材料1に、該凍結材料1の温度条件下で粘着性を有する粘着面を備えたフィルムを貼着する。図2(A)に示すように、凍結用包埋材10で包埋固定された凍結材料1を、後述する薄切装置に固定するための支持台11に固定しておき、該支持台11と対面する側の凍結材料面にフィルム15を貼着する。
薄切試料7は、フィルムに貼着した状態のまま、プラスチックフィルムとガラス板の間に挟みこみ、正立型顕微鏡等の顕微鏡により、薄切試料7のうち染色されていない部分で示される氷結晶痕跡の大きさや形状等を観察する。
このように本発明では、凍結材料1をフィルムに貼着して薄切した薄切片を有機溶剤で浸漬置換・固定する構成としているため、浸漬置換・固定工程5に要する時間を大幅に短縮でき、氷結晶観察用試料(薄切試料7)を短時間で作製可能となる。
また、従来の凍結置換法は有機溶剤への浸漬時間が長かったため組織の脱水収縮が生じることがあったが、本発明の凍結置換法によれば浸漬時間を大幅に短縮できるため、組織の脱水収縮を最小限に抑えることが可能となり、凍結時の氷結晶の状態を正確に観察することができる。
さらにまた、凍結材料1をフィルムに貼着した状態で薄切しているため、薄切時や浸漬置換・固定時における組織の変形を防ぐことが可能となり、氷結晶形態の痕跡を良好な状態のまま維持することが可能となる。
次に、本発明の具体的な実施例を以下に説明する。なお、この実施例は本発明の構成の一例であり、その数値や材料等はこれらに限定されるものではない。
本実施例では、凍結材料として、庫内温度−45℃、噴出口風速17m/sに設定した連続衝突噴流式フリーザで急速凍結させた生メバチマグロを用いた。
この凍結材料を、凍結用包埋材(CMC又はOCTコンパウンド)で包埋固定し、−20℃以下に設定したクリオスタットCM−1510(Leica Microsystems製)にセットし、トリミングした後、凍結材料1の表面にCryofilm(Leica Microsystems製)からなるフィルムを貼着した。
この薄切片を、フィルムに貼着した状態のまま、−20℃以下で液体である有機溶剤で浸漬置換・固定した。ここでは、有機溶剤は濃度65〜85%のエタノールを用い、この有機溶剤に薄切片を0.5〜2分程度浸漬させ、固定化させるようにした。
このようにして作製された薄切試料7の顕微鏡写真を図3に示す。同写真において、染色されている部分が凍結材料1の組織20を示し、染色されていない部分が氷結晶の痕跡21を示す。本実施例によれば、20〜30分程度の短時間で薄切試料を作製することができ、且つ氷結晶の痕跡を明瞭に観察可能となる。
同図は、薄切片の浸漬置換・固定に用いられる有機溶剤の適正を評価する試験を行なった結果である。実験方法は、上記した実施例と同様の方法を採用し、有機溶剤として、等張ホルマリン、99.5%エタノール、90%エタノール、85%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、65%エタノール、60%エタノール、アルコール・ホルマリン混合液、冷アセトン、カルノアを用いてそれぞれ薄切試料を作製し、各試料ごとに氷結晶面積変化率を求めた。
2 包埋固定工程
3 フィルム貼着工程
4 薄切工程
5 浸漬置換・固定工程
6 染色工程
7 薄切試料
10 凍結用包埋材
11 支持台
12 刃
15 フィルム
20 組織
21 氷結晶痕跡
Claims (4)
- 凍結材料の氷結晶を観察するための試料を作製する氷結晶観察用試料作製方法において、
前記凍結材料を凍結用包埋剤で包埋固定する工程と、前記包埋固定した凍結材料に、該凍結材料の温度条件下で粘着性を有する粘着面を備えたフィルムを貼着する工程と、前記フィルムに貼着した凍結材料を薄切する工程と、この薄切片を凍結状態のまま、該薄切片の温度条件下で液体である有機溶剤に浸漬して前記薄切片の氷を溶出させ置換するとともに該薄切片を固定する工程と、前記有機溶剤に浸漬した後の前記薄切片を染色して薄切試料を作製する工程とを備え、前記薄切試料のうち染色されていない部分を前記氷結晶の存在形態として観察するようにしたことを特徴とする凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法。 - 前記有機溶剤が、濃度65〜85%のエタノールを含むことを特徴とする請求項1に記載の凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法。
- 前記有機溶剤が、−20°以下に冷却したエタノールを含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法。
- 前記薄切片は、3〜10μmの厚さであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法。
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