CN112665951B - 一种胚乳组织包埋方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物组织包埋技术领域，具体公开了一种胚乳组织包埋方法与应用。本发明的胚乳组织包埋的方法，通过高压冷冻技术与冷冻替代技术实现，其对于冷冻替代包埋时的程序和胚乳渗透等环节进行了摸索，获得的方法能够获得保持植物原有细胞结构形态的水稻胚乳组织样品，适用于不同发育时期的水稻胚乳样品及类似的植物组织。采用本发明方法包埋的组织样品后续可以获得高质量超薄切片，可以用于透射电镜超微结构观察，也可通过免疫胶体金染色，对蛋白质进行超微结构下的定位定量研究。

Description

一种胚乳组织包埋方法与应用

技术领域

本发明涉及植物组织包埋技术领域，具体地说，涉及一种胚乳组织包埋方法与应用。

背景技术

生命科学常规电镜技术的发展，使得观察组织、细胞的超微结构成为可能。尽管透射电镜的分辨率已达到了原子水平，但在生物样品制备过程中，甲醛、戊二醛等化学试剂对样品的化学固定往往会造成不可预知的影响，并不能完整反映组织、细胞的真实形态结构，且对蛋白质等大分子物质的抗原性保存效果较差。高压冷冻固定技术可以在不使用任何化学固定剂的条件下在极短的时间之内将组织和细胞完全固定，其与冷冻替代相结合，可在低温条件下将固定和脱水过程统一起来使得样品的超微结构更接近于生活形态，最大程度保存生物样品的抗原特性。

目前高压冷冻-冷冻替代技术在动物以及人体组织细胞研究中应用得比较广泛。近年来，随着技术发展，在植物营养组织的研究中也使用的越来越多。水稻作为重要的粮食作物之一，其胚乳贮藏了大量的淀粉和蛋白质，水稻籽粒的细胞形态及免疫定位研究对于水稻品质遗传改良具有重要意义。但由于水稻胚乳淀粉颗粒排列紧密，导致常规的植物高压冷冻-冷冻替代方法难以获得良好的固定包埋效果。因此，为了推广高压冷冻-冷冻替代技术在水稻等具有类似胚乳结构的植物品质研究方面的应用，有必要进一步优化和发明效果理想的胚乳包埋方法。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种可以保持植物(水稻)胚乳细胞原有的结构状态，能够为超微结构观察与分析提供高质量的切片的胚乳组织包埋的方法。

为了实现本发明的发明目的，本发明的技术方案如下：

一种胚乳组织的包埋方法，通过高压冷冻技术与冷冻替代技术实现，其中，冷冻替代包埋时按如下程序进行：

其中，0.2％的醋酸双氧铀以0.025g醋酸双氧铀先溶于100μL甲醇，再加入10mL丙酮，混合均匀制得。各浓度的树脂以酒精配置。

胚乳贮藏了大量的淀粉和蛋白质，其中胚乳淀粉颗粒排列紧密，导致常规的植物高压冷冻-冷冻替代方法难以获得良好的固定包埋效果，样品不能很好地被树脂渗透，以至于后续无法获得切片。本发明针对胚乳结构组成特性，对高压冷冻技术与冷冻替代技术的运用进行了大量摸索，通过不断调节渗透温度，延伸渗透时间等方式，发现将冷冻替代温度、变化范围等条件调整为本发明的上述程序时，可提升包埋质量。

本发明中，在冷冻替代包埋后进行胚乳渗透时，以树脂进行梯度渗透，渗透梯度依次为8-12％、23-27％、48-52％、73-77％、100％、100％。

优选，在冷冻替代包埋后进行胚乳渗透时，以树脂进行梯度渗透，渗透梯度依次为10％、25％、50％、75％、100％、100％。

本发明中，所述梯度渗透具体如下：以10％的树脂-酒精混合液处理胚乳6.5-7.5小时，以25％的树脂-酒精混合液处理胚乳8.5-9.5小时，以50％的树脂-酒精混合液处理胚乳7.5-8.5小时，以75％的树脂-酒精混合液处理胚乳7.5-8.5小时，以100％的树脂处理胚乳11.5-12.5小时，再以100％的树脂处理胚乳23-25小时。

优选，以10％的树脂-酒精混合液处理胚乳7小时，以25％的树脂-酒精混合液处理胚乳9小时，以50％的树脂-酒精混合液处理胚乳8小时，以75％的树脂-酒精混合液处理胚乳8小时，以100％的树脂处理胚乳12小时，再以100％的树脂处理胚乳24小时。

本发明根据胚乳特性，通过大量摸索实验，将树脂渗透设置为上述特定梯度方式，以保证/实现良好的包埋效果，使得后续超薄切片观察可以获得高质量且清晰完整的超微结构图片。

本发明中，在所述冷冻替代包埋前的高压冷冻环节，冷冻速率应保持在16000-20000°/s，压力为2000-2200bar。

本发明中，以0.2％醋酸双氧铀和无水乙醇依次处理胚乳组织后，再进行所述梯度渗透。

本发明中，胚乳包埋时，在-20℃至-35℃，优选-35℃下，以紫外低温包埋100小时以上。以使得胚乳组织包埋更充分。

本发明中，胚乳组织来自于水稻。

胚乳可以是新鲜的不同发育时期的水稻胚乳。优选，水稻不同发育时期胚乳组织为水稻花后3-21天胚乳组织。

本发明方法还可适用于类似水稻胚乳的具有致密结构的植物组织样品的包埋。

本发明另提供一种上述方法在胚乳包埋切片制备和固定与水稻胚乳相似的植物组织器官中的应用。

本发明方法具体包括以下步骤：

(1)高压冷冻；

(2)冷冻替代包埋；

(3)胚乳渗透；

(4)胚乳包埋。

高压冷冻技术可以是基于Leica EM PACT2、Leica EM HPM100、Leica EM ICE及后续衍生设备。

冷冻替代技术可以是基于Leica EM AFS2及后续衍生设备。

本发明的有益效果至少在于：

本发明提供了一种适合富含淀粉和蛋白的胚乳组织的固定包埋方法，能够获得保持植物原有细胞形态结构的胚乳组织样品，适用于不同发育时期的水稻胚乳样品及类似的植物组织。并为后续获得高质量切片奠定基础。

采用本发明方法固定包埋的样品，后期可直接进行超薄切片，获得高质量超薄切片，可以用于透射电镜进行超微结构的观察和研究，也可通过超薄切片免疫胶体金染色，对蛋白质进行超微结构下的定位定量研究。有助于胚乳细胞形态及免疫定位研究，对于植物品质遗传改良具有重要意义。

附图说明

图1为本发明冷冻替代过程所用耗材；其中，A为小铝盒，B为包埋盒，C为称量盘，D为树脂填充包埋盒微微没过称量盘的照片；

图2为本发明固定包埋好的水稻胚乳树脂块；

图3为本发明实施例1中固定包埋的水稻花后3天胚乳样品的超薄切片图；其中，A为大视野图片，B为局部放大图；PSV：贮藏型液泡；Golgi：高尔基体；ER：内质网；Mitochondrion：线粒体；MVB/PVC：多囊泡体/前液泡区室；

图4为本发明实施例2中固定包埋的水稻花后12天胚乳样品的超薄切片图；其中，A为大视野图片，B为局部放大图。Starch grain：淀粉粒；Golgi：高尔基体；DV：致密囊泡；PBII：II型蛋白体；

图5为对比例1常规方法固定包埋的水稻花后12天胚乳样品的超薄切片图；PM：质膜；ER：内质网；

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1水稻花后3天胚乳样品的固定与包埋

本实施例提供一种本发明的胚乳组织包埋的方法，具体如下：

1、高压冷冻固定，以Leica EM PACT2为例。

1)准备工作：打开Leica EM PACT2，在液氮舱中加入足量液氮，加入压力液甲基环乙烷，用空载carrier(载体，Flat Specimen Carrier，Leica，cat#16706899)高压冷冻三次，使机器处于稳定状态，确认温度、压力曲线是否正常。

2)样品制备：取新鲜花后3天水稻胚乳置于0.15M蔗糖溶液中，使用单面刀片横切水稻胚乳，取厚度400μm，直径1.2mm的胚乳组织，将其放入400μm厚度carrier中，加入适量冷冻保护剂(0.15M蔗糖溶液)，液面与carrier表面相平。将装载样品的carrier放入样品夹中，推入机器高压冷冻固定。仪器参数显示冷冻速率在16000-20000°/s，压力稳定在2100bar，表明样品固定较好。固定好的样品carrier转移至样品盒中，置于液氨中保存。所用镊子等器械必须预冷到液氮温度；样品要时刻保持在液氮环境中，从而避免冰晶的形成。

2、冷冻替代包埋，以Leica EM AFS2为例。

1)试剂准备：0.2％UA(醋酸双氧铀)、HM20树脂(Lowicryl HM20Kit)

0.2％UA：0.025g UA先溶于100μL甲醇，再加入10mL丙酮，混合均匀。

HM20树脂：Monomer(树脂单体)34.04g，Cross Linker(交联剂)5.96g，Initiator(引发剂)0.2g，混合均匀。梯度树脂用酒精配置。

2)准备工作：打开Leica EM AFS2，灌入液氮，等待冷冻腔室降温至-85℃。

3)样品转移：预先在做好标记的小铝盒(如图1中A所示)中加入2mL丙酮，液氮预冷凝固后，将样品carrier从样品盒中转移至对应小铝盒中，盛满液氮，放入已降温的冷冻腔室中。

4)冷冻替代及包埋程序设定：创建程序(如表1所示)，启动程序。

表1

5)样品渗透：吸出装有样品的小铝盒中的丙酮，加入0.2％UA 1.5mL/组样品，放置21小时。吸出小铝盒中的0.2％UA，加入无水乙醇1.5mL/组样品，放置1小时。吸出小铝盒中的无水乙醇，加入10％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置7小时。吸出小铝盒中的10％的树脂/酒精混合液，加入25％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置9小时。吸出小铝盒中的25％的树脂/酒精混合液，加入50％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置8小时。吸出小铝盒中的50％的树脂/酒精混合液，加入75％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置8小时。吸出小铝盒中的75％的树脂/酒精混合液，加入100％的树脂1.5mL/组样品，放置12小时。吸出小铝盒中的100％的树脂，加入新的100％的树脂1.5mL/组样品，放置24小时。此过程中样品会从carrier中脱离，收集carrier丙酮浸泡冲洗以便重复使用。

6)样品包埋：吸出小铝盒中的100％的树脂，加入新的100％的树脂2mL/组样品，并将小型铝制称量盘(VWR，Aluminum Micro Weighing Dishes)(参见图1中C所示)放入做好标记的包埋盒(参见图1中B所示)中并置入冷冻腔室预冷，随后用预冷过的吸管将100％的树脂及样品转移至对应小型铝制称量盘中，树脂填充包埋盒微微没过小型铝制称量盘(参见图1中D所示)。待冷冻腔室降温至-20℃，打开紫外灯，低温紫外包埋100小时(温度稳定在-35℃)。取出样品置于装有干燥剂的自封袋中于阳光或灯光下照射直至树脂完全透明(如图2所示)。所用镊子等器械必须预冷到液氮温度；样品要时刻保持在液氮环境中，从而避免冰晶的形成。

7)样品观察：包埋好的样品用Leica EMUC7超薄切片机进行切片并捞片至镍网，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，利用日立HT7700透射电子显微镜观察，获得结果如图3，可以清晰的观察到水稻早期发育胚乳中各细胞器的形态结构，并且各膜组分都保持完好。

实施例2水稻花后12天胚乳样品的固定与包埋

本实施例提供一种本发明的胚乳组织包埋的方法，具体如下(未详细说明部分与实施例1相同)：

1、高压冷冻固定，以Leica EM PACT2为例。

1)准备工作：打开Leica EM PACT2，在液氮舱中加入足量液氮，加入压力液甲基环乙烷，用空载carrier高压冷冻三次，使机器处于稳定状态，确认温度、压力曲线是否正常。

2)样品制备：取新鲜水稻花后12天胚乳置于0.15M蔗糖溶液中，使用单面刀片横切水稻胚乳，取厚度400μm，直径1.2mm的胚乳组织，将其放入400μm厚度carrier中，加入适量冷冻保护剂(0.15M蔗糖溶液)，液面与carrier表面相平。将装载样品的carrier放入样品夹中，推入机器高压冷冻固定。仪器参数显示冷冻速率在16000-20000°/s，压力稳定在2100bar，表明样品固定较好。固定好的样品carrier转移至样品盒中，置于液氨中保存。所用镊子等器械必须预冷到液氮温度；样品要时刻保持在液氮环境中，从而避免冰晶的形成。

2、冷冻替代包埋，以Leica EM AFS2为例。

1)试剂准备：0.2％UA、HM20树脂(Lowicryl HM20 Kit)

0.2％UA：0.025gUA先溶于100μL甲醇，再加入10mL丙酮，混合均匀。

HM20树脂：Monomer 34.04g，Cross Linker 5.96g，Initiator 0.2g，混合均匀。梯度树脂用酒精配置。

2)准备工作：打开Leica EM AFS2，灌入液氮，等待冷冻腔室降温至-85℃。

3)样品转移：预先在做好标记的小铝盒(如图1中A)中加入2mL丙酮，液氮预冷凝固后，将样品carrier从样品盒中转移至对应小铝盒中，盛满液氮，放入已降温的冷冻腔室中。

4)冷冻替代及包埋程序设定：创建程序(如实施例1表1所示)，启动程序。

5)样品渗透：吸出装有样品的小铝盒中的丙酮，加入0.2％UA 1.5mL/组样品，放置21小时。吸出小铝盒中的0.2％UA，加入无水乙醇1.5mL/组样品，放置1小时。吸出小铝盒中的无水乙醇，加入10％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置7小时。吸出小铝盒中的10％的树脂/酒精混合液，加入25％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置9小时。吸出小铝盒中的25％的树脂/酒精混合液，加入50％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置8小时。吸出小铝盒中的50％的树脂/酒精混合液，加入75％的树脂/酒精混合液1.5mL/组样品，放置8小时。吸出小铝盒中的75％的树脂/酒精混合液，加入100％的树脂1.5mL/组样品，放置12小时。吸出小铝盒中的100％的树脂，加入新的100％的树脂1.5mL/组样品，放置24小时。在此过程中样品会从carrier中脱离，收集carrier丙酮浸泡冲洗以便重复使用。

6)样品包埋：吸出小铝盒中的100％的树脂，加入新的100％的树脂2mL/组样品，并将小型铝制称量盘(VWR，Aluminum Micro Weighing Dishes)放入(图1中C)做好标记的包埋盒(图1中B)中置入冷冻腔室预冷，随后用预冷过的吸管将100％的树脂及样品转移至对应小型铝制称量盘中，树脂填充包埋盒微微没过小型铝制称量盘(图1中D)。待冷冻腔室降温至-20℃，打开紫外灯，低温紫外包埋100小时(温度稳定在-35℃)。取出样品后置于装有干燥剂的自封袋中阳光或灯光照射直至树脂完全透明。所用镊子等器械必须预冷到液氮温度；样品要时刻保持在液氮环境中，从而避免冰晶的形成。

7)样品观察：包埋好的样品用Leica EMUC7超薄切片机进行切片并捞片至镍网，免疫胶体金标记以及醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，利用日立HT7700透射电子显微镜观察，获得结果如图4，可以清晰的观察到水稻中期发育胚乳中各细胞器的形态结构，膜组分保持完好，金标记清晰可见。

对比例1

本对比例提供一种胚乳组织包埋的方法，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，冷冻替代程序如下表2所示：

表2

获得的切片结果见图5。从图5中可以看出胚乳样品细胞器结构不清晰，内质网崩溃，看不到清晰完整的膜结构。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种胚乳组织的包埋方法，通过高压冷冻技术与冷冻替代技术实现，其特征在于，冷冻替代包埋时按如下程序进行：

。

2.根据权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，在所述程序开始后进行胚乳渗透时，以树脂进行梯度渗透，渗透梯度依次为10%、25%、50%、75%、100%、100%。

3.根据权利要求2所述的包埋方法，其特征在于，所述梯度渗透具体如下：以10%的树脂-酒精混合液处理胚乳7小时，以25%的树脂-酒精混合液处理胚乳9小时，以50%的树脂-酒精混合液处理胚乳8小时，以75%的树脂-酒精混合液处理胚乳8小时，以100%的树脂处理胚乳12小时，再以100%的树脂处理胚乳24小时。

4.根据权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，在所述冷冻替代包埋前的高压冷冻环节，冷冻速率为16000-20000 °/s，压力为2000-2200 bar。

5.根据权利要求2或3所述的包埋方法，其特征在于，所述程序开始后，先以0.2% 醋酸双氧铀和无水乙醇依次处理胚乳组织后，再进行所述梯度渗透。

6.根据权利要求1-4任一项所述的包埋方法，其特征在于，胚乳组织来自于水稻。

7.根据权利要求5所述的包埋方法，其特征在于，胚乳组织来自于水稻。

8.权利要求1-7任一项所述的包埋方法在胚乳包埋切片制备中的应用。

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