CN100482785C - 一种人卵母细胞的贮存方法 - Google Patents
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Abstract
一种人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5%～6%CO2浓度的孵箱内进行培养，以供体外受精。该方法能够提高人卵母细胞冻存后的存活率，操作简便，所需医用仪器和溶液简单、价廉，成本低、复苏率高，有利于解决人类不孕问题和计划生育国策的贯彻执行。
Description
技术领域
本发明属于生殖医学的生物医学技术领域，为一种人卵母细胞的贮存方法，确切地说，涉及一种采用缓慢降温低温冷冻和快速解冻复苏的贮存人卵母细胞方法。
背景技术
人卵母细胞的低温贮存对不育症的治疗非常重要。首先，由于在体外受精-胚胎移植(IVF-EF，in vitro fertilization and embryo transfer)技术中促超排卵技术及胚胎培养技术的提高，使得将近一半的体外受精(IVF，in vitrofertilization)治疗周期有剩余的卵母细胞，如果能将这部分人卵母细胞冻存，再经复苏后放回宫腔，可以增加受孕机会。其次，人卵母细胞的冻存具有无需及时供应精子，还可应用于对因先天缺陷或因放、化疗、手术治疗而失去卵巢功能的而不能生育的病人实施卵子赠送治疗等优点，同时也避免了伦理问题。另外，从保存生育能力的角度来看人卵母细胞的冻存比胚胎冷冻有更多的优势，尤其是对于因放、化疗、手术治疗有可能失去卵巢功能的病人，其卵母细胞的冻存是保持生育能力的唯一方式。
虽然人类精子冷冻与胚胎冷冻已十分成熟，早已常规应用临床，但是人类的卵母细胞冻融问题一直未得到解决。其主要原因是：(1)人卵母细胞是人体最大的细胞，其细胞浆十分丰富、表面积与体积比小，不易充分脱水；(2)人卵母细胞的膜通透性差，不容易脱水；(3)由于人卵母细胞处于减数分裂M II期，其膜稳定性较差及其细胞骨架(包括纺锤体等)对冷冻特别敏感，而引起复苏后存活率低及染色体异常，导致受精和发育失败；(4)处于减数分裂M II期的人卵母细胞经冻融后其减数分裂及受精形成胚胎等各项功能的恢复也很困难。
因此，如何提高人卵母细胞冻存后的存活率，及其冷冻复苏后各项功能学的恢复是目前业内人士亟待解决的问题。1986年chen等人首次报道用DMSO(二甲基亚砜)作冷冻保护剂冻存人卵母细胞，获得76％的存活率。1997年Porcu等人进行大样本的研究取得54％的存活率，并用冻融卵子经ICSI受精获得健康分娩。2002年7月在美国芝加哥地区的威斯康星大学医学院建立了美国第一卵子库，采用的方法为玻璃化超快速冻融法，虽然其复苏率为93.5％，但是其方法实施起来难度大却效果不稳定，现已有3例妊娠，库存335个卵子。另外，国内少数学者报道了他们关于卵子冷冻技术的初步实验研究结果，其复苏率为73.66％，受精率为75％，优质胚胎形成率为30.6％，6-8细胞胚胎形成率为12.24％，并得出包被的颗粒细胞有利于卵子冷冻的结论。目前世界上关于卵子冷冻的报道多是小样本量的研究，或者难度大效果不稳定，或者复苏率多在50％-90％波动，还没有可用于临床常规稳定的方法。总之，现有冷冻技术进行冻存人卵母细胞的效果很不理想，复苏率低且很不稳定。
发明内容
本发明的目的是提供一种人卵母细胞的贮存方法，该方法能够提高人卵母细胞冻存后的存活率及其减数分裂、受精形成胚胎等各项功能的恢复，操作简便、费用低；较好地解决了现有冷冻技术冻存人卵母细胞的效果不理想、复苏率低的问题。
本发明的目的是这样实现的：一种人卵母细胞的贮存方法，先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行冷冻预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后在液氮中进行低温贮存；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温解冻并使其复苏；再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％二氧化碳浓度的孵箱内进行复苏后培养，以供体外受精；所述方法包括下列具体操作步骤：
A、冷冻预处理：取卵之后，先经2-3小时的孵育，去除人卵母细胞周围卵丘组织，再将该人卵母细胞放在冷冻保护液里进行浸泡处理；
B、程序降温冷冻和低温贮存：将预处理后的人卵母细胞装入麦管中，放入程序冷冻仪中，进行程序化缓慢降温冷冻；当温度达到设定的-175±5℃时，并稳定10-20分钟之后，将该人卵母细胞移入液氮中低温贮存，以供复苏备用；
C、快速升温解冻：从液氮中取出贮存有该人卵母细胞的麦管，先后放在室温空气中和30±3℃的水中，使之迅速升温；再将麦管擦干、剪开，取出该人卵母细胞，再先后地放入不同的解冻复苏处理液中复苏；
D、复苏后培养：将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％CO2浓度孵箱内进行培养2至2.5小时，以供体外受精。
上述的冷冻保护液包括有A液、B液和C液三种液体；
所述的A液(体积比)是用磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液稀释血清或血清替代物(SSS)所得的溶液，其血清或血清替代物体积百分含量为15～25％；
所述的B液是以A液为基础工作液配制的1，2丙二醇液，其1，2丙二醇浓度为1.0～2.0M；
所述的C液是以A液为基础工作液配制的含1，2丙二醇和蔗糖的混合液，其1，2丙二醇浓度为1.0～2.0M，蔗糖浓度为0.25～0.35M。
所述的冷冻预处理进一步包括下述操作步骤：
A1、取卵之后，经2～3小时的孵育，用酶与机械相结合的方法去除人卵母细胞周围卵丘组织，再放入培养箱培养0.5～1小时；
A2、将B液和C液二种溶液分别放在室温下平衡1～2小时后，分别取出适量置于器皿中；
A3、从培养箱中取出人卵母细胞，先将该人卵母细胞置于B液中浸泡5～15分钟后，又在C液中浸泡10～20分钟，此时开始准备程序冷冻仪。
所述步骤B中进一步包括下述操作步骤：
B1、在C液中开始将人卵母细胞装入麦管，装管方法是：用麦管依次吸C液1.5±1.0cm、空气1.5±1.0cm、含有人卵母细胞的C液2.5±1.0cm、空气1.5±1.0cm和C液1.5±1.0cm，最后进行封口，即麦管吸C液1.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→含有人卵母细胞的C液2.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→C液1.5±1.0cm→封口；
B2、将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为：从+15～25℃开始，先以-2±1.0℃/分的降温速率降到-7±0.1℃时，在无人卵母细胞液柱处植冰，又从-7±0.1℃开始继续以-0.3±0.1℃/分的降温速率缓慢降温到-30±5℃时，再以-30±5℃/分的降温速率快速降温到-175±5℃，稳定10-20分钟后，再将该装有人卵母细胞的麦管迅速移入-196℃液氮中低温贮存。
所述的解冻复苏处理液包括有上述的A液和D液、E液、F液；
所述的D液是以A液为基础工作液配制的含1，2丙二醇和蔗糖的混合液，其1，2丙二醇浓度为0.5～1.5M，蔗糖浓度为0.25～0.35M；
所述的E液是以A液为基础工作液配制的含含1，2丙二醇和蔗糖的混合液，其1，2丙二醇浓度为0.2～1.2M，蔗糖浓度为0.25～0.35M；
所述的F液是以A液为基础工作液所配制的蔗糖液，其蔗糖浓度为0.25～0.35M。
所述步骤C中进一步包括下述快速升温解冻的操作步骤：
C1、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤F液、E液和D液，以供备用；
C2、将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中30～50秒后，再置于30±3℃水中浸泡30～50秒；
C3、将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后分别置于D液和E液中各2～10分钟；再将其先后分别置于F液和A液中各5～15分钟，然后将该人卵母细胞移入已在37±0.2℃孵箱中平衡的A液中平衡5～15分钟。
所述步骤D中孵箱内进行培养的时间为2至2.5小时，经培养后以供体外受精。
本发明的人卵母细胞的贮存方法具有科学合理性，成功率较高。首先，在该方法的预处理过程中，由于采用对人卵母细胞周围的卵丘组织(即包被的颗粒细胞)进行去除的方法，有利于人卵母细胞冷冻复苏后的存活，并能使以后的受精分裂发育成胚胎的潜力得到充分发挥。其主要原因颗粒细胞的保留影响着人卵母细胞冷冻过程中脱水及复苏过程中的再水化。参见表一。
表一 卵母细胞周围的颗粒细胞去除与否对冻融结果的影响
| 组别 | A组 | B组 | C组 |
| 存活率 | 93％ | 96％ | 6％ |
| 受精率 | 82％ | 80％ | 0 |
| 优质胚胎形成率 | 89％ | 90％ | 0 |
从表1中明显可知，较完全去除颗粒细胞或保留2～3层颗粒细胞与完全不去除颗粒细胞有着完全不同的结果，并且较完全去除颗粒细胞和保留2～3层颗粒细胞的人卵母细胞在冷冻后的存活率分别达到93％和96％，其受精率和优质胚胎率分别可达82％、80％和89％、90％。在该方法中冷冻保护液，如C液，其蔗糖浓度采用0.25M～0.35M，尤以0.3M为最佳，更有利于人卵母细胞解冻复苏后的形态及功能恢复，从而使人卵母细胞存活率、优质卵子获得率、受精率及优质胚胎形成率达到较高且稳定(参见表二)。
表二 冷冻保护液中不同的蔗糖浓度对人卵母细胞冻融结果的影响
| 组别 | A组(∠0.25M) | B组(0.25～0.35M) |
| 总存活率 | ∠30％ | 91％ |
| 优质卵子获得率 | ∠24％ | 90％ |
| 受精率 | ∠69％ | 81％ |
| 优质胚胎形成率 | ∠13％ | 89％ |
从表二的实验结果表明，浓度太低或太高对人卵母细胞冷冻后的复苏均有较大的影响(有关浓度太高的实验数据表中没有给出)。另外，人卵母细胞冷冻前在冷冻保护液中暴露的时间选用科学，如先在B液中浸泡5～15分钟再在C液中浸泡10～20分钟，有利细胞内外渗透压达到平衡并充分脱水，能防止冷冻保护液对细胞的毒性作用。从而有利提高人卵母细胞的存活率以及之后的受精率和优质胚胎形成率(参见表三)。
表三 卵母细胞冷冻前在冷冻液中的平衡时间对冻融结果的影响
| 组别 | A组(∠15min) | B组(15～35min) |
| 存活率 | ∠58％ | 91％ |
| 受精率 | ∠69％ | 81％ |
| 优质胚胎形成率 | ∠25％ | 89％ |
由于暴露时间过长，将对细胞产生毒性作用，不利于细胞的存活。经实验证明，暴露时间过长，细胞的存活率将降低。其次，在解冻复苏中复苏处理液，蔗糖浓度采用0.25M～0.35M，尤以0.3M为最佳，也有利于冷冻的人卵母细胞的复苏。再者，在复苏培养中，其复苏后的培养时间控制在2～2.5小时，之后再进行受精，有利于冷冻复苏后人卵母细胞减数分裂及以后受精分裂发育成胚胎的潜力恢复，从而提高了优质胚胎的形成率(参见表四)。
表四 复苏后不同培养时间对人卵母细胞冻融结果的影响
| 组别 | A组(<1.5h) | B组(1.5～2.5h) | C组(>2.5h) |
| 总存活率 | 91％ | 91％ | 91％ |
| 优质卵子获得率 | 89％ | 89％ | 89％ |
| 受精率 | ∠54％ | 63％ | 81％ |
| 优质胚胎形成率 | ∠47％ | 60％ | 89％ |
总之，本发明是一种对人卵母细胞采用慢冻快融的贮存方法。通过该冷冻复苏方法经冷冻复苏后的人卵母细胞的存活率可稳定在90％左右，复苏卵经ICSI后的受精率82％，受精胚胎分裂率93％，优质胚胎的形成率89％，6-8细胞胚胎形成率87％，染色体核性型分析未发现非整倍体现象。该人卵母细胞冻融技术已达到了国际先进水平，临床应用效果显著其临床妊娠率达47％，近似于试管婴儿新鲜胚胎移植周期(即未经卵子冷冻的治疗周期)的成功率。该方法不仅提高人卵母细胞冻存后的存活率及其复苏后受精、分裂、发育成胚胎的潜力，而且操作简便，所需医用仪器和溶液简单、价廉，成本低，有利于解决人类不孕问题和计划生育国策的贯彻执行。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
参见图1，本发明是一种人卵母细胞的贮存方法，该方法是先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行浸泡冷冻预处理1，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后低温贮存于液氮中，即降温冷冻和低温贮存2；在需要使用时，先使该人卵母细胞快速升温解冻3，使之复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％二氧化碳CO2浓度的孵箱内进行培养4，以供体外受精。
下面结合本发明的实施例具体介绍人卵母细胞的贮存方法。
先说明第一个实施例的具体操作步骤：
首先，将上述的B液和C液分别放在室温下平衡1.5小时以后，分别取出1.5ml置于无菌器皿中；然后从培养箱中取出人卵母细胞，将去除了卵丘组织的卵母细胞置于上述B液中浸泡15分钟后，又在C液中浸泡12分钟；同时启动程序冷冻仪。上述的A液、B液和C液可通过如下方式进行配制：将42ml的人体输卵管液缓冲液HTF-HEPES(选用现有产品，为医学实验中通常用品，下同)与7.4ml的人体血清(也选用现有产品，为医学实验中的通常用品，下同)混合配制成血清体积百分含量为15％的溶液，即A液；接着将8.5ml的A液与1.0ml浓度为9.5M的PROH液混合配制成1.0M的PROH溶液，即B液；又在8.5ml的A液加入1.0ml浓度为9.5M的PROH液和0.975gSucrose(分子量为342)混合配制成含1.0MPROH与0.3Msucrose的混合液，即C液；再用过滤器(其筛孔规格为0.22微米)先后顺序过滤B液和C液，即可。最后，剩余溶液可以放入4℃冰箱内，保存期为一周。
然后进行程序降温冷冻处理：在C液中浸泡到12分钟时取出该人卵母细胞装入麦管，具体装管方法是：用麦管吸C液2.5cm→空气2.0cm→其中含有人卵母细胞的C液3.0cm→空气2.0cm→C液2.5cm→封口。此时，将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为：从+18℃开始，先以-1.5℃/分的降温速率降到-7℃时，维持2分钟后，在无人卵母细胞液柱的地方植冰(seeding)，再保持10分钟后，又从-7℃开始继续以-0.3℃/分的降温速率缓慢地降温到-30℃时，再以-30℃/分的降温速率快速降温到-172℃低温，在稳定10分钟后，将该装有人卵母细胞的麦管移入液氮(-196℃)低温贮存。
在进行体外受精而取出低温贮存的人卵母细胞之前，首先应量取所需的有效的D液、E液和F液。有关D液、E液和F液可通过以下方式来进行配制：用上述方式进行配制的A液9.2ml并加入0.8ml浓度为10M的PROH液和0.855g Sucrose混合配置成0.8M的PROH与0.25M的Sucrose混合液，即D液；再用上述方式配制的9.6mlA液并加入0.4ml浓度为10M的PROH液和0.855gSucrose混合配置成含0.4M的PROH与0.25M的Sucrose混合液，即E液；还用通过上述方式配制的9mlA液和0.855g Sucrose混合配制成含0.25MSucrose的溶液，即F液；最后用筛孔为0.22微米的过滤器先后顺序过滤F液、E液和D液，以供备用。
解冻复苏的步骤是：先将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中35秒后，再置于30℃水中浸泡45秒；再将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后置于D液和E液中各5分钟；又将其先后分别放置于F液和A液中各15分钟，然后将人卵母细胞移入已在37℃孵箱中平衡的A液中放置15分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37℃、5％CO2浓度的孵箱中培养2小时后，取出进行卵胞浆内单精子显微注射受精。
本发明另一个实施例的具体操作步骤是：
首先，将上述的B液和C液分别放在室温下平衡2小时以后，分别取出1.2ml置于无菌器皿中；然后从培养箱中取出人卵母细胞，将去除了卵丘的卵母细胞置于上述B液中浸泡7分钟后，又在C液中浸泡20分钟；同时启动程序冷冻仪。上述的A液、B液和C液可通过以下方式制作：将42ml的人体输卵管液缓冲液HTF-HEPES与14ml的人体血清混合配制成血清体积百分含量为15％的溶液，即A液；接着将8.0ml的A液与2.0ml浓度为10M的PROH液混合配制成2.0MPROH的溶液，即B液；又取8.0ml的A液在其中加入2.0ml浓度为10M的PROH液和1.197g Sucrose混合配制成含2.0MPROH与0.35MSucrose的混合液，即C液；再用过滤器(其筛孔规格为0.22微米)先后顺序过滤B液和C液，以供备用。
然后进行程序降温冷冻处理：在C液中浸泡到20分钟时取出该人卵母细胞装入麦管，具体装管方法是：用麦管吸C液2.0cm→空气2.5cm→其中含有人卵母细胞的C液2.5cm→空气2.5cm→C液2.0cm→封口。此时，将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为：从+24℃开始，先以-2.5℃/分的降温速率降到-7℃时，维持3分钟后，在无人卵母细胞液柱的地方植冰(seeding)，再保持10分钟后，又从-7℃开始继续以-0.4℃/分的降温速率缓慢地降温到-35℃时，再以-35℃/分的降温速率快速降温到-180℃低温，在稳定15分钟后，将该装有人卵母细胞的麦管移入液氮(-196℃)中低温贮存。
在需要进行体外受精而取出低温贮存的人卵母细胞之前，首先应量取所需的有效的D液、E液和F液。有关A液、D液、E液和F液可通过以下方式来进行配制：先用42ml的HTF-HEPES人体输卵管液缓冲液与14ml的人体血清混合配制成血清体积百分含量为25％的溶液，即A液；接着，将8.5ml的A液加入1.5ml浓度为10M的PROH液和1.197g Sucrose混合配置成含1.5M的PROH与0.35M的Sucrose混合液，即D液；再将9ml的A液加入1ml浓度为10M的PROH液和1.197gSucrose混合配置成含1.0M的PROH与0.35M的Sucrose混合液，即E液；还用9ml的A液和1.197g Sucrose混合配制成含0.35MSucrose的溶液，即F液；最后用筛孔为0.22微米的过滤器先后顺序过滤F液、E液和D液，以供备用。
解冻复苏的步骤是：先将冷冻麦管从液氮取出，置于室温空气中45秒后，再置于32℃水中浸泡35秒；再将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后置于D液和E液中各8分钟；又将其先后分别放置于F液和A液中各8分钟，然后将人卵母细胞移入已在37℃孵箱中平衡的A液中放置10分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37℃、5％CO2浓度的孵箱中培养2.5小时后，取出进行卵胞浆内单精子显微注射受精。
上述实施例中，B液、C液与D液、E液的配制过程中，所采用的PROH浓度不一致，只是为了说明其配制方法可采用不同的技术手段。
本发明中所用的机械设备均为现有的通用设备，在此不再说明。
本发明已经试验实施多次，试验的结果是成功的，实现了发明目的。
Claims (4)
1、一种人卵母细胞的贮存方法，先把人卵母细胞放在含有蔗糖和1，2丙二醇的冷冻保护液里进行冷冻预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后在液氮中进行低温贮存；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温解冻并使其复苏，以供体外受精；其特征在于：所述方法包括下列具体操作步骤：
A、冷冻预处理：取卵之后，先经2-3小时的孵育，去除人卵母细胞周围卵丘组织，再将该人卵母细胞放在冷冻保护液里进行浸泡处理；
该冷冻保护液包括有A液、B液和C液三种液体；其中A液是用磷酸盐缓冲液或输卵管液缓冲液稀释血清或血清替代物所得的溶液，其血清或血清替代物的体积百分含量为15～25％；B液是以A液为基础工作液配制的1，2丙二醇溶液，其1，2丙二醇的浓度为1.0～2.0M；C液是以A液为基础工作液配制的1，2丙二醇和蔗糖的混合液，其1，2丙二醇的浓度为1.0～2.0M，蔗糖的浓度为0.25～0.35M；
上述的浸泡处理是先在上述的B液中浸泡5～15分钟后，再在上述的C液中浸泡10～20分钟；
B、程序降温冷冻和低温贮存：将预处理后的人卵母细胞装入麦管中，放入程序冷冻仪中，进行缓慢降温冷冻；当温度达到设定的-175±5℃时，并稳定10～20分钟之后，将该人卵母细胞移入液氮中低温贮存，以供复苏备用；
C、快速升温解冻：从液氮中取出贮存有该人卵母细胞的麦管，先后放在室温空气中30～50秒和30±3℃的水中30～50秒，使之迅速升温；再将麦管擦干、剪开，取出该人卵母细胞，再先后地放入不同的解冻复苏处理液中复苏；
该解冻复苏处理液包括有上述的A液，和D液、E液、F液；其中，D液是以上述的A液为基础工作液配制的含1，2丙二醇和蔗糖的混合液，其1，2丙二醇浓度为0.5～1.5M，其蔗糖浓度为0.25～0.35M；E液是以A液为基础工作液配制的含1，2丙二醇和蔗糖的混合液，其1，2丙二醇浓度为0.2～1.2M，蔗糖浓度为0.25～0.35M；F液是以A液为基础工作液所配制的蔗糖液，其蔗糖浓度为0.25～0.35M；
上述的复苏处理是先将人卵母细胞先后置于上述的D液和E液中各2～10分钟，再将其置于上述的F液和A液中各5～15分钟，最后置于已在37±0.2℃孵箱中平衡的A液中5～15分钟。
2、根据权利要求1所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述的冷冻预处理进一步包括下述操作步骤：
A1、取卵之后，经2-3小时的孵育，用酶与机械相结合的方法去除人卵母细胞周围卵丘组织，再放入培养箱培养0.5-1小时；
A2、将B液和C液二种溶液分别放在室温下平衡1～2小时后，分别取出适量置于器皿中；
A3、从培养箱中取出人卵母细胞，先将该人卵母细胞置于B液中浸泡5～15分钟后，又在C液中浸泡10～20分钟，此时开始准备程序冷冻仪。
3、根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述步骤B中进一步包括下述操作步骤：
B1、在C液中开始将人卵母细胞装入麦管，装管方法是：用麦管依次吸C液1.5±1.0cm、空气1.5±1.0cm、含有人卵母细胞的C液2.5±1.0cm、空气1.5±1.0cm和C液1.5±1.0cm，最后进行封口；
B2、将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行降温冷冻，其降温程序为：从+15～25℃开始，先以-2±1.0℃/分的降温速率降到-7±0.1℃时，在无人卵母细胞液柱处植冰，又从-7±0.1℃开始继续以-0.3±0.1℃/分的降温速率缓慢降温到-30±5℃时，再以-30±5℃/分的降温速率快速降温到-175±5℃，稳定10-20分钟后，再将该装有人卵母细胞的麦管迅速移入-196℃液氮中低温贮存。
4、根据权利要求3所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述步骤C中进一步包括下述快速升温解冻的操作步骤：
C1、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤F液、E液和D液，以供备用；
C2、将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中30～50秒后，再置于30±3℃水中浸泡30～50秒；
C3、将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后置于D液和E液中各2～10分钟；再将其先后置于F液和A液中各5～15分钟，然后将该人卵母细胞移入已在37±0.2℃孵箱中平衡的A液中5～15分钟。
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| 采用序贯培养法提高体外受精－胚胎移植的妊娠率. 刘丽等.中国优生与遗传杂志，第9卷第5期. 2001 |
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