CN100582221C - 滇紫草细胞的超低温冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种滇紫草细胞超低温冻存保藏的方法。其操作步骤主要包括：1.细胞冻存前预处理和脱水过程；2.细胞在液氮中的冻存阶段；3.冻存细胞的解冻过程；4.细胞解冻后的复苏培养。利用该超低温冻存方法对滇紫草细胞进行保藏，细胞解冻后可以获得较高的存活率，是保存滇紫草种质资源的有效手段。

Description

滇紫草细胞的超低温冻存方法
技术领域
本发明涉及一种能将滇紫草细胞超低温冻存保藏的方法。
背景技术
滇紫草(Onosmapaniculatum Bur.et Fr.)主产云南，是云南省本地常用中草药，属紫草科(Boraginaceae)植物，其根药用。主要有效成分为紫草素及其衍生物，这些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多种药理作用，而且还作为天然色素广泛用于医药、化妆品和印染工业。目前，滇紫草的野生资源破坏严重，市场上供需矛盾凸显。而利用植物细胞大规模培养技术在反应器中直接培养细胞获得药用次生代谢产物是将来生产植物药最直接、最有效的手段。开展细胞培养技术，最重要的就是要筛选出一个品质好的细胞株系。细胞株经过长时间继代培养后，品质会退化。因此，必须找到一种方法，在保证原有细胞品质的前提下，把细胞长时间保存下来。
目前，保存活细胞最有效的方法就是液氮超低保藏法。这种方法以有机溶剂作为保护剂，在液氮超低温(-196℃)下保藏。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。使用液氮超低温保藏法的关键问题在于：1.保护剂组分和各组分浓度的选择；2.超低温保藏冷冻阶段和解冻复苏阶段的操作步骤。以上两点决定着保藏的最终效果，是超低温保藏过程的技术的重点和难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效实现滇紫草细胞超低温冻存保藏的方法。
该方法的操作步骤如下：
1)滇紫草细胞的继代培养：用继代培养基，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25℃，避光培养；
2)滇紫草细胞超低温处理前的预培养：将继代培养8-11天的细胞转移至含5-10％二甲亚砜(DMSO)的继代培养基上预培养4-8天；
3)脱水处理：以甘油15-30％、乙二醇10-20％、二甲亚砜5-10％、MS基础培养基余量和蔗糖0.3-0.6mol/L为组分，配成冷冻保护剂，将细胞放入15-25℃冷冻保护剂中处理15-30min，然后在0℃预冷30min；
4)冷冻过程：将预冷好的细胞和冷冻保护剂一块投入液氮中冻存；
5)解冻过程：从液氮中取出冻存细胞，在10-25℃水浴中进行解冻，然后用含0.5-1.0mol/L蔗糖浓度MS培养基对细胞进行洗涤，去除冷冻保护剂；
6)细胞的复苏：解冻后，经过洗涤的细胞转入继代培养基中进行恢复培养。
本发明内容的关键点在于：1.细胞预培养过程DMSO浓度和培养时间的确定；2.脱水处理时，冷冻保护剂各组分浓度的确定以及脱水温度和时间的选择；3.解冻温度选择，以及洗涤溶液蔗糖浓度的调整。以上关键点如能把握好，细胞复苏后，可以获得满意的细胞成活率。
本发明操作简便，冻存效果好，采用文中所述方法对滇紫草细胞进行冻存，解冻后，细胞存活率高，复苏的细胞可以长期继代培养，是保存滇紫草种质资源的有效方法。
具体实施方式
下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。
实施例1：
1)滇紫草细胞的继代培养：继代培养基为：MS基础培养基+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25℃，避光培养；
2)滇紫草细胞超低温处理前的预培养：将继代培养9天的细胞转移至含5％二甲亚砜(DMSO)的继代培养基(与上述继代培养基相同)上预培养6天；
3)脱水处理：以20％甘油+10％乙二醇+10％二甲亚砜+60％MS基础培养基+0.3mol/L蔗糖为组分，配成冷冻保护剂，将细胞放入20℃冷冻保护剂中处理15min，然后在0℃预冷30min；
4)冷冻过程：将预冷好的细胞和冷冻保护剂一块投入液氮中冻存；
5)解冻过程：从液氮中取出冻存细胞，在20℃水浴中进行解冻，然后用20℃的1.0mol/L蔗糖浓度MS培养基对细胞进行洗涤，去除冷冻保护剂；
6)细胞的复苏：解冻后，经过洗涤的细胞转入继代培养基(MS基础培养基+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L)中进行恢复培养。经过上述冻存处理的滇紫草细胞存活率为71％。
实施例2：
1)滇紫草细胞的继代培养：继代培养基为：MS基础培养基+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25℃，避光培养；
2)滇紫草细胞超低温处理前的预培养：将继代培养10天的细胞转移至含9％二甲亚砜(DMSO)的继代培养基(与上述继代培养基相同)上预培养4天；
3)脱水处理：以25％甘油+10％乙二醇+8％二甲亚砜+57％MS基础培养基+0.4mol/L蔗糖为组分，配成冷冻保护剂，将细胞放入15℃冷冻保护剂中处理20min，然后在0℃预冷30min；
4)冷冻过程：将预冷好的细胞和冷冻保护剂一块投入液氮中冻存；
5)解冻过程：从液氮中取出冻存细胞，在25℃水浴中进行解冻，然后用25℃的0.8mol/L蔗糖浓度MS培养基对细胞进行洗涤，去除冷冻保护剂；
6)细胞的复苏：解冻后，经过洗涤的细胞转入继代培养基(MS基础培养基+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L)中进行恢复培养。经过上述冻存处理的滇紫草细胞存活率为65％。
实施例3：
1)滇紫草细胞的继代培养：继代培养基为：MS基础培养基+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25℃，避光培养；
2)滇紫草细胞超低温处理前的预培养：将继代培养11天的细胞转移至含10％二甲亚砜(DMSO)的继代培养基(与上述继代培养基相同)上预培养8天；
3)脱水处理：以30％甘油+20％乙二醇+5％二甲亚砜+45％MS基础培养基+0.6mol/L蔗糖为组分，配成冷冻保护剂，将细胞放入25℃冷冻保护剂中处理30min，然后在0℃预冷30min；
4)冷冻过程：将预冷好的细胞和冷冻保护剂一块投入液氮中冻存；
5)解冻过程：从液氮中取出冻存细胞，在10℃水浴中进行解冻，然后用10℃的0.5mol/L蔗糖浓度MS培养基对细胞进行洗涤，去除冷冻保护剂；
6)细胞的复苏：解冻后，经过洗涤的细胞转入继代培养基(MS基础培养基+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L)中进行恢复培养。经过上述冻存处理的滇紫草细胞存活率为52％。

Claims (1)

1.一种滇紫草细胞超低温冻存方法，其特征在于该方法的操作步骤包括：
1)滇紫草细胞的继代培养：用继代培养基，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25℃，避光培养；
2)滇紫草细胞超低温处理前的预培养：将继代培养8-11天的细胞转移至含5-10％二甲亚砜的继代培养基上预培养4-8天；
3)脱水处理：以甘油15-30％、乙二醇10-20％、二甲亚砜5-10％、MS基础培养基余量和蔗糖0.3-0.6mol/L为组分，配成冷冻保护剂，将细胞放入15-25℃冷冻保护剂中处理15-30min，然后在0℃预冷30min；
4)冷冻过程：将预冷好的细胞和冷冻保护剂一块投入液氮中冻存；
5)解冻过程：从液氮中取出冻存细胞，在10-25℃水浴中进行解冻，然后用含0.5-1.0mol/L蔗糖浓度MS培养基对细胞进行洗涤，去除冷冻保护剂；
6)细胞的复苏：解冻后，经过洗涤的细胞转入继代培养基中进行恢复培养；
上述继代培养基成分为：MS基础培养基+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102590417A (zh) * 2012-01-30 2012-07-18 云南民族大学 一种低温提取植物药中无机阴离子及离子色谱分析方法
CN103146580B (zh) * 2013-03-07 2015-02-25 西北民族大学 厌氧超低温菌种保藏剂
CN117136833B (zh) * 2023-08-18 2024-05-24 生态环境部华南环境科学研究所(生态环境部生态环境应急研究所) 一种围氏马尾藻种质保存方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1572870A (zh) * 2003-05-30 2005-02-02 北京大学第一医院 一种人卵母细胞的贮存方法
CN1670193A (zh) * 2005-02-05 2005-09-21 胡军祥 生物组织细胞玻璃化冻存液
CN1857312A (zh) * 2006-03-28 2006-11-08 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 红细胞深低温保存预处理液、冷冻保护液及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1572870A (zh) * 2003-05-30 2005-02-02 北京大学第一医院 一种人卵母细胞的贮存方法
CN1670193A (zh) * 2005-02-05 2005-09-21 胡军祥 生物组织细胞玻璃化冻存液
CN1857312A (zh) * 2006-03-28 2006-11-08 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 红细胞深低温保存预处理液、冷冻保护液及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
滇紫草愈伤组织培养与紫草素产生. 周立刚等.云南植物研究，第13卷第3期. 1991
滇紫草愈伤组织培养与紫草素产生. 周立刚等.云南植物研究，第13卷第3期. 1991 *
生产培养基中寡糖素对滇紫草愈伤组织培养的影响. 周立刚等.天然产物研究与研发，第4卷第2期. 1992
生产培养基中寡糖素对滇紫草愈伤组织培养的影响. 周立刚等.天然产物研究与研发，第4卷第2期. 1992 *

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