WO2022246746A1 - 玻璃化冷冻液套装及其制备方法和应用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention provides a vitrification liquid suit, which is composed of freezing balance liquid I, freezing balance liquid II and freezing liquid; every 1L of freezing balance liquid I is composed of the following components: ethylene glycol 3 ⁇ 4% (v/v), human serum albumin substitute 0.6% (v/v), trehalose 0.05M, base solution 95.4 ⁇ 96.4% (v/v); each 1L frozen balance solution II consists of the following components Composition: Ethylene glycol 15-20% (v/v), human serum albumin substitute 1.2% (v/v), trehalose 0.25M, base fluid 78.8-83.8% (v/v); per 1L of frozen liquid It consists of the following components: ethylene glycol 30-40% (v/v), human serum albumin substitute 6% (v/v), trehalose 0.5M, polyvinylpyrrolidone 30-80g (w/v), Base fluid 54-64% (v/v);
- A1 Measure the base solution, ethylene glycol, and human serum albumin substitute according to the ratio of frozen balance solution I, weigh trehalose, and add ethylene glycol, human serum albumin substitute, and trehalose to the base solution Mix well to obtain frozen balance solution I;
- A4 Sterilize and filter the obtained frozen balance solution I, frozen balance solution II and frozen solution into sterile PP tubes and package them.
- B2 Take out the gonad tissue and place it on the carrier, quickly use sterile gauze to gently absorb the freezing liquid on the surface of the tissue, and put the gonad tissue together with the carrier into a container containing liquid nitrogen;
- the gonad tissue is an ovarian cortex slice
- each 1L of the transport solution is composed of the following components: human serum albumin substitute 6% (v/v), penicillin and streptomycin mixed solution 1% (v/v ), base fluid 93% (v/v).
- the volume percentage of the human serum albumin substitute in the transport liquid is the same as the volume ratio of the human serum albumin substitute in the freezing liquid, and the addition of penicillin and streptomycin mixed solution in the transport liquid mainly plays the role of inhibiting bacterial growth. effect.
- the above application also includes a thawing step, the thawing step is:
- the thawing solution I is composed of the following components: human serum albumin substitute 6% (v/v), sucrose 0.5M, base liquid 94% (v/v);
- the thawing solution II is composed of the following components: Composition: human serum albumin substitute 6% (v/v), sucrose 0.25M, base fluid 94% (v/v);
- the thawing solution III is composed of the following components: human serum albumin substitute 6% (v/v), sucrose 0.125M, base liquid 94% (v/v); described thawing liquid IV is made up of following components: human serum albumin substitute 6% (v/v), base liquid 94% ( v/v).
- the preparation method of the thawing liquid I is as follows: measure the base liquid and the human serum albumin substitute according to the proportion, weigh the sucrose, add the human serum albumin substitute and the sucrose into the base liquid and mix evenly to obtain Thawing solution I;
- the preparation method of the thawing liquid II is as follows: measure the base liquid and the human serum albumin substitute according to the ratio, weigh the sucrose, add the human serum albumin substitute and the sucrose into the base liquid and mix evenly to obtain the thawing liquid II ;
- the preparation method of the thawing liquid III is as follows: measure the base liquid and the human serum albumin substitute according to the ratio, weigh the sucrose, add the human serum albumin substitute and the sucrose into the base liquid and mix evenly to obtain the thawing liquid III
- the preparation method of the thawing liquid IV is as follows: measure the base liquid and the human serum albumin substitute according to the proportion, add the human serum albumin substitute into the base liquid and mix well to obtain the thawing liquid IV.
- thawed solution I, thawed solution II, thawed solution III and thawed solution IV were sterilized and filtered, then distributed into sterile PP tubes and packaged.
- the beneficial effect of the present invention is: compared with the prior art, the vitrification effect of the vitrification solution set of the present invention on human gonadal tissue, especially ovarian tissue, is equivalent to that of currently imported vitrification refrigerants.
- the invented vitrification liquid set and thawing liquid set can completely replace imported products and reduce costs.
- the vitrification liquid set of the present invention also has the following advantages compared with the current imported reagents from Japan: the total freezing time of the Japanese Kato product is 40 minutes, and the total freezing time of the vitrification liquid set of the present invention is only 5 to 15 minutes. The total freezing time is only about 1/8-3/8 of the imported reagents, which greatly improves the work efficiency.
- the invention provides a vitrification liquid set, which comprises a freezing balance liquid and a freezing liquid.
- the freezing balance liquid is based on the M199 tissue culture liquid buffered by 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid (HEPES).
- HEPES 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid
- ethylene glycol (EG), human serum albumin substitute (SSS) and trehalose the freezing solution is based on M199 tissue culture medium buffered with 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid (HEPES), and contains
- the ingredients are: ethylene glycol (EG), human serum albumin substitute (SSS), trehalose and polyvinylpyrrolidone (PVP); wherein, the frozen balance solution has two concentrations (freeze balance solution I and freeze balance solution II) , wherein every 1L of frozen balance solution I consists of the following components: ethylene glycol 3-4% (v/v), human serum albumin substitute 0.6% (v/v
- the vitrification thawing liquid set provided by the present invention adopts the sucrose concentration gradient defreezing method, and the thawing liquid set includes thawing liquid I, thawing liquid II, thawing liquid III and thawing liquid IV; thawing liquid I, thawing liquid II, and thawing liquid III are 4 -Hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid-buffered M199 tissue culture medium is the basic solution, and its ingredients include: sucrose, human serum albumin substitute; thawing solution IV is buffered with 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid M199 tissue culture medium is the basic solution, and its ingredients are human serum albumin substitutes without sucrose.
- the invention provides a method for preparing a vitrification liquid suit, comprising the following steps:
- the preparation method of the vitrification thawing solution suit comprises the following steps:
- Preparation of the thawing solution I measure the base solution and human serum albumin substitute according to the ratio, weigh the sucrose, add the human serum albumin substitute and sucrose into the base solution and mix well to obtain the thawing solution I;
- Preparation of thawing solution II Measure the base solution and human serum albumin substitute according to the ratio, weigh sucrose, add the human serum albumin substitute and sucrose into the base solution and mix well to obtain thawing solution II;
- Preparation of thawing solution III Measure the base solution and human serum albumin substitute according to the ratio, weigh sucrose, add the human serum albumin substitute and sucrose into the base solution and mix well to obtain thawing solution III;
- Preparation of the thawing solution IV measure the base solution and the human serum albumin substitute according to the ratio, add the human serum albumin substitute to the base solution and mix well to obtain the thawing solution IV.
- thawed solution I, thawed solution II, thawed solution III and thawed solution IV were sterilized and filtered and distributed into sterile PP tubes and packaged.
- the ovarian cortex slices are transferred from the transport solution to the frozen balance solution I, and left to stand for 3 minutes, then transferred to the frozen balance solution II, left to stand for 1 minute, then transferred to the frozen solution, and left to stand After 1 minute, the ovarian cortex slices were taken out and placed on the metal grid carrier, and the freezing liquid on the surface of the ovarian cortex slices was quickly sucked gently with sterile gauze, and the ovarian cortex slices together with the metal grid carrier were put into the foam filled with liquid nitrogen.
- Each 1L transport solution consists of the following components: human serum albumin substitute 6% (v/v), penicillin and streptomycin mixed solution 1% (v/v), base solution 93% (v/v). Measure the base solution, human serum albumin substitute and penicillin-streptomycin mixed solution according to the proportion of the transport solution, add the human serum albumin substitute and penicillin-streptomycin mixed solution into the base solution and mix well to obtain the transport solution .
- Embodiment 2 Preparation of vitrification liquid set
- the preparation of the vitrification solution set is illustrated by the preparation of the vitrification solution set 2.
- the above-mentioned frozen balance liquid I, frozen balance liquid II and frozen liquid are sterilized and filtered in a 100-grade isolator;
- Embodiment three the vitrification and thawing set used in conjunction with embodiment two, including the components and proportions of thawing solution I, thawing solution II, thawing solution III and thawing solution IV
- Embodiment four the preparation of the vitrification thawing solution set in the example three
- vitrified thawed solution I vitrified thawed solution II, vitrified thawed solution III, and vitrified thawed solution IV in a class 100 isolator;
- the vitrification liquid set of the present invention is frozen and resuscitated in ovarian cortex slices
- the normal primitive follicle rate, microvessel density, and Bcl-2/Bax expression of ovarian cortex slices are equivalent to those of Japanese KATO products, and the difference is not statistically significant , indicating that the vitrification liquid and thawing liquid set of the present invention can completely replace the currently imported KATO products, and can no longer rely on imports to reduce costs.
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Abstract
本发明公开了一种玻璃化冷冻液套装及其制备方法和应用，应用于人体性腺组织，尤其是卵巢组织，玻璃化冷冻液套装包括冷冻平衡液和冷冻液，冷冻平衡液内由乙二醇、人血清白蛋白替代品、海藻糖和基础液组成；冷冻液由乙二醇、人血清白蛋白替代品、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和基础液组成。本发明还公开了与玻璃化冷冻液套装相配套应用的解冻液套装。本发明的玻璃化冷冻液套装应用于人性腺组织，尤其是卵巢组织的冷冻和保存，其玻璃化冷冻效果与目前进口的玻璃化冷冻剂冷冻效果相当，完全可以替代进口产品，降低成本，而且冷冻总时间仅约为进口试剂的1/8～3/8，大大提高了工作效率。
Description
本发明涉及冷冻技术领域，尤其涉及一种玻璃化冷冻液套装及其制备方法和应用。
世界卫生组织公布的《世界癌症报告》显示2018年全球新增860万例女性癌症患者，其中乳腺癌是最常见的癌症类型，占女性癌症病例的近1/4。而约70％的育龄期女性在诊断为乳腺癌时仍有生育意愿。众所周知，大多数癌症治疗，如化疗、放疗或两者的结合都是对性腺有生殖毒性的。因而对年轻的肿瘤患者进行生育力保护迫在眉睫。
生育力保护的方法包括卵母细胞冷冻、胚胎冷冻和卵巢组织冷冻。与传统的卵母细胞和胚胎冷冻保存相比，卵巢组织的冷冻保存存在一定的优势。第一，它不需要刺激卵巢，减少了激素暴露，同时卵巢组织可以在癌症诊断时立即获得，对患者的癌症治疗计划造成最小的干扰。第二，它不需要性成熟，因此，可能是患恶性肿瘤儿童生育力保护唯一可用的方法。第三，该方法还可以恢复卵巢的内分泌功能，提高生活质量。Cesar Diaz-Garcia等认为原位OCT可以恢复卵巢功能并允许自然生育，只要移植组织存活并有功能，就可以无限量地回收卵母细胞。因而卵巢组织冷冻保存是目前最具前景性的生育力保存方法。
卵巢组织冷冻包括玻璃化冷冻和慢速冷冻。玻璃化冷冻技术近年来发展迅速，虽然玻璃化冷冻在胚胎、精子和卵子的冷冻中应用广泛并取得了良好的冷冻效果，但在卵巢组织冷冻保存中却应用较少，卵 巢组织结构复杂，包括皮质和髓质，皮质较厚，含有不同发育阶段的卵泡，卵泡之间富有梭形细胞和网状纤维。髓质为疏松结缔组织，其中有较多的弹性纤维和较大的血管。有学者认为相比慢速冷冻，玻璃化冷冻更适合用于结构复杂的组织和器官的冷冻保存。玻璃化冷冻被认为是长期保存大型组织和器官的唯一有前途的技术，玻璃化冷冻技术的发展对生物数据库和移植医学的未来有直接的影响。目前影响玻璃化成功概率的三个主要因素是：样品的粘度、冷却和升温速率和样品体积。样品的粘度是目前研究的热点，样品的粘度与冷冻保护剂的浓度和成分有关。目前玻璃化冷冻在卵母细胞、胚胎和精子的冻存中取得了很好的效果，但卵巢组织的玻璃化冷冻目前缺乏统一的方案，很多玻璃化冷冻方案是从胚胎玻璃化冷冻方案改良而来，究竟何种玻璃化冷冻液适合用于人卵巢组织玻璃化冷冻保存还无定论，处于摸索阶段，以往大部分学者较多地从卵巢组织冻融后或移植后卵泡的形态学和超微结构等方面间接地优化玻璃液，操作过程繁琐、费时费力。而对Yavin等曾报道不同浓度同组分的玻璃液在液氮低温下表现出不同的物理性状，于是通过将不同玻璃液置于ICSI针，并投入液氮中冷冻，直接观察各组玻璃液在快速降温过程中的物理状态，将其用于玻璃化冷冻液的初筛。将玻璃液置于ICSI针内，再投入液氮中，由于ICSI针的阻隔，会影响降温的速率。于是，又对该方法进行改良，采用直接液滴法观察玻璃液在快速降温和复融时的物理状态，并通过此方法对筛选出的玻璃液进行改良和优化。同时通过将经改良的玻璃液保护的卵巢组织冷冻复融后，移植于裸鼠，通过组织形态学、凋亡 和血管生成等指标评估卵巢组织的活性，验证其对卵巢组织的冷冻保存效果。
目前国内用于卵巢组织玻璃化冷冻和卵巢组织解冻复苏的试剂主要是进口的试剂(日本加藤的试剂)，价格昂贵。因此如何采用新的玻璃化冷冻和解冻试剂，替代进口，降低成本，是目前最重要的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术问题，本申请提供了一种可应用于人性腺组织，尤其是卵巢组织的玻璃化冷冻液套装，玻璃化冷冻效果与目前进口的玻璃化冷冻剂的冷冻效果相当，使得相关试剂实现国产化，不再依赖进口，降低成本。并且本申请的玻璃化冷冻液套装与现有的进口试剂相比，冷冻总时间仅约为进口试剂的1/8～3/8，大大提高了工作效率。
为实现上述目的，本发明提供一种玻璃化冷冻液套装，所述套装由冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液组成；每1L冷冻平衡液I由以下组分组成：乙二醇3～4％(v/v)、人血清白蛋白替代品0.6％(v/v)、海藻糖0.05M、基础液95.4～96.4％(v/v)；每1L冷冻平衡液II由以下组分组成：乙二醇15～20％(v/v)、人血清白蛋白替代品1.2％(v/v)、海藻糖0.25M、基础液78.8～83.8％(v/v)；每1L冷冻液由以下组分组成：乙二醇30～40％(v/v)、人血清白蛋白替代品6％(v/v)、海藻糖0.5M、聚乙烯吡咯烷酮30～80g(w/v)、基础液54～64％(v/v)；
所述基础液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的M199组织培养液。
作为优选，所述套装由冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液组 成；每1L冷冻平衡液I由以下组分组成：乙二醇3.5％(v/v)、人血清白蛋白替代品0.6％(v/v)、海藻糖0.05M、基础液95.9％(v/v)；每1L冷冻平衡液II由以下组分组成：乙二醇17.5％(v/v)、人血清白蛋白替代品1.2％(v/v)、海藻糖0.25M、基础液81.3％(v/v)；每1L冷冻液由以下组分组成：乙二醇35％(v/v)、人血清白蛋白替代品6％(v/v)、海藻糖0.5M、聚乙烯吡咯烷酮50g(w/v)、基础液59％(v/v)；
所述基础液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的M199组织培养液。
所述的玻璃化冷冻液套装由渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂组成，其中乙二醇(EG)是渗透性冷冻保护剂，EG毒性低，可快速渗透进入细胞内并且与其他冷冻剂有较好的兼容性。人血清白蛋白替代品、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮为非渗透性冷冻保护剂。非渗透性冷冻保护剂的添加可以增加玻璃化冷冻液的粘性，从而降低渗透性冷冻保护剂的浓度和降低冷冻损伤。其中海藻糖是一种具有特殊生物学特性的二糖，它能有效地保护蛋白质和其他大分子在干燥、脱水、冷冻等恶劣条件下的活性。
本发明还公开了一种制备如上文所述的玻璃化冷冻液套装的方法，所述方法包括以下步骤：
A1：按照冷冻平衡液I的配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品，称量海藻糖，将乙二醇、人血清白蛋白替代品和海藻糖加入到基础液中混匀，获得冷冻平衡液I；
A2：按照冷冻平衡液II的配比分别量取基础液、乙二醇、人血 清白蛋白替代品，称量海藻糖，将乙二醇、人血清白蛋白替代品和海藻糖加入到基础液中混匀，获得冷冻平衡液II；
A3:按照冷冻液配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品，称量海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮，将乙二醇、人血清白蛋白替代品、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮加入到基础液中混匀，获得冷冻液；
A4:将获得的冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液进行除菌过滤后分装至无菌PP管中并封装。
本发明还公开了如上文所述的玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，包括玻璃化冷冻步骤，所述玻璃化冷冻步骤为：
B1:将性腺组织从运输液中转移至冷冻平衡液I中，静置3-5分钟，然后转至冷冻平衡液II中，静置1-5分钟，再转至冷冻液中，静置1-5分钟；
B2:将性腺组织取出放置于载体上，迅速用无菌纱布轻轻吸取组织表面的冷冻液，性腺组织连同载体一同投入装有液氮的容器中；
B3:将冷冻管投进液氮中预冷，用镊子夹住载体的一端，将性腺组织连同载体装进冷冻管中，旋紧盖子，最后将冷冻管投入液氮罐中保存。
作为优选，所述性腺组织为卵巢皮质片，每1L所述运输液由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％(v/v)、青链霉素混合液1％(v/v)、基础液93％(v/v)。所述运输液中的人血清白蛋白替代品的体积百分比与所述冷冻液中的人血清白蛋白替代品的体积比相同，运输液中添加青链霉素混合液主要起到抑制细菌生长的作用。
作为优选，所述载体为金属网格载体。金属网格载体面积为1cm×2cm大小，卵巢皮质片平铺于载体，借助金属网格载体的支撑，卵巢皮质片不易漂浮于液氮表面，有利于加快冷冻的降温速率。金属网格网眼直径为70um，可增加卵巢皮质片与液氮的接触面积，网格载体投入液氮时不会出现较长时间的“沸腾”现象，提高玻璃化冷冻的降温速率。
进一步地，上述应用还包括解冻步骤，所述解冻步骤为：
C1：将冷冻管从液氮中取出，迅速将性腺组织和载体转移到解冻液I中浸泡5-8分钟；
C2：再将性腺组织转入解冻液II中停留5-8分钟后，转入解冻液III中停留5-8分钟；
C3:最后转入解冻液Ⅳ中清洗3次，每次5分钟。
作为优选，所述解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ中的人血清蛋白替代品的体积百分比与所述冷冻液中的人血清蛋白替代品的体积百分比相同。
作为优选，所述解冻液I由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％(v/v)、蔗糖0.5M、基础液94％(v/v)；所述解冻液II由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％(v/v)、蔗糖0.25M、基础液94％(v/v)；所述解冻液III由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％(v/v)、蔗糖0.125M、基础液94％(v/v)；所述解冻液IV由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％(v/v)、基础液94％(v/v)。
作为优选，所述解冻液I的制备方法为：按照配比量取基础液、 人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液I；
所述解冻液II的制备方法为：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液II；
所述解冻液III的制备方法为：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液III
所述解冻液IV的制备方法为：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，将人血清白蛋白替代品加入到基础液中混匀，获得解冻液IV。
将获得的解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液IV进行除菌过滤后分装至无菌PP管中并封装。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的玻璃化冷冻液套装对人性腺组织，尤其是卵巢组织的玻璃化冷冻效果与目前进口的玻璃化冷冻剂的冷冻效果相当，本发明的玻璃化冷冻液套装和解冻液套装完全可以替代进口产品，降低成本。同时，本发明的玻璃化冷冻液套装较之目前的日本进口试剂还具有如下的优势：日本加藤产品冷冻总时间40min，本发明的玻璃化冷冻液套装冷冻总时间仅需5～15min，玻璃化冷冻总时间仅约为进口试剂的1/8～3/8，大大提高了工作效率。
为了更清楚地表述本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地描述。
本发明提供了一种玻璃化冷冻液套装，包括冷冻平衡液和冷冻液，冷冻平衡液以4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲的M199组织培养液为基础溶液，所含成分为：乙二醇(EG)、人血清白蛋白替代品(SSS)和海藻糖；冷冻液以4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲的M199组织培养液为基础溶液，所含成分为：乙二醇(EG)、人血清白蛋白替代品(SSS)、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；其中，冷冻平衡液具有两组浓度(冷冻平衡液I和冷冻平衡液II)，其中每1L冷冻平衡液I的由以下组分组成：乙二醇3～4％(v/v)、人血清白蛋白替代品0.6％(v/v)、海藻糖0.05M、基础液95.4～96.4％(v/v)；每1L冷冻平衡液II由以下组分组成：乙二醇15～20％(v/v)、人血清白蛋白替代品1.2％(v/v)、海藻糖0.25M、基础液78.8～83.8％(v/v)；每1L冷冻液由以下组分组成：乙二醇30～40％(v/v)、人血清白蛋白替代品6％(v/v)、海藻糖0.5M、聚乙烯吡咯烷酮30～80g(w/v)、基础液54～64％(v/v)；在具体实施例中，每1L冷冻平衡液I由以下组分组成：乙二醇3.5％(v/v)、0.05M海藻糖、人血清白蛋白替代品0.6％(v/v)、基础液95.9％(v/v)；每1L冷冻平衡液II由以下组分组成：乙二醇17.5％(v/v)、人血清白蛋白替代品1.2％(v/v)、0.25M海藻糖、基础液81.3％(v/v)；每1L冷冻液由以下组分组成：乙二醇35％(v/v)、人血清白蛋白替代品6％(v/v)、海藻糖0.5M、聚乙烯吡咯烷酮50g(w/v)、基础液59％(v/v)。
本申请还提供了一种针对上述玻璃化冷冻液套装冷冻的组织进行解冻的玻璃化解冻液套装，玻璃化解冻技术是一种逆转玻璃化冷冻的过程，通过利用浓度逐级递减的解冻剂溶液，将冷冻过程中进入细胞内的冷冻保护剂用水替换出来。本发明提供的玻璃化解冻液套装采用蔗糖浓度梯度递减解冻法，解冻液套装包括解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ；解冻液I、解冻液II、解冻液III以4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的M199组织培养液为基础溶液，所含成分有：蔗糖、人血清白蛋白替代品；解冻液Ⅳ以4-羟乙基哌嗪乙磺酸为缓冲的M199组织培养液为基础溶液，所含成分为人血清白蛋白替代品，无蔗糖。其中，解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ中的人血清白蛋白替代品的体积百分比与本发明提供的冷冻液中的人血清白蛋白替代品的体积百分比相同。解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ中的蔗糖浓度按照0.5M-0.25M-0.125M-0M逐步递减，逐步将组织中冷冻保护剂用水替换出来。更为具体的是，解冻液I的各组分为：蔗糖0.5M、人血清白蛋白替代品6％(v/v)、基础液94％(v/v)；解冻液II的各组分为：蔗糖0.25M、人血清白蛋白替代品6％、基础液94％(v/v)；解冻液III的各组分为：蔗糖0.125M、人血清白蛋白替代品6％、基础液94％(v/v)；解冻液Ⅳ的各组分为：人血清白蛋白替代品6％(v/v)、基础液94％(v/v)。
本发明提供了一种制备玻璃化冷冻液套装的方法，包括以下步骤：
1.以4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的M199的组织培养液作为基础液；
2.按配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品，称量 海藻糖，将乙二醇、人血清白蛋白替代品和海藻糖加入到基础液中混匀，配制获得冷冻平衡液I；
3.按配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品、称量海藻糖，将乙二醇、人血清白蛋白替代品和海藻糖加入到基础液中混匀，配制获得冷冻平衡液II；
4.按配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品称量海藻糖、PVP，将乙二醇、人血清白蛋白替代品、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮加入到基础液中混匀，配制获得冷冻液。
5.将获得的冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液进行除菌过滤并分装至无菌PP管中并封装。
对玻璃化解冻液套装的制备方法，包括以下步骤：
以4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的M199组织培养液作为基础液；
解冻液I的制备：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液I；
解冻液II的制备：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液II；
解冻液III的制备：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液III；
解冻液IV的制备：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品， 将人血清白蛋白替代品加入到基础液中混匀，获得解冻液IV。
将获得的解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液IV进行除菌过滤并分装至无菌PP管中并封装。
在具体实施例中，将卵巢皮质片从运输液中转移至冷冻平衡液I中，静置3分钟，然后转至冷冻平衡液II中，静置1分钟，再转至冷冻液中，静置1分钟，然后将卵巢皮质片块取出放置于金属网格载体上，迅速用无菌纱布轻轻吸取卵巢皮质片表面的冷冻液，卵巢皮质片连同金属网格载体一同投入装有液氮的泡沫盒中，然后将1.8ml的冷冻管投进液氮中预冷，用镊子夹住金属网格载体的一端，将卵巢皮质片装进冷冻管中，旋紧盖子，最后将冷冻管投入液氮罐中保存。所有操作均在常温下，在百级净化区内完成。
每1L运输液由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％(v/v)、青链霉素混合液1％(v/v)、基础液93％(v/v)。按照运输液的配比量取基础液、人血清白蛋白替代品和青链霉素混合液，将人血清白蛋白替代品、青链霉素混合液加入到基础液中混匀，获得运输液。
玻璃化解冻时，将冷冻管从液氮中取出，迅速将卵巢皮质片和金属网格载体转移到解冻液I中，使卵巢皮质片从冷冻载体中分离下来，卵巢皮质片在解冻液I中停留5分钟，转入解冻液II中停留5分钟，转入解冻液III中停留5分钟，后转入解冻液Ⅳ中清洗3次，每次5分钟即可进行移植，从而得到解冻完全的卵巢皮质片。
下面通过具体的实施例来对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
工作原理：使用海藻糖、乙二醇、人血清白蛋白替代品、聚乙烯吡咯烷酮作为冷冻保护剂，使卵巢组织在冷冻降温过程中，逐渐脱水，避免冰晶形成，最终安全进入液氮中长期储存。
实施例一：玻璃化冷冻液套装的组分及其配比
玻璃化冷冻液套装1：
玻璃化冷冻液套装2：
玻璃化冷冻液套装3
实施例二：玻璃化冷冻液套装的配制
以玻璃化冷冻液套装2的配制来说明玻璃化冷冻液套装的配制。
冷冻平衡液I的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取乙二醇35mL、人血清白蛋白替代品(SSS)6mL，称量海藻糖18.9g(0.05M)，并充分溶解于959ml HEPES缓冲的M199组织培养液中得到冷冻平衡液I。
冷冻平衡液II的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取乙二醇175mL、人血清白蛋白替代品(SSS)12mL，称量海藻糖94.5g(0.25M)，并充分溶解于813ml HEPES缓冲的M199组织培养液中得到冷冻平衡液II。
冷冻液的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取乙二醇350mL、人血清白蛋白替代品(SSS)60mL，称量海藻糖189g(0.5M)、PVP(50g)，并充分溶解于590ml HEPES缓冲的M199组织培养液中得到冷冻液。
除菌过滤和分装：
用孔径为0.22微米的薄膜，在百级隔离器中将上述冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液进行除菌过滤；
在百级隔离器中将过滤后的冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液分装至无菌PP管中并封装。
实施例三：与实施例二相配套使用的玻璃化解冻套装，包括解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液IV的组分及其配比
实施例四：实例三中的玻璃化解冻液套装的配制
玻璃化解冻液I的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取人血清白蛋白替代品(SSS)60mL，蔗糖171g(0.5M)，并充分溶解于940ml HEPES缓冲的M199组织培养液中得到玻璃化解冻液I。
玻璃化解冻液II的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取人血清白蛋白替代品(SSS)60mL，蔗糖85.5g(0.25M)，并充分溶解于940ml HEPES缓冲的M199组织培养液中得到玻璃化解冻液II。
玻璃化解冻液III的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取人血清白蛋白替代品(SSS)60mL，蔗糖42.75g(0.125M)，并充分溶解于940ml HEPES缓冲的M199组织培养液中得到玻璃化解冻液III。
玻璃化解冻液IV的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取人血清白蛋白替代品(SSS)60mL并充分溶解于940ml HEPES缓冲的M199组织培养液中得到玻璃化解冻液IV。
除菌过滤和分装：
用孔径为0.22微米的薄膜，在百级隔离器中将上述玻璃化解冻液I、玻璃化解冻液II、玻璃化解冻液III、玻璃化解冻液IV进行除菌过滤；
在百级隔离器中将过滤后的玻璃化解冻液I、玻璃化解冻液II、玻璃化解冻液III、玻璃化解冻液IV分装至无菌PP管中并封装。
实施例五：玻璃化冷冻液套装和解冻液套装对卵巢皮质片进行相关实验：
以本发明所述三种配比的玻璃化冷冻液套装和日本Kitazato冷冻液套装冷冻保存卵巢皮质片，4周后使用本发明配套的解冻液套装和日本Kitazato解冻液套装分别复苏卵巢组织，将复苏后的卵巢皮质片 移植于鸡胚上，培养5天后观察卵巢皮质片的正常原始卵泡率、微血管密度和凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的表达。其结果如下表所示。
| 组别 | 正常原始卵泡率 |
| 对照组(新鲜未移植组) | 83.0±5.5 |
| 玻璃化冷冻液套装1 | 70.2±3.7 a |
| 玻璃化冷冻液套装2 | 73.8±7.7 a |
| 玻璃化冷冻液套装3 | 72.8±6.8 a |
| KATO套装 | 73.6±6.9 a |
其中a表示与新鲜对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)
移植后各组卵巢皮质片CD105相关的微血管密度(MVD)比较(vessels/mm
2)
| 组别 | MVD(vessels/mm 2) |
| 对照组(新鲜未移植组) | 6.24±1.46 |
| 玻璃化冷冻液套装1 | 10.02±1.80a |
| 玻璃化冷冻液套装2 | 11.89±2.13a |
| 玻璃化冷冻液套装3 | 10.06±1.95a |
| KATO套装 | 10.6±1.64a |
其中a表示与新鲜对照组差别有统计学意义
各组卵巢皮质片Bcl-2、Bax蛋白的表达及Bcl/Bax的变化
其中a表示与新鲜对照组相比，差别有统计学意义
综上，本发明的玻璃化冷冻液套装在卵巢皮质片冷冻复苏移植后，卵巢皮质片的正常原始卵泡率、微血管密度、Bcl-2/Bax的表达与日本KATO产品相当，差别无统计学意义，说明本发明的玻璃化冷冻液和解冻液套装完全能替代目前进口的KATO产品，可以不再依赖进口，降低成本。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
- 一种玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述套装由冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液组成；每1L冷冻平衡液I按照体积比由以下组分组成：乙二醇3～4％、人血清白蛋白替代品0.6％、海藻糖0.05M、基础液95.4～96.4％；每1L冷冻平衡液II按照体积比由以下组分组成：乙二醇15～20％、人血清白蛋白替代品1.2％、海藻糖0.25M、基础液78.8～83.8％；每1L冷冻液由以下组分组成：乙二醇30～40％、人血清白蛋白替代品6％、海藻糖0.5M、聚乙烯吡咯烷酮30～80g、基础液54～64％；所述基础液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的M199组织培养液。
- 根据权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述套装由冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液组成；每1L冷冻平衡液I由以下组分组成：乙二醇3.5％、人血清白蛋白替代品0.6％、海藻糖0.05M、基础液95.9％；每1L冷冻平衡液II由以下组分组成：乙二醇17.5％、人血清白蛋白替代品1.2％、海藻糖0.25M、基础液81.3％；每1L冷冻液由以下组分组成：乙二醇35％、人血清白蛋白替代品6％、海藻糖0.5M、聚乙烯吡咯烷酮50g、基础液59％；所述基础液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的M199组织培养液。
- 一种制备如权利要求1或2所述的玻璃化冷冻液套装的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A1：按照冷冻平衡液I的配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品，称量海藻糖，将乙二醇、人血清白蛋白替代品和海藻糖加入到基础液中混匀，获得冷冻平衡液I；A2：按照冷冻平衡液II的配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品，称量海藻糖，将乙二醇、人血清白蛋白替代品和海藻糖加入到基础液中混匀，获得冷冻平衡液II；A3:按照冷冻液配比分别量取基础液、乙二醇、人血清白蛋白替代品，称量海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮，将乙二醇、人血清白蛋白替代品、海藻糖和聚乙烯吡 咯烷酮加入到基础液中混匀，获得冷冻液；A4:将获得的冷冻平衡液I、冷冻平衡液II和冷冻液进行除菌过滤后分装至无菌PP管中并封装。
- 一种玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，其特征在于，应用与权利要求1-2任一项所述的玻璃化冷冻液套装；包括玻璃化冷冻步骤，所述玻璃化冷冻步骤为：B1:将性腺组织从运输液中转移至冷冻平衡液I中，静置3-5分钟，然后转至冷冻平衡液II中，静置1-5分钟，再转至冷冻液中，静置1-5分钟；B2:将性腺组织取出放置于载体上，迅速用无菌纱布轻轻吸取组织表面的冷冻液，性腺组织连同载体一同投入装有液氮的容器中；B3:将冷冻管投进液氮中预冷，用镊子夹住载体的一端，将性腺组织连同载体装进冷冻管中，旋紧盖子，最后将冷冻管投入液氮罐中保存。
- 根据权利要求4所述的玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，其特征在于，所述性腺组织为卵巢皮质片，每1L所述运输液由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％、青链霉素混合液1％、基础液93％。
- 根据权利要求5所述的玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，其特征在于，所述载体为金属网格载体。
- 根据权利要求6所述的玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，其特征在于，还包括解冻步骤，所述解冻步骤为：C1：将冷冻管从液氮中取出，迅速将性腺组织和载体转移到解冻液I中浸泡5-8分钟；C2：再将性腺组织转入解冻液II中停留5-8分钟后，转入解冻液III中停留5-8分钟；C3:最后转入解冻液Ⅳ中清洗3次，每次5分钟。
- 根据权利要求7所述的玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，其特征在于，所述解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ中的人 血清蛋白替代品的体积百分比与所述冷冻液中的人血清蛋白替代品的体积百分比相同。
- 根据权利要求8所述的玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，其特征在于，所述解冻液I由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％、蔗糖0.5M、基础液94％；所述解冻液II由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％、蔗糖0.25M、基础液94％；所述解冻液III由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％、蔗糖0.125M、基础液94％；所述解冻液IV由以下组分组成：人血清白蛋白替代品6％、基础液94％。
- 根据权利要求9所述的玻璃化冷冻液套装在性腺组织的冷冻和保存中的应用，其特征在于，所述解冻液I的制备方法为：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液I；所述解冻液II的制备方法为：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液II；所述解冻液III的制备方法为：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，称量蔗糖，将人血清白蛋白替代品、蔗糖加入到基础液中混匀，获得解冻液III所述解冻液IV的制备方法为：按照配比量取基础液、人血清白蛋白替代品，将人血清白蛋白替代品加入到基础液中混匀，获得解冻液IV；将获得的解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液IV进行除菌过滤后分装至无菌PP管中并封装。
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