CN111700061A - 一种封闭式玻璃化冷冻载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医疗器械领域，具体涉及应用于大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，包括载体内芯、外套管和管帽，载体内芯由密封袋和组织载体组成，密封效果好，避免卵巢组织的交叉感染；外套管和管帽设有通气孔，方便液氮进入和空气排出；组织载体的组织承载区打有多个直径为2.5mm的空孔，利于组织降温和复温，利于卵巢组织活性的保持；外套管尺寸与常规冻存管相似，可以实现大块卵巢组织的批量化储存。本发明提高大块卵巢组织冷冻效果，而且安全稳定、操作简单、价格低廉、便于批量储存，适于卵巢组织库的建立及卵巢组织冷冻技术的临床推广应用。

Description

一种封闭式玻璃化冷冻载体及其应用
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年随着癌症诊断和治疗方式的不断发展，癌症患者存活期不断延长，许多女性患者在确诊患癌时仍有生育需求，但放化疗会导致卵巢功能严重受损，引起卵巢早衰。卵巢组织冷冻是保存女性癌症患者生育力的主要途径，也是青春期前女性保存生育力的唯一方式。但卵巢组织冷冻后会导致部分卵泡凋亡丢失，造成卵巢冷冻复苏移植后成功率较低，提升冷冻卵巢组织体积和降低冷冻损伤是提高卵巢组织冷冻效率的关键因素。
传统的卵巢组织冷冻技术采取程序化冷冻，但程序化冷冻技术存在仪器操作复杂、设备价格昂贵等缺点，限制了卵巢冷冻技术的临床应用。卵巢玻璃化冷冻技术是未来组织低温冷冻的趋势，具备操作简单、成本低廉、冷冻效率高等优势。目前尚无标准化卵巢组织玻璃化冷冻方案，大多数选取卵巢组织薄片(面积＜1cm2，厚度1mm)，以便于冷冻保护剂渗透和提高降温速率，但卵巢组织过小造成切割过程中卵泡的浪费，卵巢组织移植后血管再生过程中卵泡过少以及内分泌功能维持时间较短的缺点。因此，如何实现大块卵巢组织(面积＞1cm2)玻璃化冷冻是提高卵巢冷冻技术成功的关键。
玻璃化冷冻载体是影响玻璃化冷冻效果的关键因素，直接影响冷冻效果。目前应用玻璃化方法冻存人卵巢组织的载体包括冷冻管、麦管、铜片、细胞筛等，不同程度存在冷冻载体冻存的组织块较小、在液氮罐储存时占用空间大、不易批量储存、价格昂贵等缺点。并且大部分为开放式卵巢冷冻载体，由于卵巢组织较大，应尽可能避免液氮中病原体等对组织的污染，确保样品的安全。
发明内容
针对上述现有卵巢组织玻璃化冷冻技术中冷冻载体设计之不足，本发明提供一种简单高效、价格低廉的大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体；经实验验证，使用本发明所述载体，不仅能够较好保存卵巢组织活性，而且操作简单、价格低廉、便于大块卵巢组织的批量储存，适于卵巢冷冻技术的推广应用。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
在本发明第一个方面，提供了一种大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，所述载体由载体内芯、外套管和管帽组成；所述载体内芯由密封袋和组织载体组成；所述组织载体由上到下依次由夹持区和组织承载区组成，夹持区为磨砂样，组织承载区为大块卵巢组织放置区。
在本发明的第二个方面，提供一种使用上述载体进行玻璃化冷冻卵巢组织和玻璃化复苏卵巢组织的方法，该方法包括卵巢组织玻璃化冷冻方法和卵巢组织玻璃化复苏方法，
具体的，所述卵巢组织为大块卵巢组织；
卵巢组织玻璃化冷冻方法为：(1)将卵巢组织置于平衡液中室温平衡，然后置于玻璃化冷冻液中冷冻处理一段时间；(2)吸干卵巢组织表面液体后用无菌镊子夹住载体内芯的夹持区，将卵巢组织平铺在组织承载区；(3)将载体内芯装入密封袋，挤出密封袋中的空气并密封后将密封袋投入液氮进行冷冻，而后将载体内芯装入已在液氮中的外套管，并用管帽拧紧，放入冻存盒中长期保存；
卵巢组织玻璃化复苏方法为：
(1)将载体内芯从外套管中取出，剪开密封袋，夹住夹持区将卵巢组织快速移入预热的复苏液I中平衡；(2)将卵巢组织移入复苏液II中进行室温平衡；(3)将卵巢组织移至基础液中平衡即完成玻璃化复苏，之后可进行形态分析和培养后激素测定。
在本发明的第三个方面，提供一种上述载体在卵巢组织玻璃化冷冻和玻璃化复苏中的应用。
与现有技术相比，本发明的一个或多个技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的一个技术方案中制备的大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体选用无菌 PET塑料薄片，该材料被广泛应用于制作胚胎冷冻载杆，具有安全无毒、价格低廉等优势；
(2)本发明的的一个技术方案中使用密封袋将卵巢组织与液氮隔绝，既保持较快的降温和复温速率，同时也提供良好的密封性，防止液氮交叉感染；
(3)本发明的一个技术方案中将组织承载区进行打孔处理，利于组织降温，并且在卵巢组织解冻过程中，增加与37℃卵巢组织解冻液的接触面积，复苏速率更快，组织也更易从载体上脱落，有利于卵巢组织活性的保持；
(4)本发明的一个技术方案中使用的外套管侧壁和管帽顶部均设有通气孔，能够在冷冻过程中使液氮进入管体内部，将空气通过顶端通气孔排出，不仅能够防止冷冻管在液氮中上浮，而且冷冻管短时间从液氮取出后，管中的液氮能够提供短时间的液氮低温环境；
(5)本发明的一个技术方案中外套管总高度59mm，内径16mm，可使用常规5ml 冷冻盒置于液氮中长期储存，节约空间，便于组织批量储存，适于卵巢组织库的建立以及卵巢冷冻技术的推广应用。
(6)采用本发明所述载体进行卵巢组织玻璃化冷冻，卵巢组织活性得到较好保存，可以实现大块卵巢组织(面积＞1cm2)的玻璃化冷冻，提高卵巢组织冷冻技术成功率。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明中冷冻载体外套管结构示意图，其中图1(a)为剖面图，图1(b)为侧视图；
图2为本发明中冷冻载体内芯结构示意图；
图3为本发明中冷冻载体管帽仰视图；
图4为大块卵巢组织形态观察图，其中图4(a)为新鲜卵巢组织形态观察图，图4(b)为冷冻复苏后的卵巢组织形态观察图。
其中，1-密封袋，2-夹持区，3-组织承载区，4-空孔，5-管帽，6-密封圈，7-内螺纹，8- 外螺纹，9-外套管通气孔，10-外套管，11-载体内芯，12-标签区，13-稳定架，14-管帽通气孔。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
正如背景技术所介绍的，现有技术中对卵巢冷冻使用的玻璃化冷冻载体主要包括冷冻管、麦管、铜片、细胞筛等，不同程度存在冷冻载体冻存的组织块较小、在液氮罐储存时占用空间大、不易批量储存、价格昂贵等缺点。
鉴于此，本发明的一种实施方式中，提供一种大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，其中包括载体内芯(11)、外套管(10)、管帽(5)；载体内芯(11)由密封袋(1)和组织载体组成，密封袋(1)将卵巢组织与液氮隔绝，既保持较快的降温和复温速率，同时也提供良好的密封性，防止液氮交叉感染；所述组织载体根据功能不同划分为磨砂区域的夹持区(2)和打孔区域的组织承载区(3)，夹持区(2)为磨砂样，方便夹持，组织承载区(3)为大块卵巢组织放置区。
本发明的一种实施方式中，所述组织承载区打有多个空孔；优选的，所述空孔为直径为2.5mm的圆孔；组织承载区上的空孔利于组织降温，并且在卵巢组织解冻过程中，增加与37℃卵巢组织解冻液的接触面积，复苏速率更快，组织也更易从载体上脱落，有利于卵巢组织活性的保持。
本发明的一种实施方式中，所述组织载体为无菌PET塑料薄片，优选的，所述PET塑料薄片的厚度为0.2mm；该实施方式特别选用特定厚度的PET塑料薄片作为组织载体材料，一方面能够满足卵巢组织冷冻和复苏过程对载体导热速率的需求，同时兼顾组织载体的软硬度，方便卵巢组织冷冻复苏操作，同时其还具有安全可靠、价格便宜等优势。
本发明的一种实施方式中，所述外套管与管帽通过设置在外套管上的外螺纹和管帽上的内螺纹连接，可以避免管帽脱落，所述外套管与管帽连接处设置有橡胶密封圈，可以使得密封效果更好。
本发明的一种实施方式中，所述外套管的侧面和管帽的顶端都设有通气孔，能够在冷冻过程中使液氮进入管体内部，将空气通过顶端通气孔排出，不仅能够防止冷冻管在液氮中上浮，而且冷冻管短时间从液氮取出后，管中的液氮能够提供短时间的液氮低温环境。
本发明的一种实施方式中，所述外套管的侧部设计有标签区，以便记录卵巢组织样本信息。
本发明的一种实施方式中，所述管帽设置有防滑螺纹。
本发明的一种实施方式中，所述外套管底部设置有一至多个稳定架，以便冷冻管竖直放置时保持稳定。
本发明的一种实施方式中，外套管高度59mm，内径16mm，可使用常规5ml冷冻盒置于液氮中长期储存，节约空间，便于组织批量储存，适于卵巢组织库的建立以及卵巢冷冻技术的推广应用。
本发明的一种实施方式中，组织载体长45mm，宽12mm，可以放置的卵巢组织面积为(3-12)mm×(3-40)mm；可以实现大块卵巢组织(面积＞1cm2)的玻璃化冷冻。
本发明的另一具体实施方式中，公开了使用上述载体进行卵巢组织的玻璃化冷冻和玻璃化复苏的方法，玻璃化冷冻和玻璃化复苏的具体方法为：
玻璃化冷冻方法：(1)将卵巢组织置于平衡液中室温平衡，然后置于玻璃化冷冻液中冷冻处理一段时间；(2)吸干卵巢组织表面液体后用无菌镊子夹住组织载体的夹持区(2)，将卵巢组织平铺在组织承载区(3)；(3)将组织载体装入密封袋(1)，挤出密封袋(1) 中的空气并密封后将载体内芯(11)投入液氮进行冷冻，而后将载体内芯(11)装入已在液氮中的外套管(10)，并用管帽(5)拧紧，放入冻存盒中长期保存。
玻璃化复苏方法：(1)将载体内芯(11)从外套管(10)中取出，剪开密封袋(1)，夹住夹持区(2)将铺在组织装载区(3)上的卵巢组织快速移入预热的复苏液I中平衡；(2) 将卵巢组织移入复苏液II中进行室温平衡；(3)将卵巢组织移至基础液中平衡即完成玻璃化复苏，之后可进行形态分析和培养后激素测定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。
实施例
使用上述大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体对卵巢组织进行玻璃化冷冻和玻璃化复苏，获得的部分实验结果见图4。具体操作步骤如下：
玻璃化冷冻和玻璃化复苏的具体方法为：
玻璃化冷冻方法：卵巢组织去除髓质后，将皮质切成(1-3)mm×(3-12)mm×(3-40)mm大小组织块，在平衡液中室温平衡25min，在玻璃化冷冻液中15min；用无菌纱布吸干卵巢组织表面液体，用无菌镊子夹住组织载体的夹持区(2)，将卵巢组织平铺在组织装载区(3)，然后将铺有卵巢组织的组织装载区(3)装入密封袋(1)，挤出密封袋(1) 中的空气并用微型封口机密封后将载体内芯(11)投入液氮进行冷冻，而后将载体内芯(11) 装入已在液氮中的外套管(10)，并用管帽(5)拧紧，放入5ml冻存盒中长期保存。
玻璃化复苏方法：用镊子将载体内芯(11)从外套管(10)中夹出，用剪刀剪开密封袋(1)，用镊子夹住夹持区(2)将铺在组织装载区(3)上的卵巢组织快速移入预热的37℃复苏液I中平衡1min，再将卵巢组织移入复苏液II中，室温平衡5min，再移至基础液中平衡10min后，进行形态分析和培养后激素测定。
其中，基础液：DPBS+10％FBS(均购自Sigma公司)
平衡液：基础液+7.5％二甲基亚砜+7.5％乙二醇
玻璃化冷冻液：基础液+20％二甲基亚砜+20％乙二醇+0.5M蔗糖
复苏液I：基础液+1M蔗糖
复苏液II：基础液+0.5M蔗糖
该实施例得到的玻璃化冷冻和玻璃化复苏后的卵巢组织的形态观察图如图4所示，其中图4(a)为新鲜卵巢组织的形态观察图，图4(b)为冷冻复苏后的卵巢组织的形态观察图，从图4(b)可以看出经过本发明的方法冷冻复苏后的卵巢组织始基卵泡基膜完整，卵母细胞核膜清晰，颗粒细胞均匀，形态正常，与新鲜卵巢组织无显著差异，使卵巢组织活性得到较好保存，提高卵巢组织冷冻技术成功率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载体由载体内芯、外套管和管帽组成，所述载体内芯由外到内依次由密封袋和组织载体组成，所述组织载体由上至下依次由夹持区和组织承载区组成。
2.如权利要求1所述的大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述组织载体为PET塑料薄片；
优选的，所述PET塑料薄片的厚度为0.2mm。
3.如权利要求1所述的大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述夹持区为磨砂样；
优选的，所述组织承载区打有多个空孔；
更优选的，所述空孔为直径为2.5mm的圆孔。
4.如权利要求1所述的大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述外套管的侧面和管帽的顶端都设有通气孔；
优选的，所述外套管与管帽通过设置在外套管上的外螺纹和管帽上的内螺纹连接；
优选的，所述外套管与管帽连接处设置有橡胶密封圈。
5.如权利要求1所述的大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述外套管高度59mm，内径16mm；
优选的，所述组织载体长45mm，宽12mm。
6.如权利要求1所述的一种大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述外套管的底部设置有一至多个稳定架；
优选的，所述外套管的侧部设计有标签区；
优选的，所述管帽设置有防滑螺纹。
7.一种使用权利要求1-6任一项所述的大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体对卵巢组织进行玻璃化冷冻和玻璃化复苏的方法，其特征在于，
玻璃化冷冻卵巢组织的方法为：
(1)将卵巢组织置于平衡液中室温平衡，然后置于玻璃化冷冻液中冷冻处理一段时间；
(2)吸干卵巢组织表面液体后用无菌镊子夹住组织载体的夹持区，将卵巢组织平铺在组织承载区；(3)将组织载体装入密封袋，挤出密封袋中的空气并密封后将载体内芯投入液氮进行冷冻，而后将载体内芯装入已在液氮中的外套管，并用管帽拧紧，放入冻存盒中长期保存；
玻璃化复苏卵巢组织的方法为：
(1)将载体内芯从外套管中取出，剪开密封袋，夹住夹持区将卵巢组织快速移入预热的复苏液I中平衡；(2)将卵巢组织移入复苏液II中进行室温平衡；(3)将卵巢组织移至基础液中平衡即完成玻璃化复苏，之后可进行形态分析和培养后激素测定。
8.如权利要求7所述的对卵巢组织进行玻璃化冷冻和玻璃化复苏的方法，其特征在于，所述卵巢组织为大块卵巢组织，优选的，所述大块卵巢组织面积为(3-12)mm×(3-40)mm。
9.如权利要求7所述的对卵巢组织进行玻璃化冷冻和玻璃化复苏的方法，其特征在于，
所述基础液为：DPBS+10％FBS；
所述平衡液为：基础液+7.5％二甲基亚砜+7.5％乙二醇；
所述玻璃化冷冻液为：基础液+20％二甲基亚砜+20％乙二醇+0.5M蔗糖；
所述复苏液I为：基础液+1M蔗糖；
所述复苏液II为：基础液+0.5M蔗糖。
10.权利要求1-6任一项所述大块卵巢组织封闭式玻璃化冷冻载体在卵巢组织玻璃化冷冻和玻璃化复苏中的应用，其特征在于，所述卵巢组织为大块卵巢组织，优选的，所述大块卵巢组织面积为(3-12)mm×(3-40)mm。
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