CN117063916A - 一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，包括如下步骤：将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的体外胚胎移入操作液滴中；激发单次红外激光在滋养层细胞的连接处做切口，击破囊胚腔，使囊胚液流出；激发连续激光，使其脉冲轨迹沿单次激光所做切口并与胚胎透明带弧度吻合，在透明带上形成裂隙，进行辅助孵化，裂隙与透明带周长之比为3‑4:1；将辅助孵化后的皱缩胚胎放在平衡滴表面，待胚胎沉入底部，采用吸管将胚胎移入冷冻液表面；当胚胎沉入冷冻液底部时，将胚胎装入麦管中，启动冷冻程序，即可。可提高奶牛体外胚胎在体外培养过程中的孵化率，进一步提高移植受胎率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
在奶牛业中，利用胚胎移植技术，可最大限度的发挥种公牛及母牛的遗传优势，充分利用二者的遗传资源。使用胚胎移植技术一个世代即可实现使用冻精几个世代的遗传改良效果，增加高产奶牛数量，提高全群奶牛生产水平。然而，目前奶牛体外胚胎在我国奶牛场的应用比例远低于世界水平，原因在于，奶牛体外胚胎冷冻后的移植受胎率(35.89+3.87％)显著低于新鲜体外胚胎的移植受胎率(51.35+1.87％)。因此，如何提高奶牛体外胚胎冷冻后的移植受胎率成为制约奶牛体外胚胎产业化应用的瓶颈，亟需建立高效的奶牛体外胚胎冷冻技术。
胚胎孵出困难是导致奶牛体外胚着床失败、移植受胎率低的重要因素。尤其对于奶牛体外胚胎来讲，冷冻后的胚胎透明带硬度增加，有可能造成相当一部分胚胎在移植入受体牛子宫后，不能成功地从透明带中孵化出来，进而植入子宫内膜，导致着床失败。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，可提高奶牛体外胚胎在体外培养过程中的孵化率，进一步提高移植受胎率，以克服奶牛体外胚胎冷冻后透明带硬化、胚胎孵化难度增加的问题。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，包括如下步骤：
将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的体外胚胎移入操作液滴中；
激发单次红外激光在滋养层细胞的连接处做切口，击破囊胚腔，使囊胚液流出；
激发连续激光，使其脉冲轨迹沿单次激光所做切口并与胚胎透明带弧度吻合，在透明带上形成裂隙，进行辅助孵化，裂隙与透明带周长之比为3-4:1；
将辅助孵化后的皱缩胚胎放在平衡滴表面，待胚胎沉入底部，采用吸管将胚胎移入冷冻液表面；
当胚胎沉入冷冻液底部时，将胚胎装入麦管中，启动冷冻程序，即可。
先采用单次红外激光击破胚囊腔，让囊胚液流出，胚胎的囊胚腔会发生塌陷，增加透明带与胚胎之间的卵周隙，能够避免在后续激光操作中对胚胎的损伤。否则，直接用激光在透明带上形成裂隙，由于胚胎与透明带间接触紧密，极易在激光处理过程中，损伤到胚胎。
裂隙过长：胚胎会从透明带中脱落出来，脱落出的胚胎粘度较大，胚胎移植过程中会黏附在移植管中，降低受胎率；裂隙过短：出现胚胎“嵌顿”，胚胎孵出不完全，同样影响后续胚胎着床。
胚胎从平衡滴表面沉到底部是一个胚胎内部与冷冻液渗透压相互平衡的过程，胚胎沉入底部，表示胚胎渗透压达到平衡液的渗透压。
在一些实施例中，所述操作液为在TCM199基础液中添加8％-12％的胎牛血清FBS。
在一些实施例中，所述平衡液为在Dulbecco’s磷酸盐缓冲液基础液中添加18％-22％胎牛血清FBS。
在一些实施例中，所述冷冻液为蔗糖和乙二醇的混合液，溶剂为Dulbecco’s磷酸盐缓冲液，蔗糖的浓度为0.08-0.12M，乙二醇的浓度为1.3-1.7M。
在一些实施例中，所述操作液滴的表面盖油。在操作液滴表面盖油，防止操作液挥发，导致渗透压变化，同时盖油能防污染。
在一些实施例中，每次移入操作液滴的胚胎数不超过5个。既能减少胚胎在培养箱外的停留时间，也能保证皱缩后的胚胎在囊胚腔恢复前完成胚胎冷冻。
在一些实施例中，红外激光定位到内细胞团对面、相邻的镰刀样滋养层细胞的连接处做切口。内细胞团将来发育成胎儿，滋养层细胞将来发育为胎盘等胎儿附属结构，因此，激光处理部位选择在原理内细胞团的位置。同时，选择相邻的镰刀样滋养层细胞的连接处进行激光处理能最大限度的降低对滋养层细胞的损伤。
优选的，红外激光的脉冲宽度为0.1-0.5ms。保证对胚胎透明带进行打孔及辅助孵化操作过程中，不伤害到胚胎。
在一些实施例中，在麦管中的装管顺序为冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、含有胚胎的冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、冷冻液。
在一些实施例中，冷冻程序完成后，将麦管投入液氮中。
在一些实施例中，解冻时，将麦管从液氮中取出，在空气中暴露8-15s，然后投入30℃的温水中，停留20-40s即可。
一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，包括如下步骤：
将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的体外胚胎移入操作液滴中；
激发单次红外激光在滋养层细胞的连接处做切口，击破囊胚腔，使囊胚液流出；
激发连续激光，使其脉冲轨迹沿单次激光所做切口并与胚胎透明带弧度吻合，在透明带上形成裂隙，进行辅助孵化，裂隙与透明带周长之比为3-4:1；
然后对打孔放水、辅助孵化后的皱缩胚胎进行玻璃化冷冻。
在一些实施例中，辅助孵化后的皱缩胚胎在冷冻平衡液中放置的时间为3-8min。
优选的，将皱缩胚胎从冷冻平衡液中吸出，转移至冷冻液滴中，在冷冻液滴中放置时间为40-50s。
进一步优选的，在10s内将胚胎从冷冻液滴中取出，装载到胚胎冷冻载体上，投入液氮，进行玻璃化冷冻。
更进一步优选的，解冻时，将胚胎冷冻载体从液氮中取出，快速没入胚胎解冻液中，并晃动胚胎冷冻载体；
待胚胎从冷冻载体上脱落后，继续在解冻液中停留3-5min，完成解冻过程。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
本发明利用透明带红外激光光学系统，对冷冻前的奶牛体外胚胎进行透明带打孔及辅助孵化。一方面，通过透明带打孔放水，在胚胎冷冻前将囊胚腔中的囊胚液排出，减少了冷冻过程中冰晶的形成，避免了冷冻过程中的胚胎损伤，提高了胚胎的耐冻性，同时打孔放水后的胚胎处于皱缩状态，胚胎与透明带间的卵周隙增大，便于后续胚胎辅助孵化操作。另一方面，冷冻前对胚胎透明带进行辅助孵化，消融部分透明带，可以减少复苏后胚胎孵化过程中的阻力，提高解冻后胚胎的移植受胎率。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中放水前胚胎图；
图2为本发明实施例1中放水过程中的胚胎图；
图3为本发明实施例1中放水后胚胎图；
图4为本发明实施例1中放水后进行辅助孵化的胚胎图；
图5为本发明实施例1中放水后进行辅助孵化的胚胎图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种结合激光破膜、能提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，本发明的方法基本配置如下：
倒置显微镜(用于观察胚胎放水及辅助孵化过程)；
透明带红外激光光学系统(用于对奶牛体外胚胎进行放水及辅助孵化处理)；
程序控温仪(用于对胚胎进行程序化冷冻)。
所需耗材如下：
90mm细胞培养皿若干(使用皿盖做为操作载体，制备胚胎操作液滴，进行各种相关操作)；
30mm细胞培养皿若干(用于对胚胎进行程序化冷冻)。
所需试剂如下：
(1)胚胎操作液的配制：所述胚胎操作液采用TCM199为基础液，添加体积百分比为10％的FBS。
(2)胚胎冷冻平衡液：所述胚胎冷冻平衡液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加20％ FBS。
(3)胚胎冷冻液：所述胚胎冷冻液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加0.1M蔗糖、1.5M乙二醇。
(4)Sigma M5310(用于制备胚胎操作液滴，进行各种相关操作)。
一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，包括如下步骤：
(1)用100μl移液器及配套枪头在90mm培养皿皿盖中间位置用操作液制备若干操作液滴，并在液滴表面盖油；
(2)将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的奶牛体外胚胎移入操作液滴中，为减少胚胎在培养箱外的停留时间，每次移入操作液滴的胚胎数不超过5个，在倒置显微镜下观察其结构形态；
(3)将透明带红外激光光学系统的激光定位到内细胞团对面、相邻的镰刀样滋养层细胞的连接处；
(4)根据胚胎透明带厚度，调节透明带红外激光光学系统的参数，脉冲宽度0.100-0.500ms；
(5)激发单次激光，在滋养层细胞的连接处做切口，击破囊胚腔，使囊胚皱缩，其中的囊胚液流出(打孔放水)；
(6)激发连续激光，使其脉冲轨迹沿单次激光所做切口并与透明带弧度吻合，最终在透明带上形成占透明带周长四分之一左右的裂隙为止(辅助孵育)；
(7)将经过处理的胚胎在胚胎培养液中清洗2遍，放入提前平衡好的胚胎培养滴中，放入培养箱中继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表1。
实施例2
参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化，不同的是辅助孵化后的胚胎不继续培养，而是进行胚胎冷冻，包括如下步骤：
(1)参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化；
(2)用200μl移液器及配套枪头在30mm培养皿中间位置用冷冻平衡液：冷冻液＝1:1做平衡滴；
(3)在30mm培养皿内加入冷冻液；
(4)将放水、辅助孵化后的皱缩胚胎放在平衡滴表面，待胚胎沉入培养皿底部，用巴斯德吸管将胚胎移入冷冻液表面；
(5)待胚胎沉入培养皿底部，将胚胎装入0.25ml的麦管中，装管顺序为冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、含有胚胎的冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、冷冻液，用麦管塞封口后，装入程序控温仪中，启动冷冻程序；(将胚胎放入预冷至-6℃的程序控温仪中，静置5分钟后植冰，植冰后平衡5分钟，按照0.5℃/min的降温速度降至-35℃；
(6)冷冻程序完成后，将麦管投入液氮；
(7)胚胎解冻：从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10秒，投入30℃的温水中，停留30秒；
(8)将胚胎从麦管中取出，移入胚胎操作液，清洗3-5次；
(9)将清洗后的胚胎放入提前平衡好的胚胎培养滴中，放入培养箱中继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表2。
实施例3
参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化，参照实施例2的方法进行胚胎冷冻，不同的是解冻后的胚胎不继续培养，而是直接进行胚胎移植，包括如下步骤：
(1)参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化；
(2)参照实施例2的方法进行胚胎冷冻及解冻；
(3)将解冻后胚胎在胚胎操作液中清洗2遍，装入0.25ml细管，移植到发情后第7天的受体牛体内；
(4)胚胎移植后30天，使用B超对受体牛进行孕检，统计胚胎移植受胎率，具体见表3。
为了验证本发明的效果，设置对比例进行对比，具体如下：
对比例1：将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表1；
对比例2：将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接进行冷冻(同实施例2)，解冻后胚胎继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表2；
对比例3：将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接进行冷冻(同实施例2)，解冻后胚胎直接进行胚胎移植，受体牛胚胎移植后30天，使用B超进行孕检，统计胚胎移植受胎率，具体见表3。
表1
表2
表3
表中的指标说明：
对实施例1的奶牛体外胚胎打孔放水、辅助孵化操作与对比例1在培养24小时存活率、48小时孵化率上差异采用卡方检验。经过打孔放水、辅助孵化操作处理的奶牛体外胚胎与对比例1在24小时存活率、48小时孵化率上差异不显著(P>0.05)。实施例1的打孔放水、辅助孵化操作对胚胎的存活情况及后续发育潜能无不良影响。
对实施例2奶牛体外胚胎打孔放水、辅助孵化后冷冻、解冻操作与对比例2在培养24小时存活率、48小时孵化率上差异采用卡方检验。经过打孔放水、辅助孵化处理后冷冻、解冻操作在24小时存活率、48小时孵化率上差异显著((P<0.05))。实施例2在胚胎冷冻前对胚胎进行打孔放水、辅助孵化能极大提供奶牛体外胚胎的耐冻性，提高解冻后胚胎的存活率及孵化率。
对实施例3奶牛体外胚胎打孔放水、辅助孵化后冷冻、解冻操作与对比例3在移植受胎率上差异显著(P<0.05)。实施例3奶牛体外胚胎在冷冻前对胚胎进行打孔放水、辅助孵化能显著提高奶牛体外胚的移植受胎率。
实施例4
基本配置如下：
倒置显微镜(用于观察胚胎放水及辅助孵化过程)；
透明带红外激光光学系统(用于对奶牛体外胚胎进行打孔放水及辅助孵化处理)。
所需耗材如下：
90mm细胞培养皿若干(做为胚胎打孔及辅助孵化操作载体，制备胚胎操作液滴，进行各种操作；用于对胚胎进行玻璃化冷冻)；
30mm细胞培养皿若干(用于对冷冻后的胚胎进行解冻操作)；
胚胎冷冻载体若干(用于对胚胎进行玻璃化冷冻)。
所需试剂如下：
胚胎操作液的配制：所述胚胎操作液采用TCM199为基础液，添加体积百分比为10％的FBS。
配制胚胎冷冻平衡液：所述胚胎冷冻平衡液以胚胎操作液为基础液，添加体积百分比为10％的乙二醇、体积百分比为10％的二甲基亚砜、0.25M的蔗糖。
配制胚胎冷冻液：所述胚胎冷冻液以胚胎操作液为基础液，添加体积百分比为20％的乙二醇、体积百分比为20％的二甲基亚砜、0.5M的蔗糖。
配制胚胎解冻液：所述胚胎冷冻液以胚胎操作液为基础液，添加0.5M的蔗糖。
Sigma M5310(用于制备胚胎操作液滴，进行各种相关操作)。
参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化，不同的是打孔及辅助孵化后的胚胎不再继续培养，而是进行玻璃化冷冻，包括如下步骤：
(1)参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化；
(2)用200μl移液器及配套枪头在90mm培养皿中间位置用冷冻平衡液及冷冻液做滴；
(3)将打孔及辅助孵化后的皱缩胚胎放在冷冻平衡液滴中5分钟；
(4)用巴斯德吸管将胚胎移入冷冻液滴中，静置45秒；
(5)在10秒内将胚胎从冷冻液滴中取出，装载到胚胎冷冻载体上，投入液氮；
(6)胚胎解冻：胚胎冷冻保存30天后，将胚胎冷冻载体从液氮中取出，快速没入胚胎解冻液中，并晃动胚胎冷冻载体；
(7)胚胎从冷冻载体上脱落后，继续在解冻液中停留5分钟；
(8)将胚胎从解冻液中取出，移入胚胎操作液，清洗3-5次；
(9)将清洗后的胚胎放入提前平衡好的胚胎培养滴中，放入培养箱中继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表4。
实施例5
参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化，参照实施例4的方法进行胚胎的玻璃化冷冻，不同的是解冻后的胚胎不再继续培养，而是直接进行胚胎移植，包括如下步骤：
(1)参照实施例1的方法进行奶牛体外胚胎的打孔放水及辅助孵化；
(2)参照实施例4的方法进行胚胎玻璃化冷冻及解冻；
(3)将解冻后的胚胎在胚胎操作液中清洗2遍，装入0.25ml细管，移植到发情后第7天的受体牛体内；
(4)受体牛胚胎移植后30天，使用B超进行孕检，统计胚胎移植受胎率，具体见表5。
为了验证本发明的效果，设置对比例进行对比，具体如下：
对比例4：将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接进行玻璃化冷冻(同实施例4)，解冻后的胚胎继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表4；
对比例5：将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接进行玻璃化冷冻(同实施例4)，解冻后的胚胎直接进行胚胎移植，受体牛移植后30天，使用B超进行孕检，统计胚胎移植受胎率，具体见表5。
表4
表5
表中的指标说明：
对实施例4打孔放水及辅助孵化后奶牛体外胚胎进行玻璃化冷冻、解冻操作与对比例4在培养24小时存活率、48小时孵化率上差异采用卡方检验。经过打孔放水及辅助孵化处理后玻璃化冷冻、解冻操作在24小时存活率上差异不显著(P>0.05)，在48小时孵化率上差异显著((P<0.05))。实施例4在胚胎冷冻前对胚胎进行打孔放水及辅助孵化对胚胎耐冻性无不良影响，不影响胚胎解冻后存活率，且能极大提高解冻后胚胎的孵化率。
对实施例5奶牛体外胚胎打孔放水及辅助孵化后冷冻、解冻操作与对比例5在移植受胎率上差异显著(P<0.05)。实施例5奶牛体外胚胎在玻璃化冷冻前对胚胎进行打孔放水及辅助孵化能显著提高奶牛体外胚的移植受胎率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：包括如下步骤：
将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的体外胚胎移入操作液滴中；
激发单次红外激光在滋养层细胞的连接处做切口，击破囊胚腔，使囊胚液流出；
激发连续激光，使其脉冲轨迹沿单次激光所做切口并与胚胎透明带弧度吻合，在透明带上形成裂隙，进行辅助孵化，裂隙与透明带周长之比为3-4:1；
将辅助孵化后的皱缩胚胎放在平衡滴表面，待胚胎沉入底部，采用吸管将胚胎移入冷冻液表面；
当胚胎沉入冷冻液底部时，将胚胎装入麦管中，启动冷冻程序，即可。
2.根据权利要求1所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：所述操作液为在TCM199基础液中添加8％-12％的胎牛血清FBS；
优选的，所述平衡液为在Dulbecco’s磷酸盐缓冲液基础液中添加18％-22％胎牛血清FBS；
优选的，所述冷冻液为蔗糖和乙二醇的混合液，溶剂为Dulbecco’s磷酸盐缓冲液，蔗糖的浓度为0.08-0.12M，乙二醇的浓度为1.3-1.7M。
3.根据权利要求1所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：所述操作液滴的表面盖油。
4.根据权利要求1所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：每次移入操作液滴的胚胎数不超过5个。
5.根据权利要求1所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：红外激光定位到内细胞团对面、相邻的镰刀样滋养层细胞的连接处做切口；
优选的，红外激光的脉冲宽度为0.1-0.5ms。
6.根据权利要求1所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：在麦管中的装管顺序为冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、含有胚胎的冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、冷冻液。
7.一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：包括如下步骤：
将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的体外胚胎移入操作液滴中；
激发单次红外激光在滋养层细胞的连接处做切口，击破囊胚腔，使囊胚液流出；
激发连续激光，使其脉冲轨迹沿单次激光所做切口并与胚胎透明带弧度吻合，在透明带上形成裂隙，进行辅助孵化，裂隙与透明带周长之比为3-4:1；
然后对打孔放水、辅助孵化后的皱缩胚胎进行玻璃化冷冻。
8.根据权利要求7所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：辅助孵化后的皱缩胚胎在冷冻平衡液中放置的时间为3-8min；
优选的，将皱缩胚胎从冷冻平衡液中吸出，转移至冷冻液滴中，在冷冻液滴中放置时间为40-50s。
9.根据权利要求7所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：在10s内将胚胎从冷冻液滴中取出，装载到胚胎冷冻载体上，投入液氮，进行玻璃化冷冻。
10.根据权利要求7所述的提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法，其特征在于：解冻时，将胚胎冷冻载体从液氮中取出，快速没入胚胎解冻液中，并晃动胚胎冷冻载体；
待胚胎从冷冻载体上脱落后，继续在解冻液中停留3-5min，完成解冻过程。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311040566.2A CN117063916A (zh) | 2023-08-17 | 2023-08-17 | 一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311040566.2A CN117063916A (zh) | 2023-08-17 | 2023-08-17 | 一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117063916A true CN117063916A (zh) | 2023-11-17 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202311040566.2A Pending CN117063916A (zh) | 2023-08-17 | 2023-08-17 | 一种提高移植受胎率的奶牛体外胚胎冷冻方法 |
Country Status (1)
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-
2023
- 2023-08-17 CN CN202311040566.2A patent/CN117063916A/zh active Pending
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