CN117230001A - 一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法。针对目前体外胚胎孵出率低的现状，本发明在胚胎体外培养过程中引入了辅助孵化及玻璃化冷冻处理方式，在胚胎透明待部分人为制造裂隙，促进胚胎着床，同时裂隙的存在能够使冷冻试剂快速进入胚胎进行平衡，缩短胚胎冷冻平衡时间，有效提高了体外培养过程中的孵化率，进而提高移植受胎率。综上，本发明方法对于提高胚胎移植术的成功率具有重要意义。

Description

一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法

技术领域

本发明属于胚胎体外处理方法技术领域，具体涉及一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

奶业发达国家的经验表明，优秀种公牛对奶牛群体遗传改良的贡献率超过75％。传统的奶牛群体遗传改良靠使用种公牛的冻精进行人工授精实现，但是这种方式只能利用种公牛的遗传优势，母牛的繁殖潜力及其在奶牛群体遗传改良中的作用未得到充分发挥。利用胚胎移植技术，可最大限度的利用种公牛及母牛的遗传资源，发挥双方的遗传优势。使用胚胎移植技术一个世代即可实现使用冻精几个世代的遗传改良效果，增加高产奶牛数量，提高全群奶牛生产水平。

胚胎移植技术涉及到两种来源的胚胎：体内胚及体外胚。体外胚是目前商业可及的最快推进奶牛遗传进展的工具，在我国具有非常广阔的应用前景和发展潜力。但是目前奶牛体外胚胎在国内的应用远不及体内胚，原因在于，奶牛体外胚移植受胎率比体内胚低10％。因此，提高奶牛体外胚移植受胎率，降低体外胚应用成本，是关系到我国奶牛产业发展水平，推进奶牛遗传进展的重要一环。

胚胎孵出困难是导致奶牛体外胚着床失败、移植受胎率低的重要因素。较长的体外培养时间、不理想的体外培养环境等都会导致奶牛体外胚外层的透明带厚度增加、透明带硬化等，进而使得体外胚胎孵出困难。因此，亟需开发一种新的方法，改变奶牛体外胚透明带硬化的情况，人为的达到帮助胚胎孵化，促进胚胎着床、提高胚胎移植受胎率的方法。

发明内容

针对上述技术现状，本发明目的在于通过优化奶牛胚胎体外培养技术，提高体外培养过程中的孵化率，进而提高移植受胎率。为了实现上述技术目的，本发明在胚胎体外培养过程中引入了辅助孵化及玻璃化冷冻处理方式，通过人为在胚胎透明带上制造裂隙，以消除透明带硬化导致的着床失败。同时，通过制备裂隙帮助后续冷冻过程中胚胎快速平衡，从而有效提高胚胎孵化率，促进着床。

基于上述技术效果，本发明提供一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法，包括如下步骤：对奶牛体外胚胎进行辅助孵化，将完成辅助孵化的胚胎冷冻，解冻后移植；

所述辅助孵化的方式如下：固定胚胎，在胚胎卵周隙较大处或细胞碎片较多处制造裂隙，该裂隙占透明带周长长度四分之一至三分之一；

所述冷冻的方式如下：将完成辅助孵化的胚胎依次移入冷冻平衡液及冷冻液中静置，装载至载体后投入液氮中进行冷冻。

上述孵化方法主要适用的对象为囊胚期的体外胚胎，本发明对上述孵化方法的主要改进点在于：

(1)本发明通过人为制造裂隙减少了透明带厚度增加、透明带硬化对胚胎孵出的不良影响；在辅助孵化的具体实施方式中，本发明优选人工操作的方式，通过固定针固定胚胎，通过操作针穿入、穿出的方式进行温和、精准的裂隙制备。现有工艺中多采用激光打孔方式在胚胎中制备裂隙，本发明利用显微操作针制造裂隙的方法与激光制备裂隙相比，优势在于：①不用配备额外配备价格昂贵的激光破膜仪②激光破膜操作过程中，由于激光打孔会对胚胎细胞造成热损伤，使用本发明提供的方法能避免激光导致的热损伤。

一种实施方式中，所述辅助孵化的操作方式如下：将培养至囊胚阶段的奶牛体外胚胎移入液滴中，通过固定针固定胚胎，操作针穿入胚胎，沿卵周隙较大处或细胞碎片处位置穿出制造裂隙。

进一步的，所述液滴制备方式如下：将孵化操作液滴在操作平台，其上覆盖sigmaM5310，所述孵化操作液以TCM199为基础液，添加8～12％的FBS。

进一步的，适用于上述操作步骤的固定针内径为25-30μm，具有25～35度的弯折，操作针应当具有较为锐利的针尖，从而方便的穿入、穿出胚胎，并且操作针针头与握持部位应当具有25～35度的弯折。

(2)在冷冻操作中，与未经过辅助孵化胚胎的玻璃化冷冻相比，经过辅助孵化操作后的胚胎透明带上形成裂隙，冷冻过程中，冷冻液渗透速度明显加快，能经过更短的时间达到平衡状态，因此，经过辅助孵化后的胚胎平衡时间明显缩短，由常规15分钟缩短为4-7分钟。

本发明提供的一种实施方式中，提供一种玻璃化冷冻方法，具体操作如下：将完成辅助孵化的胚胎放入冷冻平衡液中静置4～7min，之后移入冷冻液中静置35～55秒，之后移入载体中，投入液氮进行冷冻；解冻时，取出载体快速没入解冻液中，胚胎脱落后继续停留4～7min完成解冻过程。

该实施方式中，所述冷冻液以上述孵化操作液为基础，添加体积百分比为8～12％的乙二醇、体积百分比为8～12％的二甲基亚砜、0.2～0.3M的蔗糖；所述冷冻液以上述孵化操作液为基础液，添加体积百分比为18～22％的乙二醇、体积百分比为18～22％的二甲基亚砜、0.4～0.6M的蔗糖；对应的，所述解冻液为以上述孵化操作液为基础，添加0.4～0.6M的蔗糖。

上述玻璃化冷冻方式具有冷冻效果好的优势，但是其解冻过程对时间和操作的要求更加严格，考虑到实际生产工程中，可能遇到大量处理解冻胚胎的情形，本发明还提供了一种解冻操作更为简便的程序性冷冻方法，具体操作如下：将完成辅助孵化后的胚胎放在冷冻平衡液滴表面，待胚胎沉入液滴中，吸取胚胎放在冷冻液表面，待胚胎沉入，将含有胚胎的冷冻液移入麦管中，两端分别通过不连续的冷冻液进行封装，封装好的麦管装入程序控温仪中，启动冷冻程序，之后投入液氮。投入液氮至少48小时后再进行解冻，解冻时，将麦管从液氮中取出，在空气中进行短暂暴露，之后投入28～32℃的水中停留25～35秒即可。

该实施方式中，所述冷冻平衡液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加18～22％ FBS，所述冷冻液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加0.08～0.12M蔗糖、1.2～1.7M乙二醇。

上述解冻完成后的胚胎经孵化操作液清洗后移入受体母牛进行移植，受体母牛应当处于发情期内，较为理想的移植时间如发情后的第6～8天，更进一步的，为发情后的第7天。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中处理前的胚胎图；

图2为实施例1中所述操作针进入透明带的胚胎图；

图3为实施例1中所述操作针穿透透明带的胚胎图；

图4为实施例1中所述形成裂隙后的胚胎图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下各实施例中涉及的实验器材、耗材及试剂如下：

1、实验器械

倒置显微镜(用于观察胚胎辅助孵化过程)；显微操作仪(用于控制胚胎辅助孵化操作针)；手动油压式显微注射仪(用于固定待处理的奶牛体外胚胎)；手动气压式显微注射仪(用于对奶牛体外胚胎进行辅助孵化处理)；程序控温仪(用于对胚胎进行程序化冷冻)。

2、耗材

90mm细胞培养皿若干(使用皿盖做为操作载体，制备胚胎操作液滴，进行各种相关操作)；毛细玻璃管若干(100mm×1mm×0.8mm)；30mm细胞培养皿若干(用于对胚胎进行程序化冷冻)。

3、试剂

(1)孵化操作液：采用TCM199为基础液，添加体积百分比为10％的FBS；

(2)Sigma M5310(用于制备胚胎辅助孵化操作液滴，进行各种相关操作)。

实施例1

本实施例中，提供一种体外胚胎的辅助孵化处理方法，包括如下步骤：

1、胚胎固定针的制备：制备内径在25-30μm，且经过30度打弯的固定针；

2、胚胎辅助孵化操作针的制备：制备经过拔尖及30度打弯处理的操作针；

3、用100μl移液器及配套枪头在90mm培养皿皿盖中间位置用孵化操作液制备若干液滴；

4、用sigma M5310覆盖孵化操作液滴；

5、将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的奶牛体外胚胎移入操作液滴中，在倒置显微镜下观察其结构形态；

6、将辅助孵化用固定针及操作针安装到显微操作仪上；

7、利用固定针的抽吸作用，在9点钟位置将胚胎轻轻固定；

8、用辅助孵化操作针拨动胚胎，使胚胎透明带下卵周隙较大处或有较多细胞碎片处位于12点钟方向；

9、将辅助孵化操作针从胚胎1点钟位置穿入透明带，沿卵周隙较大处或细胞碎片处从10点钟位置穿出；

10、增加固定针的吸力，将操作针向上方移动，且左右摩擦，至操作针从透明带中穿出，胚胎上形成占透明带周长长度四分之一至三分之一的裂隙为止；11、将经过处理的胚胎在胚胎操作液中清洗2遍，放入提前平衡好的胚胎培养滴中，放入培养箱中继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率；对照组为将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表1。

表1

表1中24小时存活率、48小时孵化率上差异采用卡方检验。经过辅助孵化操作处理的奶牛体外胚胎与对照组在24小时存活率上差异不显著(P>0.05),在48小时孵化率上差异显著(P<0.05)。证明上述辅助孵化操作能极大提高奶牛体外胚胎的孵化潜能，同时对胚胎的存活情况无不良影响。

12、将经过处理、形成裂隙的胚胎在胚胎操作液中清洗2遍，装入0.25ml细管，移植到发情后第7天的受体牛体内，受体牛移植后30天，使用B超进行孕检，统计胚胎移植受胎率；对照组为培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接装入0.25ml细管，进行相同的移植操作，上述两实验组孕检结果如表2所示：

表2

表2中受胎率上差异采用卡方检验。经过辅助孵化操作处理的奶牛体外胚胎与对照组在移植受胎率上差异显著(P<0.05)。证明实施例1的辅助孵化操作能显著提高奶牛体外胚的移植受胎率。

实施例2

本实施例中，提供一种玻璃化冷冻的奶牛胚胎体外处理方法，将上述实施例1中步骤(11)得到的胚胎继续进行玻璃化冷冻，该玻璃化冷冻过程中涉及的冷冻平衡液、冷冻液及解冻液配制方式如下：

(1)冷冻平衡液：以“3、试剂(1)”中的孵化操作液为基础液，添加体积百分比为10％的乙二醇、体积百分比为10％的二甲基亚砜、0.25M的蔗糖；

(2)冷冻液：以上述孵化操作液为基础液，添加体积百分比为20％的乙二醇、体积百分比为20％的二甲基亚砜、0.5M的蔗糖；

(3)解冻液：以上述孵化操作液为基础液，添加0.5M的蔗糖；

具体步骤如下：

(1)用200μl移液器及配套枪头在90mm培养皿中间位置用冷冻平衡液及冷冻液做滴；

(2)将辅助孵化后的胚胎放在冷冻平衡液滴中5分钟；

(3)用巴斯德吸管将胚胎移入冷冻液滴中，静置45秒；

(4)在10秒内将胚胎从冷冻液滴中取出，装载到胚胎冷冻载体上，投入液氮；

(5)解冻时，将胚胎冷冻载体从液氮中取出，快速没入胚胎解冻液中，并晃动胚胎冷冻载体；

(6)待胚胎从冷冻载体上脱落后，继续在解冻液中停留5分钟，完成解冻过程。

(7)将胚胎移入胚胎操作液，清洗3-5次；

(8)将清洗后的胚胎放入提前平衡好的胚胎培养滴中，放入培养箱中继续培养48小时，对照组将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接进行冷冻，解冻后胚胎继续培养48小时；分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表3。

表3

表3中24小时存活率、48小时孵化率上差异采用卡方检验。经过辅助孵化操作处理的奶牛体外胚胎与对比例2在24小时存活率上差异不显著(P>0.05)，在48小时孵化率上差异显著(P<0.05)。实施例2在胚胎玻璃化冷冻前对胚胎进行辅助孵化能在不影响胚胎后续发育潜能的前提下，提高解冻后胚胎的孵化率。

(9)将解冻后胚胎在胚胎操作液中清洗2遍，装入0.25ml细管，移植到发情后第7天的受体牛体内；对照组将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接进行冷冻，解冻后胚胎直接进行胚胎移植。受体牛胚胎移植后30天，使用B超进行孕检，统计胚胎移植受胎率，具体见表4。

表4

表4中实验组及对照组在移植受胎率方面差异显著(P<0.05)，表明实施例2中记载的胚胎体外处理方法能显著提高奶牛体外胚的移植受胎率。

实施例3

本实施例中，针对上述实施例2中玻璃化冷冻方式进行了进一步的优化，提供了一种程序性的胚胎体外处理方式，本实施例中涉及的冷冻平衡液、冷冻液配置方式如下：

(1)冷冻平衡液：所述胚胎冷冻平衡液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加20％ FBS。

(2)冷冻液：所述胚胎冷冻液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加0.1M蔗糖、1.5M乙二醇。

具体步骤如下：

(1)用200μl移液器及配套枪头在30mm培养皿中间位置用冷冻平衡液：冷冻液＝1:1做平衡滴；

(2)在30mm培养皿内加入冷冻液；

(3)将实施例1中步骤(11)得到的胚胎放在平衡滴表面，待胚胎沉入培养皿底部，用巴斯德吸管将胚胎移入冷冻液表面；

(4)待胚胎沉入培养皿底部，将胚胎装入0.25ml的麦管中，装管顺序为冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、含有胚胎的冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、冷冻液；封装好的麦管装入预冷至-6度的程序控温仪中，-6度平衡5分钟后植冰，植冰后静置5分钟，之后按照0.5度/min的速度降温至-32度，温度降至-32度后，将麦管从程序控温仪中取出；

(5)冷冻程序完成后，将麦管投入液氮；

(6)胚胎解冻：从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10秒，投入30度的温水中，停留30秒；

(7)将胚胎从麦管中取出，移入胚胎操作液，清洗3-5次；

(8)将清洗后的胚胎放入提前平衡好的胚胎培养滴中，放入培养箱中继续培养48小时；对照组为将培养至囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎，不进行任何处理，直接进行冷冻。分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，结果见表5：

表5

表5中24小时存活率、48小时孵化率上差异采用卡方检验。经过辅助孵化操作处理的奶牛体外胚胎与对比例2在24小时存活率上差异不显著(P>0.05)，在48小时孵化率上差异显著(P<0.05)。因此，实施例3中胚胎程序化冷冻处理方法能在不影响胚胎后续发育潜能的前提下，提高解冻后胚胎的孵化率。

将上述步骤(8)得到的胚胎及对照组分别进行胚胎移植：(3)将解冻后胚胎在胚胎操作液中清洗2遍，装入0.25ml细管，移植到发情后第7天的受体牛体内；受体牛胚胎移植后30天，使用B超进行孕检，统计胚胎移植受胎率，具体见表6。

表6

表6中两实验组在移植受胎率上差异显著(P<0.05)。实施例3中采用程序性冷冻方法处理胚胎能显著提高奶牛体外胚的移植受胎率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法，其特征在于，包括如下步骤：对奶牛体外胚胎进行辅助孵化，将完成辅助孵化的胚胎冷冻，解冻后移植；

所述辅助孵化的方式如下：固定胚胎，在胚胎卵周隙较大处或细胞碎片较多处制造裂隙，该裂隙占透明带周长长度四分之一至三分之一；

所述冷冻的方式如下：将完成辅助孵化的胚胎依次移入冷冻平衡液及冷冻液中静置，装载至载体后投入液氮中进行冷冻。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述辅助孵化的操作方式如下：将培养至囊胚阶段的奶牛体外胚胎移入液滴中，通过固定针固定胚胎，操作针穿入胚胎，沿卵周隙较大处或细胞碎片处位置穿出制造裂隙。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述液滴制备方式如下：将孵化操作液滴在操作平台，其上覆盖sigma M5310，所述孵化操作液以TCM199为基础液，添加8～12％的FBS。

4.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述固定针内径为25-30μm，具有25～35度的弯折；所述操作针针头与握持部位具有25～35度的弯折。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述冷冻为玻璃化冷冻方式，具体步骤如下：将完成辅助孵化的胚胎放入冷冻平衡液中静置4～7min，之后移入冷冻液中静置35～55秒，再移入载体中，投入液氮进行冷冻；解冻时，取出载体快速没入解冻液中，胚胎脱落后继续停留4～7min完成解冻过程。

6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述冷冻液以权利要求3中所述的孵化操作液为基础，添加体积百分比为8～12％的乙二醇、体积百分比为8～12％的二甲基亚砜、0.2～0.3M的蔗糖；

所述冷冻液以上述孵化操作液为基础液，添加体积百分比为18～22％的乙二醇、体积百分比为18～22％的二甲基亚砜、0.4～0.6M的蔗糖；

所述解冻液以上述孵化操作液为基础，添加0.4～0.6M的蔗糖。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述冷冻为程序性冷冻方式，具体操作如下：将完成辅助孵化后的胚胎放在冷冻平衡液滴表面，待胚胎沉入液滴中，吸取胚胎放在冷冻液表面，待胚胎再次沉入，将含有胚胎的冷冻液移入麦管中，两端分别通过不连续的冷冻液进行封装，封装好的麦管装入程序控温仪中，启动冷冻程序，之后投入液氮完成冷冻。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，解冻时，将麦管从液氮中取出，在空气中进行短暂暴露，之后投入28～32℃的水中停留25～35秒即可。

9.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述冷冻平衡液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加18～22％FBS，所述冷冻液以Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液，添加0.08～0.12M蔗糖、1.2～1.7M乙二醇。

10.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述移植的对象为发情期的受体母牛，移植时间为发情后的第6～8天。