CN117617223A - 一种牛体外胚胎一步法冷冻液及牛体外胚胎一步法冷冻方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛体外胚胎一步法冷冻液及牛体外胚胎一步法冷冻方法，属于生物技术领域。本发明的方法，包括牛卵母细胞体外成熟；牛体外受精胚胎生产；将牛体外受精胚胎培养6‑8天后移入冷冻液A中，静置后，将皱缩后的囊胚从冷冻液A中移入冷冻液B中，将沉入冷冻液B底部的胚胎移入冷冻液C中，装入麦管，进行程序化冷冻，冷冻程序运行完毕后，将麦管投入液氮中。利用本发明的三种冷冻液对牛体外胚胎进行冷冻，在兼顾常规冷冻法对操作人员技术要求不高、可以解冻后直接移植的前提下，克服了常规冷冻法解冻后胚胎的存活率、孵化率低，移植妊娠率不高的缺点，实现了使用便利性及高移植受胎率的有效整合。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛体外胚胎一步法冷冻液及牛体外胚胎一步法冷冻方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胚胎冷冻保存能打破时间和空间的限制，有利于促进种质资源交流。但每年移植的牛胚胎中，冷冻保存的胚胎占比不足50％，多数胚胎仍以鲜胚移植的方式进行使用。其中占胚胎生产总量近80％的体外胚中有将近60％通过鲜胚移植的方式进行使用。反观体内胚胎，尽管生产数量较少，但60％的胚胎是通过冻胚移植的方式使用。
体外胚相比体内胚液泡含量多、细胞间紧密程度较低等，导致体外胚比体内胚对低温保存更加敏感，冷冻后体外胚胎的存活率和移植妊娠率要明显低于体内胚胎。这也大大限制了牛体外胚胎的应用。
牛胚胎冷冻保存有两种常用方法：常规冷冻和玻璃化冷冻，二者各有利弊。常规冷冻保存的胚胎可以解冻后直接移植，对操作人员的技术要求不高，但解冻后胚胎的存活率、孵化率显著低于玻璃化冷冻胚胎，且移植妊娠率不高。与之相反，玻璃化冷冻胚胎移植妊娠率高，但胚胎解冻过程需要专业的技术人员及设备。因此，为进一步促进牛体外胚胎在生产中的应用，有必要开发一种能兼顾便利性及移植受胎率的胚胎冷冻方法及相关试剂。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种牛体外胚胎一步法冷冻液及牛体外胚胎一步法冷冻方法，利用本发明对牛体外胚胎进行冷冻，解冻后胚胎可以直接进行移植，且能获得较高的移植受胎率。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供一种牛体外胚胎一步法冷冻液，包括冷冻液A、冷冻液B和冷冻液C；
所述冷冻液A为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、0.1～0.3g/L牛血清白蛋白和1～1.5M蔗糖的水溶液；
所述冷冻液B为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、3～5g/L牛血清白蛋白、0.1～0.3M蔗糖和0.5～1M无水乙醇的水溶液；
所述冷冻液C为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、3～5g/L牛血清白蛋白、0.1～0.3M蔗糖和1.3～1.7M无水乙醇的水溶液。
本发明所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，例如Sigma-aldrich公司的产品。
在本发明的一些实施例中，所述冷冻液A为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、0.1g/L牛血清白蛋白和1M蔗糖的水溶液。
在本发明的一些实施例中，所述冷冻液B为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖和0.75M乙二醇的水溶液。
在本发明的一些实施例中，所述冷冻液C为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖和1.5M乙二醇的水溶液。
本发明的第二个方面，提供一种牛体外胚胎一步法冷冻方法，采用第一方面所述的牛体外胚胎一步法冷冻液，包括如下步骤：
(1)牛卵母细胞体外成熟；
(2)牛体外受精胚胎生产；
(3)体外胚胎一步法冷冻，步骤如下：
将牛体外受精胚胎培养6-8天后移入冷冻液A中，静置；
静置后，将皱缩后的囊胚从冷冻液A中移入冷冻液B中，使其自然沉降；
将沉入冷冻液B底部的胚胎移入冷冻液C中，装入麦管；
将装有胚胎的麦管进行程序化冷冻，冷冻程序运行完毕后，将麦管投入液氮中。
本发明在常规冷冻的基础上，在胚胎冷冻前增加了一步人工皱缩囊胚腔的操作。通过将牛体外受精胚胎培养6-8天后移入冷冻液A中静置实现皱缩囊胚腔的操作，排出囊胚腔内的液体，减少胚胎冷冻保存期间渗透损伤的发生和冰晶的产生。不同于机械法(注射针抽人工皱缩法、拉细管吹打人工皱缩法)和激光法(激光打孔人工皱缩法)，本发明采用物理方法，利用胚胎内外的渗透压差使胚胎自动排出囊胚腔内的液体，达到人工皱缩的目的，成功避免了机械法人工皱缩对胚胎损伤大、激光法人工皱缩需要特殊仪器设备的弊端。
在本发明的一些实施例中，所述牛体外受精胚胎培养条件为：将受精后的卵母细胞外层颗粒细胞脱除干净，放入胎培养液胚中进行培养，培养环境为35～40℃、5-10％二氧化碳、5-10％的氮气、饱和湿度，体积百分数；优选的，所述培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度。
在本发明的一些实施例中，所述静置，静置时间为1～2min，优选为1min。
在本发明的一些实施例中，将皱缩后的囊胚从冷冻液A中移入冷冻液B做的、体积为400～600μL的液滴表面，使其自然沉降。
在本发明的一些实施例中，按照冷冻液C、气泡、冷冻液C、气泡、含有胚胎的冷冻液C、气泡、冷冻液C、气泡、冷冻液C的顺序，将胚胎装入麦管中，每段液柱的长度相同；
优选的，麦管填装完毕后进行封口，以棉塞端向下的方式倾斜放置8～12min，进行平衡。
在本发明的一些实施例中，一种牛体外胚胎一步法冷冻方法，包括以下步骤：
(1)牛卵母细胞体外成熟
在牛卵巢或活体母牛的卵巢上采集卵母细胞，回收采卵液，选择含有三层及以上颗粒细胞、细胞质均匀的卵母细胞进行成熟培养，培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度，培养时间为20～24h；
(2)牛体外受精胚胎的生产
成熟后的卵母细胞移入受精液中，使用精子处理液对精子进行处理，调节精子密度，取处理后的精液加入到受精液中的卵母细胞里，使最终精子密度为1～5×106个/mL，于38.5℃、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境中培养16-20h。
在本发明的一些实施例中，在牛卵巢采集卵母细胞时，牛卵巢可来自与屠宰场，将从屠宰场获得的牛卵巢用0.9％生理盐水冲洗干净后，用30～35℃的运输温度运到实验室，从采集第一个卵巢到卵巢运到实验室的时间不超过6小时。
卵巢运到实验室后先用30-35℃的0.9％生理盐水进行冲洗。冲洗干净后，用带12号针头的无菌注射器抽取卵巢上的卵泡。
在本发明的一些实施例中，使用发明所述牛体外胚胎一步法冷冻方法进行冷冻后的胚胎，解冻后可以继续培养或直接进行胚胎移植。
其中，所述冷冻后的胚胎的解冻方法可选为从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10s，投入30℃的温水中，停留30s。
本发明的有益效果为：
本发明在常规冷冻的基础上，在胚胎冷冻前增加了一步人工皱缩囊胚腔的操作。通过皱缩囊胚腔的操作，排出囊胚腔内的液体，减少胚胎冷冻保存期间渗透损伤的发生和冰晶的产生。不同于机械法(注射针抽人工皱缩法、拉细管吹打人工皱缩法)和激光法(激光打孔人工皱缩法)，本发明采用物理方法，利用胚胎内外的渗透压差使胚胎自动排出囊胚腔内的液体，达到人工皱缩的目的，成功避免了机械法人工皱缩对胚胎损伤大、激光法人工皱缩需要特殊仪器设备的弊端。
利用本发明所涉及的冷冻液对牛体外胚胎进行冷冻，解冻后胚胎可以直接移植，同时能获得较高的移植受胎率。在兼顾常规冷冻法对操作人员技术要求不高、可以解冻后直接移植的前提下，克服了常规冷冻法解冻后胚胎的存活率、孵化率低，且移植妊娠率不高的缺点，实现了使用便利性及高移植受胎率的结合。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明牛体外胚胎一步法冷冻液使用流程图；
图2为本发明实施例1中对胚胎进行冷冻前的胚胎图；
图3为本发明实施例1中冷冻液1处理后胚胎图。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
名词解释
一步法冷冻：一步法冷冻即程序化冷冻，是针对于解冻来说，冷冻后的胚胎可以经过一步解冻直接移植。
以下实施例所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，例如Sigma-aldrich公司的产品。
实施例1
1、一步法冷冻液配制
冷冻液A：包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、0.1g/L牛血清白蛋白和1M蔗糖的水溶液。
冷冻液B：包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖和0.75M乙二醇的水溶液。
冷冻液C：包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖和1.5M乙二醇的水溶液。
本发明所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，例如Sigma-aldrich公司的产品。
2、活体采卵-体外胚胎生产
(1)活体采卵操作：
仪器准备：准备活体采卵仪、负压泵以及金属浴，连接采卵针、采卵管与负压泵。
供体牛准备：利用保定架对供体牛进行保定，清除直肠内的粪便，并检查供体牛卵巢上卵泡及黄体状态。确认牛只可用于采卵后，用盐酸利多卡因于尾椎处对其进行硬膜外腔麻醉。
活体采卵：利用活体采卵仪、负压泵，采用B超引导法从母牛卵巢上回收卵母细胞，回收采卵液。
(2)体外胚胎生产
卵母细胞成熟：将卵母细胞从采卵液中捡出，选择其中含有三层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞进行成熟培养。培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境，培养时间为20-24小时。
上述卵母细胞成熟时采用的成熟液为申请号2023111645589专利公开的成熟液，其以市售商业化TCM199为基础液，包含0.01IU/mL促卵泡素、0.01IU/mL促黄体素、1μg/mL雌激素、0.1g/L牛血清白蛋白。
体外受精：①成熟后卵母细胞从成熟液转移到受精液中。②将精子处理液加入解冻后的精液中，每支精液加入3mL精子处理液，400g离心5分钟，离心后去上清，取适量处理后的精液加入到含有卵母细胞的受精液中，使最终精子密度为1～5×106个/mL。精子与卵母细胞在38.5℃、5-7％(体积百分数)二氧化碳的饱和湿度环境中培养16-20小时。
上述精子处理液为申请号2023111645589专利公开的精子处理液，其为包含112mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM二水氯化钙、0.83mM一水磷酸二氢钠、0.52mM六水氯化镁、37mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/mL肝素钠、10mM咖啡因、4mg/mL牛血清白蛋白的水溶液。
上述受精液为申请号2023111645589专利公开的受精液，其为包含112mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM二水氯化钙、0.83mM一水磷酸二氢钠、0.52mM六水氯化镁、37mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/mL肝素钠、4mg/mL牛血清白蛋白的水溶液。
体外胚胎培养：将受精后的卵母细胞外层颗粒细胞脱除干净，放入胚胎培养液中进行培养，培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度。
上述胚胎培养液为申请号2023111645589专利公开的胚胎培养液，其为包含109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、6mg/mL牛血清白蛋白、20μL/mL必需氨基酸、10μL/mL非必需氨基酸、0.15mg/mL谷氨酰胺的水溶液。
3、体外胚胎一步法冷冻
人工皱缩囊胚腔：将培养至第6-8天的囊胚从胚胎培养液中移入冷冻液A，静置1分钟，使胚胎囊胚腔内的水分脱除，胚胎囊胚腔发生塌陷。
预平衡：(1)用冷冻液B做体积为500微升的微滴；(2)将皱缩后的囊胚从冷冻液A移入冷冻液B做的液滴表面，使其自然沉降。
平衡：(1)将沉入冷冻液B底部的胚胎移入冷冻液C；(2)按照冷冻液C、气泡、冷冻液C、气泡、含有胚胎的冷冻液C、气泡、冷冻液C、气泡、冷冻液C的顺序，将胚胎装入0.25mL麦管中，每段液柱的长度相同；(3)麦管用麦管塞封口后，以棉塞端(麦管一端为封口端，一端为棉塞端。)向下的方式倾斜放置10分钟，进行平衡。
冷冻：(1)平衡后的、装有胚胎的麦管放入程序控温仪中，启动冷冻程序；(2)冷冻程序运行完毕，将麦管投入液氮。其中，冷冻程序为：封装好的麦管装入预冷至-6℃的程序控温仪中，-6℃平衡5分钟后植冰，植冰后静置5分钟，之后按照0.5℃/min的速度降温至-32℃，温度降至-32℃后，将麦管从程序控温仪中取出，投入液氮。
4、胚胎解冻及培养
胚胎解冻：从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10秒，投入30℃的温水中，停留30秒。
胚胎培养：将解冻后的胚胎从麦管中转移到胚胎培养液中，经过胚胎培养液洗涤3遍后，放入新的胚胎培养液中，于38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度的环境中继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表1。
上述胚胎培养液同样为申请号2023111645589专利公开的胚胎培养液，其为包含109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、6mg/mL牛血清白蛋白、20μL/mL必需氨基酸、10μL/mL非必需氨基酸、0.15mg/mL谷氨酰胺的水溶液。
实施例2
参照实施例1的方法对活体采卵获得的体外胚胎进行冷冻，不同的是所冷冻胚胎解冻后不进行继续培养，而是直接进行胚胎移植，包括以下步骤：
(1)参照实施例1的方法进行活体采卵、体外胚胎生产；
(2)参照实施例1的方法进行胚胎冷冻及解冻；
(3)将解冻后胚胎直接移植到发情后第7天的受体牛体内；
(4)胚胎移植后30天，使用B超对受体牛进行孕检，统计胚胎移植受胎率，具体见表2。
实施例3
1、一步法冷冻液配制参照实施例1
2、体外胚胎生产：所用卵母细胞来源于屠宰场卵巢，非活体采卵获得，具体获得方法如下：
(1)卵母细胞采集
将从屠宰场获得的牛卵巢用0.9％生理盐水冲洗干净后，用30-35℃的运输温度运到实验室，从采集第一个卵巢到卵巢运到实验室的时间不超过6小时。
卵巢运到实验室后先用30-35℃的0.9％生理盐水进行冲洗。冲洗干净后，用带12号针头的无菌注射器抽取卵巢上的卵泡，得到抽卵液。
(2)体外胚胎生产
卵母细胞成熟：将卵母细胞从抽卵液中捡出，选择其中含有三层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞进行成熟培养。培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境，培养时间为20-24小时。成熟液与实施例1的相同。
体外受精：①成熟后卵母细胞从成熟液转移到受精液中。②使用精子处理液对精子进行处理，调节精子密度，取适量处理后的精液加入到含有卵母细胞的受精液中，使最终精子密度为1～5×106个/mL。精子与卵母细胞在38.5℃、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境中培养16-20小时。受精液、精子处理液与实施例1的相同。
体外胚胎培养：将受精后的卵母细胞外层颗粒细胞脱除干净，放入胚胎培养液中进行培养，培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度。胚胎培养液与实施例1的一致。
3、体外胚胎一步法冷冻：参照实施例1
4、胚胎解冻及培养：参照实施例1，具体结果见表1。
为了验证本发明的效果，设置对比例进行对比，具体如下：
对比例1
参照实施例1的方法利用活体采卵获得的卵母细胞生产体外胚胎，使用市售商业化胚胎冷冻液进行胚胎冷冻、解冻，胚胎冷冻、解冻的整个过程与实施例1一致，统计解冻后胚胎培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表1。
对比例2
参照实施例2的方法利用活体采卵获得的卵母细胞生产体外胚胎，使用市售商业化胚胎冷冻液进行胚胎冷冻、解冻、移植，胚胎冷冻、解冻、移植的整个过程与实施例2一致，统计胚胎移植受胎率，具体见表2。
对比例3
参照实施例3的方法利用屠宰场卵巢上获得的卵母细胞生产体外胚胎，使用市售商业化胚胎冷冻液进行胚胎冷冻、解冻，统计解冻后胚胎培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体见表1。
表1
表2
表中的指标说明：
使用本发明的能提高冷冻效果的牛体外胚胎一步法冷冻液对通过活体采卵及屠宰场卵巢上采集的卵母细胞进行体外受精获得的体外胚胎进行冷冻，形成的胚胎与利用市售商业化胚胎冷冻液进行冷冻的胚胎相比，其解冻后24小时存活率、解冻后48小时孵化率有明显提升，且胚胎移植妊娠率也有所提高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牛体外胚胎一步法冷冻液，其特征在于，包括冷冻液A、冷冻液B和冷冻液C；
所述冷冻液A为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、0.1～0.3g/L牛血清白蛋白和1～1.5M蔗糖的水溶液；
所述冷冻液B为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、3～5g/L牛血清白蛋白、0.1～0.3M蔗糖和0.5～1M无水乙醇的水溶液；
所述冷冻液C为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、3～5g/L牛血清白蛋白、0.1～0.3M蔗糖和1.3～1.7M无水乙醇的水溶液。
2.如权利要求1所述的牛体外胚胎一步法冷冻液，其特征在于，所述冷冻液A为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、0.1g/L牛血清白蛋白和1M蔗糖的水溶液。
3.如权利要求1所述的牛体外胚胎一步法冷冻液，其特征在于，所述冷冻液B为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖和0.75M乙二醇的水溶液。
4.如权利要求1所述的牛体外胚胎一步法冷冻液，其特征在于，所述冷冻液C为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖和1.5M乙二醇的水溶液。
5.一种牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一所述的牛体外胚胎一步法冷冻液，包括如下步骤：
(1)牛卵母细胞体外成熟；
(2)牛体外受精胚胎生产；
(3)体外胚胎一步法冷冻，步骤如下：
将牛体外受精胚胎培养6-8天后移入冷冻液A中，静置；
静置后，将皱缩后的囊胚从冷冻液A中移入冷冻液B中，使其自然沉降；
将沉入冷冻液B底部的胚胎移入冷冻液C中，装入麦管；
将装有胚胎的麦管进行程序化冷冻，冷冻程序运行完毕后，将麦管投入液氮中。
6.如权利要求5所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，所述牛体外受精胚胎培养条件为：将受精后的卵母细胞外层颗粒细胞脱除干净，放入胎培养液胚中进行培养，培养环境为35～40℃、5-10％二氧化碳、5-10％的氮气、饱和湿度，体积百分数；优选的，所述培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度，体积百分数。
7.如权利要求5所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，所述静置，静置时间为1～2min，优选为1min。
8.如权利要求5所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，将皱缩后的囊胚从冷冻液A中移入冷冻液B做的、体积为400～600μL的液滴表面，使其自然沉降。
9.如权利要求5所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，按照冷冻液C、气泡、冷冻液C、气泡、含有胚胎的冷冻液C、气泡、冷冻液C、气泡、冷冻液C的顺序，将胚胎装入麦管中，每段液柱的长度相同；
优选的，麦管填装完毕后进行封口，以棉塞端向下的方式倾斜放置8～12min，进行平衡。
10.如权利要求5所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)牛卵母细胞体外成熟
在牛卵巢或活体母牛的卵巢上采集卵母细胞，回收采卵液，选择含有三层及以上颗粒细胞、细胞质均匀的卵母细胞进行成熟培养，培养环境为38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度，培养时间为20～24h；
(2)牛体外受精胚胎的生产
成熟后的卵母细胞移入受精液中，使用精子处理液对精子进行处理，调节精子密度，取处理后的精液加入到受精液中的卵母细胞里，使最终精子密度为1～5×106个/mL，于38.5℃、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境中培养16-20h。
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