JP2000197481A - 細胞の凍結保存方法 - Google Patents
細胞の凍結保存方法Info
- Publication number
- JP2000197481A JP2000197481A JP11001975A JP197599A JP2000197481A JP 2000197481 A JP2000197481 A JP 2000197481A JP 11001975 A JP11001975 A JP 11001975A JP 197599 A JP197599 A JP 197599A JP 2000197481 A JP2000197481 A JP 2000197481A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- solution
- vitrification
- cryopreservation
- liquid nitrogen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞の凍結保存方法の提供。
【解決手段】 細胞を、ガラス化液の存在下で液体窒素
中に滴下することを特徴とする細胞の凍結保存方法。
中に滴下することを特徴とする細胞の凍結保存方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細胞の凍結保存方法
に関する。
に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞の凍結保存は、細胞を低濃度のグリ
セロールやジメチルスルフォオキサイドなどの凍結防御
剤で平衡させ、ガラスアンプルやプラスティックストロ
ー等の容器に充填し、徐々に温度を下げていくことによ
って行う緩慢冷却法、又は細胞を高濃度の凍結防御剤と
ともに容器に入れ、急激に液体窒素温度まで下げて保存
するガラス化法によって行われてきた。
セロールやジメチルスルフォオキサイドなどの凍結防御
剤で平衡させ、ガラスアンプルやプラスティックストロ
ー等の容器に充填し、徐々に温度を下げていくことによ
って行う緩慢冷却法、又は細胞を高濃度の凍結防御剤と
ともに容器に入れ、急激に液体窒素温度まで下げて保存
するガラス化法によって行われてきた。
【０００３】緩慢冷却法は、低濃度の凍結防御剤を用い
るため、細胞に対する化学的毒性や物理的ストレスが比
較的低く凍結操作も容易であるという利点があるため、
一般的な培養細胞などに広く用いられている方法であ
る。しかしながら、緩慢冷却法では、細胞外液に氷晶を
形成させることによって細胞内を脱水していくことか
ら、氷晶によって細胞がダメージを受ける、冷却速度を
コントロールするための機器が必要である、低温域を徐
々に通過するので低温感受性の高い細胞の保存には向か
ないなどの問題点があり、牛未受精卵子などの凍結保存
には適していなかった。
るため、細胞に対する化学的毒性や物理的ストレスが比
較的低く凍結操作も容易であるという利点があるため、
一般的な培養細胞などに広く用いられている方法であ
る。しかしながら、緩慢冷却法では、細胞外液に氷晶を
形成させることによって細胞内を脱水していくことか
ら、氷晶によって細胞がダメージを受ける、冷却速度を
コントロールするための機器が必要である、低温域を徐
々に通過するので低温感受性の高い細胞の保存には向か
ないなどの問題点があり、牛未受精卵子などの凍結保存
には適していなかった。
【０００４】ガラス化保存法は、細胞を高濃度の溶液と
ともに容器に充填し、急激に液体窒素温度まで冷却する
ことによって、細胞内外ともに氷晶を形成しないガラス
化状態にして保存する方法である。この方法は、氷晶に
よる細胞へのダメージがない、低温域を素早く通過する
ので低温感受性が高い細胞へも適用できる、特別な機器
を必要としないなどの利点から近年注目を浴びている方
法である。しかしながら、ガラス化保存は非常に高濃度
の凍結防御剤を含んだガラス化液を用いなければならな
いため、細胞をガラス化液に添加し、又はガラス化液を
除去した場合にその浸透圧差によって物理的なショック
を受ける、高濃度の溶液による化学的毒性によって細胞
が死んでしまうなどの問題点がある。
ともに容器に充填し、急激に液体窒素温度まで冷却する
ことによって、細胞内外ともに氷晶を形成しないガラス
化状態にして保存する方法である。この方法は、氷晶に
よる細胞へのダメージがない、低温域を素早く通過する
ので低温感受性が高い細胞へも適用できる、特別な機器
を必要としないなどの利点から近年注目を浴びている方
法である。しかしながら、ガラス化保存は非常に高濃度
の凍結防御剤を含んだガラス化液を用いなければならな
いため、細胞をガラス化液に添加し、又はガラス化液を
除去した場合にその浸透圧差によって物理的なショック
を受ける、高濃度の溶液による化学的毒性によって細胞
が死んでしまうなどの問題点がある。
【０００５】さらに、従来のガラス化法では細胞をガラ
ス化液とともにガラスアンプル、クライオチューブある
いはプラスティックストローといった容器に充填してか
ら液体窒素中に投入して冷却を行うため、その分冷却速
度が遅延していた。
ス化液とともにガラスアンプル、クライオチューブある
いはプラスティックストローといった容器に充填してか
ら液体窒素中に投入して冷却を行うため、その分冷却速
度が遅延していた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞の凍結
保存方法を提供することを目的とする。
保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、細胞を少量のガラ
ス化液存在下で、容器に充填することなく直接液体窒素
中へ滴下することによって、細胞を凍結保存し得ること
を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明は、細胞を、ガラス化液の存在下で液体窒素中に滴下
することを特徴とする細胞の凍結保存方法である。細胞
としては、例えば動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞が
挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
解決するため鋭意研究を行った結果、細胞を少量のガラ
ス化液存在下で、容器に充填することなく直接液体窒素
中へ滴下することによって、細胞を凍結保存し得ること
を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明は、細胞を、ガラス化液の存在下で液体窒素中に滴下
することを特徴とする細胞の凍結保存方法である。細胞
としては、例えば動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞が
挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の凍結保存方法は、細胞を
含むガラス化液（液滴）を直接液体窒素中へ滴下するこ
と、すなわち、当該ガラス化液を容器に充填せずに、ガ
ラス化液が液体窒素に直接触れるようにして冷却を行う
ことを特徴とするものであり、マイクロドロップレット
法又はガラス化保存法と呼ぶことができる。本発明のガ
ラス化保存法で保存される細胞としては、特に限定され
るものではなく、例えば、牛、山羊、羊、豚、マウス、
ラット、ウサギ等の動物（実験動物、家畜等）の生殖細
胞及び体細胞、又はヒトの生殖細胞及び体細胞などが例
示される。
含むガラス化液（液滴）を直接液体窒素中へ滴下するこ
と、すなわち、当該ガラス化液を容器に充填せずに、ガ
ラス化液が液体窒素に直接触れるようにして冷却を行う
ことを特徴とするものであり、マイクロドロップレット
法又はガラス化保存法と呼ぶことができる。本発明のガ
ラス化保存法で保存される細胞としては、特に限定され
るものではなく、例えば、牛、山羊、羊、豚、マウス、
ラット、ウサギ等の動物（実験動物、家畜等）の生殖細
胞及び体細胞、又はヒトの生殖細胞及び体細胞などが例
示される。
【０００８】上記細胞は、通常の手法により採取するこ
とができる。例えば、生殖細胞を採取する場合は、牛の
未受精卵子については、卵巣の表面にある卵胞より注射
器により吸引することによって採取することができる。
胚については、未受精卵子と精子とを体外受精させ、そ
の後培養することによって得ることができる。あるい
は、ホルモンにより過剰排卵処理をした動物の子宮を外
科的又は非外科的に灌流することによって採取すること
もできる。なお、生殖細胞とは、未受精卵子、精子又は
受精後０〜10日目（1〜200細胞期）における細胞若しく
は胚を意味する。本発明においては、特に従来の方法で
は保存が困難である牛の未受精卵子若しくは卵割期胚、
豚の未受精卵子若しくは胚、又はマウスの未受精卵子な
どが好適に使用される。
とができる。例えば、生殖細胞を採取する場合は、牛の
未受精卵子については、卵巣の表面にある卵胞より注射
器により吸引することによって採取することができる。
胚については、未受精卵子と精子とを体外受精させ、そ
の後培養することによって得ることができる。あるい
は、ホルモンにより過剰排卵処理をした動物の子宮を外
科的又は非外科的に灌流することによって採取すること
もできる。なお、生殖細胞とは、未受精卵子、精子又は
受精後０〜10日目（1〜200細胞期）における細胞若しく
は胚を意味する。本発明においては、特に従来の方法で
は保存が困難である牛の未受精卵子若しくは卵割期胚、
豚の未受精卵子若しくは胚、又はマウスの未受精卵子な
どが好適に使用される。
【０００９】また、体細胞を採取する場合は、例えば皮
膚細胞であれば、動物より皮膚を採取し、コラーゲンな
どの酵素で組織を分散させることによって採取できる。
得られた細胞を適当な細胞培養液（例えばウシ胎児血清
を含むH-TCM199、RPMI1640又はDMEMなど）又は緩衝液
（PBS等）に添加した後、ガラス化液に浸漬する。ガラ
ス化液とは、低温域における液体の氷晶形成を抑制する
凍結防御剤、及び細胞の脱水を促し細胞膜を保護する働
きのある糖などを含み、液体窒素中でも氷晶を形成しな
いのに十分な濃度を持った溶液を意味し、通常は5.5Mエ
チレングリコール及び１Mシュクロースの混合物、又は4
0%エチレングリコール、18%フィコール及び0.3Mトレハ
ロースの混合物が使用される。
膚細胞であれば、動物より皮膚を採取し、コラーゲンな
どの酵素で組織を分散させることによって採取できる。
得られた細胞を適当な細胞培養液（例えばウシ胎児血清
を含むH-TCM199、RPMI1640又はDMEMなど）又は緩衝液
（PBS等）に添加した後、ガラス化液に浸漬する。ガラ
ス化液とは、低温域における液体の氷晶形成を抑制する
凍結防御剤、及び細胞の脱水を促し細胞膜を保護する働
きのある糖などを含み、液体窒素中でも氷晶を形成しな
いのに十分な濃度を持った溶液を意味し、通常は5.5Mエ
チレングリコール及び１Mシュクロースの混合物、又は4
0%エチレングリコール、18%フィコール及び0.3Mトレハ
ロースの混合物が使用される。
【００１０】次に、細胞を含有する少量のガラス化液を
ピペットで吸い取り、容器に入れることなく液体窒素中
に直に滴下する。「容器に入れることなく」とは、容器
に充填した細胞含有ガラス化液を液体窒素中に入れるこ
とを意味するのではなく、細胞を含有するガラス化液を
直接液体窒素に接触させることを意味する。この場合、
液体窒素を含むタンク中に細胞含有ガラス化液を滴下す
ることもできるが、細胞の保存性を良くし、また、どの
細胞であるかを識別することができるようにするため、
液体窒素を充填した試験管又はクライオチューブ（細胞
の種類や日付等をラベルしたものが好ましい）の中に細
胞含有ガラス化液を滴下して凍結させ、そのチューブを
液体窒素タンクに改めて保存することが好ましい。ま
た、「少量の」とは、液体窒素に滴下したときに瞬時に
細胞を凍結させることができる程度の量を意味し、具体
的には1〜10μl、好ましくは4〜8μlを意味する。な
お、かかる少量のガラス化液中に含まれる細胞数は、1
μlあたり1〜1000万個、好ましくは1〜10万個である。
凍結保存後の融解は、通常の手法（例えば37℃）により
行うことができる。その後、通常の細胞培養培地を用
い、37〜39℃、5%CO2存在下で培養し、発生・分化を行
わせる。
ピペットで吸い取り、容器に入れることなく液体窒素中
に直に滴下する。「容器に入れることなく」とは、容器
に充填した細胞含有ガラス化液を液体窒素中に入れるこ
とを意味するのではなく、細胞を含有するガラス化液を
直接液体窒素に接触させることを意味する。この場合、
液体窒素を含むタンク中に細胞含有ガラス化液を滴下す
ることもできるが、細胞の保存性を良くし、また、どの
細胞であるかを識別することができるようにするため、
液体窒素を充填した試験管又はクライオチューブ（細胞
の種類や日付等をラベルしたものが好ましい）の中に細
胞含有ガラス化液を滴下して凍結させ、そのチューブを
液体窒素タンクに改めて保存することが好ましい。ま
た、「少量の」とは、液体窒素に滴下したときに瞬時に
細胞を凍結させることができる程度の量を意味し、具体
的には1〜10μl、好ましくは4〜8μlを意味する。な
お、かかる少量のガラス化液中に含まれる細胞数は、1
μlあたり1〜1000万個、好ましくは1〜10万個である。
凍結保存後の融解は、通常の手法（例えば37℃）により
行うことができる。その後、通常の細胞培養培地を用
い、37〜39℃、5%CO2存在下で培養し、発生・分化を行
わせる。
【００１１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲
が限定されるものではない。 〔実施例1〕牛体外成熟卵子の保存 1．供試材料 本実施例では、従来のガラス化保存法では保存が困難で
あり、融解したときの再発生率が低いとされている牛体
外成熟卵子を用いた。
明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲
が限定されるものではない。 〔実施例1〕牛体外成熟卵子の保存 1．供試材料 本実施例では、従来のガラス化保存法では保存が困難で
あり、融解したときの再発生率が低いとされている牛体
外成熟卵子を用いた。
【００１２】2．牛体外成熟卵子の作出 食肉処理場由来の牛卵巣より卵子を採取し、H-TCM199
（GIBCO社）、5%ウシ胎児血清（FCS）、 FSH（卵胞刺激
ホルモン；デンカ製薬社）及びE2（エストラディオール
17-β；SIGMA社）を含有する溶液中で38.5℃、5%CO2の
条件下で21〜24時間体外成熟させた後、卵丘細胞を除去
した。
（GIBCO社）、5%ウシ胎児血清（FCS）、 FSH（卵胞刺激
ホルモン；デンカ製薬社）及びE2（エストラディオール
17-β；SIGMA社）を含有する溶液中で38.5℃、5%CO2の
条件下で21〜24時間体外成熟させた後、卵丘細胞を除去
した。
【００１３】3．ガラス化保存法 上記卵子を、3％のエチレングリコール溶液に12〜15分
間平衡させた後、ガラス化液（5.5Mエチレングリコール
+1Mシュークロス）に30秒間浸し、ガラスピペットを用
いて卵子を少量の液（4-8μl）とともに液体窒素中に滴
下した。それらの小滴をクライオチューブに入れて1〜7
日保存した。融解及びガラス化液の除去は、小滴を20％
ウシ胎仔血清加199培養液中に添加することによって行
った。
間平衡させた後、ガラス化液（5.5Mエチレングリコール
+1Mシュークロス）に30秒間浸し、ガラスピペットを用
いて卵子を少量の液（4-8μl）とともに液体窒素中に滴
下した。それらの小滴をクライオチューブに入れて1〜7
日保存した。融解及びガラス化液の除去は、小滴を20％
ウシ胎仔血清加199培養液中に添加することによって行
った。
【００１４】ストロー内でのガラス化保存は、卵子を10
％のエチレングリコール液に10分間平衡させ、ガラス化
液（40％エチレングリコール+18％フィコール+0.3Ｍト
レハロース）に浸漬してからストロー内に充填し、２分
後に液体窒素中に投入し、1〜7日保存した。融解及びガ
ラス化液の除去は、ストローを空気中で10秒間保持して
から20℃の水中で融解し、卵子を0.5 Mトレハロース液
中に取り出し、10分間保持してガラス化液を除去した。
なお、何ら凍結処理を施さない卵子を対照区とした。
％のエチレングリコール液に10分間平衡させ、ガラス化
液（40％エチレングリコール+18％フィコール+0.3Ｍト
レハロース）に浸漬してからストロー内に充填し、２分
後に液体窒素中に投入し、1〜7日保存した。融解及びガ
ラス化液の除去は、ストローを空気中で10秒間保持して
から20℃の水中で融解し、卵子を0.5 Mトレハロース液
中に取り出し、10分間保持してガラス化液を除去した。
なお、何ら凍結処理を施さない卵子を対照区とした。
【００１５】4．生存性の判定 融解した卵子を体外受精し、その後の発生率を観察する
ことによって生存性の判定の指標とした。
ことによって生存性の判定の指標とした。
【００１６】5．結果 本発明のマイクロドロップレット法によってガラス化保
存した牛体外成熟卵子は、体外受精後75.9％（41／54）
が分割し、29.6％（16／54）が胚盤胞へ発生した（表
１）。対照区の卵子の発生率は、受精後分割した細胞に
ついては88.7％（47／53）、胚盤胞へ発生した細胞につ
いては41.5％（22／53）であり、ガラス化卵子の成績と
統計的に有意な差は認められなかった。従って、ガラス
化卵子は、融解後であっても対照区と同様の生存性を有
するものであると判断することができる。また、ストロ
ー内でガラス化保存した卵子の発生率は、受精後分割し
た細胞については14.8％（12／81）、胚盤胞へ発生した
細胞については1.2％（1／81）であり、マイクロドロッ
プレット法よりも低い値であった。（表１）。従って、
本発明の方法（マイクロドロップレット法）は、従来法
（ストロー法）と比較して牛体外成熟卵子に対する保存
性及び融解後の生存性に優れていることが確認された。
存した牛体外成熟卵子は、体外受精後75.9％（41／54）
が分割し、29.6％（16／54）が胚盤胞へ発生した（表
１）。対照区の卵子の発生率は、受精後分割した細胞に
ついては88.7％（47／53）、胚盤胞へ発生した細胞につ
いては41.5％（22／53）であり、ガラス化卵子の成績と
統計的に有意な差は認められなかった。従って、ガラス
化卵子は、融解後であっても対照区と同様の生存性を有
するものであると判断することができる。また、ストロ
ー内でガラス化保存した卵子の発生率は、受精後分割し
た細胞については14.8％（12／81）、胚盤胞へ発生した
細胞については1.2％（1／81）であり、マイクロドロッ
プレット法よりも低い値であった。（表１）。従って、
本発明の方法（マイクロドロップレット法）は、従来法
（ストロー法）と比較して牛体外成熟卵子に対する保存
性及び融解後の生存性に優れていることが確認された。
【００１７】
【００１８】〔実施例2〕牛の体外受精３日目胚の保存 1．供試材料 本実施例では、従来のガラス化法では保存が比較的難し
いとされている、牛体外受精３日目胚（体外受精日=0
日、8-16細胞期）を試験に供した。
いとされている、牛体外受精３日目胚（体外受精日=0
日、8-16細胞期）を試験に供した。
【００１９】2．胚の作出 食肉処理場由来の牛卵巣より採取した卵子を、常法によ
り体外成熟・体外受精させ、CR1aa及びリノール酸アル
ブミンを含む溶液中で、38.5℃、5%O2、5%CO2、90%N2の
条件下で３日間培養して、８〜16細胞期に発生した胚を
試験に用いた。
り体外成熟・体外受精させ、CR1aa及びリノール酸アル
ブミンを含む溶液中で、38.5℃、5%O2、5%CO2、90%N2の
条件下で３日間培養して、８〜16細胞期に発生した胚を
試験に用いた。
【００２０】3．ガラス化保存法 胚を2％のエチレングリコール液に12〜16分間平衡さ
せ、ガラス化液に60秒間浸し、液体窒素中に滴下した。
また、一部の胚は0.25ccのプラスティックストローに充
填してから液体窒素中に投入した。融解は37℃で行い、
ガラス化液の除去は20％ウシ胎仔血清加199培養液中で
行った。なお、何ら凍結処理を施さない胚を対照区とし
た。
せ、ガラス化液に60秒間浸し、液体窒素中に滴下した。
また、一部の胚は0.25ccのプラスティックストローに充
填してから液体窒素中に投入した。融解は37℃で行い、
ガラス化液の除去は20％ウシ胎仔血清加199培養液中で
行った。なお、何ら凍結処理を施さない胚を対照区とし
た。
【００２１】4．生存性の判定 融解後の胚を６日間培養し、その胚盤胞期及び孵化胚盤
胞期への発生率を、生存性を判定する指標とした。
胞期への発生率を、生存性を判定する指標とした。
【００２２】5．結果 胚盤胞期及び孵化胚盤胞期への発生率は、本発明のマイ
クロドロップレット法の場合は胚盤胞期への発生率が7
1.2％（37／52）、孵化胚盤胞期への発生率が50.0％（2
6／52）であり、ストロー法の場合は胚盤胞期への発生
率が43.9％（18／41）、孵化胚盤胞期への発生率が17.1
％（7／41）であり、対照区の胚の場合は胚盤胞期への
発生率が74.3％（29／39）、孵化胚盤胞期への発生率が
51.3％（20／39）であった。従って、本発明の方法（マ
イクロドロップレット法）は従来のストロー法に比べて
有意に発生率が高く、牛体外受精３日目胚に対し、対照
区の胚と比較しても遜色のないレベルの生存性を示した
（表２）。
クロドロップレット法の場合は胚盤胞期への発生率が7
1.2％（37／52）、孵化胚盤胞期への発生率が50.0％（2
6／52）であり、ストロー法の場合は胚盤胞期への発生
率が43.9％（18／41）、孵化胚盤胞期への発生率が17.1
％（7／41）であり、対照区の胚の場合は胚盤胞期への
発生率が74.3％（29／39）、孵化胚盤胞期への発生率が
51.3％（20／39）であった。従って、本発明の方法（マ
イクロドロップレット法）は従来のストロー法に比べて
有意に発生率が高く、牛体外受精３日目胚に対し、対照
区の胚と比較しても遜色のないレベルの生存性を示した
（表２）。
【００２３】
【表２】
【００２４】
【発明の効果】本発明により、細胞の凍結保存方法が提
供される。本発明の方法によれば、これまでのガラス化
法手間保存が困難であった細胞の凍結保存が可能であ
り、融解後の生存率も高く、極めて有用である。
供される。本発明の方法によれば、これまでのガラス化
法手間保存が困難であった細胞の凍結保存が可能であ
り、融解後の生存率も高く、極めて有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 居在家 義昭 茨城県つくば市吾妻４−13−34 (72)発明者 志水 学 茨城県つくば市吾妻１−16−２ 401−521 (72)発明者 クルジストフ アントニ パピス ポーランド国 05−551 ムロコウ，ヤシ ュトルツェビエック，ユーエル．ラコヴァ １／２ Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA91X AA93X BD09 BD12 BD27 BD36
Claims (2)
- 【請求項１】 細胞を、ガラス化液の存在下で液体窒素
中に滴下することを特徴とする細胞の凍結保存方法。 - 【請求項２】 細胞が、動物又はヒトの生殖細胞又は体
細胞である請求項1記載の保存方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11001975A JP3044323B1 (ja) | 1999-01-07 | 1999-01-07 | 細胞の凍結保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11001975A JP3044323B1 (ja) | 1999-01-07 | 1999-01-07 | 細胞の凍結保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3044323B1 JP3044323B1 (ja) | 2000-05-22 |
| JP2000197481A true JP2000197481A (ja) | 2000-07-18 |
Family
ID=11516560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11001975A Expired - Lifetime JP3044323B1 (ja) | 1999-01-07 | 1999-01-07 | 細胞の凍結保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3044323B1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020035462A (ko) * | 2000-11-06 | 2002-05-11 | 임진호 | 동결 융해된 배아로부터 유래한 인간 배아 간 세포로부터특정 세포 분화 방법 |
| KR100411243B1 (ko) * | 2001-01-17 | 2003-12-18 | 학교법인 성광학원 | 생식세포 및 수정란의 유리화 동결 및 융해방법 |
| KR100688443B1 (ko) | 2005-03-11 | 2007-03-02 | 경상남도 | 세포성 인공조직의 장기보관을 위한 무혈청성 동결보존액및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법 |
| KR101092411B1 (ko) | 2009-07-22 | 2011-12-09 | (주)시지바이오 | 이식용 동종 피부의 처리 방법 및 그로부터 제조된 동결보존동종피부 |
| WO2018199106A1 (ja) * | 2017-04-27 | 2018-11-01 | 株式会社北里コーポレーション | 生体細胞粒状凍結体作成具 |
| JP2021529505A (ja) * | 2019-04-19 | 2021-11-04 | エムケイバイオテック カンパニー リミテッドＭｋｂｉｏｔｅｃｈ． Ｃｏ．， Ｌｔｄ． | イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE112014002424T5 (de) | 2013-05-16 | 2016-02-04 | Mitsubishi Paper Mills Limited | Hilfsmittel zur Kryokonservierung durch Vitrifikation für Zellen oder Gewebe |
| EP3064567B1 (en) | 2013-10-29 | 2019-05-22 | School Juridical Person Kitasato Institute | Device for cell or tissue cryopreservation by vitrification |
| JP6124845B2 (ja) | 2014-06-30 | 2017-05-10 | 三菱製紙株式会社 | 細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具 |
| EP3211066A4 (en) | 2014-10-23 | 2018-06-27 | Mitsubishi Paper Mills Limited | Tool for cryopreservation of cell or tissue and cryopreservation method |
| JP6123937B2 (ja) * | 2016-05-11 | 2017-05-10 | 三菱電機株式会社 | 放電電極、放電装置 |
| US11510408B2 (en) | 2017-06-12 | 2022-11-29 | Mitsubishi Paper Mills Limited | Cryopreservation jig for cryopreserving cells or tissues |
| JP6945487B2 (ja) | 2018-04-26 | 2021-10-06 | 三菱製紙株式会社 | 細胞又は組織の凍結保存液 |
| EP3985090A4 (en) | 2019-06-12 | 2023-07-26 | Mitsubishi Paper Mills Limited | CRYOPRESERVATION JIG ATTACHMENT DEVICE AND METHOD FOR FREEZING AND THAWING USING SUCH ATTACHMENT DEVICE |
| JP7144380B2 (ja) | 2019-08-23 | 2022-09-29 | 三菱製紙株式会社 | 細胞又は組織の凍結保存用治具 |
-
1999
- 1999-01-07 JP JP11001975A patent/JP3044323B1/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020035462A (ko) * | 2000-11-06 | 2002-05-11 | 임진호 | 동결 융해된 배아로부터 유래한 인간 배아 간 세포로부터특정 세포 분화 방법 |
| KR100411243B1 (ko) * | 2001-01-17 | 2003-12-18 | 학교법인 성광학원 | 생식세포 및 수정란의 유리화 동결 및 융해방법 |
| KR100688443B1 (ko) | 2005-03-11 | 2007-03-02 | 경상남도 | 세포성 인공조직의 장기보관을 위한 무혈청성 동결보존액및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법 |
| KR101092411B1 (ko) | 2009-07-22 | 2011-12-09 | (주)시지바이오 | 이식용 동종 피부의 처리 방법 및 그로부터 제조된 동결보존동종피부 |
| WO2018199106A1 (ja) * | 2017-04-27 | 2018-11-01 | 株式会社北里コーポレーション | 生体細胞粒状凍結体作成具 |
| JP2021529505A (ja) * | 2019-04-19 | 2021-11-04 | エムケイバイオテック カンパニー リミテッドＭｋｂｉｏｔｅｃｈ． Ｃｏ．， Ｌｔｄ． | イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子 |
| JP7173497B2 (ja) | 2019-04-19 | 2022-11-16 | エムケイバイオテック カンパニー リミテッド | イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3044323B1 (ja) | 2000-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pereira et al. | Animal oocyte and embryo cryopreservation | |
| Saragusty et al. | Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification | |
| Hafez | Preservation and cryopreservation of gametes and embryos | |
| JP3044323B1 (ja) | 細胞の凍結保存方法 | |
| AU2011291993B2 (en) | Method of liquid nitrogen surface vitrification | |
| Maehara et al. | Hollow fiber vitrification provides a novel method for cryopreserving in vitro maturation/fertilization-derived porcine embryos | |
| Asada et al. | Effect of polyvinyl alcohol (PVA) concentration during vitrification of in vitro matured bovine oocytes | |
| Dos Santos Neto et al. | Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods | |
| Keskintepe et al. | Caprine blastocyst development after in vitro fertilization with spermatozoa frozen in different extenders | |
| Fujino et al. | Cryoprotective effect of egg yolk in cryopreservation of porcine embryos | |
| De Coster et al. | Cryopreservation of equine oocytes: Looking into the crystal ball | |
| EP1131998A1 (en) | Cell-cryopreservation method | |
| Keskintepe et al. | Cryopreservation of bovine blastocysts obtained by intracytoplasmic sperm injection | |
| JP3672201B2 (ja) | 哺乳動物胚移植用ストロー及びその製造法 | |
| JP2686405B2 (ja) | 牛受精卵の凍結保存方法 | |
| Taniguchi et al. | Effect of cryoprotectant composition on in vitro viability of in vitro fertilized and cloned bovine embryos following vitrification and in-straw dilution | |
| Nowak et al. | Studies on survival of horse oocytes after rapid-i method vitrification | |
| Ismirandy et al. | The Outcome of in Vitro Embryo Transfer on Bali Cattle by Utilizing Fresh and Frozen Embryos | |
| Keros et al. | Cryopreservation of mammalian oocytes: slow cooling and vitrification as successful methods for cryogenic storage | |
| WO2000030441A1 (en) | Cryopreservation of oocytes and embryos and methods for producing animals involving the same | |
| Akyol et al. | Investigation of the effects of storage period for frozen bull semen on in vitro embryo production | |
| Takagi et al. | Survival rate of frozen-thawed bovine IVM/IVF embryos in relation to post-thaw exposure time in two cryoprotectants | |
| JP2000239101A (ja) | ラット精子の凍結保存法 | |
| Choudhury et al. | Comparison between two cryo-devices for vitrification of immature oocytes of indigenous zebu cows in Bangladesh | |
| JPH03232441A (ja) | 受胎率を上げた凍結受精卵およびその調製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| S633 | Written request for registration of reclamation of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313633 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |