KR100411243B1 - 생식세포 및 수정란의 유리화 동결 및 융해방법 - Google Patents

생식세포 및 수정란의 유리화 동결 및 융해방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생식세포 및 배아에 대한 새로운 동결보존방법인 유리화 동결방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초고농도의 동결보호제를 사용하여 생식세포 및 배아세포를 초급속으로 동결 및 융해시키는 방법에 관한 것이다.
종래에는 기계장치인 동결기를 사용하여 완만동결(2∼3시간 소요)하는 방법이 이용되어 왔으나, 생식세포인 난자인 경우 이 방법을 사용할 경우 용해 후 생존율이 낮고, 염색체 이상 등과 같은 세포의 손상이 커서 임상적으로 응용이 불가능하였다. 이에 본 발명은 이런 문제를 극복할 수 있는 안전한 동결보존 방법으로서 고농도의 동결보호제를 사용하여 대략 3분이내에 순간적으로 세포를 동결하고 융해하는 방법을 안출하였다.

Description

생식세포 및 수정란의 유리화 동결 및 융해방법{Method for Vitrification of Gamete and Embryo}
본 발명은 인간 생식세포 및 배아에 대한 새로운 동결방법 및 융해방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초고농도의 동결보호제를 사용하여 인간의 생식세포 및 배아세포를 초급속으로 동결 및 융해시키는 방법에 관한 것이다.
종래에는 기계장치인 동결기를 사용하여 완만동결(2∼3시간 소요)하는 방법이 이용되어 왔으나, 인간 생식세포인 난자인 경우 이 방법을 사용할 경우 융해 후 생존율이 낮고 염색체 이상 등과 같은 세포의 손상이 커서 임상적으로 응용이 불가능하였다.
종래 기술의 문제점을 보다 구체적으로 기술하면, 종래 생식세포 등의 동결방법에는 컴퓨터 프로그램이 내장된 동결기를 사용하여 저농도의 동결보호제가 함유된 배양액에 생식세포를 처리한 다음 동결시키는 방법이 있다. 그러나 이 방법은 융해 후 생존성이 매우 낮을 뿐만 아니라 많은 세포학적 이상을 초래하는 것으로 알려져 있고, 주로 동물 생식세포의 동결방법이었다. 그러나 기본적으로 인간 생식세포와 동물 생식세포는 차이점이 있다. 예를 들면 실험동물인 마우스나 랫트의 경우 인간 난자에 비해 그 크기가 매우 작고(110㎛ vs. 70㎛), 가축의 경우는 크기는 비슷하지만 세포 내에 지질의 함유량이 많아, 동물에 적용하여 성공한다 하더라도 실제로 인간에 적용이 가능한지는 불확실한 문제점이 있다.
그 구체적인 문제점을 기술하면 다음과 같다.
첫째, 완만동결법에 의한 경우 동결보존된 난자의 생존율이 매우 낮으며,
둘째, 완만동결방법에 의해 생존난자의 경우 표층과립의 조기방출(Premature cortical exocytosis)이 발생하여 정자의 수정율이 매우 낮다.
셋째, 완만동결법에 의해 생존된 난자는 방추사의 기형을 유발하고 그 결과 염색체 이상(Chromosomal abnormality)을 초래하여 유전적 기형을 발생하게 한다.
넷째, 완만동결법에 의해 생존된 난자의 경우 난자의 보호막인 투명대(zona pellucida)의 경화현상(zona hardening)을 유발하여 수정율의 저하와 착상시 부하를 억제한다.
다섯째, 완만동결법에 의해 생존된 난자의 경우 단성생식(parthenogenesis)의 빈도가 높은 문제점이 있다.
따라서, 상기 문제점이 있는 완만동결법은 아직까지 전세계적으로 사용되고 있으나 현재 난자이외에 다른 인간생식세포의 동결에 광범위하게 사용되는 동결보존법은 아직 개발되어 있지 않은 실정이다.
따라서, 본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 획기적으로 개선한 안전하고 생존성이 높은 인간 생식세포 동결방법을 개발함으로써 불임치료에 관련된 생식의학적 기술에 기여하는 것을 목적으로 한다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은,
생식세포를 세포내 침투성이 높은 투과성 동결보조제인 에틸렌 글리콜(ethylene glycol: 이하 EG라 함) 1.5M을 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충 살라인(또는 염)(Phosphated Buffered Saline: 이하 PBS라 함) 동결용액에 2.5분간 37℃에서 처리한 다음, 5.5M의 EG와 1M의 서크로스(Sucrose)가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS) 동결용액에 20초간 37℃에서 침지한 후, 금속 격자판(Metal grid)에 옮겨 부착시킨 다음, -196℃의 액체질소에 동결보존하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 발명은 동결보존된 생식세포를 융해하는 방법으로써, 생식세포가 부착된 금속 격자판을 37℃에서, 1M 서크로스가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS)용액에 침지하여 2.5분간 처리한 후, 37℃ 온도에서 서크로스(Sucrose) 농도가 순차적으로 낮아진 0.5M, 0.25M, 0.125M 각 서크로스가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS)용액에 침지하여 각 2.5분간 처리하고, 최종적으로 서크로스(Sucrose)가 무첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS)용액에 침지하여 2.5분간 처리하는 것을 특징으로 하는 생식세포 유리화 융해방법에 관한 것이다.
상기 동결방법 및 융해방법의 대상 세포는 미성숙 또는 성숙 인간난자, 전핵기, 난할기 또는 배반포의 인간수정란, 난소조직이다.
본 발명에 대하여 실시예 및 도표를 들어 보다 상세하게 설명하면 이하와 같다.
본 발명은 세포를 구성하는 대부분의 물질인 물이 빙점이하 상태로 동결할경우 수분이 얼음으로 바뀌고, 또한 이 얼음결정에 의해 세포 내의 소기관의 손상이 이루어진다는 점에 착안하여 빙점이하에서도 세포 내에 얼음결정이 발생하는 것을 극소화시키기 위한 동결보호제를 선정하고 또한 신속한 열전달을 위해 금속재질의 운반체를 사용한 것을 특징으로 한다.
이를 위해 세포 내의 수분과 신속하게 대체가능한 동결보호제로 EG를 선정하고 세포의 독성을 최소화시킬 수 있는 농도로 EG 5.5M을 선정하였다. 급속한 고농도의 동결보호제의 접촉으로 인한 세포충격을 최소화하고자 1.5M의 EG를 처리하였으며, 또한 EG 5.5M 처리시 세포막 보호역할을 위해 1M 서크로스를 첨가하였다. 신속한 세포 내 수분과 동결보호제의 교체를 위해 37℃에서 시행한 후, 즉시 액체질소 보관을 위한 운반체로서 망처리가 된 금속 격자판을 사용함으로써 난자를 둘러 싼 동결용액을 최소화할 수 있었고 더불어 가장 빠른 시간 내에 저온상태로 도달하도록 하였다. 즉, 본 발명에서 사용된 금속 격자판은 열전도율을 높이기 위한 것으로 기존의 플라스틱 스트로우(통상 0.25㎖ 용량)를 사용할 경우 스트로우 내에 난자와 동결용액이 함께 들어가서 동결이 완만하게 되는 문제점을 해소하기 위한 것이다. 예를 들어, 종래 플라스틱 스트로우 운반체는 저온상태가 된다하더라도 실제 스트로우 내의 온도가 외부의 온도와 동일하게 되는 데는 상당한 시간이 지연되어 염색체 등의 이상이 발생될 수 있다. 따라서, 이를 극복하기 위해 본 발명에서는 금속 격자판을 이용하였다. 본 발명에서 사용된 금속 격자판은 전자현미경에서 사용하는 얇은 금속판으로서 망이 있는 금속 격자판이다. 이를 일렉트론 마이크로스코프 격자판(electron microscope grid)이라고 명명한다. 금속판의 두께는 0.3㎜,직경은 0.5㎜ 정도이고 이 안에 400개의 구멍이 나 있다. 본 발명에서는 동결보호제 처리한 다음 난자를 이 금속판에 올려놓으면 난자는 구멍으로 빠지지 않고 부착되고 나머지 동결용액은 구멍을 통해 빠져나가게 된다. 그렇기 때문에 최소한의 동결용액만 남게되어 열 전도율이 스트로우에 비해 높아질 수 밖에 없으며, 또한 금속 합금판 자체만으로도 열전도율은 우수한 장점이 있다.
또 다른 발명의 구성인 융해방법에서 서크로스(Sucrose)의 농도를 순차적으로 낮추는 것은 본 실험의 결과에 따른 것이다. 그 이론적 근거는 급속한 변화 즉 -196℃에서 37℃의 융해용액에 노출할 때 발생할 수 있는 세포충격을 최소화하기 위한 것이며, 또한 유리화 동결용액 자체가 높은 농도의 동결보호제를 사용하는 관계로 세포 내에 존재하는 동결보호제를 완전히 제거하기 위해 삼투압의 원리를 적용하였다. 즉 1.0M 서크로스(sucrose)용액의 경우 삼투압은 세포내의 고농도의 삼투압과 거의 비슷하다. 그리고 0.5 →0.25 →0.125 →0M 순으로 내려감에 따라 용액의 삼투압은 낮아지고, 세포 내의 높은 삼투압에 따라 세포 내의 동결보호제가 융해용액으로 빠져나오게 하는 원리이다. 가장 높은 생존율을 나타내는 온도와 노출시간은 37℃, 각 2.5분간이다.
실시예
본 발명은 종래에 사용하는 저농도의 동결보호물질을 고농도로 그리고 난자의 보관용기를 플라스틱 재질에서 열전도성이 뛰어난 금속성 재질로 대체하였다.
동결방법은 먼저 생식세포인 난자에 세포내 침투성이 높은 투과성 동결보조제인 에틸렌 글리콜(ethylene glycol: 이하 EG라 함) 1.5M을 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(Phosphated Buffered Saline: 이하 PBS라 함) 동결용액에 2.5분간 37℃에서 처리한 다음, 5.5M의 EG와 1M의 서크로스(Sucrose)가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS) 동결용액에 20초간 37℃에서 침지한 후, 금속 격자판(Metal grid)에 옮겨 부착시킨 다음 -196℃의 액체질소에 동결하여 보존한다.
동결 보존된 난자를 융해하기 위해서는, 난자가 부착된 금속 격자판을 37℃에서, 1M 서크로스가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS)용액에 침지하여 2.5분간 처리한 후, 순차적으로 0.5M, 0.25M, 0.125M 및 0M을 상기와 같은 방법으로 동일 용액에 침지하여 융해하였다.
실험결과
종래 완만동결방법과 본 발명의 동결방법의 생존율 및 수정율 비교
본 발명에 따른 동결방법 및 융해방법에 의한 생존율 및 수정율을 검토한 결과 생존율은 본 발명의 경우가 완만동결방법보다 33%이상이 증가되었으며, 수정율은 46%이상의 증가율을 보여 생존율 및 수정율에서 탁월한 효과를 나타내었다(표 1). 또한 발생율도 종래의 완만동결방법은 16.7%에 그쳤으나 본 발명에 의한 경우 88.5%의 발생율을 보였다.
완만동결법과 본 발명(유리화동결법)의 생존, 수정, 발생율, 염색체이상 비교
동결방법 생존율 수정율 발생율 염색체이상
완만동결법 60.2% 42.9% 16.7% 77.8%
유리화동결법 90.0% 80.0% 88.5% 0%
염색체 이상 유무
종래의 방법에 의한 난자는 77.8%의 염색체 이상이 나타났으나, 본 발명에 의한 동결 및 융해된 난자와 이를 수정하여 발생시킨 수정란에 대해 염색체 이상을 검토한 결과(표 1), 난자의 경우 총 15개 중 0%의 염색체 이상이 나타났고, 이 중 발생된 12개의 수정란을 분석한 결과 검사가능한 7개에서 모두 정상 염색체 상이 나타났다. 상기 동결방법 및 융해방법은 인간의 생식세포에 한정하는 것이 아니고 동물생식세포에도 적용된다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예나 도표에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.
본 발명의 구성에 따른 효과는 다음과 같다.
첫째, 본 발명의 동결 및 융해방법은 동물 생식세포는 물론 종래 불가능했던 인간 생식세포의 동결 및 융해가 가능하게 되었고,
둘째, 동결 후 염색체의 이상, 수정율, 발생율의 저하를 방지하였고,
셋째, 멸종 위기의 동물세포, 고 부가가치의 종자 동물의 동결 보존이 용이해졌다.
마지막으로, 종래의 동결방법은 고가의 동결장비를 사용하였는데, 이런 비용을 감소시킬 수 있었으며, 동결하는 데 소요되는 시간도 최소 1/20로 줄일 수 있게되는 효과가 있다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 생식세포(인간 생식세포 제외)를 에틸렌 글리콜(EG) 1.5M 첨가 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS) 동결용액에 2.5분간 37℃에서 처리한 후, 5.5M의 에틸렌 글리콜(EG)과 1M의 서크로스(Sucrose)가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS) 동결용액에 20초간 37℃에서 침지한 후, 금속 격자판(Metal grid)에 옮겨 부착시킨 다음 -196℃의 액체질소에 동결보존된 생식세포를,
    37℃ 온도에서 1M 서크로스(Sucrose)가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS) 용액에 침지하여 2.5분간 처리한 후,
    37℃ 온도에서 서크로스(Sucrose) 농도가 순차적으로 낮아진 0.5M, 0.25M, 0.125M 각 서크로스가 첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS)용액에 침지하여 각 2.5분간 처리하고, 최종적으로 서크로스(Sucrose) 무첨가된 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum) 및 인산 완충염(PBS)용액에 침지하여 2.5분간 처리하는 것을 특징으로 하는 생식세포 유리화 융해방법.
  3. 삭제
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 생식세포는 난자, 수정란, 난소조직 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생식세포 유리화 융해방법.
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