KR20220098966A - 고농도의 동결방지제를 이용한 줄기세포 배양체의 동결 보존방법 - Google Patents

고농도의 동결방지제를 이용한 줄기세포 배양체의 동결 보존방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고농도의 동결 방지제를 이용한 이차원(2D) 및 삼차원(3D) 줄기 세포 배양의 동결 보존방법에 관한 것이다.

Description

고농도의 동결방지제를 이용한 줄기세포 배양체의 동결 보존방법 {CRYOPRESERVATION METHOD OF STEM CELL CULTURE USING HIGH CONCENTRATION OF CRYOPROTECTIVE AGENTS}
본 발명은 고농도의 동결 방지제를 이용한 이차원(2D) 및 삼차원(3D) 줄기 세포 배양체의 동결 보존방법에 관한 것이다.
조직 또는 세포의 장기간 안정한 보존을 위하여 동결 보존방법이 사용되고 있다.
이와 같은 동결 보존을 위해 기존에 널리 사용되는 방식은 저농도의 동결방지제(Cryoprotective agent, CPA)를 사용하는 완만동결(slow-freezing) 방식이었다.
최근에는 인체 장기를 모방한 오가노이드(organoid)가 시험관 내에서 조직 생성 과정을 요약하기 위해 널리 연구되고 있다. 그러나 기존의 완만동결을 통한 동결 보존의 경우, 저농도의 동결방지제를 사용함에 따라, 세포 간 강력한 접합 및 3D 구조로 인해 오가노이드(organoid)에 동결방지제가 침투하기가 어렵다는 한계점이 존재하였다. 반면, 고농도의 동결보호제를 사용하게되면 동결 및 해동 과정에서 삼투 효과를 유발하게 되어 세포 독성이 문제될 수 있다.
더욱이, 기존의 완만 동결 방식은 동결 과정에서 빙정(ice crystal)의 형성에 따라, 세포 및 조직에 심각한 손상을 일으킬 수 있다는 문제점이 존재하였다. 따라서 기존의 방법으로는 오가노이드를 손상하지 않고 냉동 보존하기 어렵다는 문제점이 존재하였다.
최근에는 동결 과정에서 빙정(ice crystal)에 의한 손상을 예방할 수 있는 새로운 급속동결법으로서 유리화(vitrification) 방법이 사용되고 있으며, 이는 액화질소를 이용하여 급속도로 조직 또는 세포를 동결하는 과정을 통해 이루어진다. 다만, 급속동결방법인 유리화를 위해서는 고농도(~8M)의 동결방지제(CPA)가 필요하나, 전술한 바, 고농도의 동결방지제는 동결 및 해동 과정에서 삼투 효과를 유발하게 되어 기존의 완만동결(slow-freezing) 방식에 비해 세포 독성이 문제될 수 있다.
상기한 여러가지 문제를 해결하기 위하여 동결보존 방법에 관한 지속적인 연구가 필요한 실정이다.
한국 등록특허 제10-0411243호
본 발명의 목적은 세포 독성이 없는 고농도의 동결방지제를 사용한 단일 세포 또는 스페로이드(speroid)의 동결 보존방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 고농도의 동결방지제를 사용하여 세포의 생존력, 형태 유지성 및 기능 유지성이 우수한 단일 세포 또는 스페로이드(spheroid)의 유리화 및 해동 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 (a) 세포를 평형화(equilibration) 용액에 5 내지 15분간 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계가 완료된 세포를 유리화(vitrification) 용액에 10초 내지 120초간 처리하는 단계; 및 (c)상기 (b) 단계가 완료된 세포를 -196 ℃의 액체 질소에 넣는 단계;를 포함하는, 세포의 동결보존 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 평형화 용액은 20%(v/v) FBS를 함유하는 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 기반으로 한 에틸렌글리콜(EG)과 1.4 M DMSO로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 유리화 용액은 고농도의 동결방지제(Cryoprotective agent, CPA)로 구성된 것으로서, LM5 운반 용액을 베이스로 하고, PVP K12, DMSO, 에틸렌글리콜(EG) 및 포름아미드를 포함하여 구성된 것일 수 있고, 구체적으로 상기 유리화 용액은 LM5 운반 용액을 베이스로 한 70g/L PVP K12, 2.8M DMSO, 2.7M EG 및 2.8M 포름아미드로 구성된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 상기 LM5 운반 용액은 포도당(glucose), 만니톨(mannitol), 유당(lactose) 대신 0.3M의 수크로스(sucrose)을 함유하도록 조정한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 구체적으로 상기 세포를 평형화 용액에 처리하는 시간은 10분이고, 유리화 용액에 처리하는 시간은 60초일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 측면은, 상기 동결보존된 세포의 손상을 최소화하면서 해동하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 해동 방법은 액체질소에 보관된 세포를 37 °C의 수조로 옮긴 후, 20% FBS를 포함하는 DPBS에서 0.5, 0.25 및 0 M 농도의 수크로스 용액에 각각 5분씩 연속적으로 현탁하여 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 동결 보존 및 해동 방법에 의하면, 종래 사용되는 느린 동결 방법과 비교하여 세포의 생존력, 형태 유지성 및 기능의 유지력이 현저히 상승되고, DNA 손상이 억제된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 세포의 동결 보존 및 해동 방법에 사용할 수 있는 세포는 배아줄기세포(ES), 유도만능줄기세포(iPSC), 성체줄기세포(ASC)로서 중간엽줄기세포(MSC), 조혈줄기세포(HSC) 및 신경줄기세포(NSC)로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는 중간엽줄기세포(MSC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명의 동결 보존 방법은 고농도의 동결방지제(CPA)를 사용함으로써 3차원 구조를 형성하는 스페로이드(spheroid) 또는 오가노이드(organoid) 또한 성공적으로 유리화 할 수 있는 것을 확인하였으며, 특히 그 구조체의 크기가 큰 경우에도 사용할 수 있어 복잡한 연구에 적용하기 유리한 이점이 존재한다.
본 발명에 의한 동결 보존 방법은 고농도의 동결방지제를 사용하여도 세포독성이 나타나지 않고, 세포 형태 유지성 및 기능 유지성이 우수한 효과가 있다.
본 발명에 의한 동결 보존 방법은 단일세포 수준뿐만 아니라 3차원 입체구조인 스페로이드의 동결보존에도 우수한 효과가 있다.
본 발명에 의한 동결 보존 방법은 기존의 느린 동결(slow-freezing) 방법과 비교하여 동결 보존 성능이 우수한 효과가 있다.
본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명에 의한 동결보존방법과 기존의 동결보존방법인 완만동결(slow-freezing)방법에 의한 MSC의 형태 및 성장패턴을 비교한 결과를 나타낸 것이다(a: 현미경 사진, b: MSC의 생존율을 비교한 그래프).
도 2는 본 발명에 의한 동결보존방법과 기존의 동결보존방법인 완만동결(slow-freezing)방법에 의한 MSC의 집단배가시간(Population doubling time)을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 의한 동결보존방법과 기존의 동결보존방법인 완만동결(slow-freezing)방법에 의한 각 세포주의 DNA 단편화를 비교하기 위해 형광 현미경을 사용하여 TUNEL 분석을 수행한 도면이다.
도 4는 본 발명에 의한 동결보존방법에 의한 유리화 후 활성 산소 종의 세포 내 수준을 분석한 도면이다.
도 5는 본 발명에 의한 동결보존방법과 기존의 동결보존방법인 완만동결(slow-freezing)방법에 의한 세포 생존력을 분석한 것으로, a는 단일세포수준에서 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 Bax/Bcl-2, Bcl-티, Bid, p53, SOD1, HSF-1의 RNA 발현수준을 비교한 그래프이고, b는 스페로이드에서 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 Bax/Bcl-2, Bcl-티, Bid, p53, SOD1, HSF-1의 RNA 발현수준을 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의한 동결보존방법과 기존의 동결보존방법인 완만동결(slow-freezing)방법에 의한 AD-MSCs의 특성화를 분석한 것으로, 양성마커인 CD44, CD73, CD90 및 CD105와 음성마커인 CD31 및 CD34의 발현도를 분석한 도면이다.
도 7은 본 발명에 의한 동결보존방법과 기존의 동결보존방법인 완만동결(slow-freezing)방법에 의한 AD-MSCs의 특성화를 분석한 것으로, MSC의 분화 가능성을 조사하기 위하여 조골세포, 지방세포, 연골세포의 분화에 의한 골 생성, 지방 생성, 연골 생성을 oil red O 염색, Alcian blue 염색, Von kossa 염색을 통하여 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명에 의한 동결보존방법과 기존의 동결보존방법인 완만동결(slow-freezing)방법에 의한 해동 후 스페로이드의 크기별 생존력을 live-dead 염색법으로 분석한 도면이다(왼쪽부터 스페로이드의 크기가 200, 300, 500, 700, 900 ㎛이고, 스페로이드당 세포 수는 1만, 3만, 5만, 7만, 10만 cells임).
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 세포 유래 및 배양
Lonza (PT-5006; Walkersville, MD)에서 구입한 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell; 이하 MSC))를 폴리스티렌(polystyrene) 조직 배양 접시에 4500 cell/cm2의 밀도로 파종하고, 10% 소태아혈청 (FBS; Thermo Fisher Scientific)과 1 %의 페니실린스트렙토마이신(P / S; Thermo Fisher Scientific)이 보충된 GlutaMAX를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle 's Medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다. 이때, 세포 배양 조건은 5% CO2를 포함하는 습한 조건에서 37℃를 유지하였다. 배지는 2 일마다 교체하였다. 세포는 90% 합류점(confluency)에 도달할 때까지 상기 설명한 배양 배지에서 계대 배양하였다. 모든 실험은 5회 계대 배양한 세포를 사용하였다.
실시예 2. MSC 스페로이드(MSC spheroids) 생성
스페로이드를 생성하기 위해 5계대 MSC를 10,000 내지 100,000 cells/drop을 포함하는 25 ㎕의 배양 배지에 현적배양(hanging drop) 방법을 사용하여 최대 7 일 동안 현탁액에 두었다. 세포는 MSC 배양 배지에서 배양하였고, 조건은 37°C 및 5% CO2의 습한 조건을 유지하였다. 이후, 도립 현미경(Nikon, Chiyoda-ku, Japan)을 사용하여 MSC 스페로이드를 확인하였다.
실시예 3. 세포의 유리화
세포의 유리화는 평형화 및 유리화 용액을 사용한 2단계를 거쳐 수행되었다. 구체적으로, 평형화 용액을 10분간 처리하고, 유리화 용액에는 1분간 처리하였다.
평형화 용액은 20%(v/v) FBS를 함유하는 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS; Thermo Fisher Scientific)를 기반으로 한 EG(에틸렌글리콜, Sigma-Aldrich)와 1.4 M DMSO(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이다.
유리화 용액은 LM5 운반 용액을 베이스로 한 70g/L PVP K12(Thermo Fisher Scientific), 2.8M DMSO, 2.7M EG 및 2.8M 포름아미드(F;SigmaAldrich)로 구성하였다. 이때, 상기 LM5 운반 용액은 포도당(glucose), 만니톨(mannitol), 유당(lactose) 대신 0.3M의 수크로스(sucrose)을 함유하도록 약간의 조정을 가하였다.
먼저, 0.25% 트립신-EDTA (Thermo Fisher Scientific)로 분리된 바이알(vial) 당 약 500,000개의 세포 펠릿을 평형 용액에 10분 동안 현탁한 다음 1분 이내에 유리화 용액과 혼합하였다.
현탁된 세포를 즉시 1.5ml 저온유리병(Nunc, Rochester, MN, USA)으로 옮기고 액체 질소에 직접 주입하였다.
마찬가지로, MSC 스페로이드의 유리화도 상기한 것과 동일하게 2단계의 유리화 용액을 사용하여 수행하였다. 모든 스페로이드는 바이알 당 약 10개의 스페로이드로 냉동 보존하였다.
2주 후, 37 °C의 수조에 바이알을 담구어서 세포를 즉시 해동하였다. 해동된 세포를 각각 5분 동안 20% FBS를 포함하는 DPBS에서 0.5, 0.25 및 0 M 수크로스 용액에 연속적으로 현탁시켰다. 마지막으로 각 세포주를 재 현탁한 다음 배양 배지로 배양하였다.
비교예 1. 기존의 완만 동결 방법을 이용한 세포의 동결
유리화 세포와 기존의 완만 동결 방법을 이용한 비유리화 세포의 생존율을 비교하기 위해, 대조군으로서 일반적으로 수행되는 완만 동결 방법을 이용한 세포의 동결 및 해동을 실시하였다.
구체적으로, 0.25% 트립신-EDTA에 의해 분리된 펠릿을 FBS에 10% DMSO를 함유하는 1.5ml 저온유리병으로 옮겼다. Mr. Frosty 제어 냉각 속도 장치 (Thermo Fisher Scientific)에서 저온유리병을 밀봉하고 -80 °C로 냉동하였다. 24시간 후, 저온유리병을 액체 질소로 옮겼다. 2주 후, Cryovials를 37 °C 수조에 넣어 데우고 완두콩 크기의 얼음 조각만 남을 때까지 교반하였다. 이후, 세포를 1000rpm 25 °C에서 원심 분리하고 배양 배지로 재현탁 및 배양하였다.
실시예 4. 세포 생존력 및 형태 평가
세포를 순차적으로 해동한 후, 트리판 블루(Thermo Fisher Scientific) 염색 후 생존율을 확인하였다. 세포는 4500 cells/cm2의 밀도로 플레이팅 하였으며, 각 세포주를 1일 후 도립 현미경(Nikon)으로 관찰하여 배양 접시에 대한 세포 부착을 확인하였다. 스페로이드 생존력은 LIVE-DEAD 세포 생존력 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 확인하였다. LIVE-DEAD 분석을 위해, 2μM의 calcein AM(녹색, 살아있는 세포) 및 4μM의 ethidium homodimer-1(적색, 죽은 세포)을 추가하고 15분 후, Zeiss 710 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 스페로이드를 이미징하였다.
그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 실시예 3에 의한 유리화 그룹과 비교예 1에 의한 비유리화 그룹에서 해동 후 세포는 비냉동 보존 세포와 유사하게 섬유 아세포와 유사한 형태 및 성장 패턴을 보였다. 또한, 해동 후 유리화 MSC(v-MSC)와 비 유리화 MSC(nMSC)의 생존율은 각각 89.4 ± 4.2 % 및 93.2 ± 1.2 %였다. 유리화 MSC의 생존력은 비 유리화 그룹에 비해 약간 감소했지만 두 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 5. 세포 증식 분석
MSC는 각 계대의 시작과 끝에서 혈구계를 사용하여 계산되었다. 집단배가시간(Population doubling time; 이하 PDT)은 공식 PDT = ln2 / ln(NT/N0)에 의해 측정되었다. 상기 공식에서 NT는 passage 끝의 세포 수, N0은 seeding 밀도에서의 세포 수, T는 배양 시간이다.
그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 해동된 세포의 PDT 또한 5 계대까지 유리화 그룹과 비유리화 그룹 간에 유의한 차이를 보이지 않았다.
실시예 6. 세포 사멸 DNA 단편화 검출을 위한 TUNEL 분석
DNA 단편화는 말단 deoxynucleotidyl transferase 2-deoxyuridine 5-triphosphate (dUTP) nick end labeling(TUNEL; Roche, Indianapolis, IN, USA)을 사용하여 검출되었다. 유리화 세포(v-세포) 및 비-유리화 세포(n-세포)를 상기 실시예 3 및 비교예 1에서 설명한대로 해동하고, 4.0% 파라포름 알데히드로 고정한 후, Click-iT ™Plus TUNEL 분석(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 TUNEL 분석을 실시하였다. TUNEL+ 세포의 이미지는 형광 현미경 (Nikon)을 사용하여 획득하였다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 유리화 그룹과 비 유리화 그룹 간에 TUNEL+ 세포의 수에 유의한 차이가 없었다. 이는 유리화가 세포 DNA를 손상시키지 않는다는 것을 보여준다.
즉, 이러한 결과는 기존의 완만동결에 의한 세포 내 결정화를 고려하면, 고농도의 CPA를 이용한 유리화 방법이 비유리화 방법보다 세포 보존에 더 안전한 접근법이 될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7. 세포 내 활성 산소 측정
삼투압 스트레스 또는 산화 스트레스를 유발하는 동결 방지제(CPA)의 독성을 확인하기 위해 세포 활성산소종의 세포 내 수준을 조사하였다.
활성산소종(ROS)은 DCFDA 세포 ROS 검출 분석 키트 (Abcam, Cambridge, MA, USA)를 사용하여 측정되었다. 즉, 유리화 세포(v-세포) 및 비유리화 세포(n세포)를 해동한 후, 각 펠릿을 37 °C에서 45 분 동안 25μM DCFDA를 포함하는 1x 버퍼에서 배양하였다.
활성산소종(ROS)은 세척 단계 없이 유세포 분석법으로 측정하고, Becton Dickinson FACS Calibur를 사용하여 3만 개의 표지된 세포를 획득하고 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 모든 세포주에서 유리화 그룹과 비 유리화 그룹 간에 ROS 수준의 유의한 차이가 없었다. 이는 세포가 동결되고 빠르게 해동될 때 유리화에 의하여 활성산소종(ROS)이 생성되지 않음을 입증하는 것이다.
실시예 8. 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응
각 샘플의 총 RNA는 TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. 다음, 고용량 cDNA 역전사 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 1μg의 총 RNA를 complementary deoxyribonucleic acid(cDNA)으로 전사하였다. LightCycler 96 기기(Roche)에서 FastStart Essential DNA Green Master (Roche, Pleasanton, CA, USA)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
모든 PCR 반응은 삼중으로 수행되었다. 각 샘플에 대한 삼중 웰의 평균주기 역치(Ct) 값을 수집하고 발현 데이터를 내인성 대조군 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)로 표준화하였다.
표적 유전자 및 관련 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
표적 유전자 염기서열 서열번호
GAPDH sense 5'-GTCTGAACCATGAGAAGTATGA 1
GAPDH antisense 5'-CTTCCACGATACCAAAGTTGT 2
Bax sense 5'-GTCAGCTGCCACTCGGAAA 3
Bax antisense 5'-AGTAACATGGAGCTGCAGAGGAT 4
Bcl-2 sense 5'-TCAGAGACAGCCAGGAGAAATCA 5
Bcl-2 antisense 5'-CCTGTGGATGACTGAGTACCTGAA 6
Bcl-XL sense 5'-ATGGCAGCAGTAAAGCAAGC 7
Bcl-XL antisense 5'-CGGAAGAGTTCATTCACTACCTGT 8
Bid sense 5′-ACTGGTGTTTGGCTTCCTCC 9
Bid antisense 5'-ATTCTTCCCAAGCGGGAGTG 10
SOD1 sense 5'-CTGAAGGCCTGCATGGATTC 11
SOD1 antisense 5'-CCAAGTCTCCAACATGCCTCTC 12
p53 sense 5'-CCCAAGCAATGGATGATTTGA 13
p53 antisense 5'-GGCATTCTGGGAGCTTCATCT 14
HSF1 sense 5'-GCCTTCCTGACCAAGCTGT 15
HSF1 antisense 5'-AAGTACTTGGGCAGCACCTC 16
그 결과, 도 5의 a에서 보는 바와 같이 단일 세포 수준에서 유리화 그룹과 비 유리화 그룹 사이에 큰 차이가 없었다.
도 5의 b는 각 스페로이드 그룹의 다양한 유전자 발현을 분석하여 스페로이드의 유리화 후 증가된 생존력을 확인한 것인데, Bax/Bcl-2 비율이 유리화되지 않은 스페로이드가 유리화된 스페로이드에 비해 더 높은 것을 확인하였다.
Bcl-2 계열 단백질의 구성원인 Bcl-xL은 유리화된 스페로이드에서 상당히 상향 조절되었으며 BH3 도메인만 포함하는 프로-아폽토시스 Bcl-2 단백질인 Bid는 유리화 된 스페로이드와 비-유리화 된 스페로이드간에 유의한 차이가 없었다. 또한, 세포 사멸과 관련된 p53은 유리화되지 않은 스페로이드에서 유의하게 증가하여 세포가 세포 응집체에서 서서히 동결될 때 냉동 손상에 의한 세포사멸이 강화되었음을 보여준다. 또한 SOD1 유전자를 분석하여 ROS 제거로 인한 산화 스트레스 발생을 확인하였고, 비 유리화 및 유리화 스페로이드는 모두 유사한 발현 수준을 가지는 것으로 확인하였다. HSF-1은 SOD1 발현과 동일한 경향을 보였다.
실시예 9. 유세포 분석에 의한 MSC의 특성화
유리화 세포(v-MSC) 및 비유리화 세포(n-MSC)의 세포 표면 항원 프로파일을 유세포 분석에 의해 특성화하였다.
트립신-EDTA에 의해 분리된 세포 펠렛을 FACS 완충액(0.5% 소혈청알부민 (BSA) 및 2mM EDTA를 포함하는 DPBS 용액)에 재현탁하고 미리 적신 40μm 세포 스트레이너(strainer)를 사용하여 여과하였다. 그 다음 MSC 표면 마커의 각 항체를 사용하여 세포를 표지하였다. 각 항체는 CD44-APC, CD73-PE, CD90-APC, CD105-PE (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) 및 APC, PE에 접합된 음성 마커 CD31, CD34 (BD Biosciences)에 대한 형광 색소 접합 항체이다. 상응하는 IgG 대조군을 동일하게 준비하고 30,000개의 표지된 세포를 획득하고 Becton Dickinson FACS Calibur를 사용하여 분석하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 모든 그룹은 CD44, CD73, CD90 및 CD105 발현을 나타내는 일반적인 MSC 항원 프로필을 보였지만, 음성 마커에 대한 CD31 및 CD34는 검출되지 않았다.
이는 두 그룹 모두 분화 마커를 발현하지 않고 MSC의 모든 적절한 마커를 발현함을 나타낸다.
실시예 10. MSC의 분화 가능성 평가
조골 세포, 연골 모세포 및 지방 세포의 분화 유도를 위해 시판되는 키트 (Thermo Fisher Scientific)가 사용되었다. 분화 조건 하에서 세포는 12-웰 플레이트에서 유지되었다. 골 형성과 연골 형성은 21일 동안 유도되었고 지방 형성 계통은 14일 동안 유도되었다. 각 분화 과정을 평가하기 위해 적절한 염색을 수행하였고, Oil Red O 염색을 사용하여 세포 내 지질 방울(droplets)을 검출하였다. Von Kossa 염색을 수행하여 세포 외 무기질 매트릭스를 시각화하고 Alcian blue 염색을 사용하여 프로테오글리칸의 형성을 확인하였다. 이미지는 도립현미경 (Nikon, Chiyoda-ku, Japan)을 사용하여 분석하였다.
도 7에서 보는 바와 같이 분화 잠재력 또는 특성 측면에서 유리화 세포(v-MSC)와 비유리화 세포(n-MSC)간에 유의한 차이가 없음을 알 수 있다.
실시예 11. 해동 후 크기 별 스페로이드의 생존력
다양한 크기 (200~900 μm)의 스페로이드를 제작하고 해동 후 유리화 및 비 유리화 그룹 간의 생존 가능성을 확인하였다. 동결 및 재가열 단계 후, live-dead 염색 절차를 사용하여 세포 생존을 시각화하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 대부분의 세포가 살아 있고(녹색 형광), 죽은 세포는 거의 관찰되지 않았다(적색 형광).
반면, 정상적인 2D 세포 배양 결과와 달리 유리화 되지 않은(완만동결) 그룹은 코어 영역에서 과도한 세포 사멸을 보였다. 유리화 된 그룹은 비교적 가벼운 세포사멸을 보였다. 이는 고농도의 동결방지제(CPA)가 스페로이드 코어에 침투하고 세포 사멸을 보호할 수 있기 때문에 재가열 후 유리화 그룹에서 세포 응집체의 생존력이 향상되었음을 입증하는 것이다.
실시예의 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 5 (La Jolla, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 모든 통계 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였으며, 실험 결과의 통계적 중요성은 one-way ANOVA를 사용하여 결정되었다. 실험군 간의 차이는 p <0.05 일 때 유의미한 것으로 판단하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> CRYOPRESERVATION METHOD OF STEM CELL CULTURE USING HIGH CONCENTRATION OF CRYOPROTECTIVE AGENTS <130> P208629 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense <400> 1 gtctgaacca tgagaagtat ga 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense <400> 2 cttccacgat accaaagttg t 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax sense <400> 3 gtcagctgcc actcggaaa 19 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax antisense <400> 4 agtaacatgg agctgcagag gat 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 sense <400> 5 tcagagacag ccaggagaaa tca 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 antisense <400> 6 cctgtggatg actgagtacc tgaa 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-XL sense <400> 7 atggcagcag taaagcaagc 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-XL antisense <400> 8 cggaagagtt cattcactac ctgt 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bid sense <400> 9 actggtgttt ggcttcctcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bid antisense <400> 10 attcttccca agcgggagtg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD1 sense <400> 11 ctgaaggcct gcatggattc 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD1 antisense <400> 12 ccaagtctcc aacatgcctc tc 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 sense <400> 13 cccaagcaat ggatgatttg a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 antisense <400> 14 ggcattctgg gagcttcatc t 21 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSF1 sense <400> 15 gccttcctga ccaagctgt 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSF1 antisense <400> 16 aagtacttgg gcagcacctc 20

Claims (13)

  1. (a) 세포를 평형화(equilibration) 용액에 5 내지 15분간 처리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계가 완료된 세포를 유리화(vitrification) 용액에 10초 내지 120초간 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계가 완료된 세포를 -196 ℃의 액체 질소에 넣는 단계;를 포함하는, 세포의 동결보존 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 평형화 용액은 20%(v/v) FBS를 함유하는 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 기반으로 한 에틸렌글리콜(EG)과 1.4 M DMSO로 구성된 것인, 세포의 동결보존 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유리화 용액은 고농도의 동결방지제(Cryoprotective agent, CPA)로 구성된 것으로서,
    LM5 운반 용액을 베이스로 하고, PVP K12, DMSO, 에틸렌글리콜(EG) 및 포름아미드를 포함하여 구성된 것인, 세포의 동결보존 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유리화 용액은 LM5 운반 용액을 베이스로 한 70g/L PVP K12, 2.8M DMSO, 2.7M EG 및 2.8M 포름아미드로 구성된 것인, 세포의 동결보존 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 LM5 운반 용액은 포도당(glucose), 만니톨(mannitol), 유당(lactose) 대신 0.3M의 수크로스(sucrose)을 함유하도록 조정한 것인, 세포의 동결보존 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포를 평형화 용액에 처리하는 시간은 10분이고, 유리화 용액에 처리하는 시간은 60초인, 세포의 동결보존 방법.
  7. 제1항의 동결보존 방법에 의하여 동결보존된 세포를 해동하는 방법에 있어서,
    동결보존된 세포를 해동한 후, 점차적으로 낮은 농도의 수크로스 용액에 현탁하여 세포 손상을 최소화하는, 세포 해동 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포의 해동은 액체질소에 보관된 세포를 37 °C의 수조로 옮긴 후, 20% FBS를 포함하는 DPBS에서 0.5, 0.25 및 0 M 농도의 수크로스 용액에 각각 5분씩 연속적으로 현탁하여 이루어지는 것인, 세포 해동 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 해동 방법에 의해 해동된 세포는 세포의 생존력, 형태 유지성 및 기능이 유지되고, DNA 손상이 억제된 것인, 세포 해동 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 배아줄기세포(ES), 유도만능줄기세포(iPSC), 성체줄기세포(ASC)로서 중간엽줄기세포(MSC), 조혈줄기세포(HSC) 및 신경줄기세포(NSC)로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것인, 세포의 동결보존 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포는 복수개의 세포 집합체로서, 3차원 구조를 형성한 스페로이드(spheroid) 또는 오가노이드(organoid)인, 세포의 동결보존 방법.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 배아줄기세포(ES), 유도만능줄기세포(iPSC), 성체줄기세포(ASC)로서 중간엽줄기세포(MSC), 조혈줄기세포(HSC) 및 신경줄기세포(NSC)로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것인, 세포 해동 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 세포는 복수개의 세포 집합체로서, 3차원 구조를 형성한 스페로이드(spheroid) 또는 오가노이드(organoid)인 세포 해동 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20120117209A (ko) * 2011-04-14 2012-10-24 이효종 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 동결보존방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100411243B1 (ko) 2001-01-17 2003-12-18 학교법인 성광학원 생식세포 및 수정란의 유리화 동결 및 융해방법
KR20120117209A (ko) * 2011-04-14 2012-10-24 이효종 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 동결보존방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BMC Biotechnology,vol.20(45), pp.1~9(2020)* *

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