KR100187891B1 - 직접 이식용 소 수정란의 동결 보존액 및 이를 이용한 동결보존방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 소 수정란 동결보존액은 수정란을 동결 및 보존 후에 암소에 직접 이식하기 위하여 만든 것으로 소 수정란의 동결보존 기본액 약 70v/v%, 에틸렌글리콜 1.0-2.5M, 슈크로스 0.05-0.20M, 소 혈청 알부민(BSA) 3-5중량%, 및 태내 송아지 혈청(FCS) 10-30v/v%를 포함함을 특징으로 하며, 본 발명은 이러한 동결보존액을 이용하여 소의 수정란을 동결보존하는 방법을 또한 제공한다.

Description

직접 이식용 소 수정란의 동결보존액 및 이를 이용한 동결보존방법

본 발명은 직접 이식용 소 수정란의 동결보존액 및 이를 이용한 동결보존방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 동결된 수정란을 융해한 후의 생존율 및 수정란 이식시의 수태율이 높은 소 수정란의 동결보존액 및 이를 이용하여 소의 수정란을 동결보존하는 방법에 관한 것이다.

한우의 수정란은 정자보다 10배 이상 크기 때문에 특별한 동해(凍害) 방지제를 사용하여 동결하여야만 동결 융해후에 수정란이 생존할 수 있게 된다. 지금까지 수정란 동해 방지제로는 주로 1.4M, 0.74M 또는 0.35M 글리세롤(Glycerol) 동결액이 주로 이용되어 왔으나, 이 경우에는 융해후 수정란내의 글리세롤을 확실히 제거해야만 하였다.

한우 수정란 동결 및 융해시 가장 중요한 점은 동해방지제를 이용하여 여러 단계에 걸쳐 세포내 수분을 제거하게 되고 동결융해 후에는 동결의 반대로 수정란내로 수분이 환원될 수 있도록 해야만 수정란의 생존율이 높다는 것이다. 지금까지는 이러한 목적을 위하여 분자량이 비교적 작은 글리세롤을 동결시에, 그리고 분자량이 큰 슈크로스를 융해시에 각각 많이 사용하여 왔다.

즉, 슈크로스는 융해후 동해방지제의 농도를 감소시키면서 한편으로는 용액내 용매의 삼투압을 일정하게 유지함으로써 융해시 수정란의 갑작스런 팽윤이 일어나지 않게 하는 역할을 한다. 따라서 동결 융해후 여러 단계에 걸쳐 동해방지제를 제거해야만 (다단계 글리세롤 평형) 수정란을 안전하게 발달시킬 수 있다고 믿어왔기 때문에 수정란 이식기술의 산업화에 많은 장해요인이 되어왔다.

이러한 상황하에서, 본 발명자들은 다단계 글리세롤 평형 방법을 채택하지 않고도 소의 수정란을 보다 안전하고 생존성이 높게, 그리고 수정란의 이식 시에 수태율을 높일 수 있는 방법을 제공하고자 하는 목적으로 광범위하게 연구를 행하였고, 그 결과로서 특정 조성의 동결보조제 및 이를 이용한 동결보존법을 확립하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

그러므로 본 발명의 목적은 동결 융해 수정란의 생존율이 높고 수정란 이식시에 수태율이 높은 소 수정란의 동결보존제를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 상기 동결보존제를 이용하여 소의 수정란을 동결보존하는 방법을 제공하는 것에 그 목적이 있다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 후술하는 소 수정란의 동결보존 기본액 약 70v/v%, 에틸렌글리콜 1.0-2.5M, 슈크로스 0.05-0.20M, 소 혈청 알부민(BSA) 3-5중량%, 및 태내 송아지 혈청(FCS) 10-30v/v%로 이루어진 직접 이식용의 소 수정란 동결보존액을 제공한다.

본 발명은 또한 상기한 동결보존액을 이용하여 소 수정란을 동결보존하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 소 수정란을 동결보존액은 후술하는 소 수정란의 동결보존 기본액 약 70v/v%, 에틸렌글리콜 1.0-2.5M, 바람직하게는 약 1.8M, 슈크로스 0.05-0.20M, 바람직하게는 약 0.1M, 소 혈청 알부민(BSA) 3-5중량%, 바람직하게는 약 4중량%, 태내 송아지 혈청(FCS) 10-30v/v%, 바람직하게는 약 20v/v%로 이루어져 있으며, 후술하는 조성의 수정란 동결보존용 기본액과 혼합하여 사용한다.

본 발명에 따른 동결보존액 중에서, 동해 방지제인 에틸렌 글리콜은 분자량이 작고 세포내 침투성 성질을 갖고 있으며, 슈크로스는 분자량이 커서 세포 비투과성이면서 삼투압을 높여 주기 때문에 수정란의 동해 방지제인 에틸렌 글리콜과 평형을 이룰 때에 수정란 위축이나 세포형태의 변성을 막아주는 역할을 하며, BAS와 FCS는 한우 수정란에서 저온 충격의 완화와 이식시 자궁내에서 수정란의 생존을 높여줄 수 있다.

또한 본 발명은 상기와 같은 동결보존제를 이용하여 소의 수정란을 동결보존하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 소의 수정란을 약 20℃의 상기 동결보존제에 넣어 약 20분간 삼투압 평형을 시킨 후, 이어 약 -7℃에서 약 3분간 정치하고 -7℃에서 식빙(植氷, seeding)한 후, -31℃까지 분당 0.3℃씩 온도를 낮춘 다음 -196℃의 액체질소에 보존하는 것을 포함한다.

이러한 동결 조건은 기존의 상온에서 -7℃까지 분당 1℃씩 하강 한 후, -7℃에서 식빙 후 -31℃가지 분당 0.3℃씩 하강시키고, -35℃까지 분당 0.1℃씩 낮춘 다음 -196℃의 보존하는 것보다 동결에 요하는 시간을 절감할 수 있으며, 또한 융해 후 생존율을 20% 이상 개선시킨다.

본 발명의 방법에 적용할 수 있는 수정란은 소의 수정란이면 무난히 사용할 수 있지만, 바람직하게는 한우의 수정란으로서 배반포배 이상의 향태적으로 정상적인 것이 바람직하게 사용된다. 그리고, 체외 수정란일 경우에는 수정후 8일 이내의 배반포 혹은 확장 배반포의 수정란을 바람직하게 이용할 수 있다.

위와 같이 동결된 수정란은 사용시에, 따뜻한 물, 예를 들면 약 20℃의 물에 융해하여 사용하며, 바람직하게는 융해 후 약 5분 이내에 이식하여야 한다. 5분을 초과하는 경우에는, 항동해제인 에틸렌글리콜의 삼투압 영향으로 수정란 세포질의 많은 부분이 손상될 우려가 있으나 5분 이내일 경우에는 큰 문제가 안된다. 또한 생존한 세포질이 많을수록 자궁에 들어가 자궁액과 희석 혼합되므로 생존할 가능성이 높다.

상기와 같이, 본 발명의 방법에 따라 동결보존된 수정란은 종래 기술을 이용하여 동결보존시킨 경우와 달리 융해시에 다만 따뜻한 물을 이용하여 융해하면 되므로, 방법이 간단하고 수정란의 생존율을 높일 수 있으며, 수정란에 가해지는 충격이 현저히 감소되는 장점이 있다.

이하 각종 구현예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[수정란의 선정]

한우 수정란으로 배반포배 이상의 형태적으로 정상적인 것, 또는 체외 수정란일 경우는 수정 후 8일 이내에 배반포 혹은 확장 배반포의 수정란을 선정하여 이용하였다.

만일 수정란이 실온에서 5분 이상 노출될 경우에는 수정란 내의 온도변화, 그리고 이에 따른 에틸렌글리콜의 영향에 따른 수정란의 손상 등이 우려되어 생존율 또는 수태율에 영향을 미칠 수 있다.

[실시예 2]

[수정란 동결보존액 제조]

하기 표 1에 나타낸 조성을 이용하여 소 수정란의 동결보존을 위한 기본액을 제조하였다.

표 1과 같이 하여 제조한 수정란 동결을 위한 기본액 70ml에 400mg의 BSA를 첨가하고 20ml의 FCS를 첨가한 다음 에틸렌글리콜 10ml(1.8M) 및 슈크로스 3.42g(0.1M)을 넣어 잘 녹인 다음 0.22㎛의 필터를 이용하여 여과시킨 후 20℃에 보존한다.

[실시예 3-5 및 비교예 1-2]

상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 각 성분의 함량을 아래 표2와 같이 변화시키면서 동결보존액을 제조하였다.

상기 표 2의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비해 수정란의 생존율을 월등히 향상시키며, 슈크로스의 함량이 0.20M을 초과하는 비교예 2의 경우, 생존율에서의 향상이 전혀 얻어지지 않는다.

[실시예 6]

[동해방지제와 수정란의 삼투압 평형]

20℃ 온도가 유지되는 조건하에서 수정란을 상기 실시예 3-5 및 비교예 1-2의 동결보전액에 넣어 약 20분간 삼투압 평형을 시킨 후 스트로우에 주입한다.

[실시예 7]

[수정란 동결]

삼투압 평형이 된 수정란은 곧바로 -7℃로 온도 조정된 수정란 동결기에 옮겨놓고 3분 후에 식빙(植氷, seeding)하여 -31℃까지 분당 0.3℃씩 온도를 낮추고 -196℃의 액체 질소통에 곧바로 옮겨 넣어 보존한다.

[실시예 8]

[수정란 이식]

상기 실시예 7에서와 같이 -196℃에 동결보존된 수정란을 약 20℃ 물에 동결된 수정란을 10-20초간 녹이고, 이를 5분이내에 암소의 자궁각 깊숙히 이식한다.

[실험예 1]

상기 실시예 7에 따라 해동된 각 수정란, 그리고 종래의 글리세롤을 이용한 동결보존 및 슈크로스를 이용한 단계별 글리세롤 평형 해동법에 따라 3단계 및 5단계로 해동된 수정란을 각각 하기 표 4 및 표 3의 숫자대로 배양한 후 생존율을 측정하였다.

표 4에 나타낸 수정란은 상기 실시예 2의 조성의 동결보존제를 이용하여 동결보존한 경우이며, 수정란으로는 상실배, 배반포배, 확장 배반포배 단계의 것을 각각 사용하였다.

배반포배, 확장 배반포배는 암소의 자궁에 머무르는 단계로서 비외과적 이식을 수행할 때에는 반드시 이 시기의 수정란을 이식해야 생존할 수 있으며, 수정 후 6.5일 내지 9일 사이에 해당하며 이 시기보다 어린 수정란은 외과적으로 수술하여 난관에 이식하여야 생존하지만, 이 과정이 너무 복잡하고 비경제적이다.

표 3에서 보는 바와 같이 종래의 글리세롤 3단계 혹은 5단계의 평형에 의한 동격 융해시 수정란의 생존율은 약 40% 정도였으나, 표4에 나타난 대로 본 발명의 방법에 의해서는 배반포이상의 수정란에서 83∼84%의 아주 높은 생존율을 나타내고 있다. 따라서 본 발명의 방법은 상실배 보다는 배반포 이상의 수정란을 이용하는 것이 바람직하다.

[실험예 2]

상기 실험예 1과 동일하게 실시하되, 실시예 3-4 및 비교예 1-2의 보존액을 사용하여 동결보존한 배반포배 이상의 수정란에 대하여 실험을 실시하고, 그 결과를 표5에 나타내었다.

[실험예 3]

종래의 3단계 글리세롤 평형법 및 본 발명에 따른 방법에 의해 얻은 동결보존 수정란의 수태율을 측정하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

표 6에서와 같이, 본 발명의 동결보존액을 이용한 수정란 직접 이식용 동결방법에 의해서 수태율 및 쌍둥이 송아지 생산율도 기존의 수정란 동결 및 이식방법보다 높다는 것이 입증된다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 새로운 소 수정용 동결보존액은 한우 동결 수정란에 대한 독성이 적고, 동결 용해후 생존성이 높으며, 또한 수정란 이식시 수태율이 높다고 하는 특징을 갖는다.

Claims (5)

1. 소 수정란의 동결보존 기본액 약 70v/v%, 에틸렌글리콜 1.0-2.5M, 슈크로스 0.05-0.20M, 소 혈청 알부민(BSA) 3-5중량%, 및 태내 송아지 혈청(FCS) 10-30v/v%를 포함함을 특징으로 하는 직접이식용 소 수정란 동결보존액.
2. 제1항에 있어서, 상기 동결보존액은 후술하는 소 수정란의 동결보존 기본액 약 70v/v%, 에틸렌글리콜 약 1.8M, 슈크로스 약 0.1M, 소 혈청 알부민(BSA) 약 4중량%, 태내 송아지 혈청(FCS) 약 20v/v%로 이루어져 있음을 특징으로 하는 동결보존액.
3. 다음의 단계: 소의 수정란을 약 20℃의 상기 동결보존제 및 소 수정란 동결보존용 기본액의 혼합물에 넣어 약 20분간 삼투압 평형을 시키는 단계. 및 이어 약 -7℃에서 약 3분간 정치하고 -31℃까지 분당 0.3℃씩 하강시킨 후 -196℃의 액체질소에 동결된 상태로 보존하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 소 수정란을 동결보존하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 소 수정란은 한우의 배반포 이상의 수정란임을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 동결된 수정란은 사용시에 약 20℃ 정도의 물에 용해한 후, 약 5분 이내의 암컷 소에 이식함을 특징으로 하는 방법.