CN1454990A - 一种人卵母细胞的贮存方法 - Google Patents
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Abstract
一种人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱内进行培养，以供体外受精。该方法能够提高人卵母细胞冻存后的存活率，操作简便，所需医用仪器和溶液简单、价廉，成本低、复苏率高，有利于解决人类不孕问题和计划生育国策的贯彻执行。
Description
技术领域
本发明涉及一种人卵母细胞的贮存方法，确切地说，涉及一种采用缓慢低温冷冻和快速解冻复苏的贮存人卵母细胞方法，属于生殖医学的生物医学技术领域。
背景技术
由于在体外受精-胚胎移植(IVF-EF，in vitro fertilization and embryotransfer)技术中促超排卵技术及胚胎培养技术的提高，使得将近一半的IVF治疗周期有剩余的卵母细胞。人卵母细胞的低温贮存对不育症的治疗非常重要，如果能将这部分卵母细胞冻存，再经复苏后放回宫腔，可以增加受孕机会。另外，卵母细胞的冻存具有无需及时供应精子，可以在几年后复苏卵母细胞，在绝育手术和治疗前贮存卵母细胞以及包括应用于赠卵和因放、化疗、手术治疗而失去卵巢功能的病人等优点，同时也避免了伦理问题。因此，如何提高人卵母细胞冻存后的存活率是目前业内人士亟待解决的问题。因为人卵母细胞非常娇嫩，对冻存非常敏感，很容易出现非整倍体现象。所以，采用目前现有的冷冻技术进行冻存人卵母细胞的效果很不理想，复苏率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种人卵母细胞的贮存方法，该方法能够提高人卵母细胞冻存后的存活率，操作简便、费用低、复苏率高；较好地解决了现有的冷冻技术冻存人卵母细胞的效果不理想、复苏率低的问题。
本发明的目的是这样实现的：一种人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％二氧化碳(CO2)浓度的孵箱内进行培养，以供体外受精。
所述的方法包括下列具体操作步骤：
A、冷冻预处理：取卵之后，先经2-3小时的孵育，去除人卵母细胞周围卵丘组织，再将该人卵母细胞放在冷冻保护液里进行冷冻处理；
B、程序降温冷冻和低温贮存：将该人卵母细胞装入麦管中，放入程序冷冻仪中，进行程序化缓慢降温冷冻；当温度达到设定的低温值，并稳定10-20分钟之后，将该人卵母细胞移入液氮中低温贮存，以供复苏备用；
C、快速升温解冻：从液氮中取出贮存有该人卵母细胞的麦管，先后放在室温空气中和30±3℃的水中，使之迅速升温；再将麦管擦干、剪开，取出该人卵母细胞，再顺序地放入不同的解冻处理液中复苏；
D、复苏后培养：将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％CO2浓度孵箱内进行培养，以供体外受精。
所述的步骤A中进一步包括下述配制冷冻保护液的操作步骤：
A1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；
A2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液混合配制成含1.0～2.0M的PROH液，称作B液；
A3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成1.0～2.0M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作C液；
A4、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。
所述的步骤A中的冷冻预处理进一步包括下述操作步骤：
A5、将A液、B液和C液三种溶液分别放在室温(18～28℃)下平衡1～2小时后，分别取出适量置于器皿中；
A6、从培养箱中取出人卵母细胞，先将该人卵母细胞置于B液中浸泡5～15分钟后，又在C液中浸泡10～20分钟，此时开始准备程序冷冻仪。
所述的步骤B中进一步包括下述操作步骤：
B1、在C液中开始将人卵母细胞装入麦管，装管方法是：用麦管吸C液1.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→含有人卵母细胞的C液2.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→C液1.5±1.0cm→封口；
B2、将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为：从+15～25℃开始，先以-2±1.0℃/分的降温速率降到-7±0.1℃时，在无人卵母细胞液柱处植冰(seeding)，又从-7±0.1℃开始继续以-0.3±0.1℃/分的降温速率缓慢降温到-30±5℃时，再以-30±5℃/分的降温速率快速降温到-175±5℃，稳定10-20分钟后，再将该装有人卵母细胞的麦管迅速移入液氮(-196℃)中低温贮存。
所述的步骤C中进一步包括下述配制复苏处理液的操作步骤：
C1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；
C2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.5～1.5M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作D液；
C3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.2～1.2M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作E液；
C4、将体积比为85～95％的A液与Sucrose配制成0.25～0.35M的Sucrose液，称作F液；
C5、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
所述的步骤C中进一步包括下述快速升温解冻的操作步骤：
C6、将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中30～50秒后，再置于30±3℃水中浸泡30～50秒；
C7、将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后分别置于D液和E液中各2～10分钟；再将其先后分别置于F液和A液中各5～15分钟，然后将该人卵母细胞移入已在37±0.2℃孵箱中平衡的A液中5～15分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱中培养，以供体外受精。
本发明是一种对人卵母细胞采用慢冻快融的贮存方法，该方法先把人卵母细胞浸泡在含有蔗糖(Sucrose)等的冷冻保护液中进行处理，再将处理过的人卵母细胞经程序缓慢降温冷冻后贮存于液氮；需要使用时，利用解冻复苏液使该人卵母细胞快速升温复苏，再将解冻复苏的人卵母细胞放入序贯培养液中进行培养，使该人卵母细胞能够通过卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)等体外受精技术发育成为胚胎。该方法能够提高人卵母细胞冻存后的存活率，操作简便，所需医用仪器和溶液简单、价廉，成本低、复苏率高，有利于解决人类不孕问题和计划生育国策的贯彻执行。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
参见图1，本发明是一种人卵母细胞的贮存方法，该方法是先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行浸泡冷冻预处理1，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中，即降温冷冻和低温贮存2；在需要使用时，先使该人卵母细胞快速升温解冻3，使之复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％二氧化碳CO2浓度的孵箱内进行培养4，以供体外受精。
下面结合本发明的实施例具体介绍人卵母细胞的贮存方法。
先说明第一个实施例的具体操作步骤：
首先制备冷冻保护液：将42ml的人体输卵管液缓冲液HTF-HEPES与6.3ml的人体血清混合配制成含15％血清的溶液，称作A液；接着将8.5ml的A液与1.0ml的PROH液混合配制成1.0M的PROH液，称作B液；又取8.5ml的A液加入1.0ml的PROH液和Sucrose混合配制成含1.0M的PROH液与0.3M的Sucrose液的混合液，称作C液；再用过滤器(其筛孔规格为0.22微米)先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。最后，将A液、B液和C液分别放在室温(25℃)下平衡1.5小时以后，分别取出1.5ml置于无菌器皿中；剩余溶液可以放入4℃冰箱内，保存期为一周。此时从培养箱中取出人卵母细胞，将去除了卵丘的卵母细胞置于上述B液中浸泡15分钟后，又在C液中浸泡12分钟；同时启动程序冷冻仪。
然后进行程序降温冷冻处理：在C液中浸泡到12分钟时取出该人卵母细胞装入麦管，具体装管方法是：用麦管吸C液2.5cm→空气2.0cm→其中含有人卵母细胞的C液3.0cm→空气2.0cm→C液2.5cm→封口。此时，将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为：从+18℃开始，先以-1.5℃/分的降温速率降到-7℃时，维持2分钟后，在无人卵母细胞液柱的地方植冰(seeding)，再保持10分钟后，又从-7℃开始继续以-0.3℃/分的降温速率缓慢地降温到-30℃时，再以-30℃/分的降温速率快速降温到-172℃低温，在稳定10分钟后，将该装有人卵母细胞的麦管移入液氮(-196℃)低温贮存。
在需要进行体外受精而取出低温贮存的人卵母细胞之前，首先要配置解冻复苏处理液：先用42ml的HTF-HEPES人体输卵管液缓冲液与6.3ml的人体血清混合配制成含15％血清溶液，称作A液；接着在9.2ml的A液加入0.8ml的PROH液和Sucrose混合配置成0.8M的PROH液与0.25M的Sucrose液的混合液，称作D液；再将9.6ml的A液加入0.4ml的PROH液和Sucrose混合配置成0.4M的PROH液与0.25M的Sucrose液的混合液，称作E液；还用9ml的A液和Sucrose配制成0.25M的Sucrose液的混合液，称作F液；最后用筛孔为0.22微米的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
解冻复苏的步骤是：先将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中35秒后，再置于30℃水中浸泡45秒；再将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后置于D液和E液中各5分钟；又将其先后分别放置于F液和A液中各15分钟，然后将人卵母细胞移入已在37℃孵箱中平衡的A液中放置15分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37℃、5％CO2浓度的孵箱中培养2小时后，取出进行卵胞浆内单精子显微注射受精。
本发明另一个实施例的具体操作步骤是：
首先制备冷冻保护液：将42ml的人体输卵管液缓冲液HTF-HEPES与10.5ml的人体血清混合配制成含25％血清的溶液，称作A液；接着将8.0ml的A液与2.0ml的PROH液混合配制成2.0M的PROH液，称作B液；又取8.0ml的A液加入2.0ml的PROH液和Sucrose混合配制成含2.0M的PROH液与0.35M的Sucrose液的混合液，称作C液；再用过滤器(其筛孔规格为0.22微米)先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。接着，将A液、B液和C液分别放在室温(25℃)下平衡2小时，分别取出1.2ml置于无菌器皿中；剩余溶液可以放入4℃冰箱内，保存期为一周。此时从培养箱中取出人卵母细胞，将去除了卵丘的卵母细胞置于上述B液中浸泡7分钟后，又在C液中浸泡20分钟；同时启动程序冷冻仪。
然后进行程序降温冷冻处理：在C液中浸泡到20分钟时取出该人卵母细胞装入麦管，具体装管方法是：用麦管吸C液2.0cm→空气2.5cm→其中含有人卵母细胞的C液2.5cm→空气2.5cm→C液2.0cm→封口。此时，将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为：从+24℃开始，先以-2.5℃/分的降温速率降到-7℃时，维持3分钟后，在无人卵母细胞液柱的地方植冰(seeding)，再保持10分钟后，又从-7℃开始继续以-0.4℃/分的降温速率缓慢地降温到-35℃时，再以-35℃/分的降温速率快速降温到-180℃低温，在稳定15分钟后，将该装有人卵母细胞的麦管移入液氮(-196℃)中低温贮存。
在需要进行体外受精而取出低温贮存的人卵母细胞之前，首先要配置解冻复苏处理液：先用42ml的HTF-HEPES人体输卵管液缓冲液与10.5ml的人体血清混合配制成含25％血清的溶液，称作A液；接着，将8.5ml的A液加入1.5ml的PROH液与Sucrose混合配置成1.5M的PROH液与0.35M的Sucrose液的混合液，称作D液；再将9ml的A液加入1ml的PROH液与Sucrose混合配置成1.0M的PROH液与0.35M的Sucrose液的混合液，称作E液；还用9ml的A液与Sucrose配制成0.35M的Sucrose液的混合液，称作F液；最后用筛孔为0.22微米的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
解冻复苏的步骤是：先将冷冻麦管从液氮取出，置于室温空气中45秒后，再置于32℃水中浸泡35秒；再将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后置于D液和E液中各8分钟；又将其先后分别放置于F液和A液中各8分钟，然后将人卵母细胞移入已在37℃孵箱中平衡的A液中放置10分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37℃、5％CO2浓度的孵箱中培养2.5小时后，取出进行卵胞浆内单精子显微注射受精。
本发明已经试验实施多次，试验的结果是成功的，实现了发明目的。
Claims (7)
1、一种人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：先把人卵母细胞放在含有蔗糖(Sucrose)和1，2丙二醇(PROH)的冷冻保护液里进行预处理，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后贮存于液氮中；在需要使用时，使该人卵母细胞快速升温复苏，再将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％二氧化碳(CO2)浓度的孵箱内进行培养，以供体外受精。
2、根据权利要求1所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述的方法包括下列具体操作步骤：
A、冷冻预处理：取卵之后，先经2-3小时的孵育，去除人卵母细胞周围卵丘组织，再将该人卵母细胞放在冷冻保护液里进行冷冻处理；
B、程序降温冷冻和低温贮存：将该人卵母细胞装入麦管中，放入程序冷冻仪中，进行程序化缓慢降温冷冻；当温度达到设定的低温值，并稳定10-20分钟之后，将该人卵母细胞移入液氮中低温贮存，以供复苏备用；
C、快速升温解冻：从液氮中取出贮存有该人卵母细胞的麦管，先后放在室温空气中和30±3℃的水中，使之迅速升温；再将麦管擦干、剪开，取出该人卵母细胞，再顺序地放入不同的解冻处理液中复苏；
D、复苏后培养：将已解冻复苏的该人卵母细胞放入序贯培养液中，置入37±0.2℃、5％～6％CO2浓度孵箱内进行培养，以供体外受精。
3、根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述的步骤A中进一步包括下述配制冷冻保护液的操作步骤：
A1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；
A2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液混合配制成含1.0～2.0M的PROH液，称作B液；
A3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成1.0～2.0M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作C液；
A4、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、B液和C液，以供备用。
4、根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述的步骤A中的冷冻预处理进一步包括下述操作步骤：
A5、将A液、B液和C液三种溶液分别放在室温(18～28℃)下平衡1～2小时后，分别取出适量置于器皿中；
A6、从培养箱中取出人卵母细胞，先将该人卵母细胞置于B液中浸泡5～15分钟后，又在C液中浸泡10～20分钟，此时开始准备程序冷冻仪。
5、根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述的步骤B中进一步包括下述操作步骤：
B1、在C液中开始将人卵母细胞装入麦管，装管方法是：用麦管吸C液1.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→含有人卵母细胞的C液2.5±1.0cm→空气1.5±1.0cm→C液1.5±1.0cm→封口；
B2、将装有人卵母细胞的麦管放入冷冻仪中进行程序降温冷冻，其降温程序为：从+15～25℃开始，先以-2±1.0℃/分的降温速率降到-7±0.1℃时，在无人卵母细胞液柱处植冰(seeding)，又从-7±0.1℃开始继续以-0.3±0.1℃/分的降温速率缓慢降温到-30±5℃时，再以-30±5℃/分的降温速率快速降温到-175±5℃，稳定10-20分钟后，再将该装有人卵母细胞的麦管迅速移入液氮(-196℃)中低温贮存。
6、根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述的步骤C中进一步包括下述配制复苏处理液的操作步骤：
C1、将体积比为75～85％的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer)或HTF-HEPES输卵管液缓冲液与15～25％的血清或血清替代物(SSS，serumsupplement substitution)混合配制成含15～25％血清或SSS的溶液，称作A液；
C2、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.5～1.5M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作D液；
C3、将体积比为85～95％的A液与5～15％的PROH液和Sucrose混合配制成0.2～1.2M的PROH液与0.25～0.35M的Sucrose液的混合液，称作E液；
C4、将体积比为85～95％的A液与Sucrose配制成0.25～0.35M的Sucrose液，称作F液；
C5、用筛孔规格为0.22μm的过滤器先后顺序过滤A液、F液、E液和D液，以供备用。
7、根据权利要求2所述的人卵母细胞的贮存方法，其特征在于：所述的步骤C中进一步包括下述快速升温解冻的操作步骤：
C6、将冷冻麦管从液氮取出，置于空气中30～50秒后，再置于30±3℃水中浸泡30～50秒；
C7、将麦管擦干、剪开，将其中的人卵母细胞先后分别置于D液和E液中各2～10分钟；再将其先后分别置于F液和A液中各5～15分钟，然后将该人卵母细胞移入已在37±0.2℃孵箱中平衡的A液中5～15分钟，最后将其移入序贯培养液中，在37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱中培养，以供体外受精。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |