CN1068195C - 生物频谱在胚胎工程中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物频谱在胚胎工程中的应用方法。在胚胎体外生产中利用模拟的生物频谱照射，提高卵母细胞成熟率、体外受精率和胚胎成熟率，提高胚胎质量。在胚胎冷冻保存和胚胎显微操作中利用模拟的生物频谱照射，提高胚胎存活率和妊娠发育率。
Description
本发明属于生物工程领域，具体涉及生物频谱在动物胚胎工程中的应用。
近年来，有关动物胚胎工程的基础研究和技术开发取得了惊人的进展，胚胎工程研究不仅停留在研究室阶段，而以极快的速度向实用化、产业化方面迈进和普及。动物胚胎工程主要包括胚胎体外生产、胚胎冷冻保存和胚胎显微操作等技术。
胚胎体外生产技术的发展可以充分利用优良动物的遗传资源，加快遗传改良；克服某些珍稀动物的不孕症，保存稀有动物或濒危动物资源；为生产转基因动物及进行动物性别鉴定提供动物胚胎资源。然而，目前胚胎体外生产技术的效率很低，另外，体外生产的胚胎质量比体内的差，胚胎移植妊娠率也较低。
动物胚胎冷冻保存技术是动物胚胎移植技术能否应用于生产的关键技术，该技术的应用可以建立胚胎种质库，便于国际间动物品种资源的运输和交流。目前国际上通用的方法有常规汽冻(慢速控制降温)和玻璃化冷冻(快速降温)两种方浊。但是，体外生产的胚胎经冷冻后解冻，存活率降低，约6.5％，移植后妊娠率比正常鲜胚胎移植降低至少20％。
动物胚胎显微操作技术包括：性别鉴定，以获得期望性别的动物后代；动物胚胎克隆，包括胚胎切割及核移植被术，以生产来自同一优秀动物的大量相同的后代(克隆动物)，大大提高繁殖率，加速动物遗传改良；转基因技术，主要指显微注射技术及精子载体技术，目的在于促进动物生长，增强动物抗病性，提高动物产品质量，或为人类提供大量的珍贵药品(依转移的基因不同而异)。由于动物胚胎显微操作技术必然会损伤动物胚胎，因此，其成功率都很低。
本发明基于如下认识：由于种种原因，人们很少研究应用物理方法调节影响动物的繁殖生长功能，也很少应用物理方法到胚胎工程中解决技术难题。发明人认为：一切生命物质都同时具有化学特性和物理特性。生命物质本身就具有特征的物理特性(如细胞的电荷，机体的生物场，……)。当外界的电磁场与生命物质中的某些主要物理特性相似时，生命物质中的带电荷物质就会与外界电磁场相互作用，将可能使细胞内分子、原子、电子同时受到影响而产生明显的生物效应。以离体组织和细跑为例，组织和细跑在体内受到化学环境和物理环境的支持，生长发育正常；当组织或细胞离体后，尽管竭力采用各种化学性质的保护剂和营养成份来改善培养环境，但是，离体组织或细胞的生长发育仍然明显比体内生长发育时差。发明人进一步认为：在离体组织、细胞培养中，施加一个模拟生物频谱的弱电磁场将改善离体组织、细胞的生长状况。因此，模拟生物频谱方法应用到胚胎工程中具有意义。同理，模拟生物频谱也将对动物的繁殖、发育生长和防治疾病具有明显的促进作用。
本发明目的是利用模拟的生物频谱作用于动物胚胎工程技术中，引起动物胚胎和动物机体的辐射生物效应，具体包括：
在胚胎体外生产中利用模拟的生物频谱照射，提高卵母细胞成熟率、体外受精率和胚胎成熟率，提高胚胎质量；
在胚胎冷冻保存过程中利用模拟的生物频谱照射，提高胚胎存活率和妊娠发育率；
在胚胎显微操作技术中利用模拟的生物频谱照射，修复损伤胚胎，提高其成功率。
在动物繁殖发育和防治疾病中采用模拟生物频谱照射，以提高受精卵的存活率；促进动物子宫发育；提高排卵率、卵的受精率和受精卵的发育率。对雄性动物能改善精子的品质等。
这里所述的模拟生物频谱指中国专利申请91109014·2所公开的宽频带综合物理场，其波长从微米(0.2μm)到厘米(10cm)；其中在50μm-10cm之间，辐射信号很弱。用该物理场中的某一部分场也可以获得一定的效果。
实现本发明目的的技术方案是：
生物频谱在动物胚胎体外生产中应用的方法：
(1)卵母细胞收集。(2)卵母细胞体外成熟，将收集的卵母细胞放置于普通培养液或特定培养液中，用频谱发生器照射3至20分钟，照射过程中，培养液的温度不得高于40℃。(3)精子获能，将采集的精液用普通培养液或特定培养液稀释后用频谱发生器照射3至20分钟，照射过程中，培养液的温度不得高于40℃。(4)卵母细胞体外受精，将成熟的卵母细胞和获能精子放置于装有普通培养液或特定培养液的试管中，用频谱发生器照射1到3次，每次照射3到25分钟，每次照射过程中，培养液温度不得高于40℃。(5)胚胎体外培养，将受精卵母移入普通培养液或特定培养液中，用频谱发生器照射3至30分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃。
生物频谱在动物胚胎冷冻保存中应用的方法：解冻前或解冻后将动物胚胎置于培养液中，用频谱发生器照射3至30分钟，为了增强作用，也可以在解冻前和解冻后将动物胚胎置于培养液中，先用频谱发生器照射3至20分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃。
生物频谱在动物胚胎显微操作中应用的方法：显微操作前或后将动物胚胎置于培养液中，用频谱发生器照射3至35分钟，为了增强作用，也可以在显微操作前和后将动物胚胎置于培养液中先用频谱发生器照射3至35分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃。
生物频谱在动物繁殖发育生长中应用的方法：用频谱发生器照射动物，每天1-2次，每次3-60分钟，照射过程中，动物表面温度不高于45℃。使用本方法时，辅以常规的繁殖发育生长技术(如注射各种促性腺激素等)效果更佳。
生物频谱在动物疾病防治中的应用方法：用频谱发生器照射动物的局部或全身，每天1-3次，每次6-60分钟，照射过程中，动物被照射处表面温度不得高于45℃。
在胚胎体外生产中利用模拟的生物频谱照射，可以使体外受精率至少提高百分之十八，体外受精卵的发育率至少提高百分之十九。
在胚胎冷冻保存过程中利用模拟的生物频谱照射，可以使胚胎存活率至少提高百分之十六，对胚胎的妊娠发育率也有明显的提高。
在胚胎显微操作技术中利用模拟的生物频谱照射，可以显著地提高半分桑椹体外发育率和半分囊胚发育率，提高胚胎染色体标本制作效率。
在动物繁殖发育生长中利用模拟的生物频谱照射，可以促进雌性动物子宫发育，提高排卵率、卵的受精率、受精卵的存活率和发育率。改善雄性动物的精子品质等。
在动物防治疾病中利用模拟的生物频谱照射，可以缓解和控制疾病，达到治疗保健作用。
实施例1
用常规方法从供体母牛中收集卵母细胞，将所采集的卵母细胞放置于装有普通培养液或特定培养液的容器中进行卵母细胞体外成熟，用周林频谱总公司生产的WS-101D频谱治疗仪照射15分钟，治疗仪的剂量开关选择为弱档，照射过程中，培养液温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离来控制温度。特定培养液按照Brackett等的方法配制。用NaCl 6.55克/升、KCl 0.30克/升、CaCl2·2H2O 0.33克/升、NaH2PO4·H2O 0.11克/升、MgCl2·6H2O0.11克/升、NaHCO3 3.10克/升、葡萄糖2.50克/升、无水丙酮酸钠0.14克/升或丙酮酸0.11克/升、牛血清白蛋白3.00克/升、青霉素钠盐0.031克/升中加入四蒸水到1000毫升，待其充分溶解后过滤灭菌。在含59％CO2空气的38℃培养箱中平衡，渗透压约为300毫渗量/公斤。在100毫克上述配制的溶液中加入84毫克NaHCO3即配制为特定培养液，在10毫升上述配制的溶液中加入34毫克NaCl即配制为m-HIS液。
精子获能。将采集的新鲜精液先用Brackett等的方法处理，即于精液中加入上述特定培养液，350克离心5分钟，去上清，于沉淀的精子中加入m-HIS液，在38℃水浴培养15分钟，随后离心，去上清，置入装有特定培养液的试管中用周林频谱总公司生产的WS-101D频谱治疗仪照射10分钟，治疗仪的剂量开关选择为弱档，照射过程中，培养液温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离来控制温度。
卵母细胞体外受精。将体外成熟的卵母细胞和体外获能精子放置于装有特定培养液的试管中，用周林频谱总公司生产的WS-101D频谱治疗仪照射20分钟，然后将试管置于38℃ CO2培养箱中培养，一个小时后将试管取出，再用频谱治疗仪照射18分钟后置于培养箱中培养5个小时。照射过程中，频谱治疗仪的剂量开关选择为弱档，培养液温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离来控制温度。
胚胎体外培养。将受精卵母细胞移入特定培养液中，用WS-101D频谱治疗仪照射25分钟，治疗仪的剂量开关选择为弱档，培养液温度控制在38℃至40℃之间。通过调节照射距离来控制温度。
实施例2
将牛胚胎置于特定培养液中用WS-101D频谱治疗仪照射15分钟，治疗仪剂量开关选择为弱档，培养液温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离控制温度。采用井上忠恕等方法添加冷冻保护剂。即预先准备含20％CS的PBS，用甘油配制成0.18、0.33、0.75、0.88以及1.0M溶液，并分别装入小培养皿中待用。将冷冻用牛胚胎以5分钟间隔过档，并在1.0M溶液中放置30分钟后装入0.5毫升细管中，再转入冷冻仪中开始降温冷冻。以1℃/分速度降温到-7℃，在此温度诱发结晶，进行强制植冰后，再以0.3℃/分速度下降到-35℃、-35℃至-36℃以0.1℃/分速度降温后，直接投入液氮(-196℃)。
胚胎解冻。从液氮中取出装有胚胎的细管，立即投入21℃温水中，轻轻摇荡，解冻速度约360℃/分。胚胎解冻后及时以阶段性稀释法缓慢地除去冷冻保护剂，即在室温条件下，按照添加冷冻保护剂的相反的顺序进行稀释。然后，将解冻后的胚胎置于特定培养液中，用WS-101D频谱治疗仪照射20分钟，治疗仪的剂量开关选择为弱档，培养液温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离控制温度。
实施例3
采用Kasai等的玻璃化法冷冻。即在室温下往0.25ml细管内依次吸入S-PBS液(～100μl)、空气(～20μl)、EFS液(～6μl)、空气(～6μl)以及EFS液(～40μl)待用。将牛胚胎置于特定培养液中，用WS-101D频谱治疗仪照射15分钟，剂量开关选择为弱档，培养液温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离控制温度。将胚胎用EFS液在室温下平衡3分钟后，迅速吸入上述细管的最长EFS液(～40μl)段中，然后依次吸入空气(～6μl)、EFS液(～6μl)、空气(～15μl)和S-PBS液(～20μl)，最后用预热的镊子封口。
解冻。从液氮中取出装有胚胎的细管，立即投入20℃水中，轻轻摇荡。迅速用0.5mlS-PBS液冲出细管内胚胎，然后移入S-PBS液内，经过5分钟移到m-PBS液，洗涤三次后置于特定培养液中用WS-101D频谱治疗仪照射10分钟，剂量开关选择弱档，培养温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离控制温度。
用NaCl 8克/升、KCl 0.2克/升、Na2HPO4 1.15克/升、KH2PO4 0.2克/升、CaCl2 0.1克/升、MgCl2·6H2O 0.1克/升、丙酮酸钠0.036克/升、葡萄糖1克/升、青霉素100IU/mL、链霉素0.05克/升为m-PBS液，用m-BS液配制0.5M蔗糖溶液即为S-PBS液。
EFS液配制方法：先配制含30％聚蔗糖溶液的0.5M蔗糖溶液(EF液)然后以40％乙二醇和60％EF液相混合即成EFS液。
实施例4
胚胎分割。胚胎分割采用松本和也等使用过的金属刀切割法。先将剃须刀的刀尖用镊子掰开。并固定在毛细玻璃管上，然后把毛细玻璃管安装在显微操作仪器手上。操作时，将0.05mlPBS+20％CS培养液滴于塑料培养皿(直径8cm、高1cm)中央。将待切割胚胎置于培养液中，用WS-101D频谱治疗仪照射15分钟，取出胚胎放入培养皿中央，在装有显微操作仪的倒置显微镜下切割胚胎。
切割和处理完毕后将半胚置于培养液中，用WS-101D频谱治疗仪照射30分钟，治疗仪的剂量开关选择弱档，培养液温度控制在38℃至40℃之间，通过调节照射距离控制温度。
实施例5
性别鉴定。从胚胎中采取少量细胞可以准确地进行性别鉴定。但是容易对胚胎造成损伤，影响其活力。在采取细跑之后用WS-101D频谱治疗仪照射胚胎20分钟，可以提高胚胎的活力。
实施例6
动物的繁殖发育生长功能。以小鼠作为实验动物，将雌鼠随机分成两组，每组20只，A组为生物频谱照射组，B组为对照组，对照组不作照射处理，A、B两组其它实验条件相同。将每组动物分成2批，每批10只进行实验。采用周林频谱总公司制造的WS-101频谱治疗仪，每天定时照射A组1次，照射时间为20分钟，仪器剂量开关选择为强挡。鼠背温度不高于38℃，共照射10天/10次。其中在照射第4天，A、B两组每只雌鼠注射孕马血促性腺激素(PMSG10IU)。照射第6天，A、B两组每只雌鼠各注射人绒毛膜促性腺激素(HCG10IU)，注射后，每只雌鼠笼内放1只公鼠交配。第7天，A、B两组各10只雌鼠输卵管冲卵。两组比较的结果显示：用频谱治疗仪照射对受精卵的存活有明显的保护作用。在第10天对A、B两组剩余各10只雌鼠输卵管冲卵。收集囊胚数，A、B两组比较结果显示：用频谱治疗仪照射有促进排卵和卵的受精作用，并对囊胚的发育作用明显。A、B两组比较还显示：频谱治疗仪照射，明显使雌鼠子宫充血发育。本实施例说明：用频谱治疗仪照射动物，可促进动物的繁殖发育生长功能。
实施例7
用周林频谱总公司制造的WS-101频谱治疗仪照射治疗羔羊腹泻，每天一次，每次20分钟，仪器开关选择强挡。羔羊腹部被照射时的表面温度不得超过45℃，共照射2-4天，可控制腹泻、获得明显的治疗效果。
发明人认为：除了使用上述实施例外，根据本发明的主要构思，生物频谱将适用于多种生物工程对象。除能使胚胎工程乃至生物工程中的不少难题得到解决，还能使胚胎工程和生物工程中的复杂、高难度工艺变为简单易行。因此，在生物工程领域还可以有其它不同的实施方案，而这些方案都应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1．一种生物频谱在动物胚胎工程中应用的方法，包括：
(1)卵母细胞体外成熟，
(2)精子获能，
(3)卵母细胞体外受精，
(4)胚胎体外培养，
其特征在于：
卵母细胞体外成熟过程中将卵母细胞放置于普通培养液或特定培养液中，用频谱发生器照射3至20分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃，
精子获能过程中将精液用普通培养液或特定培养液稀释后用频谱发生器照射3至20分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃，
卵母细胞体外受精过程中将卵母细胞和体外获能精子放置于装有普通培养液或特定培养液的试管中，用频谱发生器照射1至3次，每次照射3至25分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃，
胚胎体外培养过程中将受精卵母细胞移入普通培养液或特定培养液中，用频谱发生器照射3至30分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃。
2．如权利要求1所述生物频谱在动物胚胎工程中应用的方法，其特征在于所述特定培养液的成份在NaCl 6.55克/升、KCl 0.30克/升、CaCl2·2H2O 0.33克/升、NaH2PO4·H2O 0.11克/升、MgCl2·6H2O 0.11克/升、NaHCO3 3.10克/升、葡萄糖2.50克/升、无水丙酮酸钠0.14克/升或丙酮酸0.11克/升、牛血清白蛋白3.00克/升、青霉素钠盐0.031克/升中加入四蒸水到1000毫升，然后在100毫升以上溶液中加入84毫克NaHCO3。
3．一种生物频谱在动物胚胎冷冻中应用的方法，其特征在于冷冻前将动物胚胎置于培养液中，用频谱发生器照射3至35分钟，也可以在解冻后将动物胚胎置于培养液中，用频谱发生器照射3至30分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃。
4．一种生物频谱在动物胚胎显微操作中应用的方法，其特征在于显微操作前或后将动物胚胎置于培养液中，用频谱发生器照射3至35分钟，也可以是在显微操作前和显微操作后将动物胚胎置于培养液中，用频谱发生器照射3至35分钟，照射过程中，培养液温度不得高于40℃。
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