KR100516881B1 - Ｘ선 조사를 이용한 체세포 복제수정란의 제조를 위한수핵난자 핵 유전 물질의 불활화 방법 - Google Patents
Ｘ선 조사를 이용한 체세포 복제수정란의 제조를 위한수핵난자 핵 유전 물질의 불활화 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 체세포 복제 기술에서 체세포 복제수정란 생산을 위한 필수 공정인 수핵난자의 물리적인 탈핵 과정을 대체할 수 있는 수핵난자 핵의 불활화 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 X선 조사를 이용한 수핵난자 핵 유전 물질의 불활화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 X선을 이용한 체세포 복제수정란의 제조를 위한 수핵난자 핵의 불활화 방법 및 상기 방법을 포함하는 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 수핵난자 핵의 불활화 방법은 물리적 탈핵방법을 대체할 수 있으며, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 체세포 복제수정란은 이후의 배반포 발달율이 높으므로 체세포 복제동물의 생산에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 체세포 복제 기술에서 체세포 복제수정란의 제조를 위하여 사용되는 수핵난자의 물리적인 탈핵 과정을 대체할 수 있는 수핵난자 핵의 불활화 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 X선 조사를 이용한 수핵난자 핵 유전 물질의 불활화 방법에 관한 것이다.
1997년 복제양 돌리의 탄생 (Wilmut I., Schnieke AE., McWhir J., Kind AJ., Campbell KHS. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385:810-13(1997)) 은 분화된 체세포가 난자와 만날 경우 배아 단계로 역분화하여 다시 하나의 완전한 개체로 분화하여 클론을 형성할 수 있는 능력, 즉 전능성을 획득할 수 있음을 보여준 첨단 생명공학 기술의 성과이다.
체세포 복제 기술은 우수형질 개체 확보, 고부가가치 생체반응기 동물의 생산, 질환 모델 동물의 생산, 인체 장기 공여 동물의 생산, 멸종 위기 동물의 보존 등 그 응용 분야의 범위가 매우 넓다. 또한 인류 복지 향상과 관련하여 체세포 복제 기술을 적용하면 환자 체세포 유래 배반포에서 배아 줄기 세포주를 수립할 수 있으며, 이렇게 수립된 배아 줄기 세포로부터 치료에 필수적인 세포를 분화시킬 경우, 환자의 면역 거부 반응을 피할 수 있다는 장점이 있기 때문에 (Trounson A., Potential benefits of cell cloning for human medicine. Reprod Fertil Dev 10:121-125(1998)) 임상적 이용성이 높다.
체세포 복제 기술의 근간은 이가 염색체를 가진 공여핵 세포와, 유전 물질을 가진 핵이 제거된 수핵난자의 융합이다. 체세포 복제 기술이란 공여핵으로서 체세포를 이용하는 것을 말하며 이는 성체 혹은 태아의 조직에서 회수된다. 공여핵이 이식될 수핵난자는 체세포와 융합된 후 발생할 수 있는 능력을 보유하여야 한다. 이러한 발생능을 가지기 위해서는 제2차 감수분열 중기 (난자가 체내에서 자연적으로 배란되는 시기) 까지 난자의 발육이 진행되어야 하며 이를 위하여 체외에서 인위적으로 난자를 배양하거나, 호르몬 처치를 통하여 체내에서 난자를 발육시킨다.
회수된 난자는 체세포와 융합시키기 전 탈핵 과정을 거치게 되는데 주로 물리적인 방법을 이용하여 난자의 핵 (제2차 감수분열 중기판이 존재하는 부분의 세포질) 을 제거한다. 탈핵 과정을 거친 난자는 투명대와 난자 세포질 막 사이의 주란강에 체세포를 이식하거나 세포질내 직접 주입법에 의하여 핵이식을 수행하게 된다.
체세포 핵이식에 따른 염색체 손상 방지 및 이식 후 발생능 향상을 위하여 체세포 이식 전에 체세포의 세포주기를 G0 기로 맞추는 작업을 수행한다. 그러나, 이 과정은 이식하는 체세포의 특성에 따라 생략할 수 있으며, 일부에서는 G2 및 M 기의 세포도 정상적으로 발생이 가능하다고 보고되고 있다.
체세포 공여핵을 탈핵 난자에 주입한 후 전기자극 등을 통해 물리적으로 융합을 시키며, 이후 체세포와 융합이 된 난자를 체세포 복제수정란이라고 부른다. 체세포 복제수정란이 생산된 후 가장 중요한 과정은 이식된 체세포 핵이 정자와 난자핵 접합에 의하여 생성된 핵과 동일한 능력과 기능을 가지고 난자의 세포질과 조화롭게 일련의 발생과정을 수행하는 것이다. 이러한 일련의 과정을 재프로그래밍 (reprogramming) 이라고 하며, 복제수정란의 최초 발생인 분할을 유도하는 과정을 활성화 (activation) 라고 한다. 활성화를 위하여 화학적이나 전기 자극 등을 이용하며, 분할 후 복제수정란의 정상적인 재프로그래밍을 유도하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다. 재프로그래밍이 순조롭게 이루어진 복제수정란의 경우 최초로 분화 (differentiation)가 일어나는 배반포기까지 체외에서 배양하며 이후 대리모 이식을 통하여 개체로 발생시킨다.
체세포 핵이식 기술은 돌리 탄생이후 다양한 종에서 복제동물의 생산이 이루어지게 했다. 1998년 Wakayama 는 마우스 난자의 난구 세포를 공여핵으로 이용해서 복제 마우스를 생산했다. 또한 Cibelli는 G0가 아닌 G1 상태의 공여핵을 사용해서 복제소를 생산했으며, Kato 역시 한 마리의 체세포에서 8 마리의 복제 송아지를 생산했다. 1999년 Galli는 백혈구를, Wells는 벽면 과립막세포 (mural granulosa cell)를 각각 이용하여 복제 송아지를 생산했다. 또한 Baguisi는 태아 섬유아세포를 이용하여 형질전환 염소를 생산했으며, Wakayama는 후기 계대의 배아 줄기 세포로부터 마우스를 복제하는데 성공했다. 2000년에는 McCreath, Brink, Kato, Onishi 및 Ogura에 의해 각각 양, 소, 돼지 및 마우스 등의 복제 동물이 생산되었으며, 2001년에는 Denning, Zakhartchenko, Keefer 및 Wakayama 에 의해 복제 동물들이 생산되었다. 특히 2002년 미국 미주리대 연구진에 의하여 초급성 면역 거부 반응을 유도하는 갈락토실 트랜스퍼라아제를 제거한 형질전환 돼지를 체세포 핵이식 기술에 의하여 생산한 것은 복제 동물 생산 기술의 의학적 이용 가능성을 제시한 업적으로 평가되고 있다. 그 외에도 2002년에는 고양이, 토끼 및 물고기까지 체세포 핵이식 기술을 이용한 개체 생산이 성공하였다.
지금까지의 많은 노력과 진전이 있었지만 아직까지 체세포 핵이식 기술을 이용한 개체생산의 효율성은 비약적으로 개선되지 않고 있으며, 복제수정란 이식 후 임신과정 중 유산 및 사산 등이 보고되고 있다. 체세포 복제수정란 배발생의 기준 지표로 사용되는 배반포 발달율도 체외 수정 유래의 수정란과 대등하지만 착상 및 발생을 거쳐 건강한 산자로 태어날 확률은 3% 이내로서 그 확률이 매우 낮다.
따라서, 현재 체세포 복제 기법의 효율을 증가시키는 일련의 연구가 진행중이다. 예컨대, 초기 배발생을 조절하는 유전자의 발현에 관한 연구, 수정란 재프로그래밍의 지표로 사용하는 메틸화 (methylation) 양상에 관한 연구, 전자현미경을 통한 세포소기관의 미세 구조의 이상에 관한 형태학적 연구, 배반포를 이루는 두 가지 세포층인 내부 세포괴와 영양외배엽 세포의 수와 비율에 관한 연구를 거쳐 도출된 실험 결과를 통하여 탈핵, 공여핵 세포의 종류 및 체외 배양 시기, 융합, 활성화의 최적화 조건을 설정하여 체세포 핵이식 수정란 유래의 산자 생산 효율을 증가시키고자 하고 있다.
기술적인 측면에서, 체세포 핵이식 과정은 공여핵 세포와 유전 물질이 제거된 수핵난자를 융합시켜 이루어진다. 체세포 핵이식은 수핵난자의 제공을 위하여 성숙한 난자에서 반수체 유전 물질을 가진 핵을 제거하는 탈핵 과정을 거치게 된다. 이러한 탈핵 과정은 복제 과정 중 가장 먼저 이루어지며, 일반적으로 사이토칼라신 등의 약물로 난자를 처리하여 세포 내에 존재하는 세포골격 손상을 최대한 방지한 상태에서 미세조작기를 이용한 특수 조작에 의하여 이루어진다.
그럼에도 불구하고, 상기 탈핵 과정에서는 기계적 조작에 의한 세포질 충격 및 일부 세포소기관 손실, 핵 유전 물질 제거 시 수반되는 세포질 소실, 그리고 투명대, 세포막 및 난자 전체에 분포하는 세포골격 구조에 손상이 가해질 수 있다. 또한 기능적 측면으로는 갑작스러운 핵 제거에 의한 핵-세포질의 신호 전달 체계의 파괴 등을 유발하여 이후 배발달에 치명적인 손상이 가해질 수 있다. 한 보고에 의하면 22시간 동안 체외 성숙시킨 소 난자의 염색체-방추사 복합체는 제 1 극체와 가까이 있지 않은 경우가 많아 흡입법 (aspiration) 으로 탈핵하였을 경우 효율이 59% 밖에 되지 않은 것으로 나타났다 (Bordignon V., Smith LC., Telophase enucleation: An improved method to prepare recipient cytoplasts for use in bovine nuclear transfer. Mol Reprod Dev 49:29-36(1998); Mohamed Nour MS., Takahashi Y., Preparation of young preactivated oocytes with high enucleation efficiency for bovine nuclear transfer. Theriogenology 51:661-666(1999)). 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 다음과 같은 탈핵 방법이 개발되어 사용되고 있다.
첫째로, 활성화를 통한 탈핵 효율의 증가이다. 제1차 감수분열 중기 성숙 난자의 활성화 전후의 탈핵율을 비교한 결과, 활성화 처리를 한 난자의 탈핵율이 유의적으로 높았다 (91.5% vs 59.9%, Mohamed Nour MS., Takahashi Y., Preparation of young preactivated oocytes with high enucleation efficiency for bovine nuclear transfer. Theriogenology 51: 661-666(1999)). 난자의 체외성숙 기간을 30시간으로 증가시킨 후, 화학적 활성화를 통해 제2극체 방출 및 중기판 생성을 유도하면 난자의 중기판은 제2극체에 보다 가까이 위치하게 되며, 이때 제2극체와 함께 세포질 흡입을 하면 이전 시간대에 형성된 중기판을 보유한 난자의 탈핵 방법보다 효율을 높일 수 있다 (Liu JL., Wang MK., Sun QY., Xu Z., Chen DY., Effect of telophase enucleation on bovine somatic nuclear transfer. Theriogenology 54:989-98(2000)).
둘째로, 원심분리에 의한 퍼콜 밀도 그래디언트 (percoll density gradient)를 이용하는 것이다. 원심분리를 통한 난자 소기관의 중층화를 유도한 다음, 퍼콜 밀도 그래디언트를 처리하여 원심분리를 하게 되면 난자의 염색체-방추사 복합체는 난자 세포질과 분리된다 (Tatham BG., Dowsing AT., Trounson AO., Enucleation by centrifugation of in vitro-matured bovine oocytes for use in nuclear transfer. Biol Reprod 51:661-66(1995)).
셋째로, 데미콜킨 (demicolcine) 을 처리한 후 탈핵하는 것이다. 탈핵 이전에 데미콜킨을 처리하여 유전 물질을 난자 표면으로 유도시킨 뒤 흡입법으로 탈핵할 경우 조작에 의한 구조적 손상과 세포질 소실을 최소화할 수 있으며, 이러한 방법으로 유전 물질이 제거된 난자를 이용하여 마우스 (Baguisi A., Induced encleation in nuclear transfer procedures to produce cloned animals. Theriogenology 53(1):209(2000)) 와 돼지 (Xi Jun Yin., Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal of maternal chromosomes. Biol Reprod 67:442-446(2002)) 에서 건강한 산자 생산이 보고되었다.
그러나, 상기의 방법을 이용하여 기계적 탈핵 기술의 효율성을 증진한 경우에도 다음과 같은 문제점이 발생하며 이러한 문제들에 의하여 근본적인 효율의 향상은 한계에 직면하여 있다. 먼저, 활성화 방법은 수핵난자와 공여핵 세포 간의 세포주기 불일치를 일으켜 융합 후 첫 DNA 복제 후 유사분열 과정에서 염색체 배수 이상을 일으킬 수 있으며, 흡입에 의한 방법은 투명대 절개와 세포질 소실에 기인한 물리적 및 기능적 손상을 피할 수 없다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 탈핵 방법으로서, 본 발명자들은 고정용 피펫 및 절개 피펫을 이용하여 성숙난자의 고정 및 절개 각도 등을 효율적으로 구성하여 난자에 조그만 구멍을 낸 뒤 핵을 짜내는 스퀴징 (squeezing) 방법에 대하여 특허등록받은 바 있으며 (참조: 대한민국 등록특허 제 342437호), 상기 방법은 소에 있어서의 체세포 복제의 성공 가능성을 크게 향상시켰다.
한편, 이러한 물리적인 탈핵 방법과는 다른 응용 탈핵방법도 다각도로 모색되고 있다. 예컨대, 자외선을 조사하여 난자의 핵을 불활화하는 방법이다. 즉, UV-C (파장: 330 nm이상)를 난자에 조사한 후 정자와 체외 수정시킨 결과 자성전핵의 생성이 비정상적으로 형성되었으며 (Bradshaw J., UV irradiation of chromosomal DNA and its effect upon MPF and meiosis in mammalian oocytes. Mol Reprod Dev 41(4):503-512(1995)), 이는 자외선이 난자의 핵을 불활화시킨다는 것을 간접적으로 보여주었다. 그러나, 이러한 자외선 조사에 의한 방법은 복제수정란 이후의 배발달을 억제시킬 수 있는 문제점이 있다.
이러한 일련의 기술적 진보에도 불구하고, 아직까지 난자의 탈핵 기술의 근본적인 발전은 이루어지지 않고 있으며, 상술한 문제점들을 최소화할 수 있는 탈핵 방법의 개발이 요구되고 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 물리적인 탈핵 방법을 대체할 수 있는 새로운 응용 탈핵 방법을 제시하고자 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허 문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허 문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상술한 문제점들을 극복한 체세포 복제수정란의 제조를 위한 새로운 응용 탈핵 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 수핵난자에 X 선을 조사하였을 때 난자 핵의 불활화가 일어나며 체세포 복제수정란 제조 이후의 배반포 발달율도 높은 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 체세포 복제 기술에 적용되는 체세포 복제수정란의 제조를 위한 새로운 응용 탈핵 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 응용 탈핵 방법을 이용한 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수핵난자에 X선을 조사하는 단계를 포함하는 수핵난자 및 체세포 공여핵의 융합을 통한 체세포 복제수정란의 제조를 위한 수핵난자 핵의 불활화 방법을 제공한다.
본 발명자들은 물리적인 탈핵 방법을 대체할 수 있는 응용 탈핵 방법의 개발을 위하여 노력한 결과, 수핵난자에 X 선을 조사하였을 때 난자 핵의 불활화가 일어나며 상기 수핵난자를 이용하여 체세포 복제수정란을 제조하였을 때 이후의 배반포 발달율도 높은 것을 발견하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체세포 복제"는 공여핵 체세포로부터 염색체가 제거된 수핵세포로의 핵 염색체 이식 및 융합, 즉 체세포 핵이식 과정을 통하여 그 핵 내 DNA가 공여핵 체세포로부터 유래된 동물이 완전한 성숙한 개체로 발달되는 과정을 의미한다.
상기 체세포 핵이식 과정에 있어서 수핵난자의 제공을 위하여 난자에서 유전 물질을 가진 핵을 제거하는 탈핵 과정이 필수적인데, 본 발명에서는 이러한 탈핵 과정을 물리적인 탈핵 방법에 의하지 않고 수핵난자의 핵 내 유전 물질을 화학적으로 불활화시키는 것으로 대체하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체세포"는 생식세포 이외의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "수핵난자"는 체세포 핵이식 시 공여핵 체세포로부터의 핵을 이식받는 난자로서 세포질을 제공하며, 공여핵 체세포의 핵 이식을 위하여 실질적으로 핵 내 유전 물질이 제거되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "공여핵 체세포"는 체세포 핵이식 시 수핵난자로 핵 내 유전 물질을 제공하는 세포이며, "체세포 공여핵"은 상기 공여핵 체세포의 핵을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "핵"은 실질적으로 DNA와 같은 염색체 내의 유전 물질을 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "융합"은 실질적으로 공여핵 세포와 수핵난자의 지질막 부분 (lipid membrane portion)의 결합을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체세포 복제수정란"은 체세포 공여핵을 유전 물질이 제거된 수핵난자에 주입한 후 물리적 또는 화학적 방법으로 융합된 난자를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "불활화"는 유전 물질의 기능이 제거되도록 하는 화학적 과정을 의미하며, 실질적으로 물리적인 유전 물질의 제거와 동일한 효과를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수핵난자는 인 비트로 또는 인 비보에서 성숙된 것이다. 이러한 수핵난자의 성숙 과정은 체세포 공여핵과 융합된 후 발생능을 가지기 위하여 필요한 과정으로서, 상기 "성숙"은 제2차 감수분열 중기까지 난자의 발육이 진행되는 것을 의미한다. 상기 인 비트로 성숙은 통상의 성숙배양 배지에서 이루어질 수 있으며, 상기 인 비보 성숙은 호르몬 처치 등을 통하여 난자가 채취될 동물의 체내에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 수핵난자 핵의 불활화 방법은 X선의 조사에 의하여 화학적으로 이루어지며, 상기 X선은 파장 10-3-10 ㎚의 전자기파로서, 의료 등의 목적으로 사용되는 통상의 X선을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 X선의 조사는 관전압 18 kVp 이내에서 이루어진다. 상기 관전압이 18 kVp를 초과할 경우에는 난자의 세포질과 세포막 등에 손상을 가하여 색깔과 모양이 크게 변형되므로 수핵난자로 사용이 불가능하다는 문제점이 있다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 X선의 조사는 관전압 15-18 kVp에서 이루어진다.
또한, X선 조사 시 바람직한 관전류는 2-8 mA이고, 보다 바람직하게는 4-6 mA이며, 가장 바람직하게는 5 mA이다. X선 조사의 시간은 10-60 초가 바람직하며, 10초 미만인 경우에는 배반포 발달율이 매우 낮아지는 문제점이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, X선의 조사는 관전압 15-18 kVp 및 관전류 5 mA에서 10-60 초 동안 실시되며, 가장 바람직한 구현예에 따르면, 관전압 15 kVp 및 관전류 5 mA에서 60초 동안 실시하는 것이다.
따라서, 본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 본 발명은 포유동물의 성숙 난자에 관전압 15-18 kVp 및 관전류 5 mA에서 10-60 초 동안 X선을 조사하는 단계를 포함하는 체세포 복제수정란의 제조를 위한 수핵난자 핵의 불활화 방법을 제공한다.
본 발명의 X선의 조사를 이용한 수핵난자 핵의 불활화 방법은 체세포 복제수정란의 제조 뿐만 아니라, 생식세포를 이용한 동물 복제 및 동물 복제 이외의 목적으로 사용되는 난자 핵의 불활화에도 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공한다: (a) 수핵난자에 X선을 조사하는 단계; (b) 체세포 공여핵을 상기 수핵난자에 이식 및 융합하는 단계; (c) 상기 융합된 체세포 복제수정란의 재프로그래밍을 유도하는 단계; (d) 상기 재프로그래밍된 체세포 복제수정란의 활성화를 유도하는 단계; (e) 상기 활성화된 체세포 복제수정란의 배반포 발달을 유도하는 단계; 및 (f) 상기 배반포의 착상 및 성숙한 개체로의 발생을 유도하는 단계.
본 발명자들은 대한민국 공개특허 제 2001-69215호에서 체세포 복제 소의 생산 방법을 개시한 바 있으며, 상기 공개특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어, 본 명세서에 기재되지 않은 본 발명의 특징이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 체세포 복제동물 생산 방법을 적용할 수 있는 동물은 어류, 양서류, 조류 및 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 포유동물, 예컨대, 영장류, 소, 양, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류 등의 체세포 복제에 적용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 소의 체세포 복제에 적용될 수 있다.
본 발명에서 공여핵 세포로 사용되는 체세포는 인 비보 또는 인 비트로 공급원으로부터 수득될 수 있다. 상기 인 비보 공급원은 예컨대, 큐물루스 (cumulus) 세포를 포함한다. 상기 공여핵 체세포는 성체 세포 및 태아 세포 모두 사용 가능하며, 성체 세포는 바람직하게는 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 연골 세포, 림프 세포, 대식 세포, 단핵 세포, 근육 세포 등이며, 태아 세포는 바람직하게는 태아 섬유아세포, 귀 상피 섬유아세포 등이다. 본 발명에서 공여핵 체세포는 바람직하게는 태아 세포이며, 보다 바람직하게는 태아 섬유아세포, 가장 바람직하게는 소의 태아 섬유아세포이다.
본 발명의 체세포 복제동물 생산 방법은 본 발명의 X선을 이용한 수핵난자 핵의 불활화 방법에 의하여 핵 내 유전 물질이 제거된 수핵난자를 이용하여 이루어지며, 상기 불활화 방법 중 중복된 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 체세포 복제동물 생산 방법에서 핵이식 과정은 통상의 핵이식 방법, 예컨대, 미세주입법에 의하여 수행될 수 있으며, 체세포 공여핵과 수핵난자의 융합은 통상의 융합 방법, 예컨대, 전기융합법에 의하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 융합은 융합 촉진 화학약품의 사용 등에 의하여 촉진될 수 있다.
본 발명의 체세포 복제동물 생산 방법에서 체세포 복제수정란의 재프로그래밍은 통상의 재프로그래밍 방법에 의하여 유도될 수 있으며, 활성화의 유도는 통상의 활성화 방법, 예컨대, 화학적 활성화 방법 또는 전기적 활성화 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 체세포 복제수정란의 배반포로의 발달, 대리모로의 이식, 그리고 착상 및 성숙한 개체로의 발생을 유도하는 과정은 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 수핵난자 핵의 불활화 방법에 의하여 제조된 체세포 복제수정란의 이후의 배반포 발달율은 일반적인 물리적 탈핵 방법, 예컨대 스퀴징 방법과 유의적인 차이를 보이지 않는 우수한 방법으로서, 상기 스퀴징 방법에 의한 탈핵 방법을 대체할 수 있는 효율적인 것으로 판명되었다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 수핵난자의 체외 성숙
실시예 1-1: 미성숙 난자의 채취
25 mM의 Hepes 가 첨가된 TCM-199 (이하, 세정용 TCM) 1 ㎖을 18 게이지 주사침을 장착한 10 ㎖ 주사기로 흡인한 후 도축장에서 채취한 난소 표면의 2-6 ㎜의 난포 만을 선별하여 난포액과 난자를 한꺼번에 흡입하였다. 난포액을 페트리디쉬 (60x15 ㎜, Becton Dickinson Labware, 미합중국)에 정치시킨 후 세포질이 균일하고 난구세포층이 2층 이상의 난자를 선별하였다.
실시예 2-2: 미성숙 난자의 성숙배양
성숙배양 배지는 10%의 FBS 및 0.015 IU FSH (Antrin, Denka Pharm., 일본국), 0.015 IU LH (Sigma, 미합중국)가 첨가된 TCM199 (이하, TCM199)을 사용하였다. 난자를 성숙배양하기 전에 4-웰 플레이트 (Nunc Co., 덴마크국)의 각 웰에 500 ㎕의 TCM-199 (Gibco, 미합중국)을 넣어 전배양 하였다. 선별한 난자는 세정용 TCM 으로 3회 세정한 후 TCM199 로 1회 세정하여 웰당 40개를 넣어 39??, 5% CO2 배양기에서 22시간 동안 성숙배양 시켰다.
실시예 2: 공여핵 세포의 준비
40일령 소 태아를 안과용 가위로 잘게 썰어 15 ㎖ 원심관에 넣고 0.05% 트립신-EDTA (Gibco-BRL, 미합중국) 10 ㎖ 을 혼합하여 37??에서 30분간 진탕한 후 5분간 정치하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액은 200 x g로 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 피부 세포는 10% FBS, 1% NEAA 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma, 미합중국)이 함유된 DMEM 용액으로 60 mm 배양 접시에 배양하였다. 배양액은 48시간마다 교환하였으며, 매 5일마다 한 배양 접시 당 다시 동일한 5개의 배양 접시로 나누어서 계대하였으며, 5계대까지 세포 배양한 후 한 바이얼 당 4 x 105개의 세포를 10% DMSO가 첨가된 DMEM 1 ㎖에 넣어 -196??에 보관하였다. 매 실험마다 한 바이얼을 해동한 후 35 mm 배양 접시 (Falcon, 미합중국) 에 3일간 배양 한 후, 0.05% 트립신 처리를 통해 세포를 회수한 다음 0.5% FBS가 함유된 DPBS (Gibco-BRL, 미합중국)로 최종 부유시켜 핵이식에 사용하였다.
실시예 3: 물리적 탈핵 및/또는 X선의 조사
실시예 3-1: 난구세포의 제거
모든 체외 조작은 Hepes가 25 mM 첨가된 mSOF (이하 Hepes-mSOF) 를 사용하였다. 22시간 동안 성숙시킨 난자를 0.1% 히알루로니다아제 (Sigma, 미합중국)가 첨가된 Hepes-mSOF로 3-4회 세정한 다음, 내경이 170 ㎛인 유리관을 사용하여 부드러운 피페팅으로 남은 난구세포층을 깨끗이 제거하였다. 실험에는 세포질이 균질하고 제1극체가 방출된 성숙 난자만을 선별하여 사용하였다.
실시예 3-2: 피펫의 제작
핵이식에 사용된 피펫은 직경이 1 ㎜인 모세관 (Narshige, 일본국)을 사용하여 고정용 (holding), 탈핵용 (enucleation) 및 미세주입용 (microinjection) 피펫을 각각 제작하였다.
실시예 3-3: 투명대의 절개, 탈핵 및 X선의 조사
성숙 난자를 스퀴징 방법으로 탈핵할 난자 (Group 1), 스퀴징 방법에 의한 탈핵 후 X선 조사 처리할 난자 (Group 2) 및 X-선 조사 단독 처리할 난자 (Group 3)로 분류하였다. 또한, 투명대 절개 및 탈핵은 5 ㎕/㎖이 사이토칼라신 B (cytochalasin B)가 함유된 Hepes-mSOF 내에서 실시하였다.
Group 1의 난자를 고정용 피펫으로 제1극체가 12시 방향으로 가도록 난자를 고정한 다음, 탈핵용 피펫을 1시 방향으로 하여 투명대를 절개하여 11시 방향으로 통과시켰다. 이후 고정용 피펫을 푼 다음 상기 고정용 피펫을 탈핵용 피펫이 통과한 제 1 극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰을 가해 투명대에 절개창을 만들었다. 그런 다음 Group 1의 난자에서는 제 1극체와 중기판이 들어있는 세포질의 일부를 압력을 가해 난자로부터 방출시켰다 (스퀴징 방법).
이후 Group 2의 난자를 2 ㎖의 Hepes-mSOF에 자유롭게 부유시켜 35 ㎜ 디쉬 (Falcon, 미합중국)에 정치시킨 후 상기 디쉬를 X선 조사기 (X-ray Irradiator, Softex Co., Kanazawa, 일본국)의 대물대 위에 정치시킨 후 관전압 15 kVp 및 관전류 5 ㎃의 출력으로 60초 동안 X 선을 조사하였다. 이후의 절개창 형성 과정 및 탈핵과정은 상기 Group 1의 투명대 절개 과정과 동일하게 수행되었다.
한편, Group 3의 난자는 상기 Group 2의 난자와 동일한 방법으로 X선을 조사한 후, 다음과 같은 방법으로 투명대를 절개하였다. 즉, 제1극체가 3시 방향으로 가도록 난자를 고정한 다음, 탈핵용 피펫을 1시 방향으로 통과하여 투명대를 절개하여 11시 방향으로 통과시켰다. 이후의 과정은 Group 1의 투명대 절개 과정과 동일하게 수행하였다.
실시예 3-4: 다양한 시간별 X선 조사
성숙 난자를 스퀴징 방법으로 탈핵할 난자 (Group 4), 탈핵 및 X선 조사를 모두 실시하지 않을 난자 (Group 5, 음성 대조군) 및 X선 조사 후 투명대 절개를 실시할 난자 (Group 6 내지 9)로 분류하였다.
Group 4의 난자를 상기 실시예 3-1 내지 3-3 의 Group 1의 난자와 동일하게 처리하였으며, Group 5의 난자는 탈핵 과정 없이 투명대 절개만을 실시한 후 상기 실시예 3-4의 Group 3의 난자와 동일한 방법으로 X선 조사 처리하였다. Group 6, 7, 8 및 9의 난자는 상기 실시예 3-4와 동일한 방법으로 X선 조사를 실시하되, X선의 조사 시간을 달리 하여 각각 10, 20, 40 및 60초간 X선을 조사한 후 상기 실시예 3-3의 Group 3과 동일한 방법으로 투명대 절개를 실시하였다.
실시예 4: 핵이식
핵이식은 100 ㎍/㎖ 피토헤마토글루티닌 (Phytohematoglutinin, Sigma, 미합중국)이 함유된 4 ㎕의 Hepes-mSOF 안에서 실시하였다. 상기 실시예 2 와 같이 준비된 체세포 부유액 4㎕ 소적에 미세주입용 피펫을 넣은 다음 직경이 20 ㎛인 세포막이 깨끗한 세포를 선별하여 피펫 안으로 흡입하였다. 그런 다음 핵이식용 소적으로 피펫을 옮긴 후, 절개창이 1시 방향으로 오도록 난자를 고정한 다음 절개창을 통해 주란강 안에 세포를 주입하였다.
실시예 5: 전기 융합
핵이식이 완료된 후 공여핵 세포와 수핵난자의 세포질의 융합은 Electronic Cell Manipulator 2001 (BTX, 미합중국)로 실시하였다. 이때 융합 배지는 0.1 mM MgCl2 및 0.05% BSA가 첨가된 0.3 M 마니톨 (Sigma, 미합중국) 용액에 3분 동안 평형을 실시한 다음, 핵이식란을 극간 3.2 ㎜ 챔버로 옮기고 전극 사이에 일렬로 배열하여 세포는 (+)극, 난자는 (-)극으로 향하게 하여 직류 전류 1.75 kV/cm, 30 ㎲간격으로 2회 자극하여 융합을 유도하였다.
실시예 6: 재프로그래밍 유도
전기 융합이 끝난 복제수정란은 4시간 동안 39??, 5% CO2 배양기 내에서 mSOF로 4시간 동안 배양하여 세포핵의 재프로그래밍을 유도하였다.
실시예 7: 화학적 활성화
재프로그래밍이 완료된 복제수정란은 5 ??M의 이노마이신 (Sigma, 미합중국)이 첨가된 Hepes-mSOF에서 4분간 처리한 후, 1.9 mM 6-디메틸아미노퓨린 (Sigma, 미합중국)이 첨가된 mSOF에서 39??, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다.
실시예 8: 복제수정란의 배양
활성화 처리가 완료된 복제수정란을 Hepes-mSOF로 3회 세정한 후 7일간 mSOF에서 39??, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
상기 실시 예 1 내지 8에서 제조된 각각의 복제수정란의 배반포 발달율은 하기 표 1 (실시예 3-3의 복제수정란을 대상으로 한 결과)및 표 2 (실시예 3-4의 복제수정란을 대상으로 한 결과)에 나타나 있다.
| G | 처리 | 난자의 수 | 발달된 복제수정란의 수(%)3 | |||||||
| 스퀴징 | X선 조사1 | 주입 | 융합(%)2 | 2세포 | 4세포 | 8세포 | 16세포 | 상실배 | 배반포 | |
| 1 | (+) | (-) | 143 | 110(69) | 77(70) | 66(60) | 55(50) | 41(37) | 27(25) | 16(15)a |
| 2 | (+) | (+) | 131 | 94(71) | 65(69) | 43(46) | 37(39) | 28(30) | 16(17) | 4(4)b |
| 3 | (-) | (+) | 142 | 109(77) | 84(77) | 54(50) | 49(45) | 36(33) | 30(28) | 22(20)a |
| a,b 각 변수에서 다른 첨자로 표시된 것은 유의적인 차이가 있음, P<0.005 115 kVp, 60초. 2주입된 난자 수의 백분율. 3 융합된 난자 수의 백분율. | ||||||||||
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 스퀴징 방법으로 탈핵하여 제조된 복제수정란 (Group 1), X선 조사 후 탈핵하여 제조된 복제수정란 (Group 2) 및 X선 조사 단독 처리하여 제조된 복제수정란 (Group 3)의 배반포 발달율을 조사한 결과, Group 1과 Group 3의 배반포 발달율이 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 한편, Group 2의 배반포 발달율은 Group 1 및 Group 3보다 낮았으며 (15-20% vs 4%), 배반포 발달율 상에서 유의적인 차이를 보였다 (P=0.0035). 따라서, 본 발명의 X선 조사 단독 처리에 의한 난자 핵의 불활화 방법이 물리적인 스퀴징 방법만큼 효과가 있음을 알 수 있다.
| G | 처리 | 난자의 수 | 발달된 복제수정란의 수(%)3 | |||||||
| 스퀴징 | X선 조사1 | 주입 | 융합(%)2 | 2세포 | 4세포 | 8세포 | 16세포 | 상실배 | 배반포 | |
| 4 | (+) | (-) | 53 | 40(75) | 34(85)a | 29(73)a | 23(56)a | 15(38)a | 15(38)a | 11(28)a |
| 5 | (-) | (-) | 56 | 48(86) | 24(50)b | 19(40)b | 16(33)b | 9(19)b | 7(15)b | 2(4)b |
| 6 | (-) | 10초 | 45 | 33(73) | 25(76)a | 22(67)a | 19(58)a | 12(36)a | 5(15)b | 4(12)a |
| 7 | (-) | 20초 | 41 | 33(80) | 25(76)a | 19(58)a | 16(48)a | 10(21)b | 6(18)b | 4(12)a |
| 8 | (-) | 40초 | 49 | 37(76) | 25(68)a | 22(60)a | 18(49)a | 15(40)a | 8(22)a | 4(11)b |
| 9 | (-) | 60초 | 91 | 73(80) | 49(67)a | 44(60)a | 32(44)a | 23(31)a | 16(22)a | 14(19)a |
| a,b 각 변수에서 다른 첨자로 표시된 것은 유의적인 차이가 있음, P<0.05. 1 15 kVp 2주입된 난자 수의 백분율. 3 융합된 난자 수의 백분율. | ||||||||||
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 대조군 2개 (Group 4 및 5)와 X선 조사 시간을 달리 한 4개의 처리군 (Group 6 내지 9)의 배반포 발달율을 조사한 결과, 배반포 발달율이 각각 28%, 4%, 12%, 12%, 11% 및 19%로 유의적인 차이를 나타내었으며 (P=0.042), 음성 대조군인 Group 2는 배반포 발달율이 2세포기부터 배반포까지 모두 유의적으로 낮았다 (P<0.05). 스퀴징 방법에 의해 탈핵하여 제조된 복제수정란 (Group 4)의 배반포 발달율이 28%로 가장 높았으며, 60초간 X선 조사 단독 처리되어 제조된 복제수정란 (Group 9)가 19%로 그 다음으로 높았으나 Group 4와 유의적인 차이를 보이지 않았다 (P=0.3912). 따라서, 본 발명의 난자 핵의 불활화 방법에서 가장 적당한 X선 조사량의 조건은 관전압 15 kVp, 관전류 5 mA 및 조사 시간 60초 내외임을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 X선을 이용한 체세포 복제수정란의 제조를 위한 수핵난자 핵의 불활화 방법 및 상기 방법을 포함하는 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 수핵난자 핵의 불활화 방법은 물리적인 탈핵 방법을 대체할 수 있으며, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 체세포 복제수정란은 이후의 배반포 발달율이 높으므로 체세포 복제동물의 생산에 유용하게 적용될 수 있다.
Claims (13)
- 수핵난자에 관전압 15-18 kVp 및 관전류 2-8 mA의 X선을 조사하는 단계를 포함하는 수핵난자와 체세포 공여핵의 융합을 통한 체세포 복제수정란의 제조를 위한 인간을 제외한 포유동물의 수핵난자 핵의 불활화 방법.
- 삭제
- 다음의 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 체세포 복제동물의 생산 방법:(a) 수핵난자에 X선을 조사하는 단계;(b) 체세포 공여핵을 상기 수핵난자에 이식하는 단계;(c) 상기 핵이식된 체세포 복제수정란의 재프로그래밍을 유도하는 단계;(d) 상기 재프로그래밍된 체세포 복제수정란의 활성화를 유도하는 단계;(e) 상기 활성화된 체세포 복제수정란의 배반포 발달을 유도하는 단계; 및(f) 상기 배반포의 착상 및 발생을 유도하는 단계.
- 제 3 항에 있어서, 상기 X선의 조사는 관전압 18 kVp 이하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 X선의 조사는 관전압 15-18 kVp에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 X선의 조사는 관전류 2-8 mA에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 X선의 조사는 10-60 초 동안 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 X선의 조사는 관전압 15-18 kVp 및 관전류 5 mA에서 10-60 초 동안 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 수핵난자는 인 비트로 또는 인 비보에서 성숙된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 3 항에 있어서, 상기 포유동물은 소인 것을 특징으로 하는 체세포 복제동물의 생산 방법.
- 포유동물의 성숙 난자에 관전압 15-18 kVp 및 관전류 5 mA에서 10-60 초 동안 X선을 조사하는 단계를 포함하는 체세포 복제수정란의 제조를 위한 인간을 제외한 포유동물의 수핵난자 핵의 불활화 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 체세포 복제동물의 생산 방법:(a) 포유동물의 수핵난자에 관전압 15-18 kVp 및 관전류 5 mA에서 10-60 초 동안 X선을 조사하는 단계;(b) 포유동물의 체세포 공여핵을 상기 수핵난자에 이식하는 단계;(c) 상기 핵이식된 체세포 복제수정란의 재프로그래밍을 유도하는 단계;(d) 상기 재프로그래밍된 체세포 복제수정란의 활성화를 유도하는 단계;(e) 상기 활성화된 체세포 복제수정란의 배반포 발달을 유도하는 단계; 및(f) 상기 배반포의 착상 및 발생을 유도하는 단계.
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| Exp Cell Res. Vol.251, No.1, pp.46-56 * |
| Proc Natl Acad Sci USA, Vol.98, No.3, pp.1071-1076, * |
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| Radiation Research, Vol.11, No.1, pp.47-57, * |
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