KR20040060348A - 체세포 복제수정란의 배발달율 향상을 위한 체외배양 배지조성물 및 체외배양 방법 - Google Patents

체세포 복제수정란의 배발달율 향상을 위한 체외배양 배지조성물 및 체외배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체세포 복제수정란의 배발달율 향상을 위한 체외배양 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 체세포 복제수정란의 제조 후 대리모에 이식하기 전 배반포기까지의 체외배양 시 배반포 발달율을 향상시키기 위한 체외배양 배지 조성물 및 체외배양 방법에 관한 것이다. 본 발명은 체세포 복제수정란의 대리모 이식 이전의 배발달 단계에서의 배반포 발달율 향상을 위한 체외배양 배지 조성물, 상기 체외배양 배지 조성물을 이용한 체외배양 방법 및 상기 체외배양 방법에 의한 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 체외배양 배지 조성물 및 체외배양 방법은 체세포 복제수정란의 배발달 단계에서 배아 할구의 아폽토시스 발생을 효과적으로 저하시켜 배반포 발달율을 효과적으로 향상시키며, 본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법은 복제수정란의 배발달율을 향상시킴으로써 건강한 산자의 생산 효율을 증진시킬 수 있다.

Description

체세포 복제수정란의 배발달율 향상을 위한 체외배양 배지 조성물 및 체외배양 방법{Medium Composition and Culture Method for Improving Preimplantation Development of Clone Embryo}
본 발명은 체세포 복제수정란의 배발달율 향상을 위한 체외배양 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 체세포 복제수정란의 제조 후 대리모에 이식하기 전 배반포기까지의 체외배양 시 배반포 발달율을 향상시키기 위한 체외배양 배지 조성물 및 체외배양 방법에 관한 것이다.
1997년 복제양 돌리의 탄생 (Wilmut I., Schnieke AE., McWhir J., Kind AJ., Campbell KHS. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature385:810-13(1997)) 은 분화된 체세포가 난자와 만날 경우 배아 단계로 역분화하여 다시 하나의 완전한 개체로 분화하여 클론을 형성할 수 있는 능력, 즉 전능성을 획득할 수 있음을 보여준 첨단 생명공학 기술의 성과이다.
체세포 복제 기술은 우수형질 개체 확보, 고부가가치 생체반응기 동물의 생산, 질환 모델 동물의 생산, 인체 장기 공여 동물의 생산, 멸종 위기 동물의 보존 등 그 응용 분야의 범위가 매우 넓다. 또한 인류 복지 향상과 관련하여 체세포 복제 기술을 적용하면 환자 체세포 유래 배반포에서 배아 줄기 세포주를 수립할 수 있으며, 이렇게 수립된 배아 줄기 세포로부터 치료에 필수적인 세포를 분화시킬 경우, 환자의 면역 거부 반응을 피할 수 있다는 장점이 있기 때문에 (Trounson A. Potential benefits of cell cloning for human medicine.Reprod Fertil Dev10:121-125(1998)) 임상적 이용성이 높다.
체세포 복제 기술의 근간은 이가 염색체를 가진 공여핵 세포와, 유전 물질을가진 핵이 제거된 수핵난자의 융합이다. 체세포 복제 기술이란 공여핵으로서 체세포를 이용하는 것을 말하며 이는 성체 혹은 태아의 조직에서 회수된다. 공여핵이 이식될 수핵난자는 체세포와 융합된 후 발생할 수 있는 능력을 보유하여야 한다. 이러한 발생능을 가지기 위해서는 제2차 감수분열 중기 (난자가 체내에서 자연적으로 배란되는 시기) 까지 난자의 발육이 진행되어야 하며 이를 위하여 체외에서 인위적으로 난자를 배양하거나, 호르몬 처치를 통하여 체내에서 난자를 발육시킨다.
회수된 난자는 체세포와 융합시키기 전 탈핵 과정을 거치게 되는데 주로 물리적인 방법을 이용하여 난자의 핵 (제2차 감수분열 중기판이 존재하는 부분의 세포질) 을 제거한다. 탈핵 과정을 거친 난자는 투명대와 난자 세포질 막 사이의 주란강에 체세포를 이식하거나 세포질내 직접 주입법에 의하여 핵이식을 수행하게 된다.
체세포 핵이식에 따른 염색체 손상 방지 및 이식 후 발생능 향상을 위하여 체세포 이식 전에 체세포의 세포주기를 G0 기로 맞추는 작업을 수행한다. 그러나, 이 과정은 이식하는 체세포의 특성에 따라 생략할 수 있으며, 일부에서는 G2 및 M 기의 세포도 정상적으로 발생이 가능하다고 보고되고 있다.
체세포 공여핵을 탈핵 난자에 주입한 후 전기자극 등을 통해 물리적으로 융합을 시키며, 이후 체세포와 융합이 된 난자를 체세포 복제수정란이라고 부른다. 체세포 복제수정란이 생산된 후 가장 중요한 과정은 이식된 체세포 핵이 정자와 난자핵 접합에 의하여 생성된 핵과 동일한 능력과 기능을 가지고 난자의 세포질과 조화롭게 일련의 발생과정을 수행하는 것이다. 이러한 일련의 과정을 재프로그래밍 (reprogramming) 이라고 하며, 복제수정란의 최초 발생인 분할을 유도하는 과정을 활성화 (activation) 라고 한다. 활성화를 위하여 화학적이나 전기 자극 등을 이용하며, 분할 후 복제수정란의 정상적인 재프로그래밍을 유도하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다. 재프로그래밍이 순조롭게 이루어진 복제수정란의 경우 최초로 분화 (differentiation)가 일어나는 배반포기까지 체외에서 배양하며 이후 대리모 이식을 통하여 개체로 발생시킨다.
체세포 핵이식 기술은 돌리 탄생이후 다양한 종에서 복제동물의 생산이 이루어지게 했다. 1998년 Wakayama 는 마우스 난자의 난구 세포를 공여핵으로 이용해서 복제 마우스를 생산했다. 또한 Cibelli는 G0가 아닌 G1 상태의 공여핵을 사용해서 복제소를 생산했으며, Kato 역시 한 마리의 체세포에서 8 마리의 복제 송아지를 생산했다. 1999년 Galli는 백혈구를, Wells는 벽면 과립막세포 (mural granulosa cell)를 각각 이용하여 복제 송아지를 생산했다. 또한 Baguisi는 태아 섬유아세포를 이용하여 형질전환 염소를 생산했으며, Wakayama는 후기 계대의 배아 줄기 세포로부터 마우스를 복제하는데 성공했다. 2000년에는 McCreath, Brink, Kato, Onishi 및 Ogura에 의해 각각 양, 소, 돼지 및 마우스 등의 복제 동물이 생산되었으며, 2001년에는 Denning, Zakhartchenko, Keefer 및 Wakayama 에 의해 복제 동물들이 생산되었다. 특히 2002년 미국 미주리대 연구진에 의하여 초급성 면역 거부 반응을 유도하는 갈락토실 트랜스퍼라아제를 제거한 형질전환 돼지를 체세포 핵이식 기술에 의하여 생산한 것은 복제 동물 생산 기술의 의학적 이용 가능성을 제시한 업적으로 평가되고 있다. 그 외에도 2002년에는 고양이, 토끼 및 물고기까지 체세포 핵이식 기술을 이용한 개체 생산이 성공하였다.
지금까지의 많은 노력과 진전이 있었지만 아직까지 체세포 핵이식 기술을 이용한 개체생산의 효율성은 비약적으로 개선되지 않고 있으며, 복제수정란 이식 후 임신과정 중 유산 및 사산 등이 보고되고 있다. 체세포 복제수정란 배발생의 기준 지표로 사용되는 배반포 발달율도 체외 수정 유래의 수정란과 대등하지만 착상 및 발생을 거쳐 건강한 산자로 태어날 확률은 3% 이내로서 그 확률이 매우 낮다.
따라서, 현재 체세포 복제 기법의 효율을 증가시키는 일련의 연구가 진행중이다. 예컨대, 초기 배발생을 조절하는 유전자의 발현에 관한 연구, 수정란 재프로그래밍의 지표로 사용하는 메틸화 (methylation) 양상에 관한 연구, 전자현미경을 통한 세포소기관의 미세 구조의 이상에 관한 형태학적 연구, 배반포를 이루는 두 가지 세포층인 내세포괴 및 영양세포의 수와 비율에 관한 연구를 거쳐 도출된 실험 결과를 통하여 탈핵, 공여핵 세포의 종류와 체외배양, 융합, 활성화, 복제수정란의 체외배양 등의 최적화 조건을 설정하여 체세포 복제수정란 유래의 산자 생산 효율을 증가시키고자 하고 있다.
특히, 체세포 복제수정란 배발달 효율의 향상을 위한 최근의 연구에서, 부적합한 재프로그래밍이 복제수정란의 배발달 효율을 감소시키는 중요한 원인이 된다는 것이 보고되었다 (William MR., Kevin E., Rudolf J. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome.Science293:1093-1098(2001); Kang YK., Koo DB., Park JS., Choi YH., Ahung AS., Lee KK., Han YM. Aberrantmethylation of donor genome in cloned bovine embryos.Nature Genetics28:173-177(2001)). 또한, 체세포 핵이식 기술의 방법적 측면 뿐 아니라 체외배양 조건 등의 세포외적 환경도 복제수정란의 배발달 지연을 감소시키는 데 중요한 요인이 된다는 연구 결과가 보고되고 있다 (Shin SJ., Lee BC., Park JI., Lim JM., Hwang WS. A separate procedure of fusion and activation in an ear fibroblast transfer program improves preimplantation development of bovine reconstructed oocytes.Theriogonology55:1697-1704(2001); Cho JK., Lee BC., Park JI., Lim JM., Shin SJ., Kim KY., Lee BD., Hwang WS. Development of bovine oocytes reconstructed with different donor somatic cells with or without serum starvation.Theriogenology57:1819-1828(2002); Choi YH., Lee BC., Lim JM., Kang SK., Hwang WS. Optimization of culture medium for cloned bovine embryos and its influence on pregnancy and delivery outcome.Theriogonology2002 (in press); Kwon J., Jang KH., Park JI., Lee ES., Lim JM., Kang SK., Lee BC., Hwang WS. A combination of fructose and glucose enhances nuclear transferred embryo development, blastocyst formation and viability.Theriogenology57:425(2001)).
한편, 배아 할구에서 아폽토시스의 발생은 수정란의 초기 배발생을 저하하는 주요한 요인이 된다 (Handyside AH., Hunter S. Cell division and death in the mouse blastocyst before implantation.Rouxs Arch Dev Biol195:519-526(1986); Jurisicova A., Varmuza S., Casper RF. Programmed cell death and human embryofragmentation.Mol Hum Reprod2:101-106(1996); Jurisicova A., Varmuza S., Casper RF. Involvement of programmed cell death in preimplantation embryo demise.Hum Reprod Update1:558-566(1995)).
따라서, 체세포 복제수정란의 경우에도 배아 할구에서 아폽토시스의 발생이 복제수정란의 초기 배발달율 저하의 주요 원인이라고 가정할 때, 복제수정란의 체외배양 시 아폽토시스 발생을 억제함으로써 배발달율을 향상시키는데 초점을 맞추어야 한다.
예컨대, 이전의 연구에 따르면, 체외수정란의 경우 체외배양 시 아폽토시스를 억제하는 것으로 추정되는 산화질소 제거자 (nitric oxide scavenger) 또는 항산화제를 첨가하여 배양하였을 때 체외수정란의 발육율이 향상되었다 (Takahashi M., Keicho K., Takahashi H., Ogawa H., Schultz RM., Okano A. Effect of oxidative stress on development and DNA damage in in-vitro cultured bovine embryos by comet assay. Theriogenology54:137-145(2000); Park SE., Chung HM., Cha KY., Hwang WS., Lee ES., Lim JM. Establishment of an animal embryo culture system containing various embryotropins and its efficacy for culturing ICR mouse one-cell embryos derived in vivo or in vitro.Fertil Steril76:167-174(2001); Lim and Hansel. Improved development of in vitro-derived bovine embryos by use of a nitric oxide scavenger in a cumulus-granulosa cell coculture system.Mol Reprod Dev50:45-53(1998); Lim JM., Mei Y., Chen B., Godke RA., Hansel W. Development of bovine IVF oocytes culturedin medium supplemented with a nitric oxide scavenger or inhibitor in a co-culture system.Theriogenology51:941-949(1999); Park SE., Chung HM., Ko JJ., Lee BC., Cha KY., Lim JM. Embryotropic role of hemoglobin and ethylenediaminetetraacetic acid in preimplantation development of ICR mouse 1-cell.Fertil Steril74:996-1000(2000); Takahashi Y., First NL. In vitro development of bovine one-cell embryos: Influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins.Theriogenology37:963-978(1992); de Matos DG., Furnus CC. The importance of having high glutathione (GSH) level after bovine in vitro maturation on embryo development effect of β-mercaptoethanol, cysteine and cystine.Theriogenology53:761-771(2000)).
또한, 본 발명자들은 산화질소 제거자인 헤모글로빈을 포함하는 포유동물 세포 배양 배지에 의한 난자, 수정란 또는 다른 세포의 배양이 배발생 단계에 있어서 배발달율을 향상시킴을 발견한 바 있다 (참조: 미국특허 제 6,424,219호).
따라서, 체세포 복제수정란의 경우에도 배아 할구에서 아폽토시스의 발생이 복제수정란의 초기 배발달율 저하의 주요 원인이라고 가정할 때, 복제수정란의 체외배양 시 아폽토시스 발생을 억제함으로써 배발달율을 향상시키는데 초점을 맞추어야 하며, 본 발명에서는 이러한 배아 할구의 아폽토시스 발생을 억제하여 배발달율을 향상시킬 수 있는 물질을 포함한 체외배양 배지의 조성 등 체세포 복제수정란의 체외배양의 최적 조건을 제시하고자 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허 문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허 문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 배아 할구의 아폽토시스 발생을 억제하여 배발달율을 향상시킬 수 있는 체세포 복제수정란의 체외배양 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 공여핵 체세포의 체외배양 시 또는 복제수정란의 체외배양 시 항산화제 또는 산화질소 제거자 등의 물질을 첨가한 배양 배지에서 체외배양할 경우 복제수정란의 배반포 발달율이 향상됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 체세포 복제수정란의 대리모 이식 이전의 배발달 단계에서의 배반포 발달율 향상을 위한 체외배양 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 체외배양 배지 조성물을 이용한 체세포 복제수정란의 배반포 발달율 향상을 위한 체외배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 체외배양 방법에 의한 배발달 및 건강한 산자의 생산 효율이 개선된 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 명확하게 설명된다.
도 1a는 체외수정란의 배반포를 TUNEL 분석한 결과;
도 1b는 체외수정란의 배반포를 육안 관찰한 결과;
도 1c는 복제수정란의 배반포를 TUNEL 분석한 결과;
도 1d는 복제수정란의 배반포를 육안 관찰한 결과;
도 2는 체외수정란과 복제수정란의 각 발달 단계에서 아폽토시스 할구의 발생율을 나타내는 그래프;
도 3은 공여핵 체세포의 배양 시 β-머캅토에탄올 및/또는 헤모글로빈의 첨가 배양하였을 경우의 아폽토시스 할구의 발생율을 나타내는 그래프; 및
도 4는 복제수정란의 체외배양 시 β-머캅토에탄올 및/또는 헤모글로빈의 첨가 배양하였을 경우의 아폽토시스 할구의 발생율을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 항산화제를 포함하는 체세포 복제수정란의 제조를 위한 공여핵 체세포의 체외배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항산화제 및 산화질소 제거자를 포함하는 체세포 복제수정란의 체외배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 체세포 복제수정란 및 체외수정란의 배발달 단계에서 초기 아폽토시스 발생이 복제수정란 및 체외수정란의 초기 배발달 효율을 낮추는 요인이 됨을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 체세포 복제수정란의 제조를 위한 공여핵 체세포의 체외배양 시에는 항산화제를, 그리고 상기 복제수정란의 대리모 이식 전 배반포기까지의 체외배양 시에는 항산화제 및 산화질소 제거자를 동시 첨가한 배양 배지에서 체외배양할 경우 복제수정란의 배반포 발달율이 향상되며 아폽토시스 할구의 수도 감소됨을 발견하였다.
본 발명은 이전의 연구에서의 체외수정란의 체외배양 시 아폽토시스 발생에 따른 배발달율과 체세포 복제수정란의 체외배양 시 아폽토시스 발생에 따른 배발달율을 최초로 비교 평가한 것이다. 또한, 본 발명은 공여핵 체세포의 배양과 복제수정란의 체외배양 시 배양액 내에 항산화제, 예컨대, β-머캅토에탄올과 산화질소 제거자, 예컨대, 헤모글로빈의 첨가가 체세포 복제수정란의 초기 배발달에 어떠한 영향이 있는지를 평가하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체세포 복제"는 공여핵 체세포로부터 염색체가 제거된 수핵난자로의 핵 염색체 이식 및 융합, 즉 체세포 핵이식 과정을 통하여 그핵 내 DNA가 공여핵 체세포로부터 유래된 동물이 완전한 성숙한 개체로 발달되는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체세포"는 생식세포 이외의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "공여핵 체세포"는 체세포 핵이식 시 수핵난자로 핵 내 유전 물질을 제공하는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체세포 복제수정란"은 체세포 공여핵을 유전 물질이 제거된 수핵난자에 주입한 후 물리적 또는 화학적 방법으로 융합된 난자를 의미한다. 본 명세서에서는 특별한 언급이 없는 한, "복제수정란"이라는 용어는 상기 "체세포 복제수정란"과 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "수핵난자"는 체세포 핵이식 시 공여핵 체세포로부터의 핵을 이식받는 난자로서 세포질을 제공하며, 공여핵 체세포의 핵 이식을 위하여 실질적으로 핵 내 유전 물질이 제거되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "핵"은 실질적으로 DNA와 같은 염색체 내의 유전 물질을 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "융합"은 실질적으로 공여핵 세포와 수핵난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다.
본 발명의 체외배양용 배지 조성물은, 공여핵 체세포의 체외배양 단계에서는 통상의 체외배양 배지에 항산화제를 단독으로 첨가할 경우, 제조된 복제수정란의 배반포 발달율이 향상된다. 또한, 제조가 완료된 복제수정란의 대리모 이식 이전의 배발달을 유도하기 위한 체외배양 단계에서는 통상의 체외배양 배지에 항산화제및 산화질소 제거자를 동시에 첨가할 경우, 제조된 복제수정란의 배반포 발달율이 향상된다. 또한, 상기 공여핵 체세포의 체외배양 시 항산화제를 첨가한 체외배양 배지에서 배양한 공여핵 체세포를 이용하여 제조된 복제수정란을 항산화제 및 산화질소 제거자를 동시에 첨가한 체외배양 배지에서 배양하여 배발달을 유도할 경우, 배반포 발달율은 상승적으로 향상된다.
또한, 본 발명의 체외배양용 배지 조성물은 복제수정란의 배반포 발달율 뿐만 아니라, 배아 할구의 아폽토시스 발생율, 그리고 배반포의 총 할구 수, 배반포를 이루는 세포층인 내세포괴와 영양세포의 수 및 비율 등도 증가시킴으로써, 결과적으로 체세포 복제의 효율을 향상시킨다.
본 발명에 의하면, 체세포 복제수정란 및 체외수정란의 배발달 단계에서 초기 아폽토시스 발생이 복제수정란 및 체외수정란의 초기 배발달 효율을 낮추는 요인이 된다. 체외수정란에 비하여 복제수정란에서 아폽토시스의 발생이 보다 빨리 관찰되었다. 즉, 체외수정란의 배발달 단계에서 아폽토시스의 최초 발생이 관찰된 단계는 8-16세포기로, 상기 단계는 수정란의 지놈 활성화가 일어나는 단계이다 (Hardy K. Cell death in the mammalian blastocyst.Mol Hum Reprod3:919-925(1997); Jurisicova A., Rogers I., Fasciani A., Casper RF., Varmuza S. Effect of maternal age and conditions of fertilization on programmed cell death during murine preimplantation embryo development.Mol Hum Reprod4:139-145(1998)). 재프로그래밍 및 탈메틸화는 수정란 지놈 활성화의 필수 요소임이 보고되어 있으며 (Kang YK., Koo DB., Park JS., Choi YH., Ahung AS., Lee KK.,Han YM. Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos. Nature Genetics 28:173-177(2001); Stojanov T., O'Neill C. In vitro fertilization causes epigenetic modifications to the onset of gene expression from the zygotic genome in mice. Biol Reprod 64:696-705(2001)), 따라서, 상기 복제수정란의 배발달 단계에서 최초 아폽토시스 발생 단계가 4-8세포기로 체외수정란에 비해 빠른 것은 수정란 지놈 활성화 이전의 부적절한 재프로그래밍에 의하여 대리모 이식 전 수정란의 사멸이 초래될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 체외배양용 배지 조성물에 포함되는 항산화제는 β-머캅토에탄올이다. 상기 β-머캅토에탄올은 체외배양 동안 세포의 생존 능력을 향상시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상세하게는, 상기 β-머캅토에탄올은 세포 성장 및 증식에 불리한 작용을 촉진하는 활성 산소류의 작용을 억제하며, 세포내 GSH 레벨을 증가시킨다 (Takahashi Y., First NL. In vitro development of bovine one-cell embryos: Influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins.Theriogenology37:963-978(1992)). 이러한 β-머캅토에탄올은 소의 체외수정란에서의 배발달 촉진 효과가 이미 보고되어 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 체외배양용 배지 조성물에 포함되는 산화질소 제거자는 헤모글로빈이다. 상기 산화질소는 아폽토시스 개시 과정을 활성화시키는 주요한 신호 분자이다 (Brison DR., Schultz RM. Apoptosis during mouse blastocyst formation: evidence for a role for survivalfactors including transforming growth factor alpha.Biol Reprod56:1088-1096(1997); Chen HW., Jiang WS., Tzeng CR. Nitric oxide as a regulator in preimplantation embryo development and apoptosis.Fertil Steril75:1163-1171(2001)). 산화질소의 작용은 산화질소 신타아제의 불활성화 또는 활성 산화질소의 제거 (scavenging)에 의하여 저해될 수 있다. 본 발명자들의 이전의 연구에 의하면, 소의 체외수정란에서는 산화질소 제거자에 의한 배발달 촉진 효과가 산화질소 신타아제 억제자에 의한 촉진 효과보다 더 우수하였다 (Lim JM., Mei Y., Chen B., Godke RA., Hansel W. Development of bovine IVF oocytes cultured in medium supplemented with a nitric oxide scavenger or inhibitor in a co-culture system.Theriogenology51:941-949(1999)). 상기 헤모글로빈은 이러한 활성 산화질소 제거자로서 산화질소의 작용을 저해한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 체외배양용 배지 조성물에 포함되는 β-머캅토에탄올 농도는 바람직하게는 1-25 μM이며, 가장 바람직하게는 10 μM이다. 상기 농도가 1 μM 미만일 경우 또는 25 μM을 초과하는 경우에는 배반포 발달율이 낮아지는 문제점이 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 체외배양용 배지 조성물에 포함되는 헤모글로빈 농도는 바람직하게는 1-10 ㎍/㎖이며, 가장 바람직하게는 1 ㎍/㎖이다. 상기 농도가 1 ㎍/㎖ 미만일 경우 또는 10 ㎍/㎖를 초과하는 경우에는 배반포 발달율이 미약해지는 문제점이 있다.
본 발명에서 공여핵 체세포로 사용되는 체세포는 바람직하게는 포유동물의체세포이며, 보다 바람직하게는 소의 체세포이다. 상기 공여핵 체세포는 성체 세포 및 태아 세포 모두 사용 가능하며, 성체 세포는 바람직하게는 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 연골 세포, 림프 세포, 대식 세포, 단핵 세포, 근육 세포 등이며, 태아 세포는 바람직하게는 태아 섬유아세포, 귀 상피 섬유아세포 등이다. 본 발명의 공여핵 체세포는 바람직하게는 태아 세포이며, 보다 바람직하게는 귀 상피 섬유아세포이고, 가장 바람직하게는 소의 귀 상피 섬유아세포이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 체세포 복제수정란의 체외배양 방법을 제공한다: (a) 공여핵 체세포를 항산화제를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 체외배양하는 단계; (b) 상기 체외배양된 공여핵 체세포의 핵을 유전물질이 제거된 수핵난자에 이식하여 체세포 복제수정란을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 체세포 복제수정란을 체외배양용 배지 조성물에서 체외배양하는 단계.
본 발명의 체세포 복제수정란의 체외배양 방법은 복제수정란의 대리모 이식 전의 배발달 유도 단계에서 배아의 초기 아폽토시스 발생율을 감소시킴으로써 배반포 발달율을 향상시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계, 즉 체세포 복제수정란의 체외배양 단계는 항산화제 및 산화질소 제거자를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 수행된다. 이러한 복제수정란의 체외배양 단계에서의 항산화제 및 산화질소 제거자의 동시 첨가 배양은 복제수정란의 배반포 발달율을 상승적으로 향상시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항산화제는 β-머캅토에탄올이다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산화질소 제거자는 헤모글로빈이다. 상기 β-머캅토에탄올 및 헤모글로빈에 대하여 중복된 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 체세포 복제수정란의 체외배양 방법에서 사용 가능한 바람직한 공여핵 체세포의 종류는 상기 체세포 복제수정란 배양 배지용 조성물에서 상세히 설명한 내용과 동일하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공한다: (a) 수핵난자의 유전물질을 제거하는 단계; (b) 공여핵 체세포를 항산화제를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 체외배양하는 단계; (c) 상기 체외배양된 공여핵 체세포의 핵을 상기 수핵난자에 이식하는 단계; (d) 상기 핵이식된 체세포 복제수정란의 재프로그래밍 및 활성화를 유도하는 단계; (e) 상기 활성화된 체세포 복제수정란을 체외배양하여 배반포 발달을 유도하는 단계; 및 (f) 상기 배반포의 착상 및 발생을 유도하는 단계.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법은 복제수정란의 대리모 이식 전의 배발달 유도 단계에서 배아의 초기 아폽토시스 발생율을 감소시킴으로써 배반포 발달율을 향상시키고, 따라서, 대리모 이식 이후 건강한 산자의 생산 효율을 증가시킨다.
본 발명자들은 대한민국 공개특허 제 2001-69215호에서 체세포 복제 소의 생산 방법을 개시한 바 있으며, 상기 공개특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어, 본 명세서에 기재되지 않은 본 발명의 특징이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (e) 단계, 즉 체세포 복제수정란의 체외배양 단계는 항산화제 및 산화질소 제거자를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 수행된다. 이러한 복제수정란의 체외배양 단계에서의 항산화제 및 산화질소 제거자의 동시 첨가 배양은 복제수정란의 배반포 발달율을 상승적으로 향상시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항산화제는 β-머캅토에탄올이다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산화질소 제거자는 헤모글로빈이다. 상기 β-머캅토에탄올 및 헤모글로빈에 대하여 중복된 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법을 적용할 수 있는 동물은 어류, 양서류, 조류 및 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 포유동물, 예컨대, 영장류, 소, 양, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류 등의 체세포 복제에 적용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 소 또느 인간, 가장 바람직하게는 소의 체세포 복제에 적용될 수 있다.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법에서 수핵난자의 탈핵 과정은 통상의탈핵 방법, 예컨대, 물리적 스퀴징 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 화학적 방법을 포함한 응용 탈핵 방법에 의하여도 수행될 수 있다.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법에서 사용 가능한 바람직한 공여핵 체세포의 종류는 상기 체세포 복제수정란 배양 배지용 조성물에서 상세히 설명한 내용과 동일하다.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법에서 핵이식 과정은 통상의 핵이식 방법, 예컨대, 미세주입법에 의하여 수행될 수 있으며, 체세포 공여핵과 수핵난자의 융합은 통상의 융합 방법, 예컨대, 전기융합법에 의하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 융합은 융합 촉진 화학약품의 사용 등에 의하여 촉진될 수 있다.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법에서 체세포 복제수정란의 재프로그래밍은 통상의 재프로그래밍 방법에 의하여 유도될 수 있으며, 활성화의 유도는 통상의 활성화 방법, 예컨대, 화학적 활성화 방법 또는 전기적 활성화 방법에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법에서 대리모로의 이식, 그리고 착상 및 성숙한 개체로의 발생을 유도하는 과정은 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 체세포 복제수정란의 제조
실시예 1-1:수핵난자의 준비
도축장에서 소의 난소를 회수하여 직경이 2-8 ㎜인 난포로부터 18 게이지 주사침이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 미성숙 난자를 채취하였으며, 이 중에서 실체 현미경하에서 다층의 치밀한 난구세포가 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자만을 선별하였다. 미성숙 난자의 성숙 배양은 성숙 배양용 조직 배양 배지 (tissue culture medium) 199 (TCM 199; Gibco, Life Technologies, 미합중국) 배양액을 기본으로 하여, 10% FBS, 26.2 mM 중탄산 나트륨, 2.5 ㎍/㎖ 난포 자극 호르몬 (FSH; Antrin, Denka Pharm., 일본국) 및 1 ㎍/㎖ 에스트라디올 (Sigma, 미합중국)을 첨가하여 사용하였다. 성숙 배양에는 4-웰 멀티 디쉬 (Nunc, 덴마크국)를 사용하였으며 배양 전 각 웰에 500 ㎕의 성숙 배양용 TCM 199 배양액을 넣어 배양기 내에 정치시켰다. 선별한 미성숙 난자는 세정용 TCM 199 액으로 3회, 성숙 배양용 TCM 199 배양액으로 1회 세정하고, 각 웰 당 난자 30개를 첨가하여 39℃, 5% CO2배양기 내에서 18시간 동안 성숙 배양하였다. 체외성숙 후 난자를 0.1% (w/v) 히이루로니다아제 (소의 고환으로부터 수득, Sigma, 미합중국)가 포함된 HEPES-완충 CR2aa 배지에서 피펫팅하여 난구세포를 제거하였으며, 제거 후 제1극체가 보이는 난자만을 선별하여 수핵난자로 사용하였다.
실시예 1-2:공여핵 체세포의 준비
공여핵 체세포의 분리 및 배양은 고능력으로 인정된 다산의 4-6세의 홀스타인 (Holstein)에서 귀 조직을 채취하여 준비하였다. 귀 조직을 무균적으로 회수한 후 배양접시 내에서 안과용 가위로 세절하여 15 ㎖ 원심관에 넣고 0.05% (w/v) 트립신-EDTA (Gibco) 10 ㎖를 혼합하여 37℃에서 30분간 진탕한 후 5분간 정치하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액을 15 ㎖ 원심관에 넣고 1,500 rpm으로 2분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM (Gibco) 3 ㎖에 재부유시켜 35 ㎜ 배양접시 (Falcon, 미합중국)에 넣고 5% CO2및 39℃의 조건에서 배양하였다. 매 3일 간격으로 배양액을 교환하였으며 세포가 약 90% 정도 집합되었을 때 계대배양 하였다. 체세포의 세포 주기를 G0 단계로 유도하기 위해 배양 후 2-3일 경에 0.5% (v/v) FBS가 포함된 DMEM에서 2일간 추가 배양하여 공여핵원으로 사용하였다.
실시예 1-3:수핵난자의 탈핵
수핵난자의 탈핵은 체외성숙 후 20시간에 5 ㎍/㎖의 사이토칼라신 B (Sigma)가 함유된 작업용 배지에서 고정용 피펫으로 성숙 난자를 고정시킨 후 커팅 바늘을 이용하여 제1극체가 있는 방향으로 투명대를 절개한 후 스퀴징 방법으로 제1극체와 중기 Ⅱ 염색체를 포함한 세포질을 제거하였다. 탈핵 조작 후 난자를 1 ㎍/㎖의Hoechst 33342 (Sigma)를 함유한 Hepes-완충 CR2aa 배지에 넣어 10분간 배양한 후 (Westhusin ME., Levanduschk MJ., Scarborough R., Looney CR., Bondioli KR. Viable embryos and normal calves after nuclear transfer into Hoechst stained enucleated demi-oocytes of cows.J Reprod Fertil95(2):475-480(1992)) 형광현미경으로 관찰하여 탈핵 여부를 검사하였으며, 탈핵이 확인된 난자만을 핵이식에 사용하였다.
실시예 1-4:핵이식
공여핵용으로 배양된 체세포를 트립신-EDTA (Gibco)로 처리하여 핵이식을 위한 단일 세포 현탁액을 준비하였다. 체세포를 직접 주입용 피펫으로 흡입하여, 탈핵을 실시한 투명대의 슬릿을 통하여 수핵난자의 주란강 내로 주입하였다. 체세포와 수핵난자의 부착을 위해 Hepes-완충 CR2aa 배지에 100 ㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 (PHA-P, Sigma)을 첨가하였다.
실시예 1-5:전기 융합
핵이식이 완료된 후 세포 융합은 전기 융합을 통하여 Ca2+를 첨가하지 않은 융합 배지에서 난자 성숙 24시간 후에 실시하였다. 융합 전 복제수정란을 5분간 만니톨 배지에 정치시켜 융합시 세포질이 빠져나오는 것을 방지하였다. 복제수정란을 융합 배지가 들어있는 융합 챔버 (BTX 453, 미합중국) 내에 넣고 미세 피펫을이용하여 체세포 공여핵과 수핵난자의 접촉면이 융합 챔버의 전극과 평행이 되도록 위치시킨 다음 Electro Cell Manipulator 2001 (BTX 2001, 미합중국)을 이용하여 1.75 kV/㎝의 직류전압으로 15 ㎲동안 2회 통전하여 세포 융합을 유도하였다.
실시예 1-6:재프로그래밍 및 활성화 유도
전기 융합 후 복제수정란을 25 ㎕ CR2aa 배지에서 39℃ 및 5% CO2배양기 내에서 4시간 동안 배양하여 재프로그래밍을 유도하였다. 복제수정란의 활성화는 난자 성숙 28시간 후에 화학적 방법으로 실시하였다. 복제수정란을 차광 조건에서 5 μM 이노마이신으로 4분간 처리하여 활성화를 유도하였다. 유도 후 Hepes-완충 CR2aa 배지에서 정치시켜 실체현미경 하에서 융합 여부를 확인하였다. 융합이 확인된 복제수정란을 1.9 mM 6-DMAP (Sigma)가 첨가된 CR2aa 배지에서 39℃, 5% CO2배양기 내에서 4시간 동안 배양하여 후활성화 하였다.
실시예 2: 체외수정란의 제조
동결 정액을 37℃ 항온 수조에서 1분간 융해한 후 체외수정액 (TALP) 배양액과 혼합하여 1,500 rpm에서 10분간 2회 원심분리하여 세척한 후 정자의 농도가 2.5 ×106정자/㎖가 되도록 준비하였다. 체외수정액은 50 ㎕의 소적을 만들어 2시간 평형시킨 후 체외수정에 이용하였다. 난구세포가 확장된 난포란을 선별하여 체외수정 배양액으로 2회 세척한 후 10개씩의 난포란을 체외배양 소적으로 옮긴 후, 상기 방법으로 준비한 정액 50 ㎕를 수정배양액에 첨가하여 체외수정을 실시하였다.
실시예 3: 복제수정란 및 체외수정란의 체외배양
복제수정란 및 체외수정란은 각각 DMAP 처리 4시간 후 및 체외수정 18시간 후에 회수하여 미네랄 오일 (M-8410, Sigma)로 덮은 배양 배지 50 ㎕ 소적에서 추가로 배양하였다. 2세포기, 4-8세포기, 8-16세포기, 상실배 및 배반포 단계는 각각 24시간, 48시간, 96시간, 144시간 및 168시간 동안 추가로 배양하여 할구 수, 아폽토시스 발생 등을 확인 및 평가하였다. 체외배양은 mSOF 체외배양액 (NaCl (106 mM), KCl (7.2 mM), NaHCO3(25 mM), KH2PO4(1.2 mM), 소듐 락테이트 (6.6 mM), CaCl2(1.7 mM), MgCl2(0.5 mM), 소듐 피루베이트 (0.3 mM), 글루코오스 (1.5 mM), BSA (8 ㎎/㎖), MEM 필수 아미노산 용액 (2%, v/v), MEM 비필수 아미노산 용액 (1%, v/v), 글루타민 (1 mM), 그리고, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄의 혼합물 (1%, v/v) 포함)을 이용하여 39℃ 및 5% CO2의 고습도의 조건에서 실시하였으며, 체외수정 후 6-9일 사이에 생산된 배반포 및 확장 배반포기 수정란을 사용하여 실험에서 평가하였다.
실시예 4: 아폽토시스 발생 확인 (TUNEL 분석)
복제수정란 및 체외수정란의 각 발달 단계의 배 및 배반포의 아폽토시스의 발생은 TUNEL 방법으로 분석하였다 (Brison DR., Schultz RM. RT-PCR-based methodto localize the spatial expression of genes in the mouse blastocyst.Mol Reprod Dev44:171-178(1996)). 먼저, 건강한 배 및 배반포를 4% 파라-포름알데히드에서 15분간 고정시켰다. 그런 다음, 0.1% 트리톤 X-100에서 4℃에서 10분간 정치 및 50 IU/㎖ DNase I (Promega, 미합중국)에서 37℃에서 20분간 정치시킨 후 TUNEL 시약 (Roche Molecular Biochemicals, 미합중국)에서 60분간 배양하고, 10 ㎎/㎖ 비스벤즈아마이드, 50 ㎎/㎖ 요오드화 프로피듐 및 50 ㎎/㎖ RNase A에서 25℃에서 40분간 처리하였다. 그런 다음, 배 및 배반포는 0.2 M 디아자바이시클로옥탄 및 50% (v/v) 글리세롤을 처리한 슬라이드 글라스에 고정하였다. 노란색의 아폽토시스 할구 (도 1a 및 도 1c에서 삼각형으로 표시된 부분)의 관찰은 FITC 필터가 장착된 형광현미경으로 수행하였으며, 붉은색의 총 할구 수는 DAPI 필터가 장착된 반전현미경 (Eclipse TE-300, Nikkon, 일본국)으로 확인하였다 (참조: 도 1a 내지 도 1d).
실시예 5: 통계적 분석
각각의 실험 데이터에 대한 통계학적 검증을 위하여, SAS 6.12 프로그램에 포함되어 있는 일반화 직선 모델 (generalized linear model, PROC-GLM)로 각 처리의 모델 효과를 검증하였다 (Statistical Analysis System Institute. SAS Users Guide.Statistics1992). 모델 효과가 통계학적 유의차를 나타낼 경우 각 처리군은 LSD로 유의적 차이를 검정하였다. 유의수준은 0.05 미만으로 하였다. 이하, 본 실시예의 실험 데이터의 통계적 분석은 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 실험의 결과는 하기 표 1 및 도 2에 나타나 있다.
배 배양시간(시) 배 발달단계 체외수정란의 수 및 (%) 복제수정란의 수 및 (%)
관찰된 것 하나 이상의 아폽토시스 할구를 가진 것 관찰된 것 하나 이상의 아폽토시스 할구를 가진 것
24 2세포기 80 0(0) 75 0(0)
48 4-8세포기 81 0(0) 84 12(14)d
96 8-16세포기 108 36(33) 95 53(56)d
144 상실배 105 77(73) 124 92(74)
168 배반포 95 95(100) 113 113(100)
d상기 백분율은 체외수정란의 수치와 비교시 유의 모델 효과가 나타남. p<0.05
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 체외수정란과 복제수정란에서 각각 다른 양상의 아폽토시스 발생율과 배 발달 단계에 따라서 유의적으로 다른 편차를 보였다. 체외수정란에서 최초 아폽토시스 발생은 8세포기인 반면, 복제수정란의 초기 아폽토시스 발생은 4세포기에서 관찰되었다. 모든 발달 단계 및 배반포기에서의 아폽토시스 할구를 평가한 결과, 복제수정란이 체외수정란에 비해 아폽토시스 할구를 가지고 있는 배아 수가 더 많았다 (p<0.05). 또한, 각 배 당 아폽토시스 할구의 평균 수를 측정한 결과, 4-8세포기 및 배반포기에서 복제수정란의 아폽토시스 할구의 수가 체외수정란보다 유의적으로 증가하였다 (참조: 도 2). 따라서, 복제수정란의 아폽토시스 초기 발생이 체외수정란에서보다 유의적으로 높으며, 이러한 초기 아폽토시스 발생은 복제수정란의 초기 배 발달 효율을 낮추는 요인이 될 수 있음을 알 수 있다.
한편, 발달중인 배에서 아폽토시스 할구 또는 정상 할구는 동시에 발생하며 모든 배반포는 아폽토시스 할구를 갖는 것으로 관찰되었다. 이러한 부분적인 아폽토시스 발생은 비균등 분할, 그리고 부분적인 상실배의 응축 및 배반포의 형성의 원인이 될 수 있으며, 상기 현상들은 체외배양 중에 종종 관찰되었다. 발달중인 배에서 아폽토시스 할구의 수는 체외수정란 및 복제수정란에서 모두 발달이 진행됨에 따라 점점 증가하였으며, 또한 배반포에서 아폽토시스 할구는 내세포괴와 영양세포 모두에서 관찰되었다. 이러한 결과는 체외수정란 및 복제수정란 모두에서 아폽토시스의 발생이 초기 유산과 같은 실패를 초래하는 원인이 될 수 있음을 증명하며, 따라서, 수정란에서의 아폽토시스 발생율은 수정란의 정상적인 발달을 예측하는 척도로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6: 공여핵 체세포의 체외배양 시 β-머캅토에탄올 및/또는 헤모글로빈의 첨가 배양이 배발달에 미치는 영향 실험
실시예 6-1:β-머캅토에탄올 및/또는 헤모글로빈의 첨가 배양
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 체세포 복제수정란을 제조하되, 공여핵 체세포를 체외배양할 때 각각 헤모글로빈 1 ㎍/㎖, β-머캅토에탄올 10 μM, 그리고 헤모글로빈 1 ㎍/㎖ 및 β-머캅토에탄올 10 μM 모두를 첨가한 혈청 무첨가 DMEM에서 배양한 후, 제조된 복제수정란을 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 2세포기, 4-8세포기, 8-16세포기, 상실배 및 배반포기까지 체외배양 하였다.
실시예 6-2:아폽토시스 분석
상기 실시예 6-1에서 배양되어 각 단계까지 발달한 복제수정란의 수를 측정하였으며, 상기 실시예 4와 동일한 TUNEL 분석 방법으로 아폽토시스 분석을 수행하였다.
상기 실험의 결과는 하기 표 2 및 도 3에 나타나 있다.
처리 난자의 수 및 (%)b 발달된 복제수정란의 수 및 (%)c
처음 제공된 것 성공적으로 융합된 것 2세포기 8세포기 상실배 배반포
무처리 198 101(51) 75(74)d 66(65)de 61(60)d 34(34)d
Hb (1 ㎍/㎖) 184 100(54) 91(91)e 82(82)f 62(62)d 40(40)de
ME (10 μM) 180 88(48) 82(93)e 76(86)f 76(86)e 36(41)e
Hb (1 ㎍/㎖)+ME (10 μM) 150 91(60) 54(59)f 49(53)e 38(42)f 17(19)f
b처음 제공된 난자 수에 대한 백분율c성공적으로 융합된 난자 수에 대한 백분율def동일한 변수 내에서 다른 첨자로 표시된 것은 유의적으로 다름, p<0.05
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 공여핵 체세포의 체외배양 시 헤모글로빈 또는 β-머캅토에탄올의 첨가 배양은 어느 것도 첨가하지 않은 대조군에 비하여 배반포기까지의 발달에 유의적인 영향을 끼쳤다 (p<0.0043). β-머캅토에탄올을 첨가하였을 경우에는 대조군에 비하여 모든 발달 단계에 있어서 배 발달율이 향상되었다. 헤모글로빈을 첨가한 경우에는 2세포기와 8세포기의 발달율이 대조군보다 유의적으로 높았고, 상실배기나 배반포기에서는 유의적인 차이가 없었다. 반면, 헤모글로빈 및 β-머캅토에탄올의 동시 첨가 배양은 배반포기까지의 발달율을 향상시키지 못하였고, 오히려 유의적으로 배반포기까지의 발달을 저해하였다. 또한, 배반포기에서의 아폽토시스 할구 발생율은 공여핵 체세포의 체외배양 시 헤모글로빈 또는 β-머캅토에탄올을 첨가 배양한 군이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다 (참조: 도 3). 그러나, 헤모글로빈 및 β-머캅토에탄올을 동시 첨가 배양한 군에서는 대조군과 유의적인 차이가 없었다. 따라서, 공여핵 체세포의 체외배양 시 β-머캅토에탄올을 첨가하여 배양할 경우 아폽토시스 발생율을 감소시키며 복제수정란의 배 발달율을 향상시킴을 알 수 있다.
실시예 6-3:배반포의 할구 수의 확인
상기 실시예 6-1에서 배양된 배반포의 할구 수, 내세포괴 및 영양세포의 수, 그리고 배반포 당 내세포괴와 영양세포 수의 비율을 각각 Thomas et al.에 의한 면역화학적 염색 방법으로 확인하였다 (Thomas GA., Korfiatis NA., French AJ., Jones GM., Trounson AO. Simplified technique for differential staining of inner cell mass and trophectoderm cells of mouse and bovine blastocysts.Reproductive BioMedicine Online Webpaper149:on web 17(2001)). 먼저, 각 발달 단계의 배 및 배반포를 1% 트리톤-X와 100 g/㎖ 요오드화 프로피듐 용액에서 30초간 정치시켰다. 영양세포의 색깔이 육안 관찰시 붉은색으로 변하면서 축소되기 시작할 때, 배 및 배반포를 25 g/㎖ 비스벤즈아마이드 고정 용액에서 4 ℃에서 12시간 동안 고정시켰다. 그런 다음, 상기 배 및 배반포를 99% 글리세롤 처리하여 슬라이드 글라스에 고정한 후 관찰하였다.
상기 실험의 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.
처리 배반포의 세포 수 (평균±표준편차) 내세포괴와 영양세포의 세포 수 비율
전체 내세포괴 영양세포
무처리 123.3±1.3b 27.6±0.9b 96.4±0.8bc 0.22±0.01b
Hb (1 ㎍/㎖) 124.2±1.4b 26.6±1.0bc 97.3±0.9bc 0.21±0.01b
ME (10 μM) 131.3±1.3c 31.9±0.9d 98.4±0.9b 0.24±0.01c
Hb (1 ㎍/㎖)+ME (10 μM) 116.3±1.4d 24.8±0.9c 91.4±0.7c 0.21±0.01b
bcd동일한 변수 내에서 다른 첨자로 표시된 것은 유의적으로 다름, p<0.05
상기 표 3에 나타난 바와 같이, β-머캅토에탄올 첨가 배양한 군이 대조군에 비하여 배반포기의 총 할구 수, 내세포괴의 수 및 내세포괴와 영양세포 수의 비율이 유의적으로 높았다. 따라서, 배반포의 발달율 및 할구 수는 헤모글로빈 또는 β-머캅토에탄올과 같은 외래적 요인에 의해서 영향을 받으며, 공여핵 체세포의 체외배양 시 β-머캅토에탄올을 첨가하여 배양할 경우 복제수정란의 배반포 발달율이 향상됨을 알 수 있다.
실시예 7: 복제수정란의 체외배양시 β-머캅토에탄올 및/또는 헤모글로빈의 첨가 배양이 배발달에 미치는 영향 실험
실시예 7-1:β-머캅토에탄올 및/또는 헤모글로빈의 첨가 배양
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 체세포 복제수정란을 제조하되, 공여핵 체세포의 배양 시 상기 실시예 6에서 배 발달율을 향상시키는 것으로 나타난 β-머캅토에탄올을 첨가 배양하여 복제수정란을 제조하고, 상기 복제수정란을 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 체외배양하되, 상기 mSOF 체외배양액에 각각 헤모글로빈 1 ㎍/㎖, β-머캅토에탄올 10 μM, 그리고 헤모글로빈 1 ㎍/㎖ 및 β-머캅토에탄올 10 μM 모두를 첨가하여 2세포기, 4-8세포기, 8-16세포기, 상실배 및 배반포기까지체외배양 하였다.
실시예 7-2:아폽토시스 분석
상기 실시예 7-1에서 배양되어 각 단계까지 발달한 복제수정란의 수를 측정하였으며, 상기 실시예 4와 동일한 TUNEL 분석 방법으로 아폽토시스 분석을 수행하였다.
상기 실험의 결과는 하기 표 4 및 도 4에 나타나 있다.
처리 난자의 수 및 (%)b 발달된 복제수정란의 수 및 (%)c
처음 제공된 것 성공적으로 융합된 것 2세포기 8세포기 상실배 배반포
무처리 78 57(73) 48(84) 35(61) 19(33)d 16(28)de
Hb (1 ㎍/㎖) 131 99(75) 74(75) 59(60) 35(35)d 18(18)e
ME (10 μM) 125 95(76) 72(76) 56(59) 35(37)d 15(16)e
Hb (1 ㎍/㎖)+ME (10 μM) 134 104(77) 85(82) 66(63) 55(53)e 40(38)e
b처음 제공된 난자 수에 대한 백분율c성공적으로 융합된 난자 수에 대한 백분율de동일한 변수 내에서 다른 첨자로 표시된 것은 유의적으로 다름, p<0.05
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 체세포 배양액 내에 β-머캅토에탄올 첨가하여 배양시킨 공여핵 체세포를 이용하여 제조된 복제수정란을 배반포기까지 체외배양할 때 배양액 내에 헤모글로빈 및 β-머캅토에탄올을 동시 첨가하여 배양한 군에서 상실배와 배반포의 발달율이 유의적으로 높게 나타났다. 또한, 배반포기에서의 아폽토시스 할구 발생율은 복제수정란의 체외배양 시 β-머캅토에탄올을 단독 첨가 배양한 군과, 헤모글로빈 및 β-머캅토에탄올을 동시 첨가 배양한 군이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다 (참조: 도 4). 따라서, 복제수정란의 체외배양 시 β-머캅토에탄올 첨가 또는 헤모글로빈 및 β-머캅토에탄올을 동시 첨가하여 배양할 경우 아폽토시스 발생율을 감소시키며 복제수정란의 배 발달율을 향상시킴을 알 수 있다.
실시예 7-3:배반포의 할구 수의 확인
상기 실시예 7-1에서 배양된 배반포의 할구 수, 내세포괴 및 영양세포의 수, 그리고 배반포 당 내세포괴와 영양세포 수의 비율을 상기 실시예 6-3과 동일한 방법으로 확인하였다.
상기 실험의 결과는 하기 표 5에 나타나 있다.
처리 배반포의 세포 수 (평균±표준편차) 내세포괴와 영양세포의 세포 수 비율
전체 내세포괴 영양세포
무처리 122.7±1.3c 27.3±0.5c 98.4±1.0c 0.22±0.01c
Hb (1 ㎍/㎖) 109.0±1.3d 26.1±0.5c 82.9±0.9d 0.24±0.01cd
ME (10 μM) 141.8±1.3e 38.5±0.6d 103.3±1.0e 0.27±0.01d
Hb (1 ㎍/㎖)+ME (10 μM) 154.6±1.4f 40.6±0.6d 114.1±1.0e 0.26±0.01d
cdef동일한 변수 내에서 다른 첨자로 표시된 것은 유의적으로 다름, p<0.05
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 복제수정란의 체외배양 시 β-머캅토에탄올을 단독 첨가 배양한 군과, 헤모글로빈 및 β-머캅토에탄올을 동시 첨가 배양한 군이 대조군에 비하여 배반포기의 총 할구 수, 내세포괴의 수 및 내세포괴와 영양세포 수의 비율이 유의적으로 높았다. 따라서, 복제수정란의 배양 시 β-머캅토에탄올 또는 헤모글로빈 및 β-머캅토에탄올을 동시 첨가하여 배양할 경우 복제수정란의 배반포의 발달율이 향상됨을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 체세포 복제수정란의 대리모 이식 이전의 배발달 단계에서의 배반포 발달율 향상을 위한 체외배양 배지 조성물, 상기 체외배양 배지 조성물을 이용한 체외배양 방법 및 상기 체외배양 방법에 의한 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 체외배양 배지 조성물 및 체외배양 방법은 체세포 복제수정란의 배발달 단계에서 배아 할구의 아폽토시스 발생을 효과적으로 저하시켜 배반포 발달율을 효과적으로 향상시키며, 본 발명의 체세포 복제동물의 생산 방법은 복제수정란의 배발달율을 향상시킴으로써 건강한 산자의 생산 효율을 증진시킬 수 있다.

Claims (18)

  1. 항산화제를 포함하는 체세포 복제수정란의 제조를 위한 공여핵 체세포의 체외배양용 배지 조성물.
  2. 항산화제 및 산화질소 제거자를 포함하는 체세포 복제수정란의 체외배양용 배지 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 항산화제는 β-머캅토에탄올인 것을 특징으로 하는 체외배양용 배지 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 산화질소 제거자는 헤모글로빈인 것을 특징으로 하는 체외배양용 배지 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 β-머캅토에탄올의 농도는 1-25 μM인 것을 특징으로 하는 체외배양용 배지 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 농도는 1-10 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 체외배양용 배지 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 농도는 1-10 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 체외배양용 배지 조성물.
  8. 다음의 단계를 포함하는 체세포 복제수정란의 체외배양 방법:
    (a) 공여핵 체세포를 항산화제를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 체외배양하는 단계; (b) 상기 체외배양된 공여핵 체세포의 핵을 유전물질이 제거된 수핵난자에 이식하여 체세포 복제수정란을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 체세포 복제수정란을 체외배양용 배지 조성물에서 체외배양하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 (c) 단계는 항산화제 및 산화질소 제거자를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포 복제수정란의 체외배양 방법.
  10. 다음의 단계를 포함하는 체세포 복제동물의 생산 방법:
    (a) 수핵난자의 유전물질을 제거하는 단계; (b) 공여핵 체세포를 항산화제를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 체외배양하는 단계; (c) 상기 체외배양된 공여핵 체세포의 핵을 상기 수핵난자에 이식하는 단계; (d) 상기 핵이식된 체세포 복제수정란의 재프로그래밍 및 활성화를 유도하는 단계; (e) 상기 활성화된 체세포 복제수정란을 체외배양하여 배반포 발달을 유도하는 단계; 및 (f) 상기 배반포의 착상 및 발생을 유도하는 단계.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 (e) 단계는 항산화제 및 산화질소 제거자를 포함하는 체외배양용 배지 조성물에서 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포 복제동물의 생산 방법.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제는 β-머캅토에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 산화질소 제거자는 헤모글로빈인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 β-머캅토에탄올의 농도는 1-25 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 농도는 1-10 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 농도는 1-10 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 방법은 포유동물의 복제에 적용되는 것을 특징으로 하는 체세포 복제동물의 생산 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 포유동물은 소 또는 인간인 것을 특징으로 하는 체세포 복제동물의 생산 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113403259A (zh) * 2021-06-04 2021-09-17 华南农业大学 一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂及其应用

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