CN112931490B - 一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法 - Google Patents

一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，涉及蜜蜂精子冷冻保存技术领域。将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合平衡静置1～2h后，加入冷冻保护剂平衡静置1～1.5h，然后进行程序降温，所述程序降温包括以3.5‑4℃/min的速率从3～4℃下降到‑60℃～‑50℃，程序降温过程中，当温度降到‑13℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到‑60℃～‑50℃后再降温至液氮温度。采用本发明提供的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法进行蜜蜂精子的保存，解冻后的精子活力高，用于人工授精时，蜂王产授精卵的比例高，保护液对授精蜂王危害小，蜂王使用寿命长。

Description

一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法
技术领域
本发明涉及蜜蜂精子冷冻保存技术领域，具体而言，涉及一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法。
背景技术
蜜蜂是一种重要的经济昆虫，可以生产多种蜂产品，同时，蜜蜂也是一种生态昆虫，蜜蜂为农作物授粉产生的生态价值远远高于蜂产品的价值。
蜜蜂种质资源保护通常采用群体水平上的活体保种技术，但活体保存风险性较高，受外界因素影响较大。精子冷冻保存技术从1803年问世以来，已经在许多哺乳动物研究上取得成功，1964年Sawada和Chang首次利用7％甘油作为冷冻保护剂成功的将蜜蜂精子保存，拉开了蜜蜂精子冷冻保存的序幕。蜜蜂精子冷冻技术能够将优质蜂种的精子低温下长时间冷冻保存，最大程度地减少外界因素影响，提高蜜蜂种质资源保护的可靠性。因此，目前蜜蜂珍惜种质资源的保护除了采用群体水平上的活体保种技术以外，还采用细胞水平上的卵子和精子的低温冻存技术。蜜蜂精子冷冻技术的出现，丰富了国家级蜜蜂基因库保种技术手段，为珍惜蜜蜂种质资源保护提供技术支撑，对于蜜蜂遗传育种以及蜜蜂生物学科的发展都具有积极的意义。
蜜蜂精子冷冻保存技术发展迄今几十年，虽然取得了一定的成功，但是还存在以下问题：蜜蜂精子冷冻效果不好，冷冻结果不稳定；蜜蜂精子冷冻贮存的质量差，人工授精蜂王产受精卵的比例低；保护液对授精蜂王危害大，蜂王使用寿命短。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法以解决上述技术问题。
本发明通过优化蜜蜂精子冷冻保存技术，创新冷冻方法，对于提高蜜蜂精子冷冻保存后的精子成活力和人工授精成功率是非常有必要的。
本发明是这样实现的：
一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其包括如下步骤：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合平衡静置后，加入冷冻保护剂平衡静置，然后进行程序降温，程序降温包括以3.5～4℃/min的速率从3～4℃下降到-60℃～-50℃，程序降温过程中，当温度降到-13～-12℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到-60℃～-50℃后再降温至液氮温度。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述加入冷冻保护剂前的混合静置是指：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合，在0～4℃下静置1～2h；优选地，待保存的蜜蜂精子与稀释液混合比例为0.5-1:5。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合后，在静置前还包括混匀步骤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述混匀步骤是先将容器置于蜜蜂精液自动混匀装置低速10～30r/min混匀10～20s，然后再调中速30～60r/min混匀10～20s。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述加入冷冻保护剂静置是指：加入冷冻保护剂后，将盛有待保存蜜蜂精子的容器置于0～4℃环境温度下，使用蜜蜂精液自动混匀装置，先低速混匀30～35s，再调中速混匀30～35s，静置1～1.5h。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述“植冰”操作是指：当温度降到-13℃时，向蜜蜂精子冻存容器中滴加液氮。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述稀释液包括：0.01～0.1g/mL的柠檬酸钠、0.001～0.005g/mL的碳酸氢钠、0.0001～0.001g/mL的氯化钾和水。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述冷冻保护剂包括质量百分比为1～3％的大豆卵磷脂、质量百分比为4～10％二甲基亚砜、体积百分比为0.5～2％的过氧化酶以及溶剂，优选地，所述溶剂为水。
一种蜜蜂精子解冻方法，其特征在于，其包括将采用上述蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法保存的蜜蜂精子进行解冻后，反复离心，取沉淀物用于蜜蜂人工授精。
反复离心是指：将解冻后的蜜蜂精子在2000～4000rpm下离心1～5min，弃上清液，加入稀释液继续离心，再取沉淀用于蜜蜂人工授精。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用两步法进行静置，先将蜜蜂精子与稀释液混匀静置以降低直接添加冷冻保护剂对蜜蜂精子的毒害作用，然后再与冷冻保护剂混匀静置。通过两步静置既起到了冷冻保护剂对精子的保护作用，又降低了冷冻保护剂对精子的损伤。同时，本发明还提供了一种新的程序降温步骤，采用该程序降温步骤有利于保持长期保存和短期保存蜜蜂精子具有较高的活力。采用本发明提供的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法进行蜜蜂精子的保存，可以提高蜜蜂精子冷冻效果，增强冷冻结果稳定性；大大提高授精蜂王产受精卵的比例；降低保护液对蜂王的危害，授精蜂王使用寿命显著延长。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其包括如下步骤：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合静置后，加入冷冻保护剂静置，然后进行程序降温，程序降温包括以3.5～4℃/min的速率从3～4℃下降到-60℃～-50℃，程序降温过程中，当温度降到-13～-12℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到-60℃～-50℃后再降温至液氮温度。
发明人发现，现有的冷冻保护剂直接与蜜蜂精子混合降温静置，这样存在保护剂对精子的毒害问题。冷冻保护剂若采用一步法，随稀释液直接与蜜蜂精液混匀，并降温静置，此过程中精子与冷冻保护剂直接接触时间过长，冷冻保护剂本身的毒害对蜜蜂精子的活力有不利影响，导致冷冻效果不佳。
本发明通过改进蜜蜂精子、稀释液和冷冻保护剂的静置顺序，可以有效减少冷冻保护剂对于蜜蜂精子的毒害，提升蜜蜂精子的活力，有助于提升冷冻效果。
此外，现有的精子冷冻方法对技术人员的操作要求极高，操作难度大。冻存时需要将保存管放置在距离液氮液面上方2～3cm处快速降温，达到降温速率-140℃/min。然而液氮罐内的液氮液面难以观察(液氮的快速气化致使液面被气体覆盖，肉眼观察液面极为模糊)，所以液氮液面上方的2～3cm距离实难控制，降温速率也存在控制难度高，导致精子冷冻活力不稳定。
针对现有存在的技术问题，本发明提供了一种新的冻存方法，该方法操作难度小，对于技术人员的要求低，有利于推广应用。借助程序降温可同时满足蜜蜂精子长期冻存和短期冻存的需求。
在一种实施方式中，上述的程序降温可选自如下的降温步骤：以4℃/min的速率从4℃下降到-60℃，程序降温过程中，当温度降到-13℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到-60℃后再降温至液氮温度。
在一种实施方式中，上述的程序降温可选自如下的降温步骤：以4℃/min的速率从4℃下降到-55℃，程序降温过程中，当温度降到-13℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到-55℃后再降温至液氮温度。
在一种实施方式中，上述的程序降温可选自如下的降温步骤：以4℃/min的速率从3℃下降到-51℃，程序降温过程中，当温度降到-13℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到-51℃后再降温至液氮温度。
需要说明的是，上述的程序降温仅为本发明列举的几种降温步骤，在实际应用中并不限于上述列举的几种降温场景。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述加入冷冻保护剂前的混合静置是指：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合，在0-4℃下静置1～2h；优选地，待保存的蜜蜂精子与稀释液混合比例为0.5-1:5。
通过低温静置以使得蜜蜂精子与稀释液尽可能的分散均匀。需要说明的是，上述静置是在低温下进行，通过低温以减缓精子的失活速度。在其他实施方式中，上述低温的环境温度也可根据需要进行自适应调整，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、3.5℃或4℃。
静置的时间也可以是1h，1.5h，1.6h，1.8h或2h。在其他实施方式中，上述静置的时间也可根据需要进行自适应调节，并不限于上述的静置时间范围内。
待保存的蜜蜂精子与稀释液混合比例为0.5-1:5时，保存效果更优，在其他实施方式中，二者的混合比例也可适当将稀释液的添加量扩大。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合后，在静置前还包括混匀步骤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述混匀步骤是先将容器置于蜜蜂精液自动混匀装置低速10～30r/min混匀10～20s，然后再调中速30～60r/min混匀10～20s。
现有技术中精子与保存液混匀时采用纯手工操作，精子容易受到损伤和污染。而采用手动器械(半自动式搅拌)搅拌混匀，又会存在搅拌转速控制难，搅拌速度过快容易产生气泡从而对精子造成损伤，而搅拌混匀不充分又容易影响保护液的效用，此外器械的灭菌不彻底也容易造成污染，影响精子冷冻存活率。
本发明在精液与稀释液、保护剂混合时，采用蜜蜂精液自动混匀装置(专利号ZL201810938924.4)，既减少了对蜜蜂精子的损伤，又能将蜜蜂精液混合得更加均匀。采用蜜蜂精液自动混匀装置有助于提高混合效率，减少外界的感染。
在其他实施方式中，也可以根据需要其他的自动搅拌器械实现上述精液与稀释液、保护剂混合，并不限于本申请中限定的蜜蜂精液自动混匀装置。先低速搅拌以使得稀释液和冻干保护液与精子有一定的接触面后再以中速进行搅拌，防止最初以较高的速度搅拌造成精子的损伤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述加入冷冻保护剂静置是指：加入冷冻保护剂后，将盛有待保存蜜蜂精子的容器置于0～4℃环境温度下，使用蜜蜂精液自动混匀装置，先低速混匀30～35s，再调中速混匀30～35s，静置1～1.5h。
在上述搅拌条件下，有助于冷冻保护剂更充分地与蜜蜂精子接触。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述“植冰”操作是指：当温度降到-13℃时，向蜜蜂精子冻存容器中滴加液氮。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述稀释液包括：0.01～0.1g/mL的柠檬酸钠、0.001～0.005g/mL的碳酸氢钠、0.0001～0.001g/mL的氯化钾和水。柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾主要起到调整稀释液的pH值的作用，蜜蜂精液pH为7.2，受精囊pH为9.0，精子可以在pH4.3-9.0的稀释剂中存活，当稀释剂pH大于7时更适合精子存活。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述冷冻保护剂包括质量百分比为1～3％的大豆卵磷脂、质量百分比为4～10％二甲基亚砜、体积百分比为0.5～2％的过氧化酶以及溶剂，优选地，溶剂为水。在其他实施方式中，上述溶剂也可根据需要进行自适应调整。
大豆卵磷脂含有丰富的不饱和脂肪酸、磷脂等脂类物质，能够降低过氧化物的生成，增强精子质膜的功能完整性。二甲基亚砜是一种快速渗透的蜜蜂精液冷冻保护剂，分子量较低，能够快速进行渗透，使精子快速脱水减少细胞内结冰。过氧化酶帮助蜜蜂精子细胞膜抵抗过氧化反应，防止或阻断氧化应激反应对精子造成损伤，提高精子抗低温打击能力。
在一种实施方式中，上述大豆卵磷脂可替换为卵黄。
一种蜜蜂精子解冻方法，其特征在于，其包括将采用上述蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法保存的蜜蜂精子进行解冻后，反复离心，取沉淀物用于蜜蜂人工授精。
反复离心是指：将解冻后的蜜蜂精子在2000～4000rpm下离心1～5min，弃上清液，加入稀释液继续离心，再取沉淀用于蜜蜂人工授精。
通过上述离心和加入稀释液的操作，有利于提升蜂王产受精卵比例，降低冷冻保护剂对授精后的蜂王毒害，使得蜂王使用寿命延长。
需要说明的是，在实际应用中，也可以根据需要选择离心3次、4次或4次以上。
解冻可采用35～40℃水浴10～60s的方式进行。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法。
在冷冻保存前，进行精子稀释液和冷冻保护剂的制备以及精液的采集。
具体地，精子稀释液制备包括：用电子分析天平准确称柠檬酸钠(2.430g)、碳酸氢钠(0.210g)、氯化钾(0.040g)，溶解于40mL超纯水中，充分搅拌，配置成50mL精子稀释液，在110℃下高压灭菌，冷却后放入4℃冰箱中临时存放。
精子冷冻保护剂制备包括：取大豆卵磷脂0.1g、二甲基亚砜2.5ml，将二者溶解于超纯水中，充分搅拌均匀后，配置成50mL基础液，然后在110℃下高压灭菌，冷却，加入过氧化酶(400ul)(购自生工生物工程股份有限公司)放入4℃冰箱中临时存放。
精液的采集包括：利用人工授精用雄蜂捕捉机构及雄蜂捕捉装置(专利号CN201810721544.5)收集成熟雄蜂。用左手拇指和食指从腹面捉住胸、腹部两侧，用右手拇指按压雄蜂的腹部背板1节～3节处，在体视显微镜下，直接用进样器逐只采集雄蜂精液。采集的精液放在12～14℃条件下短时间存放。
蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法包括：
首先进行蜜蜂精子冷冻前的平衡静置，采用两步平衡静置法。
第一步，蜜蜂精子与精子稀释液的平衡静置。按照稀释液和蜜蜂精液5：1的体积比例配制，然后放入到蜜蜂精液自动混匀装置(专利号ZL 201810938924.4)，先调至低速混匀20s，再调至中速混匀20s。把蜜蜂精子与稀释液混合物放置4℃环境静置1.5h。
第二步，加入上述的冷冻保护剂后的平衡静置步骤。加入稀释液体积10％的冷冻保护剂后在4℃环境中，使用蜜蜂精液自动混匀装置，先调至20r/min混匀30s，再调至50r/min混匀30s。继续放置4℃环境静置1h。
然后进行程序降温：将经过两步法静置的蜜蜂精子放入程序降温仪中，从4℃以3.5℃/min下降到-60℃；直接投入到液氮中。期间在-13℃时，对蜜蜂精子冷冻容器滴入一滴液氮，使蜜蜂精子快速冷冻。当温度下降到-60℃后再直接降温到液氮温度，并进行冷冻保存。
本实施例还提供了蜜蜂精子的解冻方法：
将装有待解冻的蜜蜂精子的容器从液氮取出，放入37℃水浴锅中20s，期间搅拌容器加速蜜蜂精子的解冻。蜜蜂精子解冻后，转移至离心管，放入离心机以3000rpm离心2min，弃上清液，加入稀释液混匀后，再进行3000rpm离心1min，再弃上清液，加入稀释液(上述制备的稀释液)混匀后用于蜜蜂人工授精。这种解冻方法可以提升蜂王产受精卵比例，且冷冻保护剂对授精后的蜂王毒害小，蜂王使用寿命长。
实施例2
本实施例提供了一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法。
首先进行蜜蜂精子冷冻前的静置，采用两步平衡静置法。
第一步，蜜蜂精子与精子稀释液的平衡静置。按照稀释液和蜜蜂精液5：0.5的体积比例配制，然后放入到蜜蜂精液自动混匀装置(专利号ZL 201810938924.4)，先调至低速混匀10s，再调至中速混匀10s。把蜜蜂精子与稀释液混合物放置4℃环境静置2h。
第二步，加入上述的冷冻保护剂后的平衡静置步骤。加入稀释液体积10％的冷冻保护剂后在4℃环境中，使用蜜蜂精液自动混匀装置，先调至低速混匀30s，再调至中速混匀30s。继续放置4℃环境静置1.5h。
然后进行程序降温：将经过两步法静置的蜜蜂精子放入程序降温仪中，从4℃以4℃/min下降到-60℃；直接投入到液氮中。期间在-13℃时，对蜜蜂精子冷冻容器滴入一滴液氮，使蜜蜂精子快速冷冻。当温度下降到-60℃后再直接降温到液氮温度，并进行冷冻保存。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于，降温程序步骤，其他的步骤相同。
先用程序冷冻仪冷冻，其程序是：
将经过两步法静置的蜜蜂精子放入程序降温仪中，从4℃以4℃/min下降到-52℃；直接投入到液氮中。期间在-13℃时，对蜜蜂精子冷冻容器滴入一滴液氮，使蜜蜂精子快速冷冻。当温度下降到-52℃后再直接降温到液氮温度，并进行冷冻保存。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于，静置步骤，其他的步骤相同。
首先进行蜜蜂精子冷冻前的静置，采用一步静置法。
蜜蜂精子与精子稀释液、冷冻保护液的静置。按照稀释液和蜜蜂精液5：1的体积比例配制，加入与实施例1等体积的冷冻保护剂，然后放入到蜜蜂精液自动混匀装置(专利号ZL 201810938924.4)，先调至低速混匀20s，再调至中速混匀20s。把混合物放置4℃环境静置1.5h。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于，降温程序步骤，其他的步骤相同。
先用程序冷冻仪冷冻，其程序是：
按照3℃/min降温的速度，从5℃降温至-6℃。然后将保存管迅速从冷冻仪中取出，放置在离液氮液上方2～3cm处快速降温，其降温速率是-140℃/min，然后迅速投入到液氮中冷冻保存。
实验例1
将精液冷冻后，放入37℃水浴锅中20s，期间通过搅拌容器以加速蜜蜂精子的解冻，观测活力。
4级表明精子活力极好，呈快速直线向前运动；3级表明精子活力好，精子向前运动；2级精子活力一般，向前曲线运动；1级精子活力差，只在原地蠕动；0级精子不能活动。
采用不同方法(实施例1，对比例1以及对比例2和现有专利CN 105145546B的冻存方法)冷冻保存蜜蜂精子，解冻后在400倍显微镜下观察精子活力，结果见表1。结果表明采用本申请实施例1提供的程序化冷冻方法冷冻蜜蜂精子，无论长期保存还是短期保存，蜜蜂精子都能保存较高的活力。
表1不同冷冻方法精子活力对比
Figure BDA0003005920230000121
Figure BDA0003005920230000131
实验例2
进行人工授精前对冷冻精子的处理。蜜蜂精子冷冻解冻后，直接使用冷冻后的蜜蜂精子进行人工授精，其中冷冻保护剂对蜂王的毒害作用较大，会导致蜂王存活率低。
本实验例对解冻后的蜜蜂精子进行处理，具体处理步骤蜜蜂精子解冻后，转移至离心管，放入离心机以3000rpm离心2min，弃上清液，加入稀释液混匀后，再进行3000rpm离心1min，再弃上清液，加入稀释液(上述制备的稀释液)混匀后用于蜜蜂人工授精。
使用不同方法冷冻蜜蜂精子后，对处女蜂王进行人工授精，吉林省养蜂科学研究所育种场培育的处女蜂王，观察蜂王3天内的存活情况，并记录存活的蜂王所产健康工蜂的比例，见表2。
实验结果表明：使用程序化冷冻方法冷冻蜜蜂精子，蜂王的存活率和产健康工蜂的比例都有明显地提高。
表2不同冷冻方法人工授精
Figure BDA0003005920230000132
Figure BDA0003005920230000141
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合平衡静置1～2h后，加入冷冻保护剂平衡静置1h，然后进行程序降温，所述程序降温包括以3.5～4℃/min的速率从3～4℃下降到-60℃～-50℃，程序降温过程中，当温度降到-13～-12℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到-60℃～-50℃后再降温至液氮温度；待保存的蜜蜂精子与稀释液混合体积比例为0.5-1:5；
加入所述冷冻保护剂前的混合静置是指：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合，在0～4℃下平衡静置1～2h；
所述加入冷冻保护剂静置是指：加入冷冻保护剂后，将盛有待保存蜜蜂精子的容器置于0～4℃环境温度下，使用蜜蜂精液自动混匀装置，先低速10～30r/min混匀30～35s，再调中速30～60r/min混匀30～35s，静置1～1.5h；
所述稀释液包括：0.01～0.1g/mL的柠檬酸钠、0.001～0.005g/mL的碳酸氢钠、0.0001～0.001g/mL的氯化钾和水；
所述冷冻保护剂包括质量百分比为1％～3％的大豆卵磷脂、质量百分比为4％～10％二甲基亚砜、体积百分比为0.5％～2％的过氧化酶以及溶剂。
2.根据权利要求1所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合后，在静置前还包括混匀步骤。
3.根据权利要求2所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述混匀步骤是先将容器置于蜜蜂精液自动混匀装置低速10～30r/min混匀10～20s，然后再调中速30～60r/min混匀10～20s。
4.根据权利要求1所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述“植冰”操作是指：当温度降到-13℃时，向蜜蜂精子冻存容器中滴加液氮。
5.根据权利要求1所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述冷冻保护剂中的溶剂为水。
6.一种蜜蜂精子解冻方法，其特征在于，其包括将采用权利要求1-5任一项所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法保存的蜜蜂精子进行解冻后，反复离心，取沉淀物用于蜜蜂人工授精；所述反复离心是指：将解冻后的蜜蜂精子在2000～4000rpm下离心1～5min，弃上清液，加入所述稀释液继续离心，再取沉淀用于蜜蜂人工授精。
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