CN114903032A - 东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种东佛里生奶绵羊冷冻精液的制备方法，包括精液的稀释和冷冻。本发明的的东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法能够有效保护奶绵羊精液冷冻、解冻过程中精子的生理机能，从而延长精子存活时间，达到受精受胎的目的。
Description
技术领域
本发明属于绵羊冷冻精液技术领域，特别涉及一种适用于东佛里生奶绵羊精液冷冻的稀释液配方和冷冻程序。
背景技术
精液冷冻保存技术可以打破时间和空间的障碍长期保存精液，提高优良种公羊的利用率，加快品种改良的进程，是人工授精技术的关键环节之一。近几年，国内家畜精液冷冻保存的硬件水平得到质的提升。继牛之后，猪冷冻精液也开始步入商业化生产进程。
在研究过程中，由于羊精子，特别是绵羊精子的特异性及其在冷冻和解冻过程中，很多问题和影响因素尚未研究清楚，目前在绵羊精液冷冻试验中，大多数冷冻精液解冻后总活率不能稳定在50％以上。故至今使用冻精配种的情期受胎母羊率仍处在30-50％的水平，而且还很不稳定，绵羊冷冻精液距离实现商业化生产、销售还有一定差距。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了提高绵羊冷冻精液解冻后活力以及存活时间，提升绵羊冷冻精液品质，本申请发明人在超低温情况下，绵羊精子在超微结构、生理生化等方面的变化、活性物质损失、以及在生物学上和功能上的损伤等方面潜心研究，终于发现大多数冷冻精液解冻后总活率不能稳定在50％以上是因为绵羊精子质膜中不饱和脂肪酸含量很高，胆固醇含量较低，使得绵羊精子在低温和冷冻过程中更容易遭受结构损伤，因此本申请设计一种东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法能够有效保护奶绵羊精液冷冻、解冻过程中精子的生理机能，从而延长精子存活时间，达到受精受胎的目的。
(二)技术内容
本发明提供了一种东佛里生奶绵羊冷冻精液的制备方法，该技术原理是利用含有葡萄糖、乳糖、柠檬酸钠、卵黄、甘油、青霉素和链霉素的精液冷冻稀释液对精液进行稀释，在为精子提供能量的同时保护东佛里生奶绵羊精子结构；同时利用5℃～-10℃内-5℃/min， -10℃～-100℃内-40℃/min，-100℃～-140℃内-20℃/min的降温程序进行冷冻，减少冰晶的形成，从而降低冷冻解冻过程对东佛里生奶绵羊精子造成的损伤，提高解冻后精子活力和延长精子存活时间，达到受精受胎的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)精液冷冻稀释液的配制：
将葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，柠檬酸钠1.5g，加85mL超纯水溶解，调节pH至7，用0.22μm滤器过滤；加入青霉素、链霉素各5万单位和15mL卵黄，得到Ⅰ液，放至 38℃水浴锅中保存备用；
取配制好的Ⅰ液，加入6％甘油，调节pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存备用。
(2)精液检查
①外观评定
1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的无菌离心管中观察；
2)色泽：东佛里生奶绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；
3)云雾运动：用肉眼观察新采集的东佛里生奶绵羊公羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动似云雾状；精子密度越大，活力越强，其云雾状越明显。
②活力检测
用移液器从1)的离心管中取适量精液滴在载玻片上，压片后至于显微镜下镜检，活率≥80％即可进行冷冻；
(3)精液稀释
①Ⅰ液稀释：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀释至精子终浓度计算所需体积的一半，每次添加后轻轻摇匀，用18层纱布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；
②Ⅱ液稀释：在4℃环境中按照1：1缓慢加入Ⅱ液，摇匀后放入4℃中继续平衡1.5-2h。
(4)封装和冷冻保存
精液摇匀，按每支250μL，500万精子装管，装好后摆放至冷冻搓板上，然后放入程序冷冻仪中，按照5℃～-10℃内-5℃/min，-10℃～-100℃内-40℃/min，-100℃～-140℃内-20℃/min的降温程序进行冷冻，最后将冻精投入液氮中保存。
本发明的有益效果是：利用含有葡萄糖、乳糖、柠檬酸钠、卵黄、甘油、青霉素和链霉素的精液冷冻稀释液和5℃～-10℃内-5℃/min，-10℃～-100℃内-40℃/min，-100℃～-140℃内-20℃/min的降温程序对东佛里生奶绵羊精液进行冷冻，能够有效为精子提供能量并降低东佛里生奶绵羊精子结构损伤，提高解冻后精子活力和延长精子存活时间，达到受精受胎的目的。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
目前对于绵羊精液冷冻的研究主要从稀释液配方的配制和冷冻程序展开。
在稀释液配方的研究中发现，冷冻保护剂在精液冷冻过程中起非常重要的作用。对于冷冻保护剂的研究目前存在不同观点，常见的冷冻保护剂依然以甘油为主，但是也有研究表明甘油使用会对精子产生毒害作用，而用乙二醇替代甘油作为冷冻保护剂的效果更好。由于不同物种间差异较大，选择最适合东佛里生奶绵羊精液的冷冻保护剂是非常必要的。
在冷冻程序的设计上，由冷冻温度和降温速度构成的冷冻程序是影响精子冻后质量的另一个重要因素。当冷冻温度降至-10～-100℃时，精子细胞内易形成冰晶，从而导致精子细胞结构受损，而冷冻速度过快或过慢都会对精子造成损伤，严重降低精细胞生存率。因此，设计冷冻程序让东佛里生奶绵羊精子安全的度过危险温区非常重要。
为了说明上述东佛里生奶绵羊冷冻精液的制备方法对东佛里生奶绵羊精液的冷冻保存效果，发明人对精子的运动参数进行了检测。随机取10支制作好的冻精细管放入38℃水浴锅中解冻30秒，然后借助计算机辅助精液分析仪(CASA)(Hamilton Thorne，美国)检测精子运动性能及形态正常率。精子畸形率＝1-形态正常率。每组中使用的冷冻保护剂以及冷冻程序均不同。同时，为进一步说明说明上述东佛里生奶绵羊冷冻精液的制备方法对东佛里生奶绵羊精液的冷冻保存效果，特与各对比例的效果加以对比。
实施例1：本实施例提供一种含有葡萄糖、乳糖、柠檬酸钠、卵黄、甘油、青霉素和链霉素的精液冷冻稀释液进行稀释的东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法，它包括以下步骤：
(1)精液冷冻稀释液的配制：
将葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，柠檬酸钠1.5g，加85mL超纯水溶解，调节pH至7，用 0.22μm滤器过滤；加入青霉素、链霉素各5万单位和15mL卵黄，得到Ⅰ液，放至38℃水浴锅中保存备用；
取配制好的Ⅰ液，加入6％甘油，调节pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存备用。
(2)精液检查
①外观评定
1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的无菌离心管中观察；
2)色泽：东佛里生奶绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；
3)云雾运动：用肉眼观察新采集的东佛里生奶绵羊公羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动似云雾状；精子密度越大，活力越强，其云雾状越明显。
②活力检测
用移液器从1)的离心管中取适量精液滴在载玻片上，压片后至于显微镜下镜检，活率≥ 80％即可进行冷冻；
(3)精液稀释
①Ⅰ液稀释：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀释至精子终浓度计算所需体积的一半，每次添加后轻轻摇匀，用18层纱布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；
②Ⅱ液稀释：在4℃环境中按照1：1缓慢加入Ⅱ液，摇匀后放入4℃中继续平衡1.5-2h。
(4)封装和冷冻保存
精液摇匀，按每支250μL，500万精子装管，装好后摆放至冷冻搓板上，然后放入程序冷冻仪中，按照5℃～-10℃内-5℃/min，-10℃～-100℃内-40℃/min，-100℃～-140℃内-20℃/min的降温程序进行冷冻，最后将冻精投入液氮中保存。
对比例1：本对比例提供一种含有葡萄糖、乳糖、柠檬酸钠、卵黄、乙二醇、青霉素和链霉素的精液冷冻稀释液进行稀释的东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法，它包括以下步骤：
(1)精液冷冻稀释液的配制：
将葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，柠檬酸钠1.5g，加85mL超纯水溶解，调节pH至7，用 0.22μm滤器过滤；加入青霉素、链霉素各5万单位和15mL卵黄，得到Ⅰ液，放至38℃水浴锅中保存备用；
取配制好的Ⅰ液，加入5％乙二醇，调节pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存备用。
(2)精液检查
①外观评定
1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的无菌离心管中观察；
2)色泽：东佛里生奶绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；
3)云雾运动：用肉眼观察新采集的东佛里生奶绵羊公羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动似云雾状；精子密度越大，活力越强，其云雾状越明显。
②活力检测
用移液器从1)的离心管中取适量精液滴在载玻片上，压片后至于显微镜下镜检，活率≥ 80％即可进行冷冻；
(3)精液稀释
①Ⅰ液稀释：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀释至精子终浓度计算所需体积的一半，每次添加后轻轻摇匀，用18层纱布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；
②Ⅱ液稀释：在4℃环境中按照1：1缓慢加入Ⅱ液，摇匀后放入4℃中继续平衡1.5-2h。
(4)封装和冷冻保存
精液摇匀，按每支250μL，500万精子装管，装好后摆放至冷冻搓板上，然后放入程序冷冻仪中，按照5℃～-10℃内-5℃/min，-10℃～-100℃内-40℃/min，-100℃～-140℃内-20℃/min的降温程序进行冷冻，最后将冻精投入液氮中保存。
东佛里生奶绵羊精子运动参数
结论：使用添加甘油的冷冻稀释液制作的东佛里生奶绵羊冷冻精液，解冻后精子活率及各项运动参数明显提升，畸形率也明显下降。
实施例2：本实施例提供一种-10～-100℃温区内以-40℃/min的降温程序进行降温的东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法，它包括以下步骤：
(1)精液冷冻稀释液的配制：
将葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，柠檬酸钠1.5g，加85mL超纯水溶解，调节pH至7，用 0.22μm滤器过滤；加入青霉素、链霉素各5万单位和15mL卵黄，得到Ⅰ液，放至38℃水浴锅中保存备用；
取配制好的Ⅰ液，加入6％甘油，调节pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存备用。
(2)精液检查
①外观评定
1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的无菌离心管中观察；
2)色泽：东佛里生奶绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；
3)云雾运动：用肉眼观察新采集的东佛里生奶绵羊公羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动似云雾状；精子密度越大，活力越强，其云雾状越明显。
②活力检测
用移液器从1)的离心管中取适量精液滴在载玻片上，压片后至于显微镜下镜检，活率≥80％即可进行冷冻；
(3)精液稀释
①Ⅰ液稀释：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀释至精子终浓度计算所需体积的一半，每次添加后轻轻摇匀，用18层纱布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；
②Ⅱ液稀释：在4℃环境中按照1：1缓慢加入Ⅱ液，摇匀后放入4℃中继续平衡1.5-2h。
(4)封装和冷冻保存
精液摇匀，按每支250μL，500万精子装管，装好后摆放至冷冻搓板上，然后放入程序冷冻仪中，按照5℃～-10℃内-5℃/min，-10℃～-100℃内-40℃/min，-100℃～-140℃内-20℃/min的降温程序进行冷冻，最后将冻精投入液氮中保存。
(5)取制作好的冻精细管放入38℃水浴锅中解冻30秒，然后借助计算机辅助精液分析仪 (CASA)(Hamilton Thorne，美国)检测精子运动性能及形态正常率。精子畸形率＝1-形态正常率。
对比例2：本实施例提供一种-10～-100℃温区内以-30℃/min的降温程序进行降温的东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法，它包括以下步骤：
(1)精液冷冻稀释液的配制：
将葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，柠檬酸钠1.5g，加85mL超纯水溶解，调节pH至7，用 0.22μm滤器过滤；加入青霉素、链霉素各5万单位和15mL卵黄，得到Ⅰ液，放至38℃水浴锅中保存备用；
取配制好的Ⅰ液，加入6％甘油，调节pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存备用。
(2)精液检查
①外观评定
1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的无菌离心管中观察；
2)色泽：东佛里生奶绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；
3)云雾运动：用肉眼观察新采集的东佛里生奶绵羊公羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动似云雾状；精子密度越大，活力越强，其云雾状越明显。
②活力检测
用移液器从1)的离心管中取适量精液滴在载玻片上，压片后至于显微镜下镜检，活率≥ 80％即可进行冷冻；
(3)精液稀释
①Ⅰ液稀释：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀释至精子终浓度计算所需体积的一半，每次添加后轻轻摇匀，用18层纱布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；
②Ⅱ液稀释：在4℃环境中按照1：1缓慢加入Ⅱ液，摇匀后放入4℃中继续平衡1.5-2h。
(4)封装和冷冻保存
精液摇匀，按每支250μL，500万精子装管，装好后摆放至冷冻搓板上，然后放入程序冷冻仪中，按照5℃～-10℃内-5℃/min，-10℃～-100℃内-30℃/min，-100℃～-140℃内-20℃/min的降温程序进行冷冻，最后将冻精投入液氮中保存。
(5)取制作好的冻精细管放入38℃水浴锅中解冻30秒，然后借助计算机辅助精液分析仪 (CASA)(Hamilton Thorne，美国)检测精子运动性能及形态正常率。精子畸形率＝1-形态正常率。
东佛里生奶绵羊精子运动参数
结论：使用-10～-100℃温区内以-40℃/min的降温程序进行降温制作的东佛里生奶绵羊冷冻精液，解冻后精子活率及各项运动参数明显提升，畸形率也明显下降。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)精液冷冻稀释液的配制：
将葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，柠檬酸钠1.5g，加85mL超纯水溶解，调节pH至7，用0.22μm滤器过滤；加入青霉素、链霉素各5万单位和15mL卵黄，得到Ⅰ液，放至38℃水浴锅中保存备用；
取配制好的Ⅰ液，加入6％甘油，调节pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存备用。
(2)精液检查
①外观评定
1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的无菌离心管中观察；
2)色泽：东佛里生奶绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；
3)云雾运动：用肉眼观察新采集的东佛里生奶绵羊公羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动似云雾状；精子密度越大，活力越强，其云雾状越明显，
②活力检测
用移液器从1)的离心管中取适量精液滴在载玻片上，压片后至于显微镜下镜检，活率≥80％即可进行冷冻；
(3)精液稀释
①Ⅰ液稀释：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀释至精子终浓度计算所需体积的一半，每次添加后轻轻摇匀，用18层纱布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；
②Ⅱ液稀释：在4℃环境中按照1：1缓慢加入Ⅱ液，摇匀后放入4℃中继续平衡1.5-2h；
(4)封装和冷冻保存
精液摇匀，按每支250μL，500万精子装管，装好后摆放至冷冻搓板上，然后放入程序冷冻仪中，按照5℃～-10℃内-5℃/min，-10℃～-100℃内-40℃/min，-100℃～-140℃
内-20℃/min的降温程序进行冷冻，最后将冻精投入液氮中保存。
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| CN116138248A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-05-23 | 西北农林科技大学 | 一种奶绵羊精液冷冻保存用稀释液的制备方法及其应用 |
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