CN113016779B - 一种奶绵羊精液冷冻保存方法及其稀释液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种奶绵羊精液冷冻保存方法及其稀释液，本发明的稀释液通过调整特定的配方用量，利用该稀释液对奶绵羊精液进行冷冻保存，解冻精子平均活率达到63.69％，解冻精子平均顶体完整率达到60.75％，解冻精子平均畸形率为14.27％，解冻精子平均质膜完整率达到46.97％，解冻精子子宫角输精情期受胎率达88.89％。表明采用本发明的稀释液得到的奶绵羊冻精在解冻后活率、顶体完整性、畸形率、质膜完整率、情期受胎率等重要指标方面均有保证，对于奶绵羊人工输精等生产应用具有重大价值。

Description

一种奶绵羊精液冷冻保存方法及其稀释液
技术领域
本发明涉及动物养殖技术领域，更具体地，涉及一种奶绵羊精液冷冻保存方法及其稀释液。
背景技术
在动物繁殖育种领域，人工输精是一种高效利用良种公畜繁殖性能的技术。与自然交配相比，人工输精技术的精液利用率更高，可以实现母畜批量化授精。人工输精可以使用鲜精和冻精。与鲜精相比，冷冻精液能够延长精液贮存时间，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，充分发挥优良种公畜的遗传潜力。同时冷冻精液也是建立动物精液基因库不可缺少的手段，特别是对稀有动物和濒危动物的保种具有重要的意义。
绵羊精液冷冻研究始于1937年，Bernstein等人用含9.2％甘油的稀释液将绵羊、兔、牛和猪等动物的精液保存于-20℃。近几十年来，通过对不同稀释液基础液(柠檬酸盐基、奶、乳糖基、蔗糖基、棉子糖基和Tris基等)、冷冻保护载体(甘油、乙二醇、DMSO、卵黄、大豆卵磷脂)、稀释液添加剂(抗氧化物质、精浆成分、单糖和二糖、脂肪酸)、稀释和平衡方法(一步稀释法、两步稀释法、不同平衡方式等)、冷冻形式(颗粒冻精、细管冻精)、冷冻方法(液氮熏蒸、程序化冷冻仪)和解冻方法的不断研究，绵羊冻精技术取得了长足进步。尽管如此，目前也仅有40～60％的精子在冻后仍能保留运动能力，其中只有20～30％的精子仍具备生物学功能。
绵羊奶的营养价值很高，可作为高端乳制品和保健品的原料，市场前景广阔。然而，我国历史上并无专门的乳用绵羊品种。目前的发展策略是从国外引进优良奶绵羊后与当地品种杂交，形成能够适应当地气候环境的高产奶绵羊品种。在此过程中人工输精和冷冻精液技术显得尤为重要。戴瑞奶绵羊是由新西兰引进的新品种奶绵羊，其产奶性能、产肉性能显著优于本地羊。在饲养过程中我们发现该品种抗病性能较差，较易发肺部疾病和关节炎，而健康状况对精液质量的影响不容忽略，因此适龄期的戴瑞奶绵羊精液质量较本地品种要差，适用于当地羊的冷冻精液稀释液并不完全适用于戴瑞奶绵羊。为使其快速扩繁，对其进行冻精研制显得尤为必要。
由于绵羊精子本身对温度特别敏感，精液在进行程序化冷冻过程中极易受到低温损伤，导致精子不能安全通过危险温区，使冻后活力下降以及解冻后精子的复苏率降低，进而造成人工授精后的妊娠率降低，严重阻碍了绵羊冷冻精液的推广应用，制约着优质绵羊品种的改良和育种进度。公开号为CN111226907A的中国发明专利提供了一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，但其针对的是当地品种羊，基于奶绵羊精液与本地羊敏感性的差异，且该稀释液是常温保存的稀释液，无法应用于奶绵羊精液的冷冻保存。因此，研发出适用于奶绵羊的精液冷冻技术具有相当的必要性。
发明内容
本发明旨在提供一种特定针对奶绵羊精液冷冻保存的稀释液及其保存方法，利用本发明提供的稀释液对奶绵羊精液进行冷冻保存，解冻精子成活率达到63.97％，解冻精子顶体完整率达到57.37％，解冻精子质膜完整率达到39.52％。表明采用本发明的稀释液得到的奶绵羊冻精在解冻后活率、顶体完整性、质膜完整性和畸形率等重要指标方面均有保证，对于奶绵羊人工输精等生产应用具有重大价值。
本发明的首要目的是提供一种奶绵羊精液冷冻保存稀释液。
本发明的另一目的是提供一种利用上述稀释液对奶绵羊精液冷冻保存的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种奶绵羊精液冷冻保存稀释液，所述稀释液包括A液和B液，A液配方为：每100mL蒸馏水中含Tris 2.66～2.76g、柠檬酸0.9～1.9g、糖0.5～1.5g、M199 1.5～2.5mL、大豆卵磷脂0.5～1.5g、白藜芦醇7.28～21.83mg、青霉素10 000～150000IU、链霉素9～11mg；
B液由体积比为8.8～9.2：0.8～1.2的A液和甘油组成。
本发明上述奶绵羊精液冷冻保存稀释液中，Tris(三羟甲基氨基甲烷)、柠檬酸和糖作为缓冲剂，在精液稀释时共同调解其渗透压，渗透压对精子有很大的影响，精子与周围的环境基本是等渗的，如果精清部分的盐类物质浓度过高，则会导致精子脱水，反之，会导致精子膨胀，造成精子运动变慢，甚至死亡。冷冻保存会影响精子的渗透耐受性和细胞内离子浓度，所以良好的渗透压物质能平衡精子内外渗透压，以保护精子的正常形态。糖类物质不但可以调节精液的渗透压，还可以为精子提供能源物质，使其保持活力。柠檬酸不但可以调节精液的渗透压，稳定精液的pH值，还可以为精子提供能量和营养剂。Tris对精子毒性低，具有良好的缓冲性、利尿性和渗透性。
卵黄自身的磷脂，特别是卵磷脂对冷冻过程中的精子起到保护作用。卵磷脂是构成生物膜的重要成分，可形成磷脂双分子结构，能够修复损伤的细胞膜，卵磷脂具有一定的抗氧化作用，能够修复因氧化作用引起的生物膜结构损伤，来防止生物膜因损伤而造成的硬化。卵磷脂具有的亲水基团，能够与精子里的水分子结合减少冷冻过程中精子内水分子玻璃化对精子造成的机械损伤。卵磷脂还能促进脂蛋白的合成，修复线粒体功能，改善细胞代谢。植物性大豆卵磷脂(Soybean Lecithin，SBL)已经被视为一种无动物源性成分的卵黄替代物，用来避免动物源性隐患，保证畜牧生产的生物安全性，在生产中广泛使用。
精细胞原生质中的水在降温过程中易形成冰晶，使精细胞处于脱水状态，发生不可逆的损伤从而导致精细胞死亡，而甘油可以降低这种损害。甘油具有溶于水不易发生结晶、吸水性强和可降低水溶液冰点的特点。甘油通常用作质膜渗透剂冷冻保护剂，以抑制细胞内冰晶的形成。同时甘油可以保护精子细胞内一部分酶免受冷冻损伤而逸出(GOT)。此外，大豆卵磷脂能协同甘油起到一定的抗冻性，但是存在的缺点是，甘油对精子的活力和授精力有一定的毒害作用，添加量过大，减弱精子质量，而且不能降低ROS的产生，所以在精子冷冻稀释液中，除了添加一定量的甘油和大豆卵磷脂，本发明通过添加白藜芦醇可有效保护精子的氧化损伤。白藜芦醇(Resveratrol，Res)，化学名称为3,5,4′-三羟基二苯乙烯(3,5,4′-trihydroxysitlbene)，无色针状晶体，难溶于水，易溶于乙醇、DMSO等极性溶剂，主要来源于葡萄(红葡萄酒)、虎杖、花生、桑椹等植物。具有比VC和VE更强的抗氧化能力。Res作用在氧化反应的起始和传播阶段，通过作用于发生过氧化的细胞膜，从而增加细胞膜的流动性。
M199是一种动物细胞培养基，含有十几种氨基酸，其与糖协同为精子提供能源物质；青霉素、链霉素作为抑菌剂为防止细菌等微生物在精液中繁殖衍生。
最为一种最优选的可实施方法，所述稀释液包括A液和B液，其中，A液配方为：每100mL蒸馏水中含Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇14.55mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg；
B液由体积比为9：1的A液和甘油组成。
优选地，所述糖为葡萄糖、果糖或乳糖。
本发明还提供一种利用上述稀释液对奶绵羊精液冷冻保存的方法，包括如下步骤：
S1.采集奶绵羊新鲜精液；
S2.精液的稀释和平衡
S(2-1).将所述稀释液于38℃下预热30min，通过测新鲜精液的密度，计算出稀释后总体积；
S(2-2).用A液先对新鲜精液进行1：1稀释，静置10min，然后对新鲜精液进行1：4稀释，静置10min，再对新鲜精液进行1：8稀释，静置10min，最后加A液至总体积的一半，将稀释后的精液密封，置于38℃环境中；
S(2-3).将稀释后的精液放置于4℃下平衡2h，再加稀释液B液至总体积，再置于4℃下平衡1h；
S3.冷冻：将平衡后的精液灌装到0.25mL专用冷冻精液的细管中，对精液进行冷冻；
S4.当冷冻温度下降至-140℃时冷冻结束，保持30s；打开冷冻箱盖，取出细管置入液氮并分装冻存。
优选地，所述奶绵羊为戴瑞奶绵羊。
优选地，步骤S2所述精液的稀释为稀释至精子密度2000～3000万/mL。
优选地，步骤S3所述冷冻程序为：
4℃降温至-10℃，降温速率5℃/min；-10℃降温至-100℃，降温速率60℃/min；-100℃降温至-140℃，降温速率20℃/min。
优选地，步骤S1所采集的精液无异常气味，颜色为乳白色，直线前进运动精子数量≥60％，精子密度≥6亿/mL。
优选地，S3冷冻前，应充分混匀，并检查精子活力。
优选地，所述冷冻为采用程控冷冻仪，精液冷冻前30min，将液氮阀和排气阀打开以平衡液氮罐和冷冻箱内的压力，待冷冻箱内温度降至4℃时，维持30s，再放入冷冻精液细管。
本发明还请求保护上述方法在对奶绵羊精液保存方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
提供一种特定针对奶绵羊精液冷冻保存的稀释液及其保存方法，利用本发明提供的稀释液对奶绵羊精液进行冷冻保存，解冻精子成活率达到63.97％，解冻精子顶体完整率达到57.37％，解冻精子质膜完整率达到39.52％。表明采用本发明的稀释液得到的奶绵羊冻精在解冻后活率、顶体完整性、质膜完整性和畸形率等重要指标方面均有保证，对于奶绵羊人工输精等生产应用具有重大价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1奶绵羊精液冷冻保存稀释液
本实施例提供了一系列用于奶绵羊精液冷冻保存的稀释液：
(1)稀释液1
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇14.55mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由90mL A液和10mL甘油组成。
(2)稀释液2
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇14.55mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由92mL A液和8mL甘油组成。
(3)稀释液3
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇14.55mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由88mL A液和12mL甘油组成。
(4)稀释液4
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇7.28mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由90mL A液和10mL甘油组成。
(5)稀释液5
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇21.83mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由90mL A液和10mL甘油组成。
实施例2奶绵羊精液冷冻保存
一、精液的冷冻保存方法
1、以假阴道法采集3只戴瑞奶绵羊种公羊(N1/N2/N3)的新鲜精液，将其放于38℃水浴锅中。然后，吸取8uL原精放于专用载玻片上进行精液品质的判断，准确记录采精量、密度和活力，要求原精无异常气味，颜色为乳白色，直线前进运动精子(下限)60％，精子密度(下限)6亿/mL，不具备其中任何一项者，不得用于制作冻精。通过测鲜精密度，保证稀释后精液中精子的密度为2000～3000万/mL，计算出稀释后总体积。
2、精液的稀释和平衡
将实施例1中配置好的5种稀释液在38℃水浴锅中预热30min，利用5种稀释液分别对3只种公羊的新鲜精液进行稀释，每种稀释液对应每只公羊的精液做3个平行实验：
首先利用A液先对新鲜精液进行1：1(鲜精：A液)稀释，静置10min；再进行1：4稀释(鲜精：A液)，静置10min；再经1：8(鲜精：A液)稀释，静置10min；然后加A液至总体积的一半。将稀释后的精液封口并放于含有38℃水的烧杯中，最后将其放置4℃冰箱中平衡2h后加稀释液B液至总体积，置于4℃冰箱中平衡1h。
3、冷冻
(1)制作冻精的设备，采用0.25mL细管冻精设备。
(2)精液在冷冻前，应充分混匀，并检查精子活力。用灌封机将平衡后的精液灌装到0.25mL专用冷冻精液的细管中，按照程控冷冻仪的操作步骤对精液进行冷冻。冷冻程序为：4→-10℃(降温速率5℃/min)、-10→-100℃(降温速率60℃/min)、-100→-140℃(降温速率20℃/min)。
精液冷冻前30min，将液氮阀和排气阀打开以平衡液氮罐和冷冻箱内的压力，待冷冻箱内温度降至4℃时，维持30s。打开冷冻箱盖，将放有细管精液的托架放入冷冻箱内，关闭冷冻箱盖进行精液冷冻。电脑同步显示精液温度、冷冻温度和冷冻曲线的变化。
(3)当温度下降至-140℃时冷冻结束，保持30s。打开冷冻箱盖，取出细管置入液氮并分装冻存。留样检查。
二、冷冻精液的质量检测
1、检查方法
(1)精子活率及精子运动能力检测
a预热精子分析仪，使载玻片和载物台均保持在38℃；
b解冻：水浴锅38℃预热30min以上，待水浴锅温度稳定后，迅速从贮存罐中取出预留冻精，在空气中15-20s，然后放入38℃水浴锅中15-20s并轻轻摇晃；取出细管用无菌吸水纸擦拭干净，剪掉没有海绵塞的一端，用推针推动海绵塞，将精液推入1.5mL离心管中；用移液枪吸取8μL精子悬液滴于专用载玻片上，在100倍显微镜下观察，使用辅助精子分析仪(SCA)进行精子分析。至少观察5个视野，统计活率。
(2)精子顶体完整性检测
采用花生凝集素标记法对精子顶体完整性进行分析，荧光显微镜下观察，共计数至少200个精子来统计冻后精子顶体完整性。
(3)精子畸形率检测
采用吉姆萨染色法镜检，每个抹片观察200个以上精子(分左、右两个区)，取两片的平均值，两片的变异系数不得大于20％，若超过应重新制片。
(4)精子质膜完整率检测
采用低渗肿胀方法镜检，每个样品观察精子总数500个。
(5)子宫角输精
采用腹腔内窥镜技术对发情后14～16h进行一次输精，输精部位为子宫角，每次1支冻精。
2、检测结果
表1解冻精子活率(％)
Figure BDA0002939977160000071
Figure BDA0002939977160000081
表2解冻精子顶体完整率(％)
组别 稀释液1 稀释液2 稀释液3 稀释液4 稀释液5
N1 60.37±2.1 47.26±0.83 49.13±0.50 50.85±2.65 44.43±2.54
N2 65.65±1.17 44.66±0.54 45.02±0.28 49.88±1.69 44.34±0.21
N3 56.22±1.26 42.77±1.90 46.53±1.23 47.39±3.77 44.28±2.72
表3解冻精子畸形率(％)
组别 稀释液1 稀释液2 稀释液3 稀释液4 稀释液5
N1 14.68±0.67 28.05±0.035 25.59±2.22 23.52±0.20 24.03±2.78
N2 12.50±0.92 26.57±0.62 28.41±0.48 20.40±1.95 29.75±0.26
N3 15.64±1.75 23.79±2.99 24.61±4.3 23.59±0.89 21.78±0.99
表4解冻精子质膜完整率(％)
组别 稀释液1 稀释液2 稀释液3 稀释液4 稀释液5
N1 46.52±2.99 31.73±0.21 31.7±3.62 35.26±4.89 27.9±0.51
N2 51.19±2.98 31.65±1.04 36.13±2.42 32.17±1.88 31.01±0.51
N3 43.21±0.63 32.91±0.98 33.19±2.53 31.56±2.13 31.12±1.23
从表1-4的实验结果可以看出，在稀释液1-3中，用稀释液1进行冻精，解冻后精子活力、质膜完整率最高，顶体完整率较佳，畸形率最低。
子宫角输精显示，用稀释液1进行冻精解冻输精后情期受胎率达88.89％(24/27)。
对比例1
1、稀释液的配置(山羊冷冻精液稀释液国家标准配方)
柠檬酸钠1.5g、葡萄糖3.0g、乳糖5g、补蒸馏水至100mL，消毒待用。取消毒后的基础液75mL，添加卵黄20mL、甘油5mL，青霉素、链霉素各10万单位形成稀释液。
2、奶绵羊精液冷冻保存的方法
(1)精液的采集同实施例2；
(2)采用稀释液稀释精液到总体积(保证稀释后精液中精子的密度为2000～3000万/mL)，将稀释后的精液置于4℃冰箱中平衡1h；
(3)冷冻方式同实施例2。
对比例2
1、稀释液的配置(绵羊冷冻精液稀释液国家标准配方)
A液：柠檬酸钠3.0g、葡萄糖3.0g、卵黄25mL、补蒸馏水至100mL。
B液：取A液75mL、甘油12mL。
2、奶绵羊精液冷冻保存的方法
(1)精液的采集同实施例2；
(2)先利用A液先对新鲜精液进行1：1(鲜精：A液)稀释，静置10min；再进行1：4稀释(鲜精：A液)，静置10min；再经1：8(鲜精：A液)稀释，静置10min；然后加A液至总体积的一半。将稀释后的精液封口并放于含有38℃水的烧杯中，最后将其放置4℃冰箱中平衡2h后加稀释液B液至总体积(保证稀释后精液中精子的密度为2000～3000万/mL)，置于4℃冰箱中平衡1h。
(3)冷冻方式同实施例2。
对比例3
稀释液的配制(参考现有技术配置稀释液)
首先将30.2～31.2g Tris、15.9～16.9g柠檬酸、19.5～20.5g果糖、0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐充分溶解于1000mL灭菌的超纯水中，然后使用0.22um滤膜进行过滤除菌，过滤除菌后添加0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐，使其充分溶解。取80mL上述配制的稀释液，向其中添加20mL卵黄，放置4℃下平衡，使卵黄充分溶解。
将上述溶解后的混合液放入冰箱过夜使其充分溶解，然后10000r/min，4℃条件下离心20min，离心取上清液即得到稀释液。
注意：离心一定要彻底，不要摇晃离心管，尽可能减少卵黄大颗粒进入到稀释液中。
2、奶绵羊精液冷冻保存的方法
(1)精液的采集同实施例2；
(2)采用稀释液稀释精液到总体积(保证稀释后精液中精子的密度为2000～3000万/mL)，将稀释后的精液置于4℃冰箱中平衡1h；
(3)冷冻方式同实施例2。
对比例4
(1)稀释液
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由90mL A液和10mL甘油组成。
(2)精液的采集，稀释和平衡，冷冻方式同实施例2。
对比例5
(1)稀释液
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇3.64mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由90mL A液和10mL甘油组成。
(2)精液的采集，稀释和平衡，冷冻方式同实施例2。
对比例6
(1)稀释液
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇29.1mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由90mL A液和10mL甘油组成。
(2)精液的采集，稀释和平衡，冷冻方式同实施例2。
对比例7
(1)稀释液
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇14.55mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由94mL A液和6mL甘油组成。
(2)精液的采集，稀释和平衡，冷冻方式同实施例2。
对比例8
(1)稀释液
A液：每100mL蒸馏水中添加Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇14.55mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg得到A液；
B液：每100mL B液由86mL A液和14mL甘油组成。
(2)精液的采集，稀释和平衡，冷冻方式同实施例2。
对比例1-8的方法得到的精液的质量检测
1、冷冻精液的质量检测同实施例2。
2、检测结果
表5解冻精子活率(％)
Figure BDA0002939977160000111
表6解冻精子顶体完整率(％)
组别 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6 对比例7 对比例8
N1 25.50±1.37 28.37±0.44 27.23±0.73 29.84±1.32 36.76±1.86 31.42±0.59 26.32±0.21 28.51±0.03
N2 26.74±1.95 31.82±0.76 26.45±1.24 34.73±0.56 42.17±1.89 36.75±0.30 28.46±0.04 29.03±0.18
N3 26.77±0.16 28.44±0.95 25.74±2.02 30.76±0.88 37.96±2.45 35.31±2.82 27.02±1.04 27.27±1.17
表7解冻精子畸形率(％)
组别 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6 对比例7 对比例8
N1 38.42±0.60 37.22±1.06 31.67±0.22 36.27±1.21 30.31±0.34 40.36±0.95 39.23±0.24 35.85±1.06
N2 38.05±1.93 35.85±0.53 34.33±1.26 33.79±1.11 29.98±2.06 36.99±3.11 37.60±1.30 32.40±0.05
N3 34.27±3.13 35.32±1.51 31.62±0.23 37.44±2.36 31.77±1.85 43.32±2.63 35.48±0.40 37.21±0.01
表8解冻精子质膜完整率(％)
组别 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6 对比例7 对比例8
N1 13.27±0.44 17.88±0.91 19.31±1.11 23.89±0.21 27.23±1.10 24.24±0.45 29.09±0.03 27.23±1.03
N2 17.94±1.24 18.24±1.19 20.49±0.02 19.94±1.42 24.75±1.90 25.66±0.45 27.56±0.85 26.65±1.18
N3 16.03±2.51 16.91±1.14 18.56±0.94 19.45±1.38 28.08±2.99 25.76±1.97 25.98±1.38 28.47±0.07
从表5-8的实验结果可以看出，使用对比例1-9得到的稀释液对本发明的戴瑞奶绵羊精液进行冷冻，解冻后精子活力、顶体完整率和质膜完整率都不佳，均低于本发明的稀释液保存的奶绵羊精子，且畸形率均高于本发明稀释液保存的奶绵羊精子。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种戴瑞奶绵羊精液冷冻保存的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.采集奶绵羊新鲜精液；
S2.精液的稀释和平衡
S(2-1).将奶绵羊精液冷冻保存稀释液于38℃下预热30min，通过测新鲜精液的密度，计算出稀释后总体积；
S(2-2).用A液先对新鲜精液进行1：1稀释，静置10min，然后对新鲜精液进行1：4稀释，静置10min，再对新鲜精液进行1：8稀释，静置10min，最后加A液至总体积的一半，将稀释后的精液密封，置于38℃环境中；
S(2-3).将稀释后的精液放置于4℃下平衡2h，再加稀释液B液至总体积，再置于4℃下平衡1h；
S3.冷冻：将平衡后的精液灌装到0.25mL专用冷冻精液的细管中，对精液进行冷冻；
S4.当冷冻温度下降至-140℃时冷冻结束，保持30s；打开冷冻箱盖，取出细管置入液氮并分装冻存；
所述奶绵羊精液冷冻保存稀释液包括A液和B液，其中，A液配方为：每100mL蒸馏水中含Tris 2.66～2.76g、柠檬酸0.9～1.9g、糖0.5～1.5g、M1991.5～2.5mL、大豆卵磷脂0.5～1.5g、白藜芦醇7.28～21.83mg、青霉素10 000～150000IU、链霉素9～11mg；
B液由体积比为8.8～9.2：0.8～1.2的A液和甘油组成。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述奶绵羊精液冷冻保存稀释液包括A液和B液，其中，A液配方为：每100mL蒸馏水中含Tris 2.71g、柠檬酸1.4g、糖1g、M199 2mL、大豆卵磷脂1g、白藜芦醇14.55mg、青霉素10 000IU、链霉素10mg；
B液由体积比为9：1的A液和甘油组成。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述奶绵羊精液冷冻保存稀释液中的糖为葡萄糖、果糖或乳糖。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2所述精液的稀释为稀释至精子密度2000～3000万/mL。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3所述冷冻程序为：
4℃降温至-10℃，降温速率5℃/min；-10℃降温至-100℃，降温速率60℃/min；-100℃降温至-140℃，降温速率20℃/min。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所采集的精液无异常气味，颜色为乳白色，直线前进运动精子数量≥60％，精子密度≥6亿/mL。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3冷冻前，应充分混匀，并检查精子活力。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述冷冻为采用程控冷冻仪，精液冷冻前30min，将液氮阀和排气阀打开以平衡液氮罐和冷冻箱内的压力，待冷冻箱内温度降至4℃时，维持30s，再放入冷冻精液细管。
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