CN110037011A - 一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法及其应用 - Google Patents

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张德福
戴建军
韩雪峻
姜红菊
吴彩凤
孙玲伟
吕松洁
范文华
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Abstract

本发明涉及一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，首先制备TCG液，然后将大豆卵磷脂以1～10％的重量百分比加入到预热后的制备TCG液中，搅拌均匀后进行超声处理，得到混合液；最后将混合液进行高压均质处理，即得清澈透亮、性质稳定、久置无沉淀的大豆卵磷脂冷冻稀释液。本发明制得的大豆卵磷脂冷冻稀释液添加甘油后用于绵羊精液的冷冻保存，能通过大幅度降低冷冻稀释液中大豆卵磷脂的粒径，提高其溶解性并增加溶液的稳定性，对精子的冷冻保存效果好。

Description

一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，属于家畜繁殖技术领域。
背景技术
目前家畜繁殖生产中生物安全性开始逐渐受到人们的关注，许多研究者对精液冷冻稀释液中添加卵黄、牛奶等动物源成份提出异议，认为可能带来微生物污染并存在生物安全性，故以植物源的有效成份替代动物源成份已成为当前家畜精子冷冻保存技术的一个研究热点，也是精子冷冻稀释液实现商业化、标准化生产的一个积极推动因素。
大豆卵磷脂(Soy lecithin)是从大豆中提取的一种两性表面活性的磷脂类物质，与鸡蛋卵黄中具有抗低温打击保护能力的主要功能性成分类似，且不存在生物安全性问题。故大豆卵磷脂在精液冷冻中应用代替卵黄等成份受到许多研究者的关注。近十年来，国内外研究者将大豆卵磷脂在牛、马、羊和猪等家畜精子冷冻上进行了大量试验，证实大豆卵磷脂对家畜精子的抗低温打击保护能力与鸡蛋卵黄接近或相当。然而，由于常规加热、超声波等常规辅助促溶手段的局限性，导致大豆卵磷脂添加浓度较低，且溶液呈悬浊液、粒径较大(15.25±9.744μm)，久置会造成沉淀，从而影响精子的冷冻效果。
研究证实，冷冻稀释液中存在不规则大颗粒是影响精子冷冻效果的重要因素之一。一方面，精液冷冻稀释液中存在较多不规则的大颗粒，在冷冻过程中使溶液中水分子更容易生成不规则大冰晶，造成对精子细胞不可逆的机械性损伤；另一方面，大豆卵磷脂较大粒径也不利于其附着在精子膜表面发挥保护作用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中冷冻稀释液存在的不足，提供一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，制得的大豆卵磷脂冷冻稀释液粒径小，均一稳定、久置无沉淀，对精子的冷冻保存效果好。
技术方案
一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备TCG液：取柠檬酸1.8252g、葡萄糖0.5044g和三羟甲基氨基甲烷3.6342g加入到超纯水中溶解，然后定容至100mL，得到TCG液；
(2)将大豆卵磷脂以1～10％的重量百分比加入到预热后的TCG液中，搅拌均匀后进行超声处理得到混合液；
(3)将混合液进行高压均质处理，即得大豆卵磷脂冷冻稀释液。
进一步，步骤(2)中，所述预热的温度为50～60℃。
进一步，步骤(2)中，所述超声处理的参数为：40KHz，50～60℃，30min。
进一步，步骤(3)中，高压均质处理的条件为：4～10℃，压强1500～2500bar，处理2次以上。
上述大豆卵磷脂冷冻稀释液在绵羊精液冷冻保存中的应用，应用方法：往大豆卵磷脂冷冻稀释液中加入甘油，大豆卵磷脂冷冻稀释液与甘油重量比为94:6，然后将其以3:1的体积比缓慢加至绵羊精液中，混匀后4℃条件下水浴平衡2～3h，4℃条件下装管，然后置于程序冷冻仪(5～-10℃：4.5℃/min；-10～-110℃：25℃/min；-110～-140℃：10℃/min)进行冷冻，最后将冷冻细管投入液氮保存。
本发明的有益效果：本发明提供了一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，该方法能大幅度降低冷冻稀释液中大豆卵磷脂的粒径，提高其溶解性并增加溶液的稳定性，制得的大豆卵磷脂冷冻稀释液清澈透亮，性质稳定，久置无沉淀产生，对精子的冷冻保存效果好。
附图说明
图1为对比例2的大豆卵磷脂冷冻稀释液的粒径图；
图2为实施例1-4的大豆卵磷脂冷冻稀释液的粒径图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
下述实施例中，采用的大豆卵磷脂为Sigma公司产品，采用的高压均质机的型号为JNBIO JN-02C，广州聚能纳米生物科技股份有限公司生产，但均不限于此。
实施例1
一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取柠檬酸1.8252g、葡萄糖0.5044g和三羟甲基氨基甲烷3.6342g加入到超纯水中溶解，然后利用容量瓶定容至100mL，得到TCG液；
(2)将大豆卵磷脂以1％的重量百分比加入到预热至55℃的TCG液中，搅拌均匀后进行超声处理(40KHz，50～60℃，30min)，得到混合液；
(3)将混合液加到高压均质机中进行高压均质处理(7℃，压强2000ba r，处理3次)，即得清澈透亮的大豆卵磷脂冷冻稀释液。
实施例2
一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取柠檬酸1.8252g、葡萄糖0.5044g和三羟甲基氨基甲烷3.6342g加入到超纯水中溶解，然后利用容量瓶定容至100mL，得到TCG液；
(2)将大豆卵磷脂以2％的重量百分比加入到预热至55℃的TCG液中，搅拌均匀后进行超声处理(40KHz，50～60℃，30min)，得到混合液；
(3)将混合液加到高压均质机中进行高压均质处理(4℃，压强2000bar，处理3次)，即得清澈透亮的大豆卵磷脂冷冻稀释液。
实施例3
一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取柠檬酸1.8252g、葡萄糖0.5044g和三羟甲基氨基甲烷3.6342g加入到超纯水中溶解，然后利用容量瓶定容至100mL，得到TCG液；
(2)将大豆卵磷脂以3％的重量百分比加入到预热至55℃的TCG液中，搅拌均匀后进行超声处理(40KHz，50～60℃，30min)，得到混合液；
(3)将混合液加到高压均质机中进行高压均质处理(4℃，压强2000ba r，处理3次)，即得清澈透亮的大豆卵磷脂冷冻稀释液。
实施例4
一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取柠檬酸1.8252g、葡萄糖0.5044g和三羟甲基氨基甲烷3.6342g加入到超纯水中溶解，然后利用容量瓶定容至100mL，得到TCG液；
(2)将大豆卵磷脂以4％的重量百分比加入到预热至55℃的TCG液中，搅拌均匀后进行超声处理(40KHz，50～60℃，30min)，得到混合液；
(3)将混合液加到高压均质机中进行高压均质处理(4℃，压强2000ba r，处理3次)，即得清澈透亮的大豆卵磷脂冷冻稀释液。
对比例1
鸡蛋卵黄冷冻稀释液，制备方法：取柠檬酸1.8252g、葡萄糖0.5044g和三羟甲基氨基甲烷3.6342g加入到超纯水中溶解，然后定容至100mL，得到TCG液，然后加入鸡蛋卵黄(基础冷冻液与鸡蛋卵黄的体积比为4:1)，磁力搅拌器充分搅拌均匀，即得。
对比例2
大豆卵磷脂冷冻稀释液，制备方法：添加1g大豆卵磷脂到TCG液(55℃)中搅拌均匀，然后定容至100mL，超声处理即得到大豆卵磷脂冷冻基础液。粒径图见图2。
一.将实施例1-4的冷冻稀释液和对比例1-2的冷冻稀释液进行静置和粒径对比测试，结果见表1：
外观 4℃下静置1周 粒径
实施例1-4 清澈透亮 静置无沉淀 0.133±0.022um
对比例1 浑浊，不透明 静置有沉淀
对比例2 浑浊，不透明 静置有沉淀 15.25±9.744um
二.将实施例1-4的冷冻稀释液和对比例1-2的冷冻稀释液分别用于绵羊精液的冷冻保存，然后测试绵羊精液的冷冻保存效果，方法如下：
1.绵羊精液采集
精液样品来自1.5～2岁、体格健壮、精子耐冻性能良好的8头湖羊种公羊，利用母羊做台畜假阴道法采集种公羊精液，取3头镜检合格的湖羊精液混合均匀，然后取实施例1-4和对比例1和2大豆卵磷脂冷冻稀释液分别添加甘油，大豆卵磷脂冷冻稀释液与甘油重量比为94:6，将添加甘油后的冷冻稀释液分别以3:1的体积比加入到湖羊精液中稀释、混匀，加冷冻稀释液的湖羊精液移至4℃条件下水浴平衡2～3h(每隔1h去掉一半水量)后，4℃条件下装管(0.25mL)，然后置于程序冷冻仪(5～-10℃：4.5℃/min；-10～-110℃：25℃/min；-110～-140℃：10℃/min)、冷冻细管迅速投入液氮。冷冻细管保存3d后检测冷冻精液运动性能和顶体完整性等指标。
3.绵羊精液品质指标检测
①精子活率的检测
取细管冷冻精液于70℃、5s水浴解冻，37℃水浴10min，取10μL精液于精子品质分析仪专用计数板，利用CASA系统检测精子活率(即直线运动精子百分数)。
②精子顶体完整性检测
采用FITC-PNA荧光染色法对绵羊精子顶体完整性进行检测。精子经FITC-PNA染色后(FITC-PNA染液：0.001g FITC-PNA，溶于10mL PBS中，用0.45μm滤膜过滤后，即得)，因FITC-PNA可与精子顶体膜上的受体特异结合，在激发波长480nm、发射波长530nm紫外光激发下可区分出四种不同类型的精子：
1)顶体完整精子，顶体顶部发强光且边缘规则光滑；
2)顶体部分破坏精子，顶体前区杂乱发光且边缘不规则；
3)顶体前帽缺失的精子，仅在赤道区有荧光；
4)顶体完全破坏精子，无荧光。每项每次计算至少200个精子。
③精子质膜完整率检测
将解冻后的精液用果糖－柠檬酸钠低渗液稀释，调整精子密度为2×106/mL，37℃孵育30min后，取20μL精子悬液于血细胞计数板上，400×倒置显微镜下计算弯尾精子的百分率，每次至少数200个精子。
4.测试结果：利用SPSS统计软件的t检验和方差分析进行数据处理，结果见表2：
表2
注：表中数据为平均值±标准差，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表2可以看出，本发明实施例制得的大豆卵磷脂冷冻稀释液对绵羊精子的冷冻保护效果优于鸡蛋卵黄(20％)和常规溶解的大豆卵磷脂(1％)冷冻稀释液组。本发明的大豆卵磷脂冷冻稀释液经高压均质处理，溶液稳定、呈清澈透亮，久置无沉淀产生，利于冷冻稀释液的标准化生产。

Claims (5)

1.一种大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备TCG液：取柠檬酸1.8252g、葡萄糖0.5044g和三羟甲基氨基甲烷3.6342g加入到超纯水中溶解，然后定容至100mL，得到TCG液；
(2)将大豆卵磷脂以1-10％的重量百分比加入到预热后的TCG液中，搅拌均匀后进行超声处理得到混合液；
(3)将混合液进行高压均质处理，即得大豆卵磷脂冷冻稀释液。
2.如权利要求1所述大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预热的温度为50～60℃。
3.如权利要求1所述大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超声处理的参数为：40KHz，50～60℃，30min。
4.如权利要求1或2或3所述大豆卵磷脂冷冻稀释液的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，高压均质处理的条件为：4～10℃，压强1500～2500bar，处理2次以上。
5.权利要求1或2或3或4所述大豆卵磷脂冷冻稀释液在绵羊精液冷冻保存中的应用。
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